益生菌株以及从其衍生的抗微生物肽
阅读：1014发布：2020-11-23
专利汇可以提供益生菌株以及从其衍生的抗微生物肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及具有 益生菌 性质的蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)菌株。蒙氏肠球菌菌株(ST4SA)产生对大范围的细菌表现出抗 微 生物 活性的抗微生物肽。本发明还提供了编码抗微生物肽(肽ST4SA)的分离的核苷酸序列。本发明的另一个方面涉及生产本发明的肽的方法，包括在微气生的条件下、在10℃到45℃之间的 温度 下、在营养培养基中培养蒙氏肠球菌菌株ST4SA，直到产生可回收量的所述肽，并回收所述肽。本发明的分离的肽可以在用于局部 治疗 的液体制剂或凝胶制剂中用作抗微生物剂，也可以在囊封于 聚合物 中之后用作抗微生物剂。，下面是益生菌株以及从其衍生的抗微生物肽专利的具体信息内容。
1.在ATCC保藏的保藏号为PTA-7278的蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)菌株ST4SA的基本上纯的培养物，所述培养物能够产生分离的肽SEQ.ID.NO.12。
2.治疗有效量的权利要求1中要求的培养的蒙氏肠球菌菌株在生产用于治疗细菌感染的药物中的应用，其中的细菌感染是动物或人类中由下面任何一种或多种细菌引起的感染：鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、清酒乳酸杆菌(Lactobacillus sakei)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、丙酸丙酸杆菌(Prop.Acidipropionici)、丙酸杆菌(Propionibacterium sp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、山羊链球菌(Streptococcus caprinus)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、或嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
6 9
3.权利要求2中要求的应用，其中培养的菌株用于施用的浓度为10 到10 个活细胞/毫升。
8
4.权利要求3中要求的应用，其中培养的菌株用于施用的浓度为10 个活细胞/毫升。
5.用于治疗动物或人类细菌感染方法中的物质或组合物，所述物质或组合物含有权利要求1中要求的培养的蒙氏肠球菌，并且所述方法包括给动物或人类施用治疗有效量的物质或组合物。
6 9
6.权利要求5中要求的物质或组合物，其中培养的菌株的施用浓度为10 到10 个活细胞/毫升。
8
7.权利要求6中要求的物质或组合物，其中培养的菌株的施用浓度为10 个活细胞/毫升。
8.权利要求5到7任一项中要求的物质或组合物，其中所述物质或组合物为液体制剂、软膏制剂、凝胶制剂、冻干粉剂、冻干喷雾剂或漱口水的形式。
9.权利要求8中要求的物质或组合物，其中细菌感染是由下面任何一种或多种细菌引起的感染：鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、清酒乳酸杆菌(Lactobacillus sakei)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、丙酸丙酸杆菌(Prop.Acidipropionici)、丙酸杆菌(Propionibacterium sp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、山羊链球菌(Streptococcus caprinus)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、或嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
10.益生菌组合物，其含有治疗有效浓度的权利要求1中要求的蒙氏肠球菌菌株ST4SA的生物纯培养物。
5 9
11.权利要求10中要求的益生菌组合物，其中包含的细菌菌株的浓度为10 到10 个活细胞/毫升益生菌组合物。
8
12.权利要求11中要求的益生菌组合物，其中包含的细菌菌株的浓度为2×10 个活细胞/毫升益生菌组合物。
13.权利要求10到12任一项中要求的益生菌组合物，其中所述组合物是液体、片剂、胶囊、甜食或口香糖的形式。
14.权利要求10到13任一项中要求的益生菌组合物在制备用于降低动物或人类中如下细菌水平的药物中的应用：
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、清酒乳酸杆菌(Lactobacillus sakei)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、丙酸丙酸杆菌(Prop.Acidipropionici)、丙酸杆菌(Propionibacterium sp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、山羊链球菌(Streptococcus caprinus)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、或嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
15.权利要求14中要求的应用，其中用于给动物或人类施用的益生菌组合物的终浓度
3 6
在10 到10 个活细胞/毫升之间。
16.权利要求15中要求的应用，其中用于给动物或人类施用的益生菌组合物的终浓度
5 6
在10 到10 个活细胞/毫升之间。
17.权利要求16中要求的应用，其中用于给动物或人类施用的益生菌组合物的终浓度
5
为3×10 个活细胞/毫升。
18.权利要求1中要求的蒙氏肠球菌菌株的生物纯培养物在制造用于降低动物或人类的如下细菌水平的益生菌中的应用：
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、清酒乳酸杆菌(Lactobacillus sakei)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、丙酸丙酸杆菌(Prop.Acidipropionici)、丙酸杆菌(Propionibacterium sp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、山羊链球菌(Streptococcus caprinus)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、或嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
6 9
19.权利要求18中要求的应用，其中培养的菌株用于施用的浓度为10 到10 个活细胞/毫升。
8
20.权利要求19中要求的应用，其中培养的菌株用于施用的浓度为10 个活细胞/毫升。
益生菌株以及从其衍生的抗微生物肽
[0001] 发明领域
[0002] 本发明涉及了从蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)菌株获得的肽以及蒙氏肠球菌菌株的益生组合物。更具体来说，本发明涉及从蒙氏肠球菌菌株获得的肽、编码肽的基
因以及生产肽的菌株和肽本身的各种不同的应用。
因以及生产肽的菌株和肽本身的各种不同的应用。
[0003] 发明背景
[0004] 乳酸菌在维持正常的胃肠微生物菌群的平衡中发挥重要的作用。饮食、压力、微生物感染和肠道疾病扰乱了微生物平衡，经常导致肠道中活的乳酸菌(特别是乳酸杆菌
(lactobacilli)和双歧杆菌(bifidobacteria))的数量减少。随后病原性细菌不受控制的
增殖则导致了腹泻和其它的临床病患，例如癌症、炎性疾病和溃疡性结肠炎。
(lactobacilli)和双歧杆菌(bifidobacteria))的数量减少。随后病原性细菌不受控制的
增殖则导致了腹泻和其它的临床病患，例如癌症、炎性疾病和溃疡性结肠炎。
[0005] 益生乳酸菌的一种重要性质是将细胞粘附于上皮细胞或肠粘膜上。这需要上皮细胞和细菌表面上的受体分子之间的强烈相互作用。益生细胞的附着防止了病原菌的附着，
并刺激了免疫系统。后者是通过与粘膜相互作用实现的，它又接着致敏了淋巴样细胞。益
生菌的另一个重要特征是在低的pH和高胆盐下可以存活。
并刺激了免疫系统。后者是通过与粘膜相互作用实现的，它又接着致敏了淋巴样细胞。益
生菌的另一个重要特征是在低的pH和高胆盐下可以存活。
[0006] 与人类和动物的肠道有关的双歧杆菌、乳酸杆菌和肠球菌的某些菌株已知生产细菌素(抗微生物肽)。这些肽的功能、以及它们在控制肠道中病原性细菌的增殖中的意义，
尚不确定。但是，从最近关于细菌素对抗革兰氏阴性细菌活性的报告中得出结论，对这些
肽以及它们与肠道病原菌的相互作用可能又有了新兴趣。许多近来的细菌素由通常存在
于肠道中的乳酸细菌产生，即嗜酸乳酸杆菌组群(Lactobacillus acidophilus-group)、罗
伊氏乳酸杆菌(Lactobacillusreuteri)、干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)、发酵乳酸
杆菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳酸
杆菌(Lactobacillus pentosus)、类干酪乳酸杆菌类干酪亚种(Lactobacillus paracasei
subsp.Paracasei)和粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)。
尚不确定。但是，从最近关于细菌素对抗革兰氏阴性细菌活性的报告中得出结论，对这些
肽以及它们与肠道病原菌的相互作用可能又有了新兴趣。许多近来的细菌素由通常存在
于肠道中的乳酸细菌产生，即嗜酸乳酸杆菌组群(Lactobacillus acidophilus-group)、罗
伊氏乳酸杆菌(Lactobacillusreuteri)、干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)、发酵乳酸
杆菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳酸
杆菌(Lactobacillus pentosus)、类干酪乳酸杆菌类干酪亚种(Lactobacillus paracasei
subsp.Paracasei)和粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)。
[0007] 本发明描述了能够抵抗肠道应激状态(例如低pH、胆盐、盐、胰腺酶)并产生广谱抗菌肽(肽ST4SA)的蒙氏肠球菌菌株。
[0008] 发明简述
[0009] 根据本发明的一个方面，提供了来自细菌蒙氏肠球菌的分离的肽，所述肽具有下面的氨基酸序列：
[0010] MSQVVGGKYYGNGVSCNKKGCSVDWGKAIGIIGNNSAANLATGGAAGWKS(SEQ.ID.NO.12)；
[0011] 其具有抗微生物活性的片段；
[0012] 其具有抗微生物活性的突变蛋白质和衍生物；
[0013] 其具有抗微生物活性的共价连接的桥接构建物；或
[0014] 具有抗微生物活性、与所述氨基酸序列具有超过大约95％同源性、优选超过85％同源性、最优选超过大约75％同源性的序列。
[0015] 根据本发明的另一个方面，提供了编码细菌蒙氏肠球菌的ST4SA肽的分离的核苷酸序列。
[0016] 分离的核苷酸序列可以包含下面的核苷酸序列：
[0017] ATGTCACAAGTAGTAGGTGGAAAATACTACGGTAATGGAGTCTCATGTAATAAAAAAGGGTGCAGTGTTGATTGGGGAAAAGCTATTGGCATTATTGGAAATAATTCTGCTGCGAATTTAGCTACTGGTGGAGCAGCTGGTTGG
AAAAGT(SEQ.ID.NO.11)；
AAAAGT(SEQ.ID.NO.11)；
[0018] 其互补序列；
[0019] 其能够在其表达后产生具有抗微生物活性的肽的片段；或
[0020] 在严紧的杂交条件下与其杂交的核苷酸序列。
[0021] 严紧的杂交条件对应于2 x SSC、0.1％SDS在50℃的清洗。
[0022] 核苷酸序列可以包含在载体中，例如质粒形式的表达载体或转移载体。载体可以包含编码选择性属性、例如抗生素抗性选择属性的核酸序列或其它标记物基因。因此，本发
明扩展到适合于转化微生物宿主细胞的重组质粒，所述质粒包含的质粒载体中已经插入编
码本发明的抗微生物肽的核苷酸序列。
明扩展到适合于转化微生物宿主细胞的重组质粒，所述质粒包含的质粒载体中已经插入编
码本发明的抗微生物肽的核苷酸序列。
[0023] 细胞可以是原核细胞或真核细胞，例如细菌细胞或酵母细胞。核苷酸序列可以暂时或组成性整合在细胞的基因组中。因此，本发明扩展到包含重组质粒的转化的微生物细
胞，所述质粒包含的质粒载体中已经插入编码本发明的抗微生物肽的核苷酸序列。
胞，所述质粒包含的质粒载体中已经插入编码本发明的抗微生物肽的核苷酸序列。
[0024] 根据本发明的另一个方面，提供了来自细菌蒙氏肠球菌的分离的肽，该肽具有抗微生物活性。
[0025] 产生上面鉴定的分离的肽的细菌蒙氏肠球菌已经保藏在ATCC，保藏号为PTA-7278。产生上面鉴定的分离的肽的细菌蒙氏肠球菌的具体菌株已经被命名为菌株
ST4SA。因此，本发明扩展到在ATCC的保藏号为PTA-7278的蒙氏肠球菌菌株ST4SA的基本
上纯的培养物，所述培养物在含有可同化的碳源、氮源和无机物质源的营养培养基中发酵
后，能够产生可回收量的ST4SA肽。
ST4SA。因此，本发明扩展到在ATCC的保藏号为PTA-7278的蒙氏肠球菌菌株ST4SA的基本
上纯的培养物，所述培养物在含有可同化的碳源、氮源和无机物质源的营养培养基中发酵
后，能够产生可回收量的ST4SA肽。
[0026] 本发明的另一个方面涉及用于生产本发明的肽的方法，包括在微气生条件下、在10℃到45℃之间的温度下、在营养培养基中培养蒙氏肠球菌菌株ST4SA，直到产生可回收
量的所述肽，并回收所述肽。优选培养在大约37℃的温度下进行。
量的所述肽，并回收所述肽。优选培养在大约37℃的温度下进行。
[0027] 营养培养基可以选自包括下面的任何一类或多类：玉米浆、乳清粉、MRS肉汤、酵母提取物和糖蜜。优选营养培养基是pH6到6.5的MRS肉汤。
[0028] 本发明的分离的肽可以用作液体制剂或凝胶制剂中的抗微生物剂，用于例如耳部感染如中耳感染还有咽喉、眼睛或皮肤感染的局部治疗。液体制剂也可以用作膳食的液体
补加剂。肽还可以另外用作喷雾剂中的抗微生物剂，用于治疗例如鼻窦感染、鼻窦炎、扁桃
体炎、咽喉感染或鼻炎。肽也可以是冻干粉的形式。
补加剂。肽还可以另外用作喷雾剂中的抗微生物剂，用于治疗例如鼻窦感染、鼻窦炎、扁桃
体炎、咽喉感染或鼻炎。肽也可以是冻干粉的形式。
[0029] 分离的肽也可以囊封在聚合物中后用作抗微生物剂。本发明按照其另一个方面，扩展到其中掺有抗微生物量的ST4SA肽的聚合物。然后可以将该聚合物用在制剂中用于感
染例如皮肤感染的局部治疗，或可以用于掺入到移植物或医用装置中，例如耳置管、导管、
造瘘管和袋、支架、缝合材料、卫生产品例如女性卫生产品、隐形眼镜、隐形眼镜溶液，或用
于掺入到创伤敷料中。抗微生物肽囊封在聚合物中导致抗微生物肽的缓慢释放以及对微生
物感染的治疗时间延长。
染例如皮肤感染的局部治疗，或可以用于掺入到移植物或医用装置中，例如耳置管、导管、
造瘘管和袋、支架、缝合材料、卫生产品例如女性卫生产品、隐形眼镜、隐形眼镜溶液，或用
于掺入到创伤敷料中。抗微生物肽囊封在聚合物中导致抗微生物肽的缓慢释放以及对微生
物感染的治疗时间延长。
[0030] 分离的肽可以以每毫升聚合物100 000 AU(任意单位)到300 000AU的浓度被包含，优选为大约每毫升聚合物200 000 AU。
[0031] 肽还可以通过掺入到软膏、洗液或霜膏制剂中用作抗微生物剂。这些软膏、洗液或霜膏制剂可以用于治疗感染。肽还可以进一步通过掺入到液体制剂例如隐形眼镜清洗液中
用作抗微生物剂，或者它可以掺入到隐形眼镜本身中。因此，本发明作为其另一方面，提供
了含有本发明的抗微生物肽的抗微生物软膏、洗液或霜膏。
用作抗微生物剂，或者它可以掺入到隐形眼镜本身中。因此，本发明作为其另一方面，提供
了含有本发明的抗微生物肽的抗微生物软膏、洗液或霜膏。
[0034] 根据本发明的另一个方面，提供了包含生物纯培养物的益生组合物，所述培养物中含有治疗有效浓度的蒙氏肠球菌菌株ST4SA。该菌株被包含的浓度为每毫升益生组合物
6 9 8
大约10 到10、优选大约10 个活细胞(cfu)。
6 9 8
大约10 到10、优选大约10 个活细胞(cfu)。
[0035] 在本发明的一种形式中，益生组合物可以用于减少动物或人类中的病原性细菌。
[0036] 在本发明的另一种形式中，益生组合物可以用于减少动物或人类中的病原性病毒。
[0037] 益生组合物可以采取粉末、液体、凝胶、片剂的形式，或者可以掺入到食品中。液体形式的益生组合物可以用作膳食的液体补加剂。菌株可以被包含的浓度为每毫升液体补加
6 9 8
剂大约10 到10、优选大约10 个活细胞(cfu)。
6 9 8
剂大约10 到10、优选大约10 个活细胞(cfu)。
[0038] 益生组合物可以以103到106cfu/ml之间、优选105到106cfu/ml之间、最优选大约5
3x10cfu/ml的终浓度给动物或人类施用。
3x10cfu/ml的终浓度给动物或人类施用。
[0039] 根据本发明的另一个方面，提供了在动物或人类中治疗细菌感染病症的方法，该方法包括将动物或人类的感染区域暴露于选自包含下面任何一种或多种的物质或组合物
的步骤：
的步骤：
[0040] 药物有效量的本发明的蒙氏肠球菌菌株；以及
[0041] 药物有效量的本发明的抗微生物肽。
[0042] 因此，本发明还扩展到使用治疗有效量的本发明的蒙氏肠球菌制造用于治疗动物或人类细菌感染的方法中的药物。
