技术领域
[0001] 本
发明涉及脂肪酶抑制剂提取技术领域，具体为一种
海水稻胚芽中脂肪酶抑制剂的提取方法。
背景技术
[0002] 脂肪酶抑制剂的来源主要有化学合成、天然
植物提取物和
微生物代谢产物等。化学合成的有机磷化合物对脂肪酶有明显的抑制作用，但这类脂肪酶抑制剂主要用于研究脂肪酶催化反应机理。目前用于
治疗肥胖的脂肪酶抑制剂主要来源于
植物提取物和微生物
发酵产物。从植物中提取抑制脂肪酶活性成分的报道较多，如水皂
角中的黄烷二聚物等；微生物发酵方法生产的减肥用脂肪酶抑制剂，已有产品上市。
[0003] 中国
专利库公开了一种来源于纳豆的脂肪酶抑制剂及其制备方法和用途(CN201110278595.3)。该脂肪酶抑制剂是先将纳豆芽孢杆菌(Bacillus Subtilis natto)活化培养，再用固体发酵或液体发酵的方法制成含有抑制脂肪酶的活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物，再进行提取分离，最终制成脂肪酶抑制剂。本发明是通过抑制脂肪酶活性而达到减肥降脂的目的，其新颖性在于①该脂肪酶抑制剂来源于食用纳豆，对人体没有毒
副作用；②该脂肪酶抑制剂选择性地作用于胃肠道脂肪酶尤其是胰脂肪酶，而对蛋白酶和
淀粉酶等没有抑制作用。
[0004] 中国专利库公开了一种生物法制备脂肪酶抑制剂的方法 (CN201210304596.5)，包括菌体制备、生产脂肪酶抑制剂、脱色、
电渗析、制成脂肪酶抑制剂粉剂产品或脂肪酶抑制剂晶体产品等步骤。本发明利用游离乳酸菌细胞催化合成脂肪酶抑制剂，并改进生产工艺，使脂肪酶抑制剂产量提高，成本降低，而且还建立了制备高纯度脂肪酶抑制剂的方法。本工艺中反应体系里不含有
碳源、氮源等培养成分，相对于发酵液而言反应液成分简单，可大幅度提高产品纯度，同时具有后处理简单、生产周期短及环境污染小、成本低等优点。
[0005] 海水稻在我国取得了巨大的成功，海稻米不仅含有粮食作物的普通营养成分，而且作为一种在特殊海洋环境下生长的作物，还含有与普通稻米不同的特殊生物活性物质，包括：脂肪酶抑制剂(pancreatic lipase inhibitor,PLI)、六
磷酸肌醇(IP6)、脂肪酶抑制剂(GABA)、谷胱甘肽(GSH)等，如何有效地提取出海稻米中的有效成分，制得深入研究。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种外界条件刺激强化萃取法从海水稻胚芽中提取脂肪酶抑制剂的方法，简化了制备工艺，且制得的脂肪酶抑制剂组合物中脂肪酶抑制剂含量高。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案
[0008] 一种海水稻胚芽中脂肪酶抑制剂的提取方法，包括以下步骤：
[0009] A)制备海稻米胚芽粉：
[0010] (1)胚芽驯化，精选海水稻
种子，并浸泡于驯化液中；
[0011] (2)催芽，置于发芽器中催芽，催芽过程中使用采用
电场强化催芽，发芽后用水漂洗干净；
[0012] (3)
粉碎，将海水稻胚芽干燥处理，对干燥的胚芽进行
超微粉碎；
[0013] B)提取脂肪酶抑制剂：
[0014] (1)预处理，将胚芽粉置于反应罐中，
真空环境下采用红外线照射；
[0015] (2)
脱脂，加入85％以上浓度的
乙醇溶液，液料比比为1:6-9，在常温下回流提取2-3h，提取过程中，采用
超声波辅助；
[0016] (3)萃取，向胚芽粉中加入去离子水，去离子水与胚芽粉的料液比为1：2-4，在60-75℃的
温度下超重
力萃取1-1.5h；
[0017] (4)离心，加入同体积的等离子水，离心提取30-60min，之后
抽取上清液；
[0018] (5)纯化，盐析法去除
蛋白质，加入
硫酸铵盐进行沉淀，过滤掉沉淀物；
[0019] (6)凝胶柱层析，凝胶柱层析后洗脱，冷冻离心后抽取上清液；
[0020] (7)浓缩，对上清液进行浓缩，浓缩至原体积的1/6-1/10；
[0021] (8)干燥，采用
喷雾干燥法干燥制得含有脂肪酶抑制剂的组合物。
[0022] 优选地，步骤A)(2)中，电场强化条件：电场强度30-50kV/cm，脉冲时间500-600μs,脉冲
频率100-300Hz。
