一种从鹅掌柴叶中提取的化合物及其应用
阅读：893发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种从鹅掌柴叶中提取的化合物及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种从鹅掌柴中提取的化合物，以及该化合在制备 治疗 成人T细胞白血病及人类T淋巴细胞白血病药品中的应用；从鹅掌柴中提取的该化合物通过线料体途径诱导含HTLV-1病毒的 肿瘤 细胞凋亡，而对正常细胞几乎无毒性；同时，该化合物可以抑制HTLV-1病毒的复制，对治疗成人T细胞白血病提供了新的候选药物，具有良好的应用前景。，下面是一种从鹅掌柴叶中提取的化合物及其应用专利的具体信息内容。
1.一种从鹅掌柴叶中提取的化合物，其特征在于，该化合物分子式为：C30H46O5，化学名为：3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸，结构式为：
R1：OH R2：COOH R3：COOH。
2.权利要求1所述的从鹅掌柴叶中提取的化合物在制备治疗成人T细胞白血病及人类T淋巴细胞白血病药品中的应用。
3.一种权利要求1所述的化合物的提取方法，其特征在于，提取方法包括以下步骤：
(1)将干燥的鹅掌柴叶，用70％乙醇室温浸提3次，每次分别为3天、2天、1天，合并滤液，减压浓缩获得总提取物；
(2)分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对总提取物萃取三次，每次一天，乙酸乙酯部位通过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷—甲醇梯度100:0、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、1:1洗脱获得六个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为F1至F6；
(3)将组分F2过正相硅胶H柱层析，用二氯甲烷—甲烷梯度100:1、80:1洗脱获得4个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1至4，其中，组分3经过重结晶即得化合物。
一种从鹅掌柴叶中提取的化合物及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于天然药物提取技术领域，尤其涉及一种从鹅掌柴叶中提取的化合物及其应用。
背景技术
[0002] 鹅掌柴(又名“鸭脚木”)是一种常见的药用植物，其根、皮、叶等部位入药具有镇痛、抗炎功效。迄今为止，从鹅掌柴属中分离出超过200个化合物，中国发明专利CN109438544A公开一种鹅掌柴叶提取物及其提取方法以及在制备促凝血、止血药物的应用；中国发明专利CN105232557A公开一种鸭脚木提取物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用。但无资料显示鹅掌柴提取物在成人T细胞白血病 /淋巴瘤中的研究。
[0003] 成人T细胞白血病/淋巴瘤(Atl)是由一种逆转录病毒——人类 T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)引起的一种独特的肿瘤。它只在 HTLV-1感染的个体中发生，所有Atl细胞都含有整合的HTLV-1前体细胞。全世界约有2000万人感染HTLV-1。Atl患者的共同特征包括周围淋巴结肿大、肝肿大、脾肿大、高钙血症和皮肤病变。
[0004] 但是，由于其对常规化疗和高剂量化疗的耐药，Atl的预后较差。迄今为止，最成功的治疗策略是联合使用抗病毒药物齐多夫定(AZT) 和干扰素-α(IFNA)，以及异基因干细胞移植，但缓解率仅为30-40％。
发明内容
[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种从鹅掌柴叶中提取的化合物。
[0006] 本发明的另一目的是提供从鹅掌柴叶中提取的化合物在制备治疗成人T细胞白血病及人类T淋巴细胞白血病药品中的应用。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] 一种从鹅掌柴叶中提取的化合物，分子式为：C30H46O5，化学名为：3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸，结构式为：
[0009]
[0010] R1：OH R2：COOH R3：COOH。
[0011] 所述化合物的提取方法，包括以下步骤：
[0012] (1)将干燥的鹅掌柴叶，用70％乙醇室温浸提3次，每次分别为3天、2天、1天，合并滤液，减压浓缩获得总提取物；
[0013] (2)分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对总提取物萃取三次，每次一天，乙酸乙酯部位通过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷—甲醇梯度100:0、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、1:1洗脱获得六个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为F1至F6；
[0014] (3)将组分F2过正相硅胶H柱层析，用二氯甲烷、甲烷梯度 100:1、80:1洗脱获得4个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1至4，其中，组分3经过重结晶即得化合物。