[0043] 该方法还包括将细菌菌种暴露于浓度为100 000到300 000 AU/ml、优选大约200000 AU/ml的本发明的抗微生物肽的步骤。
[0044] 本发明还扩展到使用治疗有效量的本发明抗微生物肽制造用于治疗动物或人类细菌感染的方法中的药物。
[0045] 本发明还提供了用于治疗动物或人类细菌感染的方法中的物质或组合物，所述物质或组合物包含本发明的蒙氏肠球菌菌株，并且所述方法包括给动物或人类施用治疗有效
量的物质或组合物。
量的物质或组合物。
[0046] 本发明还提供了用于治疗动物或人类细菌感染的方法中的物质或组合物，所述物质或组合物包含本发明的抗微生物肽，并且所述方法包括给动物或人类施用治疗有效量的
物质或组合物。
物质或组合物。
[0047] 细菌感染可以是由下面的任何一种或多种细菌引起的感染：鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、酪丁酸梭菌(Clostridium
tyrobutyricum)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、大肠埃希氏菌(Escherichia
coli)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肉
葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、山羊链球菌(Streptococcus caprinus)、粪链球
菌(肠球菌)(Streptococcus(Enterococcus)faecalis)或肺炎链球菌(Streptococcus
pneumoniae)。
tyrobutyricum)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、大肠埃希氏菌(Escherichia
coli)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肉
葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、山羊链球菌(Streptococcus caprinus)、粪链球
菌(肠球菌)(Streptococcus(Enterococcus)faecalis)或肺炎链球菌(Streptococcus
pneumoniae)。
[0048] 根据本发明的又一个方面，提供了抑制细菌菌种生长的方法，该方法包括将细菌菌种暴露于有效量的本发明抗微生物肽的步骤。细菌菌种可以选自：
[0049] 鲍曼不动杆菌、蜡状芽孢杆菌、酪丁酸梭菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、无害李斯特菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊链球菌、粪链
球菌(肠球菌)和肺炎链球菌。
球菌(肠球菌)和肺炎链球菌。
[0050] 该方法可以包括将细菌菌种暴露于浓度为100 000到300 000AU/ml、优选大约200 000 AU/ml的本发明抗微生物肽的步骤。
[0051] 根据本发明的一个方面，提供了来自细菌蒙氏肠球菌的分离的转运蛋白肽，所述肽具有SEQ.ID.NO.14的氨基酸序列；
[0052] 其片段；
[0053] 其突变蛋白和衍生物；或
[0054] 具有抗微生物活性、与所述氨基酸序列具有超过大约90％同源性、优选超过80％同源性、最优选超过大约70％同源性的序列。
[0055] 根据本发明的另一个方面，提供了编码细菌蒙氏肠球菌的ST4SA转运蛋白肽的分离的核苷酸序列。该分离的核苷酸序列可以包含SEQ.ID.NO.13的核苷酸序列；
[0056] 其互补序列；
[0057] 其片段；或
[0058] 在严紧的杂交条件下与其杂交的核苷酸序列。
[0059] 根据本发明的一个方面，提供了来自细菌蒙氏肠球菌的分离的免疫性肽，所述肽具有SEQ.ID.NO.16的氨基酸序列；
[0060] 其片段；
[0061] 其突变蛋白和衍生物；或
[0062] 具有抗微生物活性、与所述氨基酸序列具有超过大约90％同源性、优选超过80％同源性、最优选超过大约70％同源性的序列。
[0063] 根据本发明的另一个方面，提供了编码细菌蒙氏肠球菌的ST4SA免疫性/粘附性肽的分离的核苷酸序列。该分离的核苷酸序列可以包含SEQ.ID.NO.15的核苷酸序列；
[0064] 其互补序列；
[0065] 其片段；或
[0066] 在严紧的杂交条件下与其杂交的核苷酸序列。
[0067] 本发明根据其另一个方面，扩展到选自SEQ.ID.NO.1到SEQ.ID.NO.10的引物。因此，本发明也扩展到选自下面的引物对：
[0068] 含有SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的引物对；
[0069] 含有SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4的引物对；
[0070] 含有SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.NO.6的引物对；
[0071] 含有SEQ.ID.NO.7和SEQ.ID.NO.8的引物对；和
[0072] 含有SEQ.ID.NO.9和SEQ.ID.NO.10的引物对。
[0073] 本发明还扩展到在鉴定蒙氏肠球菌中使用SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的引物对。
[0075] 为了更好地理解本发明并显示本发明是如何实施的，现在将参考附图和表，仅仅作为示例，其中：
[0077] 图2是琼脂糖凝胶照片，显示了使用属特异性引物获得的PCR产物(DNA片段)；获得了对肠球菌特异的112bp的属特异性DNA条带；
[0078] 图3是琼脂糖凝胶照片，显示了使用种特异性引物获得的PCR产物(DNA片段)；获得了对蒙氏肠球菌特异的306bp的种特异性DNA条带；
[0079] 图4是通过凝胶过滤(AKTA纯化仪)分离的肽AT4SA的图示；
[0080] 图5是显示肽ST4SA位置的SDS聚丙烯酰胺凝胶的照片；
[0081] 图6A是显示了蒙氏肠球菌ST4SA的质粒图谱的琼脂糖凝胶照片；
[0082] 图6B是显示菌株ST4SA的染色体(基因组)上结构基因位置的Southern印迹图；
[0083] 图7是蒙氏肠球菌肽ST4SA的氨基酸序列的图示；
[0084] 图8是肽ST4SA的结构基因(A)、转运蛋白基因(B)和免疫性基因(C)的DNA序列；
[0085] 图9A和9B显示了生长培养基成分对肽ST4生产的影响；
[0086] 图10是在MRS肉汤中生产ST4SA肽的图示；
[0087] 图11是琼脂糖凝胶照片，显示可能含有推定的粘附基因的DNA片段；
[0088] 图12是显示了肽ST4SA(悬浮在无菌蒸馏水中的粗制提取物)在不同温度下的稳定性的图；
[0089] 图13是在琼脂板上记录到的针对假单胞菌(Pseudomonas sp.)的抑菌圈的照片；
[0091] 图15是显示肺炎链球菌(病原体27)生长抑制的图；
[0092] 图16是显示肺炎链球菌(病原体29)生长抑制的图；
[0093] 图17是显示肺炎克雷伯氏杆菌(病原体30)生长抑制的图；
[0094] 图18是显示中耳分离物(病原体40)生长抑制的图；
[0095] 图19是显示了中耳分离物(病原体BW)生长抑制的图；
[0096] 图20是显示了中耳分离物(病原体E)生长抑制的图；
[0097] 图22是显示中耳分离物(病原体GW)生长抑制的图；
[0098] 图23是显示中耳分离物(病原体HW)生长抑制的图；
[0099] 图24是显示菌株ST4SA在无害李斯特菌LMG 13568存在下的生长和产生肽ST4SA的图。符号：-◆-＝菌株ST4SA在无害李斯特菌LMG13568存在下的生长；-■-＝无害李
斯特菌LMG 13568的生长抑制；-●-＝pH变化；＝肽ST4SA的生产；
斯特菌LMG 13568的生长抑制；-●-＝pH变化；＝肽ST4SA的生产；
[0100] 图25是为了评估益生菌株ST4SA而发展的胃肠模型(GIM)的示意图；
[0101] 图26是示意图，显示了用万古霉素阻断脂质II靶位点及其对肽ST4SA的作用方式(抗微生物活性)的影响。泄露％是指通过DNA和β-半乳糖苷酶活性水平的增加记录
到的细胞质泄露；
到的细胞质泄露；
[0102] 图27是导入到肽中共价连接氨基酸9(半胱氨酸)和14(半胱氨酸)的二硫桥的示意图；
[0103] 图28显示了ST4SA的疏水性图；
[0104] 图29显示了用ST4SA攻击单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)和在体外GIT模型中存活的结果；
[0105] 图30显示了蒙氏肠球菌ST4SA在MRS肉汤和CSL培养基中的生长曲线；
[0106] 图31显示了放大60倍的溶血素和伊红染色的切片：(A)对照结肠(B)喂饲菌株ST4SA的结肠(C)对照回肠(D)喂饲菌株ST4SA的回肠(E)对照肝脏(F)喂饲菌株ST4SA
的肝脏(G)对照脾脏(H)喂饲菌株ST4SA的脾脏；
的肝脏(G)对照脾脏(H)喂饲菌株ST4SA的脾脏；
[0107] 图32显示了每个实验大鼠组每日测量的体重的图示；箭头表示李斯特菌感染的时间；
[0108] 图33显示了每日测量大鼠饲料摄入的图示；
[0109] 图34显示了每个实验大鼠组每日测量的水消耗的图示；
[0110] 图35显示了施用菌株ST4、菌株423和水对照的每个实验大鼠组的粪便水分含量的图示；以及
[0111] 图36显示了在感染前1天和感染后2天从每个实验大鼠组收集到的粪便样品中李斯特菌的计数。
[0112] 表1 显示了菌株ST4SA的表型特征(糖发酵反应)；
[0113] 表2 显示了菌株ST4SA的区别特征；
[0114] 表3 显示了酶、温度、pH和去污剂对肽ST4SA的影响；
[0115] 表4 显示了肽ST4SA的活性谱；
[0116] 表5 显示了肽ST4SA对纸盘的活性；
[0117] 表6 显示了肽ST4SA与常用的抗生素的活性比较；
[0118] 表7 显示了肽ST4SA与病原体的粘附；
[0119] 表8 显示了在用肽ST4SA处理病原体后记录到的细胞外DNA；
[0120] 表9 显示了在用肽ST4SA处理病原体后记录到的β-半乳糖苷酶活性；
[0121] 表10 显示了GIM的操作(计算机化的)；
[0122] 表11 显示了GIM中菌株ST4SA的存活和肽ST4SA的生产—单核细胞增多性李斯特菌被用作靶生物体(病原体)。值是三次实验的平均值。使用的营养基分别是NAN
Pelargon(Nestlé)和MRS(De ManRogosa medium，Biolab)；
Pelargon(Nestlé)和MRS(De ManRogosa medium，Biolab)；
[0123] 表12 显示了菌株ST4SA的抗生素抗性；
[0125] 表14 显示了被分析的毒力因子；
[0126] 表15 显示了通过平板计数(对照)的菌株ST4SA与Caco-2细胞系的粘附；
[0127] 表16 显示了菌株ST4SA和单核细胞增多性李斯特菌的竞争性排斥；
[0128] 表17 显示了施用菌株ST4SA、Lactovita或无补加物的水的大鼠的体重数字。
[0129] 表18 显示了在(A)107天的Lactovita研究和(B)50天的菌株ST4SA研究期间，雄性Wistar大鼠的粪便样品中β-葡糖醛酸糖苷酶活性。值是每2小时释出的对硝基苯
酚的mM数。括号中显示的是标准误差值；
酚的mM数。括号中显示的是标准误差值；
[0130] 表19显示了在MRSf(MRS滤液)培养基中肽ST4SA的纯化；
[0131] 表20 显示了纯CSL、糖蜜和CWp作为生产肽ST4SA的生长培养基的结果；
[0132] 表21 显示了使用CSL和CWp作为成分确定哪种培养基对肽ST4SA的生产有最显著影响的全因子设计(FFD)；
[0133] 表22 显示了在CSL中补加MRS成分用于优化ST4SA活性的结果；
[0134] 表23 显示了高和低浓度的MRS成分和CSL；
[0135] 表24 显示了210-5FrFD设计；
[0136] 表25 显示了210-5FrFD设计的方差分析表；
[0137] 表26 显示了具有3个中心点、用于确定CSL和YE浓度的22FFD；
[0138] 表27 显示了在发酵过程中碳的摄入；
[0139] 表28 显示了蒙氏肠球菌ST4对抗生素和抗炎药物的抗性试验的结果；
[0140] 表29 显示了抗生素和抗炎药物对ST4SA与Caco-2细胞粘附的影响。
[0141] 发明详述
[0142] 本发明描述了抵抗肠道应激条件(例如低pH、胆盐、盐、胰腺酶)并产生广谱抗细菌肽、也就是肽ST4SA的蒙氏肠球菌菌株。产生肽ST4SA的细菌蒙氏肠球菌已经保藏在
ATCC(美国典型培养物保藏中心)，保藏号为PTA-7278。已经观察到了针对许多革兰氏阳
性和革兰氏阴性细菌的活性，它们中的大多数是从中耳感染和肠道中分离到的。被抑制的
细菌的例子如下：鲍曼不动杆菌、蜡状芽孢杆菌、酪丁酸梭菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、
肺炎克雷伯氏杆菌、无害李斯特菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊链球
菌、粪链球菌(肠球菌)、肺炎链球菌，以及从感染的中耳流体样品中分离到的许多未鉴定
的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的临床菌株。这是很大的活性谱，特别是针对如此多样的
人类病原体。
ATCC(美国典型培养物保藏中心)，保藏号为PTA-7278。已经观察到了针对许多革兰氏阳
性和革兰氏阴性细菌的活性，它们中的大多数是从中耳感染和肠道中分离到的。被抑制的
细菌的例子如下：鲍曼不动杆菌、蜡状芽孢杆菌、酪丁酸梭菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、
肺炎克雷伯氏杆菌、无害李斯特菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊链球
菌、粪链球菌(肠球菌)、肺炎链球菌，以及从感染的中耳流体样品中分离到的许多未鉴定
的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的临床菌株。这是很大的活性谱，特别是针对如此多样的
人类病原体。
[0143] 已经描述了许多广谱的具有针对革兰氏阴性细菌的活性的抗菌肽，例如戊糖乳酸杆菌产生的戊糖乳杆菌素(pentocin)35d、戊糖乳酸杆菌ST151BR产生的细菌素ST151BR、
类干酪乳酸杆菌类干酪亚种产生的细菌素、嗜热链球菌(Streptococcus termophylus)产
生的耐热革裥菌素、粪肠球菌产生的肽AS-48、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KCA2386
产生的细菌素、以及粪肠球菌产生的肠道菌素CRL35。但是，这些肽的活性谱比从肽ST4SA
记录到的要窄得多，这可以从上面列出的对肽ST4SA敏感的菌种中看出。广谱的、特别是针
对病原性细菌的活性，使肽ST4SA理想地用于控制细菌性感染，特别是中耳感染(因为肽对
于各种各样的中耳病原菌具有活性)，以及参与伤口继发感染的病原体(肽抑制了许多这
些病原体的生长)。从感染的中耳流体分离到的病原体是鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、肺
炎克雷伯氏杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肉葡萄球菌、肺炎链球菌以及许多未鉴
定的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。
类干酪乳酸杆菌类干酪亚种产生的细菌素、嗜热链球菌(Streptococcus termophylus)产
生的耐热革裥菌素、粪肠球菌产生的肽AS-48、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KCA2386
产生的细菌素、以及粪肠球菌产生的肠道菌素CRL35。但是，这些肽的活性谱比从肽ST4SA
记录到的要窄得多，这可以从上面列出的对肽ST4SA敏感的菌种中看出。广谱的、特别是针
对病原性细菌的活性，使肽ST4SA理想地用于控制细菌性感染，特别是中耳感染(因为肽对
于各种各样的中耳病原菌具有活性)，以及参与伤口继发感染的病原体(肽抑制了许多这
些病原体的生长)。从感染的中耳流体分离到的病原体是鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、肺
炎克雷伯氏杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肉葡萄球菌、肺炎链球菌以及许多未鉴
定的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。
[0144] 材料和方法
[0145] 菌株ST4SA的分离以及到种水平的鉴定
[0146] 将在灭菌蒸馏水中浸泡了4小时的从大豆获得的大豆提取物连续稀释，铺在MRS琼脂(Biolab，Biolab Diagnostics，Midrand，SA)上，补加了50mg/l纳他霉素(
，Gist-brocades，B.V.，Delft，荷兰)以防止真菌生长。将平板在30℃和37℃温育2天。
，Gist-brocades，B.V.，Delft，荷兰)以防止真菌生长。将平板在30℃和37℃温育2天。
[0147] 从具有50到300cfu(菌落形成单位)之间的平板随机选择菌落，并通过用第二层补加了 (50mg/l)的MRS琼脂覆盖它们筛选抗微生物活性。将平板在缺氧烧瓶中
(Oxoid，New Hampshire，英国)、在存在气体发生试剂盒(Oxoid)的情况下，在30℃和37℃
温育48h。将菌落用第三层(大约10ml)半固体的(1.0％琼脂，w/v)BHI培养基(Merck，