[0023] 优选地，步骤A)(3)中，采用
微波干燥法进行干燥，微波干燥条件为：频率3000-4000MHz、功率3000W、温度50-60℃。
[0024] 优选地，步骤B)(1)中，真空环境下采用红外线照射1-2h，每隔3min照射一次，持续3min。
[0025] 优选地，步骤B)(2)中，
超声波强化，功率400-800W、频率 50-100KHz，工作半分钟，间隔半分钟。
[0026] 优选地，步骤B)(4)中，以2000-3000r/min离心40-50min。
[0027] 优选地，步骤B)(5)中,采用分级沉淀法，在0-4℃下进行硫酸铵沉淀蛋白，
饱和度分别为10％、30％、50％、70％、90％。
[0028] 优选地，步骤B)(5)中，沉淀后以2000-3000r/min离心10-20min 后过滤。
[0029] 优选地，步骤B)(6)中，平衡液为0.5mol/L
磷酸盐缓冲液，其中包括1.2mol/L的氯化
钾。
[0030] 优选地，步骤B)(6)中，洗脱时，洗脱液同平衡液，洗脱液流速为10-15mL/h。
[0031] 优选地，步骤B)(6)中，在0℃以2000-4000r/min离心20-30min。
[0032] 优选地，步骤B)(7)中，采用
反渗透浓缩技术浓缩至原体积的 1/8。
[0033] 本发明的有益效果：在脂肪酶抑制剂的提取过程中，采用外界刺激提高脂肪酶抑制剂活性，通过红外线照射、超声波强化、超重力提取提高提取效率；本制备方法简化了工艺流程，降低了生产成本，制得的脂肪酶抑制剂纯度高；采用海水稻作为原料制备脂肪酶抑制剂，材料成本低，纯天然，效果更好，可应用于食品和医学领域。
具体实施方式
[0034] 下面将结合本发明的
实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0035] 实施例1
[0036] 一种海水稻胚芽中脂肪酶抑制剂的提取方法，包括以下步骤：
[0037] A)制备海稻米胚芽粉：
[0038] (1)胚芽驯化，精选海水稻种子，并浸泡于驯化液中；
[0039] (2)催芽，置于发芽器中催芽，催芽过程中使用采用电场强化催芽，发芽后用水漂洗干净；电场强化条件：电场强度30kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率100Hz；
[0040] (3)粉碎，采用微波干燥法将海水稻胚芽干燥处理，对干燥的胚芽进行超微粉碎；微波干燥条件为：频率3000MHz、功率3000W、温度50℃；
[0041] B)提取脂肪酶抑制剂：
[0042] (1)预处理，将胚芽粉置于反应罐中，真空环境下采用红外线照射1h，每隔3min照射一次，持续3min；
[0043] (2)脱脂，加入85％浓度的乙醇溶液，液料比比为1:6，在常温下回流提取2h，提取过程中，采用超声波辅助；超声波强化，功率 400W、频率5KHz，工作半分钟，间隔半分钟；
[0044] (3)萃取，向胚芽粉中加入去离子水，去离子水与胚芽粉的料液比为1：2，在65℃的温度下超重力萃取1h；
[0045] (4)离心，加入同体积的等离子水，以2000r/min离心50min，之后抽取上清液；
[0046] (5)纯化，盐析法去除蛋白质，加入硫酸铵盐进行沉淀，采用分级沉淀法，在0℃下进行硫酸铵沉淀蛋白，饱和度分别为10％、30％、 50％、70％、90％；沉淀后以2000r/min离心20min后过滤掉沉淀物；
[0047] (6)凝胶柱层析，凝胶柱层析后洗脱，平衡液为0.5mol/L磷酸盐缓冲液，其中包括1.2mol/L的
氯化钾；洗脱时，洗脱液同平衡液，洗脱液流速为10mL/h；在0℃以2000r/min离心30min后抽取上清液；
[0048] (7)浓缩，采用反渗透浓缩技术对上清液进行浓缩，浓缩至原体积的1/6；
[0049] (8)干燥，采用喷雾干燥法干燥制得含有脂肪酶抑制剂的组合物。
[0050] 实施例2
[0051] 一种海水稻胚芽中脂肪酶抑制剂的提取方法，包括以下步骤：
[0052] A)制备海稻米胚芽粉：
[0053] (1)胚芽驯化，精选海水稻种子，并浸泡于驯化液中；