[0015] 一种所述的从鹅掌柴叶中提取的化合物在制备治疗成人T细胞白血病及人类T淋巴细胞白血病药品中的应用。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] 本发明的从鹅掌柴叶中提取的化合物可诱导ATL细胞中活性氧簇(ROS)产生并减少细胞内Bcl-2与Bcl-xl蛋白的表达，促使AIF切割活化，诱导含肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞几乎无毒性；同时，该化合物可以抑制HTLV-1病毒的复制，对治疗成人T细胞白血病提供了新的候选药物，具有良好的应用前景。附图说明
[0019] 图1B为本发明实施例水相提取物分离的三种化合物的化学结构式。
[0020] 图1C为本发明实施例提取的化合物A对ATL细胞系增殖的剂量反应作用。
[0021] 图1D为本发明实施例提取的化合物A在不同细胞系中的作用的比较。
[0022] 图2A为本发明实施例提取的化合物A处理后的细胞形态。
[0023] 图2B为本发明实施例提取的化合物A处理后的细胞凋亡分析图。
[0024] 图3A为本发明实施例提取的化合物A处理后细胞ROS检测图。
[0025] 图3B为用含有或不含有NAC预处理，用100nM化合物A诱导的细胞活力图。
[0026] 图3C为用含有或不含有NAC预处理，用50nM化合物A诱导的细胞凋亡图。
[0027] 图4A为化合物A处理后的细胞中Bcl-2家族Bax，Bcl-2和Bcl-xl成员的表达谱。
[0028] 图4B为化合物A处理后的细胞核中的AIF表达水平。
[0029] 图5A为合物A对病毒蛋白的表达分析图。
[0030] 图5B为化合物A对病毒抑制分析图。
[0031] 图5C为化合物对病毒复制分析图。
具体实施方式
[0032] 以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0033] 实施例1：化合物的提取
[0034] 1)将10Kg干燥的鹅掌柴叶，用45L的70％乙醇室温浸提3次，每次分别为3天、2天、1天，合并滤液，减压浓缩获得总提取物；
[0035] 2)分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对总提取物萃取萃取三次，每次一天，乙酸乙酯部位通过正相硅胶(200-300目)柱层析，用二氯甲烷—甲醇梯度(100:0、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、1:1)洗脱获得六个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为F1至F6；
[0036] 3)将组分F2过正相硅胶H柱层析，用二氯甲烷—甲烷梯度 (100:1、80:1)洗脱获得4个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1至4，其中，组分3经过重结晶即得化合物A。
[0037] 对化合物A进行成分鉴定，分子式C30H46O5，化学名为：3α- 羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸，结构式为：
[0038]
[0039] R1：OH R2：COOH R3：COOH。
[0040] 实施例2：化合物A对ALT细胞活力及抗增殖测定
[0041] 通过CCK-8(Beyotime Biotechnology，中国)试剂盒测试了鹅掌柴叶水相、正丁醇相、乙酸乙酯相和甲醇相的提取物对三种HTLV-1- 相关细胞系(ATL-2，MT-2和MT-4)的抗增殖活性。将2×103个细胞接种于在96孔培养板，12小时后分别加入浓度为0μg，0.5μg，5 μg，50μg，500μg和5000μg的待测化合物，并加入CCK-8溶液。将细胞再培养2小时后，用酶标仪在
450nm的测试波长下测量存活细胞的数量并计算IC50值(50％细胞毒性的浓度)。结果如图
1A 表明水相提取物对ATL细胞系具有细胞毒性作用。因此，进一步分离了水相提取物中的三种化合物，三种化合物结构式如图1B如示，并检测了它们对三种HTLV-1-相关细胞系(ATL-2，MT-2和MT-4) 和急性T细胞白血病细胞增殖的影响。与CEM-T4细胞系相比，化合物A对HTLV-1-相关细胞系显示出更强的作用(图1C)。为了证实这一观察结果，对ATL-2，ATL-ED，ATL-T，MT-1，MT-2，MT-4， TL-OM1，Jurkat，CEM-T4，MOLT-4，Hut-78，HUVEC，293T， ChangLiver，LO-2细胞系和外周血单个核细胞中进行了实验，如预期的那样，HTLV-1-相关细胞系对化合物A敏感。相比之下，非HTLV-1 相关细胞显示出对化合物A的抗性(图1D)，这使得化合物A有希望的抗ATL抗增殖剂。此外，化合物A的细胞损伤作用主要发生在治疗的前
48小时。因此，我们使用48h作为最佳的体外治疗条件。
450nm的测试波长下测量存活细胞的数量并计算IC50值(50％细胞毒性的浓度)。结果如图