Darmstadt，德国)覆盖，所述培养基中分别补加了1ml干酪乳酸杆菌、粪肠球菌、金黄色葡
萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏杆菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的活性生长细胞
(大约106cfu/ml)。平板在37℃温育24h。
(Oxoid，New Hampshire，英国)、在存在气体发生试剂盒(Oxoid)的情况下，在30℃和37℃
温育48h。将菌落用第三层(大约10ml)半固体的(1.0％琼脂，w/v)BHI培养基(Merck，
Darmstadt，德国)覆盖，所述培养基中分别补加了1ml干酪乳酸杆菌、粪肠球菌、金黄色葡
萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏杆菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的活性生长细胞
(大约106cfu/ml)。平板在37℃温育24h。
[0148] 菌落之一抑制了包含在测试组(表4)中的最多种病原体，将其重新接种到MRS肉汤(Biolab)中，然后重新划线培养以获得纯培养物。分离物被命名为菌株ST4SA。通过使
用琼脂斑点实验(agar-spot test)方法证实了抗微生物活性。
用琼脂斑点实验(agar-spot test)方法证实了抗微生物活性。
[0149] 通过扫描电子显微镜(SEM)研究了菌株ST4SA的细胞形态(参见图1)。10ml菌株ST4SA的指数初期(OD600nm＝0.2)培养物被离心收获，用无菌蒸馏水洗5次(3000 x g，
10min，4℃)。将沉淀重新悬浮在500μl无菌MilliQ水中(Waters，Millipore)，然后进行
显微镜观察。
10min，4℃)。将沉淀重新悬浮在500μl无菌MilliQ水中(Waters，Millipore)，然后进行
显微镜观察。
[0150] 通过生理学(表2)和生物化学性质来完成进一步的鉴定。在胰酶大豆肉汤(Merck)上测试色素形成。还进行了运动性试验。糖发酵反应(表1)使用API 50 CHL和
API 20 Strep试纸(Biomérieux，Marcy-l’Etiole，法国)记录，并与为肠球菌列出的反应
进行比较。
API 20 Strep试纸(Biomérieux，Marcy-l’Etiole，法国)记录，并与为肠球菌列出的反应
进行比较。
[0151] 表1
[0152]化合物/衍生物 蒙氏肠球菌ST4SA发酵
对照
甘油 +
赤藓糖醇
D-阿拉伯糖
L-阿拉伯糖 ++
核糖 +++
D-木糖 ++
L-木糖
侧金盏糖醇
甲基木糖苷
半乳糖 ++
D-葡萄糖 +++
D-果糖 +++
D-甘露糖 ++
L-山梨糖
鼠李糖 ++
卫矛醇
肌醇
甘露糖醇 ++
山梨糖醇 ++
甲基-D-甘露糖苷 ++
甲基-D-葡萄糖苷
乙酰葡萄糖胺e ++
扁桃苷 +++
熊果苷 +++
七叶苷 +++
水杨苷 +++
纤维二糖 +++
麦芽糖 +++
乳糖 +++
蜜二糖 ++
蔗糖 +++
海藻糖 ++
菊糖
松三糖
D-棉子糖
阿米酮 +
糖原
木糖醇
B 龙胆二糖 +++
D-松二糖
D-来苏糖
D-塔格糖
D-岩藻糖
L-岩藻糖
D-阿拉伯糖醇
L-阿拉伯糖醇
葡糖酸
2 Ceto-葡萄糖酸
5 Ceto-葡萄糖酸
对照
甘油 +
赤藓糖醇
D-阿拉伯糖
L-阿拉伯糖 ++
核糖 +++
D-木糖 ++
L-木糖
侧金盏糖醇
甲基木糖苷
半乳糖 ++
D-葡萄糖 +++
D-果糖 +++
D-甘露糖 ++
L-山梨糖
鼠李糖 ++
卫矛醇
肌醇
甘露糖醇 ++
山梨糖醇 ++
甲基-D-甘露糖苷 ++
甲基-D-葡萄糖苷
乙酰葡萄糖胺e ++
扁桃苷 +++
熊果苷 +++
七叶苷 +++
水杨苷 +++
纤维二糖 +++
麦芽糖 +++
乳糖 +++
蜜二糖 ++
蔗糖 +++
海藻糖 ++
菊糖
松三糖
D-棉子糖
阿米酮 +
糖原
木糖醇
B 龙胆二糖 +++
D-松二糖
D-来苏糖
D-塔格糖
D-岩藻糖
L-岩藻糖
D-阿拉伯糖醇
L-阿拉伯糖醇
葡糖酸
2 Ceto-葡萄糖酸
5 Ceto-葡萄糖酸
[0153]
[0154] 表2
[0155]特征 菌株ST4SA
来自葡萄糖的CO2 -
在10℃生长 +
在45℃生长 +
在6.5％NaCl中生长 +
在18％NaCl中生长 -
在pH4.4下生长 +
在pH9.6下生长 +
乳酸构型 L
来自葡萄糖的CO2 -
在10℃生长 +
在45℃生长 +
在6.5％NaCl中生长 +
在18％NaCl中生长 -
在pH4.4下生长 +
在pH9.6下生长 +
乳酸构型 L
[0156] 进一步的鉴定是通过使用对肠球菌(图2)和蒙氏肠球菌(图3)特异的引物产生的DNA条带带型来进行的。50bp的DNA片段(Amersham Bioscience，UK Limited，UK)被
用作标记物。用于产生306bp片段(显示在图3中)的引物根据16S rDNA上适合的保守
区设计。
用作标记物。用于产生306bp片段(显示在图3中)的引物根据16S rDNA上适合的保守
区设计。
[0157] SEQ.ID.NO.1：正向引物：AACGAGCGCAACCC；
[0158] SEQ.ID.NO.2：反向引物：GACGGGCGGTGTGTAC
[0159] DNA片段的测序显示出与GenBank中保守的16S rDNA片段具有98％的同源性。
[0160] 抗微生物活性的表达
[0161] 抗微生物活性被表示为每毫升无细胞上清液的任意单位(AU)。1AU被定义为显示出清晰的生长抑制圈的最高稀释度的倒数，计算如下：
[0162] abx100，其中“a”表示稀释因子，“b”是产生直径至少为2mm的抑菌圈的最后稀释度。活性被乘以100表示为每毫升。干酪乳酸杆菌LHS被用作指示菌株。
[0163] 抗微生物物质的性质
[0164] 将菌株ST4SA在MRS肉汤(Biolab)中于30℃培养24到48小时。收获细胞(8000x g，4℃，15分钟)，用6M NaOH将无细胞上清液调整到pH6.0。取每种上清液1ml，用0.1mg/
ml(终浓度)过氧化氢酶、1mg/ml和0.1mg/ml(终浓度)的蛋白酶K(Roche，Indianopolis，
IN，USA)、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶(BoehringerMannheim GmbH，德
国)分别进行处理。温育后，将酶热失活(100℃3分钟)，并按照以前的描述测试抗微生物
活性。结果列于表3中。
ml(终浓度)过氧化氢酶、1mg/ml和0.1mg/ml(终浓度)的蛋白酶K(Roche，Indianopolis，
IN，USA)、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶(BoehringerMannheim GmbH，德
国)分别进行处理。温育后，将酶热失活(100℃3分钟)，并按照以前的描述测试抗微生物
活性。结果列于表3中。
[0166] 表3
[0167]处理 肽ST4SA
酶：
α-淀粉酶 +
蛋白酶K -
胃蛋白酶 -
链霉蛋白酶 -
pH：
2.0-12.0 +
加热：
30，60，100℃ 进行10 min +
30，60，100℃ 进行30 min +
30，60，100℃ 进行90 min +
121℃进行 20 min -
去污剂(1％)：
SDS +
Tween 20，Tween 80 +
尿素 +
Triton X-100 +
Triton X-114 _
EDTA：
0.1mM，1.0mM，2.0mM +
酶：
α-淀粉酶 +
蛋白酶K -
胃蛋白酶 -
链霉蛋白酶 -
pH：
2.0-12.0 +
加热：
30，60，100℃ 进行10 min +
30，60，100℃ 进行30 min +
30，60，100℃ 进行90 min +
121℃进行 20 min -
去污剂(1％)：
SDS +
Tween 20，Tween 80 +
尿素 +
Triton X-100 +
Triton X-114 _
EDTA：
0.1mM，1.0mM，2.0mM +
[0168] 符号：-＝无活性；+＝活性圈直径至少5mm。
[0169] 在分开的实验中，肽ST4SA样品被调整到pH在2-12的范围内，在37℃温育30分钟，中和到pH 7，然后测试抗微生物活性(表3)。
[0170] 肽ST4SA的分离和纯化
[0171] 将培养24小时的菌株ST4SA的培养物接种(2％，v/v，OD600nm＝8.0)到MRS肉汤(Biolab)中。在37℃不搅拌培养20小时。收集细胞(8 000 x g，10min，4℃)，用80％饱
和的硫酸铵将肽从无细胞上清液中沉淀出来。将沉淀重新悬浮在十分之一体积的25mM乙
酸铵中(pH6.5)，使用1000Da截留透析膜(Spectrum Inc.，CA，USA)对蒸馏水进行脱盐，并
上样到SepPak C18柱(Water Millipore，MA，USA)。将柱子用含有20％(v/v)异丙醇的
25mM乙酸铵(pH 6.5)洗涤，然后用含有40％(v/v)异丙醇的25mM乙酸铵(pH 6.5)将细菌
素洗脱。在真空下干燥(Speed-Vac；Savant)后，将级份合并，溶解在pH 6.5的50mM磷酸
tm
盐缓冲液中。在与 纯化仪(Amersham)相连的Superdex 75柱(Amersham Pharmacia
Biotech)中，通过凝胶过滤色谱将活性级份进一步分离(图4)。用pH6.5的50mM磷酸盐
缓冲液和400mM NaCl将肽从柱子上洗脱。分别在254nm和280nm检测肽。将含有活性肽
的级份收集、真空下干燥，并储存在-20℃。活性测试使用琼脂斑点方法进行。
和的硫酸铵将肽从无细胞上清液中沉淀出来。将沉淀重新悬浮在十分之一体积的25mM乙
酸铵中(pH6.5)，使用1000Da截留透析膜(Spectrum Inc.，CA，USA)对蒸馏水进行脱盐，并
上样到SepPak C18柱(Water Millipore，MA，USA)。将柱子用含有20％(v/v)异丙醇的
25mM乙酸铵(pH 6.5)洗涤，然后用含有40％(v/v)异丙醇的25mM乙酸铵(pH 6.5)将细菌
素洗脱。在真空下干燥(Speed-Vac；Savant)后，将级份合并，溶解在pH 6.5的50mM磷酸
tm
盐缓冲液中。在与 纯化仪(Amersham)相连的Superdex 75柱(Amersham Pharmacia
Biotech)中，通过凝胶过滤色谱将活性级份进一步分离(图4)。用pH6.5的50mM磷酸盐
缓冲液和400mM NaCl将肽从柱子上洗脱。分别在254nm和280nm检测肽。将含有活性肽
的级份收集、真空下干燥，并储存在-20℃。活性测试使用琼脂斑点方法进行。
[0172] 大小测定
[0173] 将菌株ST4SA在MRS肉汤(Biolab)中于30℃生长20小时。通过离心(8 000 x g，10min，4℃)收获细胞，用80％饱和的硫酸铵将肽ST4SA从无细胞上清液中沉淀出来。将沉
淀重新悬浮在十分之一体积的25mM乙酸铵中(pH6.5)，使用1000Da截留透析膜(Spectrum
Inc.，CA，USA)对蒸馏水进行脱盐，并通过tricine-SDS-PAGE进行分离(图5A)。使用了大
小范围从2.35到46kDa的低分子量标记物(AmershamInternational，UK)。将凝胶固定，
一半用干酪乳酸杆菌LHS覆盖(106cfu/mL)，包埋在脑心浸液(BHI)琼脂(Biolab)中，以确
定活性细菌素的位置(图5B)。
淀重新悬浮在十分之一体积的25mM乙酸铵中(pH6.5)，使用1000Da截留透析膜(Spectrum
Inc.，CA，USA)对蒸馏水进行脱盐，并通过tricine-SDS-PAGE进行分离(图5A)。使用了大
小范围从2.35到46kDa的低分子量标记物(AmershamInternational，UK)。将凝胶固定，
一半用干酪乳酸杆菌LHS覆盖(106cfu/mL)，包埋在脑心浸液(BHI)琼脂(Biolab)中，以确
定活性细菌素的位置(图5B)。
[0174] 肽ST4SA的细胞毒性试验
[0175] 为了确定肽ST4SA是否具有细胞毒性性质，将的单层猴肾Vero细胞满底的三个孔在组织培养板中生长48小时，然后暴露于各种不同浓度的抗微生物肽中。温育48小时后，
通过用四唑鎓盐MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-γ-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)(Sigma)处理
细胞，测试细胞存活性。记录通过琥珀酸脱氢酶水解MTT后形成的蓝色产物(甲臜)的产
生。
通过用四唑鎓盐MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-γ-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)(Sigma)处理
细胞，测试细胞存活性。记录通过琥珀酸脱氢酶水解MTT后形成的蓝色产物(甲臜)的产
生。
[0176] 50％细胞毒性水平(CC50)被定义为使细胞存活性降低50％所需的肽浓度(μg/ml)。根据CC50结果(细胞毒性水平)，没有记录到细胞毒性，也就是说，肽的CC50为零(0)。
[0177] 质粒分离
[0178] 分离总DNA。分离质粒DNA，然后将DNA通过CsCl密度梯度离心进一步纯化。将DNA在琼脂糖凝胶上分离(图6)。用EcoRI和HindIII(Promega，Madison，USA)消化的
λDNA被用作分子量标记物。
λDNA被用作分子量标记物。
[0179] 质粒消除
[0180] 进行了消除实验。将蒙氏肠球菌ST4SA的细胞在新生霉素(1-25μg ml-1)存在下在37℃温育72小时。将在最高浓度的新生霉素中生长的培养物用无菌盐水连续稀释，铺于
MRS琼脂平板上。37℃温育过夜后，将菌落影印铺板，将原始平板用粪肠球菌LMG 13566细
胞覆盖。在37℃继续温育16小时后，检查菌落抗微生物活性的丧失。
MRS琼脂平板上。37℃温育过夜后，将菌落影印铺板，将原始平板用粪肠球菌LMG 13566细
胞覆盖。在37℃继续温育16小时后，检查菌落抗微生物活性的丧失。
[0181] 接合转移实验
[0182] 进行了滤膜交配实验。将蒙氏肠球菌ST4SA和粪肠球菌FA2-2的过夜生长培养物(0.25ml)加入到4.5ml MRS中，混合，并通过0.45μm孔径的无菌膜滤器(HAWP，Millipore)
进行过滤。将膜放置在MRS琼脂平板上，在37℃温育过夜。将细胞从滤器上洗到1ml MRS
-1 -1 -1
中，连续稀释，在含有25μg ml 梭链孢酸、25μg ml 利福平和2000AU ml 粗制ST4SA肽
的MRS琼脂平板上铺板。使用粪肠球菌OGX1作为受体重复该实验。在这种情况下，在含有
-1 -1
1mg ml 链霉素和2000AU ml 粗制ST4SA肽的平板上进行筛选。随机选取菌落，按照前面
的描述检查ST4SA肽的生产并筛选质粒含量。将含有pST4SA的粪肠球菌OGX1的接合细胞
的菌落进行培养，按前面的描述对无细胞上清液进行活性测试。
进行过滤。将膜放置在MRS琼脂平板上，在37℃温育过夜。将细胞从滤器上洗到1ml MRS
-1 -1 -1
中，连续稀释，在含有25μg ml 梭链孢酸、25μg ml 利福平和2000AU ml 粗制ST4SA肽
的MRS琼脂平板上铺板。使用粪肠球菌OGX1作为受体重复该实验。在这种情况下，在含有
-1 -1
1mg ml 链霉素和2000AU ml 粗制ST4SA肽的平板上进行筛选。随机选取菌落，按照前面
的描述检查ST4SA肽的生产并筛选质粒含量。将含有pST4SA的粪肠球菌OGX1的接合细胞
的菌落进行培养，按前面的描述对无细胞上清液进行活性测试。
[0183] 检测编码肽ST4SA的遗传元件和DNA测序
[0184] 分离总DNA。根据发表的其它抗微生物肽的部分序列设计的DNA引物用于通过PCRTM TM
扩增结构基因、转运蛋白基因和免疫性基因(列于下面)。测序使用ABI Prism BigDye
TM
Terminator Cycle SequencingReady Reaction试剂盒在ABI Prism 377 DNA测序仪(PE
AppliedBiosystem，Foster City，USA)上进行。使用国家生物技术信息中心(National
Center for Biotechnology Information(NCBI)，Bethesda，MD20894，USA)的BLASTN和
BLASTX程序进行数据库搜索。
扩增结构基因、转运蛋白基因和免疫性基因(列于下面)。测序使用ABI Prism BigDye
TM
Terminator Cycle SequencingReady Reaction试剂盒在ABI Prism 377 DNA测序仪(PE
AppliedBiosystem，Foster City，USA)上进行。使用国家生物技术信息中心(National
Center for Biotechnology Information(NCBI)，Bethesda，MD20894，USA)的BLASTN和
BLASTX程序进行数据库搜索。
[0185] 结构基因引物：
[0186] SEQ.ID.NO.3：SG-a：TGAGAGAAGGTTTAAGTTTTGAAGAA(正向)
[0187] SEQ.ID.NO.4：SG-b：TCCACTGAAATCCATGAATGA(反向)
[0188] ABC转运蛋白引物：
[0189] SEQ.ID.NO.5：ABC1-a：TGATGGATTTCAGTGGAAGT(正向)
[0190] SEQ.ID.NO.6：ABC1-b：ATCTCTTCTCCGTTTAATCG(反向)
[0191] SEQ.ID.NO.7：ABC2-a：GTCATTGTTGTGGGGATTAT(正向)
[0192] SEQ.ID.NO.8：ABC2-b：TCTAGATACGTATCAAGTCC(反向)
[0193] 免疫性引物：
[0194] SEQ.ID.NO.9：Immun-a：TTCCTGATGAACAAGAACTC(正向)