[0054] (2)催芽，置于发芽器中催芽，催芽过程中使用采用电场强化催芽，发芽后用水漂洗干净；电场强化条件：电场强度40kV/cm，脉冲时间550μs,脉冲频率200Hz；
[0055] (3)粉碎，采用微波干燥法将海水稻胚芽干燥处理，对干燥的胚芽进行超微粉碎；微波干燥条件为：频率4000MHz、功率3000W、温度55℃；
[0056] B)提取脂肪酶抑制剂：
[0057] (1)预处理，将胚芽粉置于反应罐中，真空环境下采用红外线照射1.5h，每隔3min照射一次，持续3min；
[0058] (2)脱脂，加入90％浓度的乙醇溶液，液料比比为1:7，在常温下回流提取2.5h，提取过程中，采用超声波辅助；超声波强化，功率600W、频率100KHz，工作半分钟，间隔半分钟；
[0059] (3)萃取，向胚芽粉中加入去离子水，去离子水与胚芽粉的料液比为1：3，在70℃的温度下超重力萃取1.5h；
[0060] (4)离心，加入同体积的等离子水，以3000r/min离心45min，之后抽取上清液；
[0061] (5)纯化，盐析法去除蛋白质，加入硫酸铵盐进行沉淀，采用分级沉淀法，在0℃下进行硫酸铵沉淀蛋白，饱和度分别为10％、30％、 50％、70％、90％；沉淀后以3000r/min离心15min后过滤掉沉淀物；
[0062] (6)凝胶柱层析，凝胶柱层析后洗脱，平衡液为0.5mol/L磷酸盐缓冲液，其中包括1.2mol/L的氯化钾；洗脱时，洗脱液同平衡液，洗脱液流速为12mL/h；在0℃以3000r/min离心25min后抽取上清液；
[0063] (7)浓缩，采用反渗透浓缩技术对上清液进行浓缩，浓缩至原体积的1/8；
[0064] (8)干燥，采用喷雾干燥法干燥制得含有脂肪酶抑制剂的组合物。
[0065] 实施例3
[0066] 一种海水稻胚芽中脂肪酶抑制剂的提取方法，包括以下步骤：
[0067] A)制备海稻米胚芽粉：
[0068] (1)胚芽驯化，精选海水稻种子，并浸泡于驯化液中；
[0069] (2)催芽，置于发芽器中催芽，催芽过程中使用采用电场强化催芽，发芽后用水漂洗干净；电场强化条件：电场强度50kV/cm，脉冲时间600μs,脉冲频率300Hz；
[0070] (3)粉碎，采用微波干燥法将海水稻胚芽干燥处理，对干燥的胚芽进行超微粉碎；微波干燥条件为：频率4000MHz、功率3000W、温度60℃；
[0071] B)提取脂肪酶抑制剂：
[0072] (1)预处理，将胚芽粉置于反应罐中，真空环境下采用红外线照射2h，每隔3min照射一次，持续3min；
[0073] (2)脱脂，加入95％浓度的乙醇溶液，液料比比为1:8，在常温下回流提取3h，提取过程中，采用超声波辅助；超声波强化，功率 800W、频率100KHz，工作半分钟，间隔半分钟；
[0074] (3)萃取，向胚芽粉中加入去离子水，去离子水与胚芽粉的料液比为1：4，在75℃的温度下超重力萃取1.5h；
[0075] (4)离心，加入同体积的等离子水，以3000r/min离心40min，之后抽取上清液；
[0076] (5)纯化，盐析法去除蛋白质，加入硫酸铵盐进行沉淀，采用分级沉淀法，在4℃下进行硫酸铵沉淀蛋白，饱和度分别为10％、30％、 50％、70％、90％；沉淀后以3000r/min离心10min后过滤掉沉淀物；
[0077] (6)凝胶柱层析，凝胶柱层析后洗脱，平衡液为0.5mol/L磷酸盐缓冲液，其中包括1.2mol/L的氯化钾；洗脱时，洗脱液同平衡液，洗脱液流速为10-15mL/h；在0℃以4000r/min离心20min后抽取上清液；
[0078] (7)浓缩，采用反渗透浓缩技术对上清液进行浓缩，浓缩至原体积的1/10；
[0079] (8)干燥，采用喷雾干燥法干燥制得含有脂肪酶抑制剂的组合物。
[0080] 在本
说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0081] 最后需要说明的是，以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的
修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受
权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