1A 表明水相提取物对ATL细胞系具有细胞毒性作用。因此，进一步分离了水相提取物中的三种化合物，三种化合物结构式如图1B如示，并检测了它们对三种HTLV-1-相关细胞系(ATL-2，MT-2和MT-4) 和急性T细胞白血病细胞增殖的影响。与CEM-T4细胞系相比，化合物A对HTLV-1-相关细胞系显示出更强的作用(图1C)。为了证实这一观察结果，对ATL-2，ATL-ED，ATL-T，MT-1，MT-2，MT-4， TL-OM1，Jurkat，CEM-T4，MOLT-4，Hut-78，HUVEC，293T， ChangLiver，LO-2细胞系和外周血单个核细胞中进行了实验，如预期的那样，HTLV-1-相关细胞系对化合物A敏感。相比之下，非HTLV-1 相关细胞显示出对化合物A的抗性(图1D)，这使得化合物A有希望的抗ATL抗增殖剂。此外，化合物A的细胞损伤作用主要发生在治疗的前
48小时。因此，我们使用48h作为最佳的体外治疗条件。
[0042] 实施例3：细胞凋亡坏死检测
[0044] 通过FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒I(碧云天，中国)测量凋亡。将细胞接种在6孔板中，并用化合物A以25、50、100nM，用DMSO作为阴性对照处理48小时，然后通过流式细胞术分析，结果表示为FlowJo软件统计的凋亡细胞百分比的平均值。如图2B结果所示，与DMSO组相比，HTLV-1-相关细胞的凋亡率以剂量依赖性方式显着增加，而CEMT-4细胞中凋亡的比例几乎没有增加。
[0045] 实施例4：活性氧簇(ROS)检测
[0046] 在6孔板中在6孔板中以1×106个细胞/毫升的初始密度接种，用含有或不含NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸)的化合物A(ROS的直接清除剂)处理细胞48小时，然后测量细胞内ROS。在室温下用10μM 荧光染料2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)(碧云天，中国) 染色30分钟。然后用流式细胞仪进行分析。结果表示为FlowJo软件程序的百分比平均值。可观察到ROS以剂量依赖性方式增加，如图 3A为用DCFH-DA形成ROS染色的流式细胞术分析，将细胞与 25nM，50nM，100nM浓度的化合物A，DMSO作为对照，孵育48 小时。此外，将细胞与含有或不含NAC的100nM化合物A一起孵育48小时，NAC可以保护ALT细胞免受氧化损伤，细胞的荧光信号降低(如图3B)。并且用NAC(1mM)预处理1小时可以消除化合物A诱导的细胞活力下降和细胞凋亡(图3C)。这些现象表明ROS 可能在化合物A诱导的细胞凋亡中起主要作用。
[0047] 实施例5：细胞凋亡分子机探究
[0048] 用培养基将化合物A分别稀释至25nM，50nM，100nM，进行换液处理。将用化合物A处理过的细胞在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液(abcam，英国)中裂解，获得细胞总蛋白。之后将蛋白样品在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶中进行电泳，然后转移至硝酸纤维素膜上，用相应的一抗：Bcl-2，Bax，Bcl-xl， Casepaes-3(Cell Signaling Technology，美国)，AIF(碧云天，中国) 在4℃下探测印迹过夜，然后在室温下与适当的辣根过氧化物酶 (HRP)偶联的二抗：山羊抗兔，山羊抗鼠(碧云天，中国)孵育2 小时。使用增强的化学发光系统使抗体识别的蛋白质条带显影。按照以上方法，发明人研究了化合物A处理的HTLV-1相关细胞中Bcl-2 家族Bax，Bcl-2和Bcl-xl成员的表达谱。蛋白印迹分析表明，化合物A下调Bcl-2和Bcl-xl表达，而Bax的表达几乎不变(图4A)。发明人还用蛋白免疫印迹法测试了胱天蛋白酶依赖性和独立途径中效应蛋白的表达水平。结果表明，化合物A对半胱天冬酶-3几乎没有影响，但诱导了AIF活化为57kDa的形式(图4A)。由于活化的 AIF将从线粒体转移到细胞核，发挥促凋亡因子的作用，因此发明人通过蛋白免疫印迹法测试了细胞核中的AIF表达水平，发现核AIF 表达量升高(图4B)，表明化合物A引起ATL细胞通过非caspase 依赖途径的细胞凋亡。
[0049] 实施例6：细胞内病毒含量的效应检测
[0050] 接下来，发明人检测了化合物A对细胞内病毒含量的效应。通过蛋白免疫印迹检测法检测了病毒蛋白如Tax，gp46，p24和p19的表达。结果显示化合物A以剂量依赖性方式抑制病毒蛋白表达(图 5A)。此外，发明人通过p19 ELISA测量HTLV-1病毒的产生，将来自培养细胞的培养液以1,710×g离心5分钟以除去碎片。离心培养基除去细胞碎片并在-80℃冷冻直至进行ELISA以根据制造商的说明书通过HTLV-1p19抗原测定HTLV-1p19的水平。结果还表明化合物A 以剂量依赖性方式抑制病毒(图5B)。此外，我们在ATL-T细胞中转染了仅在病毒周期复制完成后转导的报告基因质粒 pCRU5HT1-inLuc(addgene，美国)，并用双荧光酶素报告基因试剂盒(promega，美国)检测了化合物A对病毒复制的影响。结果显示，随着化合物A浓度的增加，Luc1与Luc2的比例逐渐降低，表明化合物A可以抑制病毒复制(图5C)。
[0051] 由上所述，从鹅掌柴叶中提取的化合物A可诱导ATL细胞中活性氧簇(ROS)产生并减少细胞内Bcl-2与Bcl-xl蛋白的表达，促使AIF切割活化，诱导含肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞几乎无毒性；同时，该化合物A可以抑制HTLV-1病毒的复制，对治疗成人T细胞白血病提供了新的候选药物，具有良好的应用前景。
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