[0195] SEQ.ID.NO.10：Immun-b：GTCCCCACAACCAATAACTA(反向)
[0196] 在不同的生长培养基中和不同的生长起始pH值下肽ST4SA的生产
[0197] 将菌株ST4SA的18个小时培养物分别接种(2％，v/v)到MRS肉汤、BHI肉汤和M17肉汤(Merck，Darmstadt，德国)中。分别在30℃和37℃不搅拌温育28小时。每小时
取样并检查细菌生长(600nm处OD)、培养物pH的变化、对干酪乳酸杆菌LHS的抗微生物活
性(AU/ml)。按照前面的描述使用琼脂斑点实验方法。
取样并检查细菌生长(600nm处OD)、培养物pH的变化、对干酪乳酸杆菌LHS的抗微生物活
性(AU/ml)。按照前面的描述使用琼脂斑点实验方法。
[0198] 在分开的实验中，测定了培养基起始pH对肽ST4SA生产的影响。将体积为300ml的MRS肉汤用6M HCl或6M NaOH分别调整到pH4.5、5.0、5.5、6.0和6.5，然后高温高压灭
菌(图9A)。每个烧瓶用2％(v/v)的菌株ST4SA的18个小时培养物接种，并在30℃不搅
拌温育20小时。按照本文前面的描述每个小时测定培养物pH的变化和肽ST4SA的生产，
用AU/ml表示。所有的实验一式三份进行。
菌(图9A)。每个烧瓶用2％(v/v)的菌株ST4SA的18个小时培养物接种，并在30℃不搅
拌温育20小时。按照本文前面的描述每个小时测定培养物pH的变化和肽ST4SA的生产，
用AU/ml表示。所有的实验一式三份进行。
[0199] 培养基组成对肽ST4SA生产的影响
[0200] 将菌株ST4SA在10ml MRS肉汤中于30℃生长18小时，离心(8000 x g，10min，4℃)收获细胞，将沉淀重新悬浮在10ml无菌蛋白胨水中。使用该细胞悬浮液4ml接种
200ml下面的培养基：(a)MRS肉汤(De Man，Rogosa and Sharpe)，不含有机营养物，分别补
加了胰蛋白胨(20.0g/l)、肉浸膏(20.0g/l)、酵母提取物(20.0g/l)、胰蛋白胨(12.5g/l)
加肉浸膏(7.5g/l)、胰蛋白胨(12.5g/l)加酵母提取物(7.5g/l)、肉浸膏(10.0g/l)加酵
母提取物(10.0g/l)，或胰蛋白胨(10.0g/l)、肉浸膏(5.0g/l)和酵母提取物(5.0g/l)的
组合；(b)MRS肉汤(Biolab)，即含有20.0g/l葡萄糖；(c)不含葡萄糖的MRS肉汤(De Man，
Rogosa and Sharpe)，分别补加了20.0g/l果糖、蔗糖、乳糖、甘露糖和麦芽糖；(d)含有
0.1-40.0g/l果糖作为唯一碳源的MRS肉汤；(e)MRS肉汤(De Man，Rogosa and Sharpe)，
含有2.0-50.0g/l K2HPO4或2.0-50.0g/l KH2PO4；以及(f)MRS肉汤(DeMan，Rogosa and
Sharpe)，补加了0-50.0g/l甘油。在分开的实验中，将维生素氰钴胺素(Sigma，St.Louis，
Mo.)、L-抗坏血酸(BDH ChemicalsLtd，Poole，UK)、硫胺素(Sigma)、DL-6，8-硫辛酸
(Sigma)和维生素K1(Fluka Chemie AG，CH-9471Buchs，瑞士)过滤除菌，以1.0mg/ml(终浓
度)补加到MRS肉汤中。所有的试验于30℃温育20小时。按照前面的描述测定肽ST4SA
的活性水平。所有的实验一式三份进行。
200ml下面的培养基：(a)MRS肉汤(De Man，Rogosa and Sharpe)，不含有机营养物，分别补
加了胰蛋白胨(20.0g/l)、肉浸膏(20.0g/l)、酵母提取物(20.0g/l)、胰蛋白胨(12.5g/l)
加肉浸膏(7.5g/l)、胰蛋白胨(12.5g/l)加酵母提取物(7.5g/l)、肉浸膏(10.0g/l)加酵
母提取物(10.0g/l)，或胰蛋白胨(10.0g/l)、肉浸膏(5.0g/l)和酵母提取物(5.0g/l)的
组合；(b)MRS肉汤(Biolab)，即含有20.0g/l葡萄糖；(c)不含葡萄糖的MRS肉汤(De Man，
Rogosa and Sharpe)，分别补加了20.0g/l果糖、蔗糖、乳糖、甘露糖和麦芽糖；(d)含有
0.1-40.0g/l果糖作为唯一碳源的MRS肉汤；(e)MRS肉汤(De Man，Rogosa and Sharpe)，
含有2.0-50.0g/l K2HPO4或2.0-50.0g/l KH2PO4；以及(f)MRS肉汤(DeMan，Rogosa and
Sharpe)，补加了0-50.0g/l甘油。在分开的实验中，将维生素氰钴胺素(Sigma，St.Louis，
Mo.)、L-抗坏血酸(BDH ChemicalsLtd，Poole，UK)、硫胺素(Sigma)、DL-6，8-硫辛酸
(Sigma)和维生素K1(Fluka Chemie AG，CH-9471Buchs，瑞士)过滤除菌，以1.0mg/ml(终浓
度)补加到MRS肉汤中。所有的试验于30℃温育20小时。按照前面的描述测定肽ST4SA
的活性水平。所有的实验一式三份进行。
[0201] 基于图1中显示的形态学、不运动、缺乏色素形成以及使用属特异性引物(图2)和种特异性引物(图3)进行的PCR，将菌株ST4SA鉴定为肠球菌属的菌株。通过表1中显
示的糖发酵形式和上面表2中显示的生理学特征进一步鉴定种的水平。
示的糖发酵形式和上面表2中显示的生理学特征进一步鉴定种的水平。
[0202] 正如可以在表3中看见的那样，通过用蛋白水解酶(蛋白酶K、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)、Triton X-114处理，和在121℃下20分钟后，肽ST4SA被
失活。在100℃处理90分钟后以及当用Tween 20、Tween 80、尿素、EDTA和Triton X-100
处理时，肽保留了活性(表3)。在从2.0到12.0的pH值范围内温育后，没有活性损失(表
3)。
失活。在100℃处理90分钟后以及当用Tween 20、Tween 80、尿素、EDTA和Triton X-100
处理时，肽保留了活性(表3)。在从2.0到12.0的pH值范围内温育后，没有活性损失(表
3)。
[0203] 肽ST4SA抑制众多的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，如表4中所显示的那样。
[0204] 表4
[0205]性
活
肽 + + + + + + + - - - - - - - - + - + - - + + + + + + -
育温，基养培 氧好，IHB 氧好，IHB 氧厌，MCR IHB 氧好，SRM IHB IHB 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧好，IHB 氧厌，SRM 氧厌，PYG 氧厌，PYG 氧好，IHB IHB 氧好，IHB 氧好，IHB 氧好，IHB 氧厌，SRM
)
℃(
度温 73 73 03 73 73 73 73 73 73 73 03 73 24 73 73 03 03 03 03 23 23 73 73 73 73 73 24
体物生 61BA iinamuab retcabotenicA菌杆动不曼鲍 96531 GML suerec sullicaB菌杆孢芽状蜡 17531 GML mucirytuboryt muidirtsolC菌梭酸丁酪 62 eacaolc retcaboretnE菌杆肠沟阴 ，08E，77E，66531 GML silaceaf succocoretnE菌球肠粪 12,02,2AF，29E，09E 1CE iloc aihcirehcsE菌氏希埃肠大 13PK eainomuenp aleisbelK菌杆氏伯雷克炎肺 05531 GML sulihpodica sullicabotcaL菌杆酸乳酸嗜 GML suciraglub sullicabotcaL菌杆酸乳亚利加保 15531 25531 GML iesac sullicabotcaL菌杆酸乳酪干 35531 GML sutavruc sullicabotcaL菌杆酸乳曲弯 45531 GML mutnemref sullicabotcaL菌杆酸乳酵发 55531 GML sucitevleh sullicabotcaL菌杆酸乳士瑞 65531 GML muratnalp sullicabotcaL菌杆酸乳物植 75531 GML iretuer sullicabotcaL菌杆酸乳氏伊罗 85531 GML iekas sullicabotcaL菌杆酸乳酒清 sedioretnesem cotsonocueL种亚膜肠菌珠串明膜肠 26531 GML siromerc.psbus 86531 GML auconni airetsiL菌特斯李害无 06531 GML suecasotnep succocoideP菌球片糖戊 27531 GML icinoiporpidica.porP菌杆酸丙酸丙 47531 GML.ps muiretcabinoiporP菌杆酸丙 7，1 asonigurea sanomoduesP菌胞单假绿铜 83-33，31，6 suerua succocolyhpatS菌球萄葡色黄金 76531 GML susonrac succocolyhpatS菌球萄葡肉 2ST，1ST sunirpac succocotpertS菌球链羊山 92，72，4，3 eainomuenp succocotpertS菌球链炎肺 56531 GML sulihpomreht succocotpertS菌球链热嗜
活
肽 + + + + + + + - - - - - - - - + - + - - + + + + + + -
育温，基养培 氧好，IHB 氧好，IHB 氧厌，MCR IHB 氧好，SRM IHB IHB 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧厌，SRM 氧好，IHB 氧厌，SRM 氧厌，PYG 氧厌，PYG 氧好，IHB IHB 氧好，IHB 氧好，IHB 氧好，IHB 氧厌，SRM
)
℃(
度温 73 73 03 73 73 73 73 73 73 73 03 73 24 73 73 03 03 03 03 23 23 73 73 73 73 73 24
体物生 61BA iinamuab retcabotenicA菌杆动不曼鲍 96531 GML suerec sullicaB菌杆孢芽状蜡 17531 GML mucirytuboryt muidirtsolC菌梭酸丁酪 62 eacaolc retcaboretnE菌杆肠沟阴 ，08E，77E，66531 GML silaceaf succocoretnE菌球肠粪 12,02,2AF，29E，09E 1CE iloc aihcirehcsE菌氏希埃肠大 13PK eainomuenp aleisbelK菌杆氏伯雷克炎肺 05531 GML sulihpodica sullicabotcaL菌杆酸乳酸嗜 GML suciraglub sullicabotcaL菌杆酸乳亚利加保 15531 25531 GML iesac sullicabotcaL菌杆酸乳酪干 35531 GML sutavruc sullicabotcaL菌杆酸乳曲弯 45531 GML mutnemref sullicabotcaL菌杆酸乳酵发 55531 GML sucitevleh sullicabotcaL菌杆酸乳士瑞 65531 GML muratnalp sullicabotcaL菌杆酸乳物植 75531 GML iretuer sullicabotcaL菌杆酸乳氏伊罗 85531 GML iekas sullicabotcaL菌杆酸乳酒清 sedioretnesem cotsonocueL种亚膜肠菌珠串明膜肠 26531 GML siromerc.psbus 86531 GML auconni airetsiL菌特斯李害无 06531 GML suecasotnep succocoideP菌球片糖戊 27531 GML icinoiporpidica.porP菌杆酸丙酸丙 47531 GML.ps muiretcabinoiporP菌杆酸丙 7，1 asonigurea sanomoduesP菌胞单假绿铜 83-33，31，6 suerua succocolyhpatS菌球萄葡色黄金 76531 GML susonrac succocolyhpatS菌球萄葡肉 2ST，1ST sunirpac succocotpertS菌球链羊山 92，72，4，3 eainomuenp succocotpertS菌球链炎肺 56531 GML sulihpomreht succocotpertS菌球链热嗜
[0206] 图4中显示了通过凝胶过滤纯化肽ST4SA，从图4和5中可以看出，在3400 Da的范围内。当按照本文前面的描述对Vero细胞进行测试时，肽没有细胞毒性。
[0207] 如图6A所示，菌株ST4SA具有两个质粒。从菌株中消除这些质粒没有导致抗微生物活性的丧失。用编码结构基因的DNA片段探测染色体和质粒DNA，显示出与染色体(基因
组)的清楚的杂交(图6B)。这证明了编码肽ST4SA的结构基因位于基因组上。此外，将这
些质粒接合到粪肠球菌中(没有显示)没有将该菌株转化为肽ST4SA产生菌，证实了编码
肽ST4生产的基因位于菌株ST4SA的基因组上。
组)的清楚的杂交(图6B)。这证明了编码肽ST4SA的结构基因位于基因组上。此外，将这
些质粒接合到粪肠球菌中(没有显示)没有将该菌株转化为肽ST4SA产生菌，证实了编码
肽ST4生产的基因位于菌株ST4SA的基因组上。
[0210] 图9A和9B中显示了不同生长培养基中肽ST4SA的产生。起始生长pH对肽ST4SA生产的影响显示在图9A中。根据这些结果，显然在起始pH为6.0和6.5时，肽ST4SA在
MRS肉汤中得到最适的生产，并且在存在10-20g/l K2HPO4、15.0-20.0g/l果糖或存在维生
素C、B1和DL-6，8-硫辛酸的情况下被刺激。
MRS肉汤中得到最适的生产，并且在存在10-20g/l K2HPO4、15.0-20.0g/l果糖或存在维生
素C、B1和DL-6，8-硫辛酸的情况下被刺激。
[0211] 肽ST4SA的生产显示在图10中。在生长14小时后记录到最大的生产。
[0212] 含有粘附/免疫性基因的DNA片段显示在图11中，出于本发明的目的被编号为SEQ.ID.NO.15。
[0213] 蒙氏肠球菌ST4SA产生了对多种病原体具有活性的广谱抗微生物肽(肽ST4SA)。编码前导肽和前肽(合称为前体肽)的结构基因位于菌株ST4SA的基因组上(参见图6B)。
只检测到了一个这样的基因结构，表明只有一个肽负责广谱的抗微生物活性。对于消除菌
株ST4SA的50kb和100kb的质粒(图1)进行了尝试，但是失败了。这表明质粒可能在赋
予肽ST4SA免疫性方面有重要的功能，或包藏有对于关键的代谢反应来说重要的基因。
只检测到了一个这样的基因结构，表明只有一个肽负责广谱的抗微生物活性。对于消除菌
株ST4SA的50kb和100kb的质粒(图1)进行了尝试，但是失败了。这表明质粒可能在赋
予肽ST4SA免疫性方面有重要的功能，或包藏有对于关键的代谢反应来说重要的基因。
[0214] 通过使用根据16S rDNA保守区设计的引物进行种特异性PCR(聚合酶链反应)，获得了ST4SA是蒙氏肠球菌菌株的进一步证据，使用：
[0215] SEQ.ID.NO.16：正向引物：AACGAGCGCAACCC；
[0216] SEQ.ID.NO.17：反向引物：GACGGGCGGTGTGTAC.
[0217] 扩增到了306碱基对的片段(显示在图3中)。DNA片段的测序显示出与GenBank中保守的16S rDNA片段具有98％的同源性。
[0218] 对结构基因(编码ST4SA前肽)、转运蛋白基因和免疫性基因进行了测序，并从DNA序列翻译了它们相应的氨基酸序列(图8)。
[0219] 在-20℃到60℃的温度范围内，经42天测试了悬浮在无菌蒸馏水中的肽ST4SA的稳定性(图12)。肽在-20℃下保持42天稳定，在4℃下保持3周稳定。在37℃下一周后
稳定性降低。但是，粉末形式的肽ST4SA在室温(25℃)确能保持6个月的稳定。肽ST4SA
将以粉末形式生产并这样销售。溶解在无菌蒸馏水中之后，肽ST4SA可以在4℃保持3周
(参见图12)。
稳定性降低。但是，粉末形式的肽ST4SA在室温(25℃)确能保持6个月的稳定。肽ST4SA
将以粉末形式生产并这样销售。溶解在无菌蒸馏水中之后，肽ST4SA可以在4℃保持3周
(参见图12)。
[0220] 肽ST4SA在纸盘上的活性列于表5中。活性与抗生素的比较列于表6中。测试了针对从感染的中耳流体分离到的假单胞菌的活性。抑菌圈的图像显示在图13中。
[0221] 表5.肽ST4SA在纸盘上的活性
[0222]
[0223] 表6.肽ST4SA的活性与常用的抗生素的比较
[0224]
[0225] 肽ST4SA与靶细胞的结合对于确保肽的透入是重要的。研究了肽ST4SA与病原体粘附的能力，结果表示为与病原体结合的百分数(表7)。从这些结果得出结论，至少75％
的肽ST4SA与测试的病原体结合。肽ST4SA与靶细胞的粘附导致穿透并破坏了细胞膜(图
14)。
的肽ST4SA与测试的病原体结合。肽ST4SA与靶细胞的粘附导致穿透并破坏了细胞膜(图
14)。
[0226] 表7.肽ST4SA与病原体的粘附
[0227]
[0228]
[0229] 通过测试细胞外DNA和细胞外β-半乳糖苷酶的活性，获得了细胞膜破坏和细胞成分泄漏的进一步证据。结果分别显示在表8和表9中。结果表明，DNA和β-半乳糖苷
酶从被肽ST4SA破坏的细胞中泄漏出来。不是所有病原体都没有记录到β-半乳糖苷酶的
泄漏，这是由于不是所有的菌种都具有细胞内高水平的该酶。
酶从被肽ST4SA破坏的细胞中泄漏出来。不是所有病原体都没有记录到β-半乳糖苷酶的
泄漏，这是由于不是所有的菌种都具有细胞内高水平的该酶。
[0230] 表8.在用肽ST4SA处理病原体后记录到的细胞外DNA
[0231]病原体 DNA泄漏(260nm的O.D.读数)
肺炎链球菌
27 1.670
29 1.182
D 1.160
化脓性链球菌
20 0.930
铜绿假单胞菌
E 0.187
金黄色葡萄球菌
36 0.892
肺炎克雷伯氏杆菌
30 1.01
