METTL3基因敲除的细胞系及其构建方法与干扰载体
专利汇可以提供METTL3基因敲除的细胞系及其构建方法与干扰载体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种METTL3基因敲除的细胞系及其构建方法与干扰载体。METTL3基因敲除的细胞系，利用m6A甲基转移酶基因Mettl3在通过基因编辑方法获得耐受LPS刺激导致 脂肪酸 吸收障碍的猪肠道上皮细胞系。一种耐受LPS刺激导致脂肪酸吸收障碍的猪肠道上皮细胞系。一种针对猪源m6A甲基转移酶基因Mettl3的基因干扰载体。本发明公开了Mettl3基因的一种新功能，参与调控肠道上皮细胞脂肪酸吸收转运，并提供了通过基因编辑手段改善LPS刺激导致的脂肪酸吸收障碍的方法。本发明不仅为研究Mettl3在脂肪酸吸收过程中的作用奠定 基础 ，还利用基因编辑的方法改善了LPS刺激导致的脂肪酸吸收障碍。，下面是METTL3基因敲除的细胞系及其构建方法与干扰载体专利的具体信息内容。
1.一种METTL3基因敲除的细胞系的构建方法，其特征在于，利用m6A甲基转移酶基因Mettl3在通过基因敲除方法获得耐受LPS刺激导致脂肪酸吸收障碍的猪肠道上皮细胞系。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）根据所述的m6A甲基转移酶基因Mettl3设计shRNA，
所述的Mettl3序列如SEQ ID NO.1所示，所述的shRNA序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；
2）针对m6A甲基转移酶基因Mettl3 shRNA进行磷酸化；
3）将磷酸化的Mettl3 shRNA连接到慢病毒表达载体获得Mettl3 shRNA慢病毒表达载体；
4）以293A细胞作为受体，将步骤3）获得的Mettl3 shRNA慢病毒表达载体进行慢病毒包被；
5）将步骤4）获得的Mettl3 shRNA慢病毒侵染肠道上皮细胞，利用嘌呤霉素进行筛选，获得基因编辑敲除m6A甲基转移酶基因Mettl3的肠道上皮细胞。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的Mettl3 shRNA慢病毒表达载体的构建方法具体如下：对shRNA慢病毒表达载体利用BbsI进行酶切，并进行胶回收获得线性载体；以步骤2）获得磷酸化的Mettl3 shRNA，采用T4连接酶，连接到pRSI9-U6慢病毒表达载体。
4.一种根据权利要求1所述的建立方法得到的耐受LPS刺激导致脂肪酸吸收障碍的猪肠道上皮细胞系。
5.一种针对猪源m6A甲基转移酶基因Mettl3的基因干扰载体，其特征在于，所述的干扰载体是将针对所述的m6A甲基转移酶基因Mettl3设计shRNA，插入到shRNA慢病毒表达载体所得，用于敲除肠道上皮细胞内Mettl3的表达。
METTL3基因敲除的细胞系及其构建方法与干扰载体
技术领域
背景技术
2014)。但是其在脂肪酸吸收转运过程中的作用，尚未报道。
发明内容
所述的Mettl3序列如SEQ ID NO.1所示，所述的shRNA序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；
2）针对m6A甲基转移酶基因Mettl3 shRNA进行磷酸化；
3）将磷酸化的Mettl3 shRNA连接到慢病毒表达载体获得Mettl3 shRNA慢病毒表达载体；
4）以293A细胞作为受体，将步骤3）获得的Mettl3 shRNA慢病毒表达载体进行慢病毒包被；
5）将步骤4）获得的Mettl3 shRNA慢病毒侵染肠道上皮细胞，利用嘌呤霉素进行筛选，获得基因编辑敲除m6A甲基转移酶基因Mettl3的肠道上皮细胞。
附图说明
图3A为Mettl3 shRNA慢病毒侵染上皮细胞之后Mettl3的蛋白表达水平Western-blot图；
图3B为基因编辑后的肠道上皮细胞Mettl3的转录水平；数据平均值代表3个生物学重复，误差线表示标准误差(SE)。显著性分析*表示p < 0.05，**表示p< 0.01。
具体实施方式
www.broadinstitute.org/rnai/public/seq/search，根据所述的m6A甲基转移酶基因Mettl3设计；其中，Mettl3基因序列如如SEQ ID NO.１所示，shRNA序列包括上游序列P1，下游序列P2，如下所示：
P1（上游序列）：ACCGG GAGATCCTAGAACTATTAAAT CTCGAG ATTTAATAGTTCTAG GATCTC TTTTTTG （SEQ ID NO.2）；
P2（下游序列）: CGAACAAAAAA GAGATCCTAGAACTATTAAAT CTCGAG ATTTAATAGTTCTAG GATCTC C （SEQ ID NO.3）。
515 nm，cut-off 495 nm）。如图6所示，分别针对对照组（Scramble）和Mettl3基因编辑后的肠道上皮细胞（shMettl3）进行LPS刺激处理0小时，3小时，6小时。紫外分光法检测细胞荧光标记脂肪酸的吸收情况。
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