中耳分离物(未知)
40 0.801
BW 1.186
DW 1.153
F 1.428
HW 1.559
GW 0.751
K 0.455
L 0.592
M 0.326
对照
肠球菌HKLHS 1.395
肺炎链球菌
27 1.670
29 1.182
D 1.160
化脓性链球菌
20 0.930
铜绿假单胞菌
E 0.187
金黄色葡萄球菌
36 0.892
肺炎克雷伯氏杆菌
30 1.01
中耳分离物(未知)
40 0.801
BW 1.186
DW 1.153
F 1.428
HW 1.559
GW 0.751
K 0.455
L 0.592
M 0.326
对照
肠球菌HKLHS 1.395
[0232] 表9
[0233]病原体 OD420处记录的β-半乳糖苷酶
肺炎链球
27 没有泄漏
29 没有泄漏
D 没有泄漏
化脓性链球菌
20 没有泄漏
金黄色葡萄球菌
36 没有泄漏
肺炎克雷伯氏杆菌
30 没有泄漏
中耳分离物(未知)
40
BW 0.370
DW 0.293
F 0.318
HW 0.235
GW 0.373
K 没有泄漏
L 没有泄漏
M 没有泄漏
对照
肠球菌HKLHS 没有泄漏
肺炎链球
27 没有泄漏
29 没有泄漏
D 没有泄漏
化脓性链球菌
20 没有泄漏
金黄色葡萄球菌
36 没有泄漏
肺炎克雷伯氏杆菌
30 没有泄漏
中耳分离物(未知)
40
BW 0.370
DW 0.293
F 0.318
HW 0.235
GW 0.373
K 没有泄漏
L 没有泄漏
M 没有泄漏
对照
肠球菌HKLHS 没有泄漏
[0234] 用肽ST4SA处理后不同病原体的细胞溶解显示在图15到23中。将过夜培养的病原体的0.2％(v/v)接种物接种到BHI肉汤中。在指数中期在每种病原体中加入肽ST4SA。
从本文显示的结果(图15到23)，显然肽ST4SA以对抗最多种病原体的杀细菌方式起作用。
从本文显示的结果(图15到23)，显然肽ST4SA以对抗最多种病原体的杀细菌方式起作用。
[0235] 在无害李斯特菌存在下研究了肽ST4SA的产生(图24)。根据这些结果，无害李斯特菌刺激了菌株ST4SA产生肽ST4SA，在此期间无害李斯特菌被抑制。
[0236] 蒙氏肠球菌ST4SA作为益生菌
[0237] 在计算机化的胃肠模型(GIM，显示在图25中)中评估了蒙氏肠球菌ST4SA的存活性。
[0238] 在GIM中，第一个容器模拟胃，第二个容器模拟十二指肠，第三个容器模拟空肠和回肠和第四个容器模拟结肠。营养物质的流动由专用软件调控。GIM不同部分中的pH由
蠕动加入的无菌1N HCl或1NNaOH调控。每个部分装配有高度灵敏的pH探针，连接到控
制单元和计算机上。营养物质通过GIM的流速按照婴儿的肠道调整。选择模拟短消化道
的条件以允许较大的波动，从而增加对益生菌的应激。对四种婴儿配方(Lactogen2，NAN
8
Pelargon，ALL110和Alfare)进行评估。益生菌(ST4SA)的剂量按照处方，即每毫升10 个
活细胞(cfu)。将益生细胞悬浮在唾液中。将含有NaHCO3、胰酶制剂和牛胆汁的胰腺-胆
汁溶液溶解在蒸馏水中。在GIM中使用的条件概述在表10和11中。
蠕动加入的无菌1N HCl或1NNaOH调控。每个部分装配有高度灵敏的pH探针，连接到控
制单元和计算机上。营养物质通过GIM的流速按照婴儿的肠道调整。选择模拟短消化道
的条件以允许较大的波动，从而增加对益生菌的应激。对四种婴儿配方(Lactogen2，NAN
8
Pelargon，ALL110和Alfare)进行评估。益生菌(ST4SA)的剂量按照处方，即每毫升10 个
活细胞(cfu)。将益生细胞悬浮在唾液中。将含有NaHCO3、胰酶制剂和牛胆汁的胰腺-胆
汁溶液溶解在蒸馏水中。在GIM中使用的条件概述在表10和11中。
[0239] 表10
[0240]
[0241] 表11
[0242]在NAN Pelargon 细菌素活性 在MRS肉汤 细菌素活性
GIM部分
中的Cfua/ml (>25 600 AUb/ml) 中的Cfu/ml (>25 600 AU/ml)
接种物 1.6x108 + 6.0x107 +
胃 1.2x107 + 3.7x107 +
十二指肠 2.5x106 + 1.0x108 +
空肠 1.0x107 + 1.3x108 +
回肠 5.0x107 + 1.0x108 +
GIM部分
中的Cfua/ml (>25 600 AUb/ml) 中的Cfu/ml (>25 600 AU/ml)
接种物 1.6x108 + 6.0x107 +
胃 1.2x107 + 3.7x107 +
十二指肠 2.5x106 + 1.0x108 +
空肠 1.0x107 + 1.3x108 +
回肠 5.0x107 + 1.0x108 +
[0243] aCfu＝菌落形成单位(即活细胞的数量)
[0244] bAU＝任意单位(因此反映了抗微生物活性)
[0245] 通过用单核细胞增多性李斯特菌感染GIM，测试了菌株ST4SA对病原体的存活性。监测了菌株ST4SA的存活性以及它生产抗微生物肽ST4SA的能力(结果显示在表12中)。
[0246] 表12
[0247]抗生素 ST4
氨苄青霉素 +++
杆菌肽 ++
头孢唑林 +
氯霉素 +++
环丙沙星 +++
磺酰胺镉 -
氯苯唑青霉素 -
红霉素 +++
甲硝唑 -
甲氧西林 -
新霉素 -
新生霉素 +++
制霉菌素 -
氧氟沙星 ++
苯唑青霉素 -
利福平 +++
四环素 +++
链霉素 -
万古霉素 ++
青霉素 +++
氨苄青霉素 +++
杆菌肽 ++
头孢唑林 +
氯霉素 +++
环丙沙星 +++
磺酰胺镉 -
氯苯唑青霉素 -
红霉素 +++
甲硝唑 -
甲氧西林 -
新霉素 -
新生霉素 +++
制霉菌素 -
氧氟沙星 ++
苯唑青霉素 -
利福平 +++
四环素 +++
链霉素 -
万古霉素 ++
青霉素 +++
[0248] 符号-＝没有抑菌圈(对抗生素有抗性)；+＝直径1到11mm的抑菌圈；++＝直径12到16mm的抑菌圈；+++＝直径大于17mm的抑菌圈.。
[0249] 从表12中显示的结果可以得出结论，菌株ST4SA在肠道的所有部分中都能存活。在肠道的所有部分中，抗微生物肽的生产都超过每毫升25 600 AU(任意单位)。在NAN
Palargon中的生长比在MRS中略微差些。但是，在这两个实验中，细胞的数量都没有减少超
过1个对数周期(参见表13)。
Palargon中的生长比在MRS中略微差些。但是，在这两个实验中，细胞的数量都没有减少超
过1个对数周期(参见表13)。
[0250] 表13
[0251]抗生素(mg) 菌株ST4SA的活细胞数量
对照 1x108
TMP-SMX 20/100 7x104
4
TMP-SMX 40/200 8x10
TMP-SMX 60/300 8x104
TMP-SMX 80/400 1.8x104
4
甲硝唑 50 1.3x10
甲硝唑 100 6x104
甲硝唑 200 3x104
对照 1x108
TMP-SMX 20/100 7x104
4
TMP-SMX 40/200 8x10
TMP-SMX 60/300 8x104
TMP-SMX 80/400 1.8x104
4
甲硝唑 50 1.3x10
甲硝唑 100 6x104
甲硝唑 200 3x104
[0252] 按照标准的步骤(抗生素圆盘，Oxoid)测试了菌株ST4SA对各种抗生素的抗性。从这些结果得出结论，菌株ST4SA对磺酰胺、氯苯唑青霉素、甲硝唑、甲氧西林、新霉素、制
霉菌素、苯唑青霉素和链霉素有抗性(表13)。
霉菌素、苯唑青霉素和链霉素有抗性(表13)。
[0253] 用三甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑(TMP-SMX)和/或甲硝唑治疗患有HIV/AIDS的儿童以防止腹泻。在NAN Palargon中补加了不同浓度的后一种抗生素，在最适生长温度
(37℃)18小时后测定对菌株ST4SA的影响。
(37℃)18小时后测定对菌株ST4SA的影响。
[0254] 从表4中显示的结果可以得出结论，TMP-SMX和甲硝唑使菌株ST4SA的细胞数量降低了4个对数周期。但是，增加的浓度对存活性没有强烈的影响。
[0255] ST4SA中毒力因子的发生率
[0256] 为了将菌株ST4SA开发成益生菌，重要的是了解是否有任何毒力因子与其相关。为编码下列毒力因子的基因设计了引物：万古霉素抗性(VanA/VanB)、明胶酶的产生
(Gel)、凝集物质(AS)、肠球菌胶原的粘附素(Ace)、肠球菌表面蛋白(Esp)、溶血素/细菌素
(Cyl)和非溶细胞素的β-溶血素基因。使用上述引物扩增的菌株ST4SA的DNA表明菌株
不含有编码万古霉素抗性、明胶酶活性、凝集物质和胶原粘附的基因。根据显示的结果，菌
株ST4SA不是病原性的，当摄入时不会引起过敏反应。
(Gel)、凝集物质(AS)、肠球菌胶原的粘附素(Ace)、肠球菌表面蛋白(Esp)、溶血素/细菌素
(Cyl)和非溶细胞素的β-溶血素基因。使用上述引物扩增的菌株ST4SA的DNA表明菌株
不含有编码万古霉素抗性、明胶酶活性、凝集物质和胶原粘附的基因。根据显示的结果，菌
株ST4SA不是病原性的，当摄入时不会引起过敏反应。
[0257] 因为肽ST4SA具有作用于许多革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的广谱的抗微生物活性，肽ST4SA的作用方式显得与迄今为止描述的乳酸细菌的其它抗微生物肽不同。此外，
在敏感细胞的细胞壁上的识别位点，也可能与申请人注意到的其它肽使用的常见脂质II
锚定位点不同(图26)。
在敏感细胞的细胞壁上的识别位点，也可能与申请人注意到的其它肽使用的常见脂质II
锚定位点不同(图26)。
[0258] 为了试验该假说，用万古霉素阻断了清酒乳酸杆菌DSM 20017的脂质II靶位点(对肽ST4SA敏感)(参见图26的图示)。万古霉素粘附于脂质II分子的氨基酸侧链上，
理论上这将阻止肽ST4SA与同样位点的结合(也就是说如果脂质II作为受体的话)。但
是，用万古霉素和肽ST4SA的组合处理靶细胞(清酒乳酸杆菌DSM 20017)导致了生长抑制
(细胞质泄漏；参见图26)，表明脂质II之外的靶位点作为肽ST4SA的受体。肽ST4SA与敏
感细胞上一个以上的锚定位点结合这个事实，可以解释它为什么具有如此广谱的抗微生物
活性(抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌)。本申请人注意到乳链菌肽(羊毛硫抗生素)
与脂质II结合，如图26显示的那样，其中用万古霉素处理清酒乳酸杆菌DSM 20017阻止了
乳链菌肽与脂质II靶位点的结合。
理论上这将阻止肽ST4SA与同样位点的结合(也就是说如果脂质II作为受体的话)。但
是，用万古霉素和肽ST4SA的组合处理靶细胞(清酒乳酸杆菌DSM 20017)导致了生长抑制
(细胞质泄漏；参见图26)，表明脂质II之外的靶位点作为肽ST4SA的受体。肽ST4SA与敏
感细胞上一个以上的锚定位点结合这个事实，可以解释它为什么具有如此广谱的抗微生物
活性(抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌)。本申请人注意到乳链菌肽(羊毛硫抗生素)
与脂质II结合，如图26显示的那样，其中用万古霉素处理清酒乳酸杆菌DSM 20017阻止了
乳链菌肽与脂质II靶位点的结合。
[0259] 肽ST4SA具有两个疏水区(图27)，在其与细胞壁上的受体位点发生反应后可以嵌入到富含磷脂的细胞膜中。两个疏水区之间、更具体来说是氨基酸29(丝氨酸)和氨基酸
30(丙氨酸)之间的区域(图27)比结构中的其它部分更柔曲，可以用作铰链区，使肽的C
末端一半弯曲并将其自身插入到富含磷脂的细胞膜中。为了试验这种假设，根据从结构基
因的DNA序列推导的氨基酸序列合成了肽ST4SA的两个部分(图27)(后文列为称为片段
1和片段2)
30(丙氨酸)之间的区域(图27)比结构中的其它部分更柔曲，可以用作铰链区，使肽的C
末端一半弯曲并将其自身插入到富含磷脂的细胞膜中。为了试验这种假设，根据从结构基
因的DNA序列推导的氨基酸序列合成了肽ST4SA的两个部分(图27)(后文列为称为片段
1和片段2)
[0260] 如下所示，片段1由前29个氨基酸(从赖氨酸到丝氨酸)构成，刚好在铰链区(即29位的丝氨酸和30位的丙氨酸之间)之前。引入了二硫键(下面显示的连线)将氨基酸
9(半胱氨酸)和氨基酸14(半胱氨酸)共价连接，它也显示在下面的全长肽序列中：
9(半胱氨酸)和氨基酸14(半胱氨酸)共价连接，它也显示在下面的全长肽序列中：
[0261]
[0262] 二硫键用于稳定肽的结构。片段1含有第一个疏水区，用画圈的区域表示(从21位到26位的6个氨基酸，即AIGIIG)。该部分分子识别靶(敏感)生物体的细胞壁上的受
体。
体。
[0263] 片段2含有铰链区下游第二个疏水环中的后13个C-末端氨基酸，加上刚好在铰链区(丝氨酸和丙氨酸之间)之前的前11个氨基酸：
[0264] 片段2：KAIGIIGNNSAANLATGGAAGWKS
[0265] 用肽ST4SA的这两个片段处理敏感细胞，表明了分子的这两个片段(部分)对于抗微生物活性来说都是需要的。因此，从而似乎只有当N-末端锚定到细胞表面上的受体上
时，才可能破坏细胞膜。
时，才可能破坏细胞膜。
[0266] 肽ST4SA与聚乙烯(PE)的结合
[0267] 试验了肽ST4SA与聚乙烯(PE)的结合。将PE薄膜切成5x5cm的切片，在60％异丙醇和肽ST4SA(活性水平：102 400AU/ml)的溶液中浸泡1小时。将PE切片空气干燥(60℃，
20分钟)，使用标准的琼脂扩散方法分析抗微生物活性。将用清酒乳酸杆菌DSM 20017接
种的平板在30℃温育24小时，并检查生长抑制圈。
20分钟)，使用标准的琼脂扩散方法分析抗微生物活性。将用清酒乳酸杆菌DSM 20017接
种的平板在30℃温育24小时，并检查生长抑制圈。
[0268] 肽ST4SA在60秒内吸附到PE上，产生抗微生物活性高的薄膜(在PE切片周围有大的抑菌圈)。通过将肽包被的PE薄膜浸泡在SDS缓冲液中，然后使用30mA的电流2小
时(室温，即大约25℃)，将肽ST4SA从薄膜上电洗脱，以测定结合强度。在规定的时间间
隔取样并测试抗微生物活性。使用Bradford方法测定蛋白的浓度。使用前面描述的琼脂
扩散方法测试电洗脱的薄膜的抗微生物活性。
时(室温，即大约25℃)，将肽ST4SA从薄膜上电洗脱，以测定结合强度。在规定的时间间
隔取样并测试抗微生物活性。使用Bradford方法测定蛋白的浓度。使用前面描述的琼脂
扩散方法测试电洗脱的薄膜的抗微生物活性。
[0269] 肽ST4SA强烈地、并且似乎是不可逆地粘附于PE薄膜上。只有使用30mA电流1小时后才可能将肽ST4SA从PE表面释放下来。在以红肉作为模型的攻击研究中，表面(PE)结
合的肽ST4SA阻止了病原细菌(李斯特菌、芽孢杆菌和葡萄球菌)的生长。这表明肽ST4SA
可用于创伤敷料中，以防止或减少微生物感染，并也在其它的医学或无菌应用中发现用途，
例如移植物、耳置管、导管、造瘘管和袋、支架、缝合材料、卫生产品例如女性卫生产品、隐形
眼镜、隐形眼镜清洗溶液。将抗微生物肽囊封在聚合物中导致抗微生物肽的缓慢释放，以及
对微生物感染的治疗期延长。此外，肽ST4SA与PE的强烈吸附显示出它可以用作缓释抗微
生物药剂。
合的肽ST4SA阻止了病原细菌(李斯特菌、芽孢杆菌和葡萄球菌)的生长。这表明肽ST4SA
可用于创伤敷料中，以防止或减少微生物感染，并也在其它的医学或无菌应用中发现用途，
例如移植物、耳置管、导管、造瘘管和袋、支架、缝合材料、卫生产品例如女性卫生产品、隐形
眼镜、隐形眼镜清洗溶液。将抗微生物肽囊封在聚合物中导致抗微生物肽的缓慢释放，以及
对微生物感染的治疗期延长。此外，肽ST4SA与PE的强烈吸附显示出它可以用作缓释抗微
生物药剂。
[0270] 肽ST4SA与微生物细胞上一个以上的受体位点结合，这是人们对广谱抗微生物药剂所典型期望的。肽ST4SA的第一部分(在铰链区之前)与受体结合。第二部分(在铰链
区下游)含有较大的疏水区，嵌入到细胞膜中并改变了渗透性，导致细胞死亡(通过DNA和
酶的泄漏看出)。肽ST4SA以稳定和缓慢释放的方式与PE结合，适合掺入到创伤敷料中。
区下游)含有较大的疏水区，嵌入到细胞膜中并改变了渗透性，导致细胞死亡(通过DNA和
酶的泄漏看出)。肽ST4SA以稳定和缓慢释放的方式与PE结合，适合掺入到创伤敷料中。
[0271] 将蒙氏肠球菌ST4SA开发成益生菌
[0272] 如显示的那样，在计算机化的胃肠模型中评估了蒙氏肠球菌ST4SA的存活性。该阶段还包括对菌株ST4SA作为益生菌的体外和体内评估。在体外使用人类细胞系研究了与
粘膜和上皮细胞的粘附。体内研究在大鼠中进行。
粘膜和上皮细胞的粘附。体内研究在大鼠中进行。
[0273] 在本研究中使用的人类肠细胞系来自人类结肠腺癌，包括Caco-2细胞系、HT-29和HT29-MTX(粘液分泌细胞)。当在标准培养条件下生长时，细胞系表现出形态和功能上的
差异，并显示出成熟肠上皮细胞的特征，包括极化、功能性刷毛层次以及顶端的肠水解酶。
差异，并显示出成熟肠上皮细胞的特征，包括极化、功能性刷毛层次以及顶端的肠水解酶。
[0274] 菌株ST4SA与宿主细胞的粘附受到与病原性有关的细胞表面碳水化合物、Efa A蛋白、Ace(来自肠球菌的胶原粘附素)蛋白和凝集物质(AS)的影响。AS是介导细胞丛形
成的粘附素，所述细胞块的形成允许将性信息素质粒高效转移到编码AS的细菌上。
成的粘附素，所述细胞块的形成允许将性信息素质粒高效转移到编码AS的细菌上。
[0275] 在本研究中，在体外胃肠(GIT)模型中，筛选了菌株ST4SA的毒力性状、胆盐水解酶(BSH)活性、和粘附于人类肠上皮细胞样细胞株Caco-2的能力和粘附于Caco-2细胞株
时的竞争性排斥。此外，测定了ST4SA的细胞表面疏水性。
时的竞争性排斥。此外，测定了ST4SA的细胞表面疏水性。
[0276] 毒力因子
[0277] 通过体外试验和/或PCR筛选，研究了毒力因子的存在，即万古霉素抗性(VanA/VanB/VanC1/VanC2/VanC3)、明胶酶(Gel)的产生、凝集物质(AS)、肠球菌胶原粘附素
(Ace)、肠球菌表面蛋白(Esp)、溶血素/细菌素(Cyl)和非细胞溶素的β-溶血素基因。从
蒙氏肠球菌ST4中按照标准方法提取了DNA。为扩增上述基因而设计的引物如前描述。结
果显示在表14中。
(Ace)、肠球菌表面蛋白(Esp)、溶血素/细菌素(Cyl)和非细胞溶素的β-溶血素基因。从
蒙氏肠球菌ST4中按照标准方法提取了DNA。为扩增上述基因而设计的引物如前描述。结
果显示在表14中。
[0278] 表14
[0279]VanA VanB Van Gel Efa- Efa- AS Ace Cyl Esp Non-cyt
C1/2/3 Afm Afs
ST4SA - - - - - - - - + - +
C1/2/3 Afm Afs
ST4SA - - - - - - - - + - +
[0280] Key：
[0281] VanA/VanB：万古霉素抗性
[0282] Gel：明胶酶的产生
[0283] EfaAfm：粪肠球菌(E.faecium)心内膜炎抗原
[0284] EfaAfs：粪肠球菌心内膜炎抗原
[0285] As：凝集物质
[0286] Ace：粪肠球菌的胶原粘附素
[0287] Cyl：细胞溶素(β-溶血素活性)
[0288] Esp：肠球菌表面蛋白
[0289] Non-Cyt：非细胞溶素β-溶血素III
[0290] 凝集物质(AS)的生产
[0291] 在存在性信息素的情况下在聚集分析中研究了AS的产生。性信息素通过将信息素产生菌粪肠球菌JH2-2在MRS肉汤中于37℃生长18小时而获得。信息素产生菌粪肠球
菌OG1X的上清液被用于微量滴定板中的聚集分析。200微升用菌株ST4SA接种(0.5％，v/
v)，在2、4、8和24小时后通过显微镜检查细胞聚集。没有观察到细胞聚集。
菌OG1X的上清液被用于微量滴定板中的聚集分析。200微升用菌株ST4SA接种(0.5％，v/
v)，在2、4、8和24小时后通过显微镜检查细胞聚集。没有观察到细胞聚集。
[0292] 明胶酶的产生
[0293] 在含有30g明胶/升的MRS琼脂上测试了明胶酶的产生。在37℃18小时后，在菌落周围的透明圈被认为是阳性反应。没有检测到明胶酶的产生。
[0294] β-溶血素的产生
[0295] β-溶血素的产生由血琼脂平板上菌落周围透明圈的形成来指示。血琼脂板使用含有5％绵羊血的哥伦比亚血琼脂基来制备。没有观察到β-溶血素的产生。
[0296] 显然，本申请人已经显示了菌株ST4SA不具有编码万古霉素抗性、明胶酶产生、心内膜炎抗原产生、形成细胞凝集、与胶原粘附、和/或表面蛋白产生的基因。检测到了编码
β-溶血素活性和非细胞溶素β-溶血素III的基因。但是，后两个基因没有表达(在血琼
脂平板上没有观察到溶血活性——参见下文)。
β-溶血素活性和非细胞溶素β-溶血素III的基因。但是，后两个基因没有表达(在血琼
脂平板上没有观察到溶血活性——参见下文)。
[0297] 胆盐水解(BSH)活性的测定
[0298] 通过将10μl过夜培养物点样在补加了0.5％(w/v)牛磺脱氧胆酸(TCDA)钠盐和0.37g/L CaCl2的MRS琼脂平板上，测试了菌株ST4SA的BSH活性。将平板在厌氧瓶中
在37℃温育72小时。沉淀区的形成被当作BSH阳性。
在37℃温育72小时。沉淀区的形成被当作BSH阳性。
[0299] 对菌株ST4SA没有观察到胆盐水解(BSH)活性。BSH活性可能对乳酸细菌对十二指肠中结合的胆盐的毒性的抗性有贡献。但是，胆盐水解活性和对胆盐的抗性一般被认为
是无关的。
是无关的。
[0300] 细胞表面疏水性的测定
[0301] 将蒙氏肠球菌ST4SA的过夜培养物用四分之一强度的Ringer’s溶液(QSRS)洗两次，并测定OD580nm。将同样体积的悬浮液和正十六烷加到一起并混合2分钟。在室温进行相
分离30分钟，然后取出1ml水相并测定OD580nm。将OD580nm的两次重复评估值平均，并用于计
算疏水性：
分离30分钟，然后取出1ml水相并测定OD580nm。将OD580nm的两次重复评估值平均，并用于计
算疏水性：
[0302] ％疏水性＝[(OD580nm读数1-OD580nm读数2)/OD580nm读数1]x 100
[0303] 从图28中显示的结果可以看出，显然菌株ST4SA没有显示出疏水性的迹象。因此，在GIT中细胞并不永久粘附到表面上。细胞在肠道中自由地移动(象浮游细胞一样)，
这增加了其作为良好的益生菌的有用性。
这增加了其作为良好的益生菌的有用性。
[0304] 蒙氏肠球菌ST4SA和单核细胞增多性李斯特菌与Caco-2细胞系的粘附
[0305] 将Caco-2细胞(Highveld Biological Sciences)以每个孔5x105个细胞的浓5
度接种以获得满底。通过向孔中加入100μl细菌悬浮液(1x10cfu/ml菌株ST4SA和
3
1x10cfu/ml单核细胞增多性李斯特菌)来检测粘附性。在37℃温育2小时后，用PBS将
细胞系洗两次。使用Trition-X 100将细菌细胞溶解，分别铺在MRS和BHI琼脂上。从初
始的活细胞计数和细胞溶解产物计算粘附性。
度接种以获得满底。通过向孔中加入100μl细菌悬浮液(1x10cfu/ml菌株ST4SA和
3
1x10cfu/ml单核细胞增多性李斯特菌)来检测粘附性。在37℃温育2小时后，用PBS将
细胞系洗两次。使用Trition-X 100将细菌细胞溶解，分别铺在MRS和BHI琼脂上。从初
始的活细胞计数和细胞溶解产物计算粘附性。
[0306] 通过将菌株ST4SA和单核细胞增多性李斯特菌每种菌株100μl接种到细胞单层中来测定两种菌株的竞争性排斥。在2小时温育期后，将细胞溶解，并分别铺在肠球菌和李
斯特菌特异性培养基上。
斯特菌特异性培养基上。
[0307] Caco-2细胞单层被制备在12孔组织培养板中的玻璃盖玻片上。将ST4SA细胞的悬浮液加到孔中。在2小时粘附期后，用PBS将细胞系洗2次，用10％福尔马林固定，进行
革兰氏染色。通过显微镜检测粘附的细菌。结果显示在表15和表16中。
革兰氏染色。通过显微镜检测粘附的细菌。结果显示在表15和表16中。
[0308] 表15
[0309]Cfu/ml ST4的接种 ST4的粘附 单核细胞增多性李 单核细胞增多性李
斯特菌的接种 斯特菌的粘附
实验 1 1x106 2x104 1x105 3x102
实验 2 1x106 1x104 3x104 1x103
斯特菌的接种 斯特菌的粘附
实验 1 1x106 2x104 1x105 3x102
实验 2 1x106 1x104 3x104 1x103
[0310] 表16
[0311]Cfu/ml ST4的接种 ST4的粘附 单核细胞增多性李 单核细胞增多性李
斯特菌的接种 斯特菌的粘附
实验1 1x106 8x103 1x105 4x101
实验2 1x106 1x104 3x104 3x103
斯特菌的接种 斯特菌的粘附
实验1 1x106 8x103 1x105 4x101
实验2 1x106 1x104 3x104 3x103
[0312] 根据表15和16显示的结果，显然蒙氏肠球菌ST4SA细胞阻止了李斯特菌与Caco-2细胞的粘附，细胞成功地与李斯特菌竞争人类细胞系上的识别位点。因此菌株
ST4SA能够竞争过李斯特菌。
ST4SA能够竞争过李斯特菌。
[0313] 用ST4SA攻击单核细胞增多性李斯特菌以及在体外胃肠(GIT)模型中的存活率
[0314] 测定了在体外胃肠模型中ST4SA对单核细胞增多性李斯特菌的抗微生物活性。将4
ST4SA如前所述接种到胃容器中。将单核细胞增多性李斯特菌(1x10)接种到GIT的十二
指肠容器中。从每个容器取样并分别铺在肠球菌和李斯特菌特异性培养基上。以GIT模型
中仅接种单核细胞增多性李斯特菌作为对照。
ST4SA如前所述接种到胃容器中。将单核细胞增多性李斯特菌(1x10)接种到GIT的十二
指肠容器中。从每个容器取样并分别铺在肠球菌和李斯特菌特异性培养基上。以GIT模型
中仅接种单核细胞增多性李斯特菌作为对照。
[0315] 在体外GIT模型中用ST4SA攻击单核细胞增多性李斯特菌表明ST4对单核细胞增4
多性李斯特菌有抗微生物效应(参见下页的图)。与对照相比，在空肠容器中生长从8x10
4 1
减少到2x10，在回肠容器中单核细胞增多性李斯特菌低了1x10cfu/ml，如图29中所示。
多性李斯特菌有抗微生物效应(参见下页的图)。与对照相比，在空肠容器中生长从8x10
4 1
减少到2x10，在回肠容器中单核细胞增多性李斯特菌低了1x10cfu/ml，如图29中所示。
[0316] 口服施用的蒙氏肠球菌ST4SA的安全性、细菌移位、存活性和免疫调节能力的体内评估：与Lactovita的比较
[0317] 材料和方法
[0318] 动物
[0319] 将10只体重在318g到335g之间的雄性Wistar大鼠以5只每种笼养在塑料笼子中，使用12小时的光照/黑暗周期，并在受控的环境下(温度20℃±3℃)。动物用标准的
饮食以及高温高压灭菌的补加或未补加益生菌的反渗水喂养，进食不受限制。
饮食以及高温高压灭菌的补加或未补加益生菌的反渗水喂养，进食不受限制。
[0320] 细菌菌株和益生菌
[0321] 菌株ST4SA在MRS肉汤中在30℃培养18小时；将600nm处光密度调整到1.8。通过离心收获细胞，在20mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)中清洗。将清洗过的细胞重新悬浮在100mM
蔗糖中，在液氮中冷冻并冷干过夜。通过将给定质量的细胞悬浮在1ml磷酸盐缓冲液中并
8
稀释铺板在MRS固体培养基上，测定cfu/ml值。将菌株ST4SA以大约2x10cfu/ml的浓度
加到饮用水中。
蔗糖中，在液氮中冷冻并冷干过夜。通过将给定质量的细胞悬浮在1ml磷酸盐缓冲液中并
8
稀释铺板在MRS固体培养基上，测定cfu/ml值。将菌株ST4SA以大约2x10cfu/ml的浓度
加到饮用水中。
[0322] 将三个含有商标名为Lactovita的商购益生菌的胶囊打开并加入到每瓶饮用水5
中。这导致施用了大约3x10cfu/ml。
中。这导致施用了大约3x10cfu/ml。
[0323] 实验设计
[0324] 进行了两项分别的研究。在每个研究中，将10只大鼠随机分成两组，每组5只。一组作为对照，接受未加料的水；第二组接受补加了Lactovita胶囊或冷干的菌株
11 9
ST4SA的水。在研究期间，每只大鼠接受总量为9.89x10 cfu的菌株ST4或3.1x10cfu的
Lactovita。每天监测大鼠的任何异常活动、行为或总体健康状况，包括皮毛起皱、弓背姿
势、行动不稳、震颤或摇晃、咳嗽或呼吸困难、四肢颜色。使用三级方法监测活动：1＝怠惰，
活动迟缓；2＝中间；3＝运动和探索活跃。每日测量活重和耗水体积。菌株ST4SA的研究
进行50天，Lactovita研究进行108天，结果显示在表17中。
11 9
ST4SA的水。在研究期间，每只大鼠接受总量为9.89x10 cfu的菌株ST4或3.1x10cfu的
Lactovita。每天监测大鼠的任何异常活动、行为或总体健康状况，包括皮毛起皱、弓背姿
势、行动不稳、震颤或摇晃、咳嗽或呼吸困难、四肢颜色。使用三级方法监测活动：1＝怠惰，
活动迟缓；2＝中间；3＝运动和探索活跃。每日测量活重和耗水体积。菌株ST4SA的研究
进行50天，Lactovita研究进行108天，结果显示在表17中。
[0325] 表17
[0326]
[0327] β-葡糖醛酸糖苷酶活性
[0328] 将大鼠在指定的取样点放置在单一的笼子中过夜，收集24小时的粪便样品来确定细菌计数和β-葡糖醛酸糖苷酶活性。将粪便样品以100mg粪便/ml缓冲液的浓度在
20mM磷酸盐缓冲液中匀浆。样品储存在-20℃直到分析。将粪便样品通过离心沉淀，重新
悬浮在1ml GUS提取缓冲液中(50mM NaHPO4，5mM DTT，1mM EDTA，0.1％ TritonX-100)，在
22℃混合和温育10分钟。样品在-20℃冷冻过夜，在测定β-葡糖醛酸糖苷酶活性前融化。
β-葡糖醛酸糖苷酶活性通过将100μl处理过的粪便悬浮液与900μl反应缓冲液(含有
1mM对硝基苯基葡萄糖苷酸的提取缓冲液)温育并在37℃温育2小时来分析。通过加入
2.5ml pH 10.4的1M Tris终止反应。在415nm处测定吸收值，使用浓度为0.1、0.2、0.5、1
和10mM对硝基酚制作标准曲线。
20mM磷酸盐缓冲液中匀浆。样品储存在-20℃直到分析。将粪便样品通过离心沉淀，重新
悬浮在1ml GUS提取缓冲液中(50mM NaHPO4，5mM DTT，1mM EDTA，0.1％ TritonX-100)，在
22℃混合和温育10分钟。样品在-20℃冷冻过夜，在测定β-葡糖醛酸糖苷酶活性前融化。
β-葡糖醛酸糖苷酶活性通过将100μl处理过的粪便悬浮液与900μl反应缓冲液(含有
1mM对硝基苯基葡萄糖苷酸的提取缓冲液)温育并在37℃温育2小时来分析。通过加入
2.5ml pH 10.4的1M Tris终止反应。在415nm处测定吸收值，使用浓度为0.1、0.2、0.5、1
和10mM对硝基酚制作标准曲线。
[0329] 细菌移位、毒理研究和组织学
[0330] 在特定的时间间期用试验菌株喂食后，用过量的戊巴比妥钠使动物安乐死。通过对右心室进行心脏穿刺获得血样。检查并记录每只大鼠内脏器官的大体解剖学。切下肝
脏、脾脏、回肠、盲肠和结肠组织样品。将组织样品收集在盒子中，放置在4％甲醛(PBS)溶
液中，然后包埋在石蜡中用于组织学分析和FISH研究。回肠和结肠的一部分被冷冻在液氮
中。将血液样品铺板在BHI固体培养基上，在37℃温育过夜。
脏、脾脏、回肠、盲肠和结肠组织样品。将组织样品收集在盒子中，放置在4％甲醛(PBS)溶
液中，然后包埋在石蜡中用于组织学分析和FISH研究。回肠和结肠的一部分被冷冻在液氮
中。将血液样品铺板在BHI固体培养基上，在37℃温育过夜。
[0331] 免疫调节
[0332] 从冷冻的回肠和结肠样品使用Trizol试剂提取总RNA。RNA的浓度通过用DNase处理完成后使用Nanodrop分光光度计测量260nm的吸收值来确定。将每个RNA样品稀释
到浓度为42ng/μl。将每种样品总共5μg使用狭线印迹一式三份装置转移到尼龙膜上。
然后用从大鼠基因组DNA扩增的、用DIG标记的肿瘤坏死因子(TNF)、γ-干扰素(IFN)或
β-肌动蛋白DNA探针探测膜。将膜暴露于X-射线胶片过夜并显影。
到浓度为42ng/μl。将每种样品总共5μg使用狭线印迹一式三份装置转移到尼龙膜上。
然后用从大鼠基因组DNA扩增的、用DIG标记的肿瘤坏死因子(TNF)、γ-干扰素(IFN)或
β-肌动蛋白DNA探针探测膜。将膜暴露于X-射线胶片过夜并显影。
[0333] 结果
[0334] 总体健康状况和体重增加
[0335] 在整个研究期间，在大鼠中没有观察到明显的行为或活动变化，在实验组和对照组之间也没有可察觉的区别。没有发生与处理相关的疾病或死亡。
[0336] β-葡糖醛酸糖苷酶活性
[0337] 细菌的酶，包括β-葡糖醛酸糖苷酶，已知参与了从GIT中发现的前体产生诱变物、致癌物和肿瘤促进物，它们的存在可能指示了细菌菌株的毒性，因此可以用作可能的益
生菌的安全性指示。ST4SA菌株和Lactovita悬浮液在体外都没有显示出β-葡糖醛酸糖
苷酶活性(数据未显示)。但是，给予了Lactovita悬浮液的大鼠对对照大鼠相比显示出
粪便样品中β-葡糖醛酸糖苷酶活性增加(表 18A)。对照动物在研究的107天时与56天
时的活性相比也显示出活性降低，实验动物在107天时与56天时相比显示出值略微增加。
给予ST4补加物的大鼠与对照组相比显示出较高的β-葡糖醛酸糖苷酶活性(表18B)，但
是，该活性在研究结束时与研究第0天的值相比仍然较低。对照组在研究结束时也显示出
比第0天低的活性。
生菌的安全性指示。ST4SA菌株和Lactovita悬浮液在体外都没有显示出β-葡糖醛酸糖
苷酶活性(数据未显示)。但是，给予了Lactovita悬浮液的大鼠对对照大鼠相比显示出
粪便样品中β-葡糖醛酸糖苷酶活性增加(表 18A)。对照动物在研究的107天时与56天
时的活性相比也显示出活性降低，实验动物在107天时与56天时相比显示出值略微增加。
给予ST4补加物的大鼠与对照组相比显示出较高的β-葡糖醛酸糖苷酶活性(表18B)，但
是，该活性在研究结束时与研究第0天的值相比仍然较低。对照组在研究结束时也显示出
比第0天低的活性。
[0338] 表18
[0339] 表18A
[0340]
[0341] 细菌移位、毒理学研究和组织学
[0342] 在任何动物组中都没有检测到菌血症。内脏器官的肉眼检查表明给予菌株ST4SA的大鼠具有比对照大鼠明显更显著的MLN。在对照大鼠中极难鉴定到MLN。对照组中的脾
脏较为狭窄，对照组与实验组相比肌肉量和腹部脂肪都较少。在给予Lactovita的动物中，
与对照组相比，MLN没有那么显著，脾脏也较小。
脏较为狭窄，对照组与实验组相比肌肉量和腹部脂肪都较少。在给予Lactovita的动物中，
与对照组相比，MLN没有那么显著，脾脏也较小。
[0343] 淋巴细胞进入脾脏，并促进针对血液抗原的免疫应答。增大的脾脏可能表明免疫系统活性增加。这也与显著的MLN有关。MLN也参与免疫功能，并可能作为炎症或感染的结
果而增大。这种增大是它们正在执行其预期功能的指示。因此，菌株ST4SA可能起免疫刺
激剂的作用。接受Lactovita补加剂的大鼠与对照大鼠相比显示出较小的脾脏和较不显著
的MLN。这表明Lactovita不诱导免疫反应。但是，在没有任何免疫刺激物的情况下对照大
鼠的MLN和脾脏增大了，并且没有观察到疾病的症状。
果而增大。这种增大是它们正在执行其预期功能的指示。因此，菌株ST4SA可能起免疫刺
激剂的作用。接受Lactovita补加剂的大鼠与对照大鼠相比显示出较小的脾脏和较不显著
的MLN。这表明Lactovita不诱导免疫反应。但是，在没有任何免疫刺激物的情况下对照大
鼠的MLN和脾脏增大了，并且没有观察到疾病的症状。
[0344] 免疫调节
[0345] Northern杂交研究没有表明在实验ST4SA组或对照组中有任何细胞因子(TNF或IFN)的表达。当使用β-肌动蛋白DNA探针探测RNA时，检测到了相对同样强度的阳性信
号，表明了RNA的存在。
号，表明了RNA的存在。
[0346] 细胞因子是介导细胞生长、炎症、免疫、分化和修复的分泌的蛋白。它们通常只需要飞摩尔(femtomolar)的浓度就产生它们所需的效果。通常它们与细胞表面受体一同作
用，产生RNA和蛋白合成模式的变化。因为它们通常存在的浓度太低，因此，确定在这些蛋
白的影响之下的其它基因的表达可能更加有利。
用，产生RNA和蛋白合成模式的变化。因为它们通常存在的浓度太低，因此，确定在这些蛋
白的影响之下的其它基因的表达可能更加有利。
[0347] 本文显示的结果表明，测试的益生菌对雄性Wistar大鼠的总体健康状况都没有负面影响。
[0348] 概括来说，菌株ST4SA不具有编码万古霉素抗性的基因。编码β-溶血素活性和非细胞溶素β-溶血素III的基因被探明，但是它们保持沉默(不表达)。菌株ST4SA不
具有胆盐水解(BSH)活性。这表明该菌株在GIT的下段(回肠和结肠)将更好地起作用。
正如上面显示的那样，数据表明蒙氏肠球菌菌株ST4SA自由运动通过GIT，并阻止了李斯特
菌与Caco-2细胞的粘附，同时也成功地对抗李斯特菌竞争与人类细胞上受体的结合。在胃
肠模型(GIM)研究中，菌株ST4SA对单核细胞增多性李斯特菌具有抗微生物效应。正如在
大鼠研究中显示的那样，菌株ST4SA没有毒性。没有发生与处理相关的疾病或死亡。菌株
ST4SA的表现也比Lactovita更好，因为给予Lactovita的大鼠显示出β-葡糖醛酸糖苷酶
活性增加；因此，菌株ST4SA在大鼠中刺激了免疫应答。与对照大鼠相比，给予Lactovita
补加物的大鼠显示出较小的脾脏和较不显著的MLN，提示Lactovita不诱导免疫反应。
具有胆盐水解(BSH)活性。这表明该菌株在GIT的下段(回肠和结肠)将更好地起作用。
正如上面显示的那样，数据表明蒙氏肠球菌菌株ST4SA自由运动通过GIT，并阻止了李斯特
菌与Caco-2细胞的粘附，同时也成功地对抗李斯特菌竞争与人类细胞上受体的结合。在胃
肠模型(GIM)研究中，菌株ST4SA对单核细胞增多性李斯特菌具有抗微生物效应。正如在
大鼠研究中显示的那样，菌株ST4SA没有毒性。没有发生与处理相关的疾病或死亡。菌株
ST4SA的表现也比Lactovita更好，因为给予Lactovita的大鼠显示出β-葡糖醛酸糖苷酶
活性增加；因此，菌株ST4SA在大鼠中刺激了免疫应答。与对照大鼠相比，给予Lactovita
补加物的大鼠显示出较小的脾脏和较不显著的MLN，提示Lactovita不诱导免疫反应。
[0349] 正如上面指出的那样，肽ST4SA抑制各种不同细菌的生长，肽ST4SA的最大产量(51 200AU/ml)是在MRS肉汤(Biolab)中20小时后记录到的，并在整个发酵过程中得以维
持。
持。
[0350] 18小时的培养菌株ST4SA培养物被分别接种(2％，v/v，OD600nm＝2.0)到MRS肉汤(Biolab)和过滤的MRS肉汤中。MRS肉汤(Biolab)使用装备有孔径为6000-8000 Da的硝
TM
酸纤维素膜的Minitan 系统(Millipore，BioSciences International)过滤。然后将含
有小于8000Da的蛋白的MRS滤液(MRSf)高温高压灭菌，按照以前的描述接种。在MRS肉
汤和MRSf中的培养在30℃和37℃下不搅拌进行29小时。每2小时测定肽ST4SA的活性。
TM
酸纤维素膜的Minitan 系统(Millipore，BioSciences International)过滤。然后将含
有小于8000Da的蛋白的MRS滤液(MRSf)高温高压灭菌，按照以前的描述接种。在MRS肉
汤和MRSf中的培养在30℃和37℃下不搅拌进行29小时。每2小时测定肽ST4SA的活性。
[0351] 肽ST4SA的纯化
[0352] 用蒙氏肠球菌ST4SA接种1升MRSf(OD600nm＝1.8)，在30℃温育24小时。离心(8000 x g，4℃，15min)收获细胞，将无细胞上清液在80℃温育10分钟。在4℃下向无细胞
上清液中轻柔加入硫酸铵到60％的饱和水平。经过4小时缓慢搅拌后，通过离心(20000x
g，1h，4℃)收集沉淀。将沉淀重新悬浮在十分之一体积的25mM乙酸铵(pH6.5)中，对无
菌MilliQ水使用1.0kDa截留Spectra/Por透析膜(SpectrumInc.，CA，USA)进行脱盐。
按照本文前面的描述使用 纯化仪(Amersham)在1 ml Resource S柱(Amersham
Biosciences)中通过阳离子交换色谱进行进一步的分离。
上清液中轻柔加入硫酸铵到60％的饱和水平。经过4小时缓慢搅拌后，通过离心(20000x
g，1h，4℃)收集沉淀。将沉淀重新悬浮在十分之一体积的25mM乙酸铵(pH6.5)中，对无
菌MilliQ水使用1.0kDa截留Spectra/Por透析膜(SpectrumInc.，CA，USA)进行脱盐。
按照本文前面的描述使用 纯化仪(Amersham)在1 ml Resource S柱(Amersham
Biosciences)中通过阳离子交换色谱进行进一步的分离。
[0353] 在每个纯化步骤后获得的肽ST4SA的活性水平显示在表19中。
[0354] 表19
[0355]样品 活性 总蛋白 比活性 产率 纯化
(AU/ml) (μg/ml) (AU/μg蛋白) (％) 系数
无细胞上清液 12 800 10.77 1 188.49 100 1
(450ml)
硫酸铵沉淀 102 400 82.31 1 244.08 80 1.1
(45ml)
透析液 102 400 35.77 2 862.73 80 2.4
(45ml)
(AU/ml) (μg/ml) (AU/μg蛋白) (％) 系数
无细胞上清液 12 800 10.77 1 188.49 100 1
(450ml)
硫酸铵沉淀 102 400 82.31 1 244.08 80 1.1
(45ml)
透析液 102 400 35.77 2 862.73 80 2.4
(45ml)
[0356] 从 纯化仪收集到的活性级份对应于ST4SA峰，产生了42个氨基酸的肽，这是肽ST4SA的预计大小。
[0357] 肽ST4SA的等电聚焦
[0358] 肽ST4SA的等电聚焦使用Rotofor 等电聚焦装置(Bio-Rad，Hercules，California，USA)进行。从培养在MRSf中的菌株ST4SA获得的、按照以前的描述制备的1
升无细胞上清液被冷冻干燥，按照制造商的说明书重新悬浮在50ml含有两性电解质(pH范
围3到10，Bio-Rad)的无菌蒸馏水中。在8℃施加12W的恒定电流5小时。分离后，从每
个收集的级份的少量用3N NaOH或3N HCl调整到pH 7.0，并测试对干酪乳酸杆菌LHS的抗
微生物活性。测试为阳性的级份被合并，重新悬浮在去离子水中到总体积50ml，再次进行等
电聚焦，收集级份并测试抗微生物活性。将样品储存在-20℃。
升无细胞上清液被冷冻干燥，按照制造商的说明书重新悬浮在50ml含有两性电解质(pH范
围3到10，Bio-Rad)的无菌蒸馏水中。在8℃施加12W的恒定电流5小时。分离后，从每
个收集的级份的少量用3N NaOH或3N HCl调整到pH 7.0，并测试对干酪乳酸杆菌LHS的抗
微生物活性。测试为阳性的级份被合并，重新悬浮在去离子水中到总体积50ml，再次进行等
电聚焦，收集级份并测试抗微生物活性。将样品储存在-20℃。
[0359] 培养基的成本降低成为培养基优化的重要部分。可以通过使用工业培养基作为碳源和/或氮源来降低培养基成本。玉米浆(CSL)、乳清粉CWp)和糖蜜常规用作生长培养基
的一部分。CSL是在玉米磨粉过程中形成的副产物。它主要是氮源，但是也含有糖(主要是
蔗糖)、维生素和矿物质。乳清是乳制品工业中的副产物，是乳酸(LA)生产的最常用的发酵
培养基，主要含有乳糖、蛋白和盐。糖蜜是主要含有蔗糖以及微量其它矿物质的副产物。
的一部分。CSL是在玉米磨粉过程中形成的副产物。它主要是氮源，但是也含有糖(主要是
蔗糖)、维生素和矿物质。乳清是乳制品工业中的副产物，是乳酸(LA)生产的最常用的发酵
培养基，主要含有乳糖、蛋白和盐。糖蜜是主要含有蔗糖以及微量其它矿物质的副产物。
[0360] 培养物和培养基
[0361] 菌株ST4SA培养在MRS肉汤(Biolab)中，并分别接种(2％ v/v)到CSL、CWp和糖蜜中。
[0362] 发酵
[0363] 发酵在含有10ml培养基的试管中进行。在灭菌(121℃，15分钟)前用NaOH调节pH。NaOH的浓度依赖于培养基的缓冲能力。使用24小时的培养物进行接种(2％v/v)。在
试管中在30℃、pH 6.5-7.0下进行分批发酵16小时。不控制pH。在600nm处测定光密度
(OD)。
试管中在30℃、pH 6.5-7.0下进行分批发酵16小时。不控制pH。在600nm处测定光密度
(OD)。
[0364] 评估了10、20和50g.l-1的糖蜜和CSL作为肽ST4SA产生的可能的培养基(表20)。尽管糖蜜中的pH在发酵过程中下降了(因此表明细胞生长)，但在上清液中没有记录到肽
-1 -1
ST4SA的活性。另一方面，CSL在最小浓度20g.l 时产生了具有高达3200AU.ml 活性的
上清液。从这些结果可以得出结论，为了持续生产肽ST4SA，氮源(CSL)是需要的。
-1 -1
ST4SA的活性。另一方面，CSL在最小浓度20g.l 时产生了具有高达3200AU.ml 活性的
上清液。从这些结果可以得出结论，为了持续生产肽ST4SA，氮源(CSL)是需要的。
[0365] 表20
[0366]-1
[0367] 在后续的实验中，将CWp加入到工业培养基列表中，在10、20和50g TS.l 下发酵-1
(表20)。在CWp中记录到了高达1600AU.ml 的肽ST4SA活性(表20)。
(表20)。在CWp中记录到了高达1600AU.ml 的肽ST4SA活性(表20)。
[0368] 使用了以CSL和CWp作为成分的全因子设计(FDD)来确定哪种培养基对肽ST4SA的生产有最显著的影响(表21)。FFD也给出了对于营养物之间是否具有任何相互作用的
指示。
指示。
[0369] 表212
[0370] 使用CSL和CWp的2FFD
[0371]
[0372] 糖的利用通过使用下面的方法来测定：
[0373] 总糖的苯酚-硫酸分析方法
[0374] 将苯酚(500μl，5％，v/v)和浓硫酸(2.5ml)加入到试管中的500μl稀释样品中。将溶液彻底涡旋，在490nm处获得吸光度读数(室温)。使用标准图计算糖的浓度(g
-1
葡萄糖.1 )。
-1
葡萄糖.1 )。
[0375] 单体糖的Dionex测定
[0376] 带有CarboPac PA100柱的Dionex DX500分析仪被用于分析样品的单体糖。使用-1
的洗脱液是250mM NaOH、H2O和1M NaOAc，流速为1ml.min 。Dionex装备有自动进样器，注
射体积为10μl。
的洗脱液是250mM NaOH、H2O和1M NaOAc，流速为1ml.min 。Dionex装备有自动进样器，注
射体积为10μl。
[0377] 总糖浓度在5到10g TS.l-1之间变化(分别用＂-1＂和＂1＂表示)。结果(实-1
验双份进行)表明，CSL和CWp的浓度对肽ST4SA的生产没有影响(表21)。5和10g TS.l
下CSL产生的肽ST4SA的活性与在CSL和CWp的组合中记录到的(表21)相似，比使用50g.
-1
l CSL记录到的高4倍(表20)。从这些结果证明，CSL对肽ST4SA的产生有最显著的影响。
验双份进行)表明，CSL和CWp的浓度对肽ST4SA的生产没有影响(表21)。5和10g TS.l
下CSL产生的肽ST4SA的活性与在CSL和CWp的组合中记录到的(表21)相似，比使用50g.
-1
l CSL记录到的高4倍(表20)。从这些结果证明，CSL对肽ST4SA的产生有最显著的影响。
[0378] 优化CSL
[0379] 在浓度为10g TS.l-1的纯CSL中记录到了高达12800AU ml-1的肽ST4SA活性。但-1
是，这与在MRS中记录到的肽ST4SA活性(51200AU.ml )相比要低。在预备性实验中，将MRS
-1
成分(除了葡萄糖)分别加入到10和40g TS.l CSL和CWp中(表22)。与纯CSL相比，
-1 -1
在含有补加物的10g TS.l CSL中观察到活性增加了两倍。相反，含有补加物的40g TS.l
下CSL产生了低活性。高浓度的CSL抑制了生长(pH降低得少)，从而也抑制的肽ST4SA的
生产。这可能是由于CSL中的抑制性成分所致。使用CWp进行了同样的实验(表22)。随
-1
着CWp浓度的增加(从10到40g TS.l )，没有记录到对肽ST4SA的影响。
是，这与在MRS中记录到的肽ST4SA活性(51200AU.ml )相比要低。在预备性实验中，将MRS
-1
成分(除了葡萄糖)分别加入到10和40g TS.l CSL和CWp中(表22)。与纯CSL相比，
-1 -1
在含有补加物的10g TS.l CSL中观察到活性增加了两倍。相反，含有补加物的40g TS.l
下CSL产生了低活性。高浓度的CSL抑制了生长(pH降低得少)，从而也抑制的肽ST4SA的
生产。这可能是由于CSL中的抑制性成分所致。使用CWp进行了同样的实验(表22)。随
-1
着CWp浓度的增加(从10到40g TS.l )，没有记录到对肽ST4SA的影响。
[0380] 表22
[0381] 补加了MRS成分的CSL
[0382]-1 -1
[0383] 在10g TS.l CSL中，产生的肽ST4SA的活性与CWp相比为2倍(25600AU.ml )。因此CSL被选为培养基进行进一步实验。
[0384] 因为不是所有的MRS成分都对增加肽ST4SA的生产有作用，因此进行了筛选实验10-5
以鉴定重要的成分。该筛选实验是通过2 分数因子设计(FrFD)来进行的。设计使得在
仅仅32次实验而不是正常的1024次实验中测试10个因子成为可能(表23和24)。确定
在成分之间是否有相互作用也是可能的。结果用ANOVA进行分析(表25)。
以鉴定重要的成分。该筛选实验是通过2 分数因子设计(FrFD)来进行的。设计使得在
仅仅32次实验而不是正常的1024次实验中测试10个因子成为可能(表23和24)。确定
在成分之间是否有相互作用也是可能的。结果用ANOVA进行分析(表25)。
[0385] 表23
[0386] 高浓度和低浓度的MRS成分和CSL
[0387]
[0388] 根据编码值的线性模型：
[0389] 活 性 ＝ -1431.2*B+956.2*C+3831.2*D-2781.3*E-2243.8*G-2006.2*K+7668.8[方程2]
[0390] R2＝0.73
[0391] 使用线性模型描述肽ST4SA的生产。尽管线性模型不能精确地预测活性(R2＝0.73)，但它仍然可以用于评估成分的效果(阳性或阴性)。牛肉提取物(B)、磷酸钾(E)、柠
檬酸三铵(G)和乙酸钠(K)在线性模型(方程2)中具有负的系数，导致反应变量降低。这
反映了它们对ST4SA生产的负效应。这意味着只有酵母提取物(YE)(C)和CSL(D)增加了
肽ST4SA的生产。
檬酸三铵(G)和乙酸钠(K)在线性模型(方程2)中具有负的系数，导致反应变量降低。这
反映了它们对ST4SA生产的负效应。这意味着只有酵母提取物(YE)(C)和CSL(D)增加了
肽ST4SA的生产。
[0392] 表24. 210-5FrFD设计
[0393]
[0394] 表25.210-5FrFD设计的方差表的分析
[0395]2
[0396] 使用2FFD设置CSL和YE的浓度(表26)。用于确定肽ST4SA活性的临界稀释方法没有产生准确的结果。这使得不可能将与CSL和YE浓度相关的模型与活性相拟合。实
验结果被用于确定成分的浓度。从表26中可以看出，当使用低或高浓度CSL和YE时没有
-1 -1
明显的影响。平均值被选为最好的，含有CSL 7.5g TS.l 和YE 6.5g.l 的组成。
验结果被用于确定成分的浓度。从表26中可以看出，当使用低或高浓度CSL和YE时没有
-1 -1
明显的影响。平均值被选为最好的，含有CSL 7.5g TS.l 和YE 6.5g.l 的组成。
[0397] 表262
[0398] 带有3个中心点的2FFD，用于确定CSL和YE的浓度
[0399]
[0400] 使用最适培养基的生长曲线显示在图30中。基于CSL的培养基和MRS产生了相似的生长动力学。
[0401] 批间差异
[0402] 因为是废物产品，CSL的组成可能每天都不同。组成的差异可能对结果有显著的影响。这通过对第二批CSL进行同样的实验来研究。这次ANOVA分析鉴定YE、CSL、Tween80、
MnSO4和乙酸钠为对细菌素生产有最显著影响的成分(P<0.1)。连续的优化显示出MnSO4是
不显著的，而乙酸钠引起了活性的降低。
MnSO4和乙酸钠为对细菌素生产有最显著影响的成分(P<0.1)。连续的优化显示出MnSO4是
不显著的，而乙酸钠引起了活性的降低。
[0403] 最终的培养基由下列三种成分组成：YE(C)、CSL(D)和Tween80(F)。意料之内地发3
现酵母又一次是重要成分之一。Tween80具有乳化性质。根据在2FFD设计中的设置，最终
-1 -1 -1
的浓度是：YE 7.5g.l ，CSL10g.l ，Tween80 2g.l 。
现酵母又一次是重要成分之一。Tween80具有乳化性质。根据在2FFD设计中的设置，最终
-1 -1 -1
的浓度是：YE 7.5g.l ，CSL10g.l ，Tween80 2g.l 。
[0404] 生长限制
[0405] 在发酵之前和之后测量了CSL培养基的糖含量。在发酵开始时，CSL的浓度接-1 -1
近7.5g TS.l 。存在的主要单糖是葡萄糖和果糖，总浓度为3.883g.l 。因此，只有大约
51.8％的总糖处于可发酵的形式，并且不是所有的糖都在发酵期间被代谢。在发酵结束时
(OD恒定)，pH为4.6，剩余的残糖为8.8％。生长限制是由于pH低而不是由于缺少氮、矿
物质、维生素或任何其它营养物，表27显示了在发酵过程中的碳摄入。
近7.5g TS.l 。存在的主要单糖是葡萄糖和果糖，总浓度为3.883g.l 。因此，只有大约
51.8％的总糖处于可发酵的形式，并且不是所有的糖都在发酵期间被代谢。在发酵结束时
(OD恒定)，pH为4.6，剩余的残糖为8.8％。生长限制是由于pH低而不是由于缺少氮、矿
物质、维生素或任何其它营养物，表27显示了在发酵过程中的碳摄入。
[0406] 表27
[0407] 发酵过程中的碳摄入
[0408]
[0409] 因此，显然补加了YE的CSL可以与商业化MRS肉汤中达到的高ST4SA肽水平相匹敌。有利的是，这可能显著降低了与培养基有关的成本。选择CSL作为工业生产ST4SA肽
的生长培养基。
的生长培养基。
[0410] 将蒙氏肠球菌ST4SA开发成益生菌
[0411] 选择益生菌株的重要标准是与上皮细胞的粘附。益生细菌也可以与病原细菌竞争粘附位点。源自于人类结肠腺癌的Caco-2细胞被用作体外模型，以研究蒙氏肠球菌ST4SA
与上皮细胞的粘附和竞争性排斥。
与上皮细胞的粘附和竞争性排斥。
[0412] 结果表示为与接种物相比的粘附百分率。蒙氏肠球菌ST4SA和单核细胞增多性李斯特菌Scott A都能够粘附，并且都显示出与Caco-2细胞有5％的粘附。当温育时间仅仅
为1小时时，蒙氏肠球菌ST4SA的粘附降低到1％。食物物质在小肠中停留2小时，因此使
蒙氏肠球菌ST4有足够的时间与上皮细胞粘附。但是，蒙氏肠球菌ST4SA对单核细胞增多
性李斯特菌Scott A的粘附没有影响，无论菌株是在与病原菌温育之前、期间还是之后加入
的。在排斥和置换试验中，单核细胞增多性李斯特菌Scott A显示出5％的粘附。竞争性试
验显示出没有针对粘附的竞争，因为粘附百分率保持与对照中相同。这可以用蒙氏肠球菌
ST4SA和单核细胞增多性李斯特菌Scott A可能结合上皮细胞上的不同受体这个事实来解
释。因此，蒙氏肠球菌ST4SA和单核细胞增多性李斯特菌Scott A将不竞争类似的受体。
为1小时时，蒙氏肠球菌ST4SA的粘附降低到1％。食物物质在小肠中停留2小时，因此使
蒙氏肠球菌ST4有足够的时间与上皮细胞粘附。但是，蒙氏肠球菌ST4SA对单核细胞增多
性李斯特菌Scott A的粘附没有影响，无论菌株是在与病原菌温育之前、期间还是之后加入
的。在排斥和置换试验中，单核细胞增多性李斯特菌Scott A显示出5％的粘附。竞争性试
验显示出没有针对粘附的竞争，因为粘附百分率保持与对照中相同。这可以用蒙氏肠球菌
ST4SA和单核细胞增多性李斯特菌Scott A可能结合上皮细胞上的不同受体这个事实来解
释。因此，蒙氏肠球菌ST4SA和单核细胞增多性李斯特菌Scott A将不竞争类似的受体。
[0413] 蒙氏肠球菌ST4SA对抗生素和抗炎性药物的抗性
[0414] 蒙氏肠球菌ST4SA显示出对两种抗生素(Cefasyn和Utin)以及抗炎性药物Rheugesic、Coxflam和Pynmed的抗性。结果显示在表28中。对蒙氏肠球菌ST4SA具有最
大生长抑制的抗生素是Promoxil、Cipadur、Roxibidd和Doximal。
大生长抑制的抗生素是Promoxil、Cipadur、Roxibidd和Doximal。
[0415] 与对照相比，Promoxil、Doximal、Cefasyn和Utin对ST4SA细胞与Caco-2细胞的粘附没有影响。在Cipadur、Roxibudd和Ibugestic糖浆的存在下粘附降低了10％，在较
高浓度Cefasyn的存在下降低了14％，这可以在表29中看到。
高浓度Cefasyn的存在下降低了14％，这可以在表29中看到。
[0416] 表28
[0417]药物 菌株ST4SA
布洛芬，5mg/ml ++
阿司匹林，5mg/ml +
Promoxil，100mg/ml ++++
Cipadur，50mg/ml +++
Cefasyn，100mg/ml -
Roxibidd，30mg/ml +++
Doximal，20mg/ml +++
Ciploxx，100mg/ml +
Utin，80mg/ml -
Rheugesic，4mg/ml -
Coxflam，1.5mg/ml -
K-fenak，5mg/ml ++
Preflam，3mg/ml +
Ibugesic ++
Pynmed -
布洛芬，5mg/ml ++
阿司匹林，5mg/ml +
Promoxil，100mg/ml ++++
Cipadur，50mg/ml +++
Cefasyn，100mg/ml -
Roxibidd，30mg/ml +++
Doximal，20mg/ml +++
Ciploxx，100mg/ml +
Utin，80mg/ml -
Rheugesic，4mg/ml -
Coxflam，1.5mg/ml -
K-fenak，5mg/ml ++
Preflam，3mg/ml +
Ibugesic ++
Pynmed -
[0418] -＝没有抑菌圈；+＝直径在1mm和11mm之间；++＝直径在12mm和16mm之间；+++＝直径在17mm及以上。
[0419] 表29
[0420]药物 菌株ST4SA的粘附
接种物 1 x 107
对照 5 x 104
Cipadur(5mg/ml) 6 x 103
Roxibidd(10mg/ml) 3 x 103
Promoxil(8mg/ml) 1.25 x 104
Doximal(2mg/ml) 1 x 104
Cefasyn(10mg/ml) 1.2x104
Cefasyn(50mg/ml) 7 x 102
Utin(8mg/ml) 4 x 104
Utin(40mg/ml) 3 x 104
Ibugestic糖浆(100μl) 6 x 103
K-fenak(0.5mg/l) 3x104
接种物 1 x 107
对照 5 x 104
Cipadur(5mg/ml) 6 x 103
Roxibidd(10mg/ml) 3 x 103
Promoxil(8mg/ml) 1.25 x 104
Doximal(2mg/ml) 1 x 104
Cefasyn(10mg/ml) 1.2x104
Cefasyn(50mg/ml) 7 x 102
Utin(8mg/ml) 4 x 104
Utin(40mg/ml) 3 x 104
Ibugestic糖浆(100μl) 6 x 103
K-fenak(0.5mg/l) 3x104
[0421] 体内评估口服施用蒙氏肠球菌ST4SA细胞的安全性、毒性、细菌移位和存活性、免疫调节能力和效能——与Lactovita比较
[0422] 动物
[0423] 将36只称重在150g到180g之间的雄性Wistar大鼠以6组一组，笼养在塑料笼子中，使用12小时的光照/黑暗周期，并在受控的环境下(温度20℃±3℃)。动物用标准
的饮食喂养，并不受限制。
的饮食喂养，并不受限制。
[0424] 细菌菌株和益生菌
[0425] 蒙氏肠球菌菌株ST4SA在MRS肉汤中在30℃培养18小时；将600nm处光密度调整到1.8。离心收获细胞，在20mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)中清洗。将清洗过的细胞重新悬
浮在100mM蔗糖中，-80℃冷冻并冻干过夜。通过将给定质量的细胞悬浮在1ml磷酸盐缓冲
液中并在MRS固体培养基上稀释铺板，测定了cfu/小瓶值。冻干的细胞被重新悬浮在无菌
8
脱脂奶(10％)中，通过胃内管饲施用2x10cfu的菌株ST4SA。
浮在100mM蔗糖中，-80℃冷冻并冻干过夜。通过将给定质量的细胞悬浮在1ml磷酸盐缓冲
液中并在MRS固体培养基上稀释铺板，测定了cfu/小瓶值。冻干的细胞被重新悬浮在无菌
8
脱脂奶(10％)中，通过胃内管饲施用2x10cfu的菌株ST4SA。
[0426] 将Lactovita胶囊倒入小瓶中，重新悬浮在无菌脱脂奶(10％)中，通过胃内管饲8
施用2x10cfu。
施用2x10cfu。
[0427] 单核细胞增多性李斯特菌Scott A在BHI肉汤中在37℃培养18小时。通过离心收获细胞，在20mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)中清洗。将清洗过的细胞重新悬浮在100mM蔗糖
中，-80℃冷冻并冻干过夜。按照上面的描述测定了cfu/小瓶的数量。冻干的细胞重新悬
4
浮在无菌脱脂奶(10％)中，通过胃内管饲施用10cfu。
中，-80℃冷冻并冻干过夜。按照上面的描述测定了cfu/小瓶的数量。冻干的细胞重新悬
4
浮在无菌脱脂奶(10％)中，通过胃内管饲施用10cfu。
[0428] 实验设计
[0429] 两组动物通过胃内管饲接受菌株ST4，两组接受Lactovita，剩下两个对照组接受水，连续7天。在第8天，通过胃内管饲，两个对照组用单核细胞增多性李斯特菌感染，菌株
ST4SA和Lactovita组各一组也用单核细胞增多性李斯特菌感染。这时，动物也接受蒙氏肠
球菌ST4SA、Lactovita或水。在第9天和第10天再次施用益生菌和水。当对照组开始出
现症状时，给其中一组通过胃内管饲施用蒙氏肠球菌ST4SA。然后监测该组症状的缓解。
ST4SA和Lactovita组各一组也用单核细胞增多性李斯特菌感染。这时，动物也接受蒙氏肠
球菌ST4SA、Lactovita或水。在第9天和第10天再次施用益生菌和水。当对照组开始出
现症状时，给其中一组通过胃内管饲施用蒙氏肠球菌ST4SA。然后监测该组症状的缓解。
[0430] 每天两次监测动物的李斯特菌病症状。在第11天处死动物(除了现在接受蒙氏肠球菌菌株ST4SA的对照组之外)。从右心室获取血样。通过病理实验室测定全血计数，将
血样接种到BHI固体培养基和李斯特菌选择性琼脂培养基上，测定cfu/ml。收集血浆，测定
内毒素水平和细胞因子(IL-6和IFN-α)水平。切下肝脏、脾脏和胃肠道切片，在石蜡包埋
前固定在甲醛中。
血样接种到BHI固体培养基和李斯特菌选择性琼脂培养基上，测定cfu/ml。收集血浆，测定
内毒素水平和细胞因子(IL-6和IFN-α)水平。切下肝脏、脾脏和胃肠道切片，在石蜡包埋
前固定在甲醛中。
[0431] 用溶血素和伊红染色切片，用于组织学分析。溶血素和伊红分析表明口服菌株ST4SA不对肝脏、脾脏或GIT产生任何结构伤害(参见图31)。在施用菌株ST4SA和仅接受
不含补加物的水的动物间没有观察到区别。
不含补加物的水的动物间没有观察到区别。
[0432] 如在本文所述，从大豆提取物中分离的蒙氏肠球菌菌株ST4SA，已经被本申请人发现能够产生有用的抗菌肽——ST4SA肽，它对许多病原性生物体、例如从人类中耳感染和人
类肠道中分离的病原生物体具有活性。有利的是，肽ST4SA不具有细胞毒性。通过糖发酵
反应、许多生化实验、两个质粒(pST4SA1和pST4SA2)的存在、以及编码与肠上皮细胞和粘
膜粘附的独特基因(AdhST4SA)，本申请人已经将蒙氏肠球菌菌株ST4SA与其它蒙氏肠球菌
菌株区分开。肽ST4SA已经被纯化并测序，它含有两个大的疏水区。本申请人分离并测序
了编码肽ST4SA的核酸序列，以及编码肽ST4SA跨细胞膜转运的核酸序列，它的作用是赋予
了生产细胞对抗它自身的肽的免疫性。所有上述的基因都位于基因组上，因为从菌株中消
除其质粒没有导致抗微生物活性的丧失。此外，用质粒转化粪肠球菌菌株也没有将受体菌
株转变成肽ST4SA生产菌，这进一步证明了基因不位于质粒上。用蛋白水解酶处理肽后抗
微生物活性的丧失，证实了活性是由于肽的结构而不是与分子连接的脂质或碳水化合物。
令人吃惊的是，肽在pH2.0到12.0之间的缓冲液中温育30分钟后、以及在100℃下90分
钟后，仍保留了活性。更令人吃惊的是，用EDTA、SDS、Tween 20、Tween 80和TritonX-100
处理没有导致抗微生物活性的丧失。菌株ST4SA在低pH条件下(pH 2.5)存活，在6.5％
NaCl存在下在pH被调整到4.0到9.6的培养基中生长，并耐受1.0％(w/v)胆盐和胰液。
菌株ST4SA的生长发生在10℃(尽管缓慢)到45℃之间，最适生长在37℃。从葡萄糖只产
生L(+)-乳酸。这些菌株特性、即使当菌株暴露于环境应激下时肽ST4SA仍能快速稳定地
生产、肽没有毒性的事实、以及它由具有GRAS(一般被认为是安全的)状态的生物体产生，
这些都使菌株成为有用的益生菌。
类肠道中分离的病原生物体具有活性。有利的是，肽ST4SA不具有细胞毒性。通过糖发酵
反应、许多生化实验、两个质粒(pST4SA1和pST4SA2)的存在、以及编码与肠上皮细胞和粘
膜粘附的独特基因(AdhST4SA)，本申请人已经将蒙氏肠球菌菌株ST4SA与其它蒙氏肠球菌
菌株区分开。肽ST4SA已经被纯化并测序，它含有两个大的疏水区。本申请人分离并测序
了编码肽ST4SA的核酸序列，以及编码肽ST4SA跨细胞膜转运的核酸序列，它的作用是赋予
了生产细胞对抗它自身的肽的免疫性。所有上述的基因都位于基因组上，因为从菌株中消
除其质粒没有导致抗微生物活性的丧失。此外，用质粒转化粪肠球菌菌株也没有将受体菌
株转变成肽ST4SA生产菌，这进一步证明了基因不位于质粒上。用蛋白水解酶处理肽后抗
微生物活性的丧失，证实了活性是由于肽的结构而不是与分子连接的脂质或碳水化合物。
令人吃惊的是，肽在pH2.0到12.0之间的缓冲液中温育30分钟后、以及在100℃下90分
钟后，仍保留了活性。更令人吃惊的是，用EDTA、SDS、Tween 20、Tween 80和TritonX-100
处理没有导致抗微生物活性的丧失。菌株ST4SA在低pH条件下(pH 2.5)存活，在6.5％
NaCl存在下在pH被调整到4.0到9.6的培养基中生长，并耐受1.0％(w/v)胆盐和胰液。
菌株ST4SA的生长发生在10℃(尽管缓慢)到45℃之间，最适生长在37℃。从葡萄糖只产
生L(+)-乳酸。这些菌株特性、即使当菌株暴露于环境应激下时肽ST4SA仍能快速稳定地
生产、肽没有毒性的事实、以及它由具有GRAS(一般被认为是安全的)状态的生物体产生，
这些都使菌株成为有用的益生菌。
[0433] 肽也可以用作液体制剂中的抗微生物剂，用于例如中耳感染的局部治疗。该液体制剂可以使用滴耳液给药器用于耳朵。液体制剂也包含在液体形式的蒙氏肠球菌益生菌
中，用作餐食的液体补加剂。肽还被发现可用作喷鼻剂中液体或吸入形式的抗微生物剂，用
于治疗例如鼻窦感染或鼻窦炎。肽还可以用作囊封在聚合物中的抗微生物剂。然后将该聚
合物用于制剂中，用于感染例如皮肤感染的局部治疗，或者它可以用于掺入到移植物例如
耳置管中，或掺入到创伤敷料中。将抗微生物肽囊封在聚合物中导致抗微生物肽的缓慢释
放以及对微生物感染的治疗时限延长。该肽还被发现通过掺入到软膏、洗液或霜膏制剂中
作为抗微生物剂应用，用于治疗感染。肽还可以进一步通过掺入到液体制剂例如隐形眼镜
清洗液中用作抗微生物剂，或者它可以掺入到隐形眼镜本身中。肽还可以通过掺入到包装
材料例如塑料中用作抗微生物剂，用于生产无菌包装。在本发明的另一种形式中，肽可以以
片剂形式或胶囊形式用作蒙氏肠球菌广谱益生菌的一部分，或者它可以是可食用的形式例
如甜食或口香糖。
中，用作餐食的液体补加剂。肽还被发现可用作喷鼻剂中液体或吸入形式的抗微生物剂，用
于治疗例如鼻窦感染或鼻窦炎。肽还可以用作囊封在聚合物中的抗微生物剂。然后将该聚
合物用于制剂中，用于感染例如皮肤感染的局部治疗，或者它可以用于掺入到移植物例如
耳置管中，或掺入到创伤敷料中。将抗微生物肽囊封在聚合物中导致抗微生物肽的缓慢释
放以及对微生物感染的治疗时限延长。该肽还被发现通过掺入到软膏、洗液或霜膏制剂中
作为抗微生物剂应用，用于治疗感染。肽还可以进一步通过掺入到液体制剂例如隐形眼镜
清洗液中用作抗微生物剂，或者它可以掺入到隐形眼镜本身中。肽还可以通过掺入到包装
材料例如塑料中用作抗微生物剂，用于生产无菌包装。在本发明的另一种形式中，肽可以以
片剂形式或胶囊形式用作蒙氏肠球菌广谱益生菌的一部分，或者它可以是可食用的形式例
如甜食或口香糖。
[0434] 序列表
[0435] 蒙氏肠球菌菌株ST4SA(ATCC PTA-7278)16S核糖体亚基16S基因引物
[0436] SEQ.ID.NO.1：正向引物
[0437]
[0438] SEQ.ID.NO.2：反向引物
[0439]
[0440] 蒙氏肠球菌ST4SA(ATCC PTA-7278)结构基因引物
[0441] SEQ.ID.NO.3：正向引物
[0442]
[0443] SEQ.ID.NO.4：反向引物
[0444]
[0445] 蒙氏肠球菌ST4SA(ATCC PTA-7278)ABC转运蛋白基因引物
[0446] SEQ.ID.NO.5：正向引物
[0447]
[0448] SEQ.ID.NO.6：反向引物
[0449]
[0450] SEQ.ID.NO.7：正向引物
[0451]
[0452] SEQ.ID.NO.8：反向引物
[0453]
[0454] 蒙氏肠球菌ST4SA菌株(ATCC PTA-7278)免疫性基因引物
[0455] SEQ.ID.NO.9：正向引物
[0456]
[0457] SEQ.ID.NO.10：反向引物
[0458]
[0459] SEQ.ID.NO.11
[0460] 编码蒙氏肠球菌(ATCC PTA-7278)抗微生物肽ST4SA的多核苷酸
[0461]
[0462] SEQ.ID.NO.12
[0463] 由蒙氏肠球菌(ATCC PTA-7278)抗微生物肽ST4SA编码的多肽
[0464]
[0465] SEQ.ID.NO.13
[0466] 编码蒙氏肠球菌ST4SA(ATCC PTA-7278)ABC转运蛋白基因的多核苷酸
[0467]
[0468]
[0469] SEQ.ID.NO.14
[0470] 由蒙氏肠球菌ST4SA(ATCC PTA-7278)ABC转运蛋白基因编码的多肽
[0471]
[0472]
[0473] SEQ.ID.NO.15
[0474] 编码蒙氏肠球菌ST4SA(ATCC PTA-7278)免疫性基因的多核苷酸
[0475]
[0476] SEQ.ID.NO.16
[0477] 由蒙氏肠球菌ST4SA免疫性基因编码的多肽
[0478]
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种快速降解土壤油污的微生物菌剂 | 2020-05-12 | 628 |
| 具有对抗半翅目和/或鳞翅目昆虫的活性的昆虫抑制毒素家族 | 2020-05-13 | 745 |
| 经涂覆的颗粒及其制备和使用方法 | 2020-05-08 | 472 |
| 一种无毒灭鼠饵药及制备方法 | 2020-05-11 | 827 |
| 含有表面活性剂的钙钛矿溶液涂布设备及其方法 | 2020-05-13 | 480 |
| 一种油茶种植土壤改良用缓释肥 | 2020-05-08 | 254 |
| 一种农作物增产复合剂及其制备方法 | 2020-05-13 | 630 |
| 一种纤体纳米脂质体及其制备方法和应用 | 2020-05-08 | 106 |
| 作为添味剂的不饱和内酯 | 2020-05-14 | 904 |
| 一种基于丝素蛋白的纳米乳及其制备方法和应用 | 2020-05-13 | 875 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