技术领域
[0001] 本
发明实施例涉及
生物分析技术领域，具体涉及一种荧光微球与抗体的偶联方法。
背景技术
[0002] 对某些
抗原或特异性蛋白进行检测时,通常会应用到免疫标记技术。免疫标记技术是将既容易测定又具有高敏感性的物质标记到特异性抗原或者抗体蛋白上,通过这些标记物的增强放大作用来显示反应体系中抗原或抗体的性质和含量的技术。
[0003] 目前常用的标记物包括胶体金、乳胶、荧光素、荧光微球、酶和
放射性核素等。然而，现有的荧光微球标记抗体过程中，由于标记方法不合理，荧光微球与抗体偶联效率和偶联强度较低，导致荧光强度偏低。
发明内容
[0004] 为此，本发明实施例提供一种荧光微球与抗体的偶联方法，以解决
现有技术中由于标记方法不合理，导致荧光微球与抗体偶联效率和偶联强度较低导致荧光强度偏低的问题。
[0005] 为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
[0006] 根据本发明实施例的第一方面提供一种荧光微球与抗体的偶联方法，所述偶联方法包括如下步骤：
[0007] (a)将荧光微球进行活化处理，得到活化荧光微球；
[0008] (b)向活化荧光微球中添加含有甘油的MES缓冲液、超声混匀，随后再添加抗体溶液、超声反应、避光旋转混匀；
[0009] (c)待反应结束后，向沉淀物中添加封闭液、超声混匀、避光旋转混匀、离心并弃去上清液，随后继续添加封闭液、超声混匀、离心；
[0010] (d)收集离心后的沉淀物，并置于甘
氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体的复合物。
[0011] 本发明上述偶联方法，通过对荧光微球进行活化处理，并选择特定的缓冲液和混匀方式，保障各反应物的充分
接触，能够显著提高荧光微球与抗体的偶联效率以及偶联强度，使得微球表面与抗体蛋白的结合位点充分结合，能够有效提高制备复合物的
稳定性，并避免凝集现象的发生；此外，还能够提高荧光检测的灵敏度。
[0012] 进一步地，所述步骤(b)中，超声反应时间为8-12min。
[0013] 进一步地，所述荧光微球表面含有羧基，所述荧光微球选自红色荧光微球、绿色荧光微球、
量子点荧光微球和时间分辨荧光微球中的任意一种。
[0014] 优选地，所述荧光微球粒径80-500nm。
[0015] 进一步地，所述抗体为肌红蛋白单克隆抗体。
[0016] 本发明通过对荧光微球和抗体蛋白种类以及粒径的限定，能够更好地提高荧光微球与抗体蛋白的偶联效率和偶联强度，提高免疫荧光的检测效果。
[0017] 在本发明中对超声混匀、避光旋转混匀以及离心不作严格限制，优选地，所述超声混匀采用的超声
频率为40KHz，时间为不小于2min；
[0018] 所述避光旋转混匀转速为25-35r/min，时间为30-120min；更优选地，所述步骤(b)中，避光旋转混匀时间为100-120min；所述步骤(c)中，避光旋转混匀时间为30-50min；
[0019] 所述离心转速为12000-16000rpm，离心时间为15-25mnin，
温度为3-5℃。
[0020] 进一步地，所述活化处理包括如下步骤：
[0021] (1)向荧光微球中添加MES缓冲液、超声混匀、离心并弃去上清液，继续添加MES缓冲液、超声混匀、离心，收集沉淀物；
[0022] (2)向沉淀物中添加MES缓冲液、超声混匀，再向混匀后的混合物中添加含有NHS的
乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、超声反应5min、避光旋转混匀、离心弃去上清液，随后添加
柠檬酸缓冲液、超声混匀、离心，即得活化荧光微球。
[0023] 进一步地，所述MES缓冲液的添加量与荧光微球的体积比为(8-10)∶1；所述MES缓冲液浓度为48-52mM。
[0024] 进一步地，所述含有NHS的乙醇溶液中NHS的浓度为8-12mg/ml；所述含有EDC的乙醇溶液中EDC的浓度为8-12mg/ml。
[0025] 进一步地，所述步骤(2)中，柠檬酸缓冲液的添加量与荧光微球的体积比为10∶1；优选地，柠檬酸缓冲液为pH6.5、0.01M的柠檬酸缓冲液。
[0026] 进一步地，所述步骤(2)中，避光旋转混匀转速为25-35r/min，时间为30-50min。
[0027] 本发明通过上述特定的活化方法，能够充分提高荧光微球的活性，提高其与抗体的偶联强度和偶联效率。
[0028] 进一步地，所述含有甘油的MES缓冲液的添加量与荧光微球的体积比为(9-11)∶1；所述抗体溶液的添加量与荧光微球的体积比为1∶(4-6)，所述抗体溶液中抗体浓度为0.8-
3mg/ml。
[0029] 本发明通过控制抗体与荧光微球的添加量，能够使得抗体与荧光微球充分结合，并具有较佳的空间构象，避免抗体蛋白活性的降低，影响荧光检测的检测效果。
[0030] 进一步地，所述步骤(c)中，封闭液为20％的BSA，且添加后的反应液中BSA浓度为0.4-0.6％；封闭时间为55-65min。
[0031] 进一步地，所述步骤(d)中，甘氨酸溶液中甘氨酸浓度为4.5-5.5％。
[0032] 本发明实施例具有如下优点：
[0033] (1)本发明上述偶联方法，通过对荧光微球进行活化处理，并选择特定的缓冲液和混匀方式，保障各反应物的充分接触，能够显著提高荧光微球与抗体的偶联效率以及偶联强度，使得微球表面与抗体蛋白的结合位点充分结合，能够有效提高制备复合物的稳定性，并避免凝集现象的发生；此外，还能够提高荧光检测的灵敏度。
[0034] (2)本发明通过对荧光微球和抗体蛋白种类以及粒径的限定，能够更好地提高荧光微球与抗体蛋白的偶联效率和偶联强度，提高免疫荧光的检测效果。
[0035] (3)本发明通过控制抗体与荧光微球的添加量，能够使得抗体与荧光微球充分结合，并具有较佳的空间构象，避免抗体蛋白活性的降低，影响荧光检测的灵敏度。
具体实施方式
[0036] 以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本
说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037] 实施例1
[0038] 本实施例为一种荧光微球与抗体的偶联方法，该偶联方法包括如下步骤：
[0039] (a)向100μL荧光微球中添加800μL 52mM MES缓冲液，超声混匀、离心，弃去上清液，继续添加800μL 52mM MES缓冲液、超声混匀、离心，收集沉淀物；向沉淀物中添加800μL 52mM MES缓冲液、超声混匀，再向混匀后的混合物中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、超声反应5min、避光旋转混匀、离心弃去上清液，随后添加1000μL pH6.5、0.01M的柠檬酸缓冲、超声混匀、离心，即得活化荧光微球；
[0040] 其中，含有NHS的乙醇溶液中NHS的浓度为8-12mg/ml；含有EDC的乙醇溶液中EDC的浓度为8-12mg/ml；超声混匀为采用40KHz
超声波处理2min；离心为在3℃下以16000rpm离心15mnin；避光旋转混匀转速为25r/min，时间为50min；
[0041] (b)向活化荧光微球中添加900μL含0.5％甘油的MES缓冲液、采用40KHz
超声波处理2min，随后再添加17μL3mg/ml的抗体溶液，随后采用40KHz超声波处理10min，再以35r/min避光旋转混匀100min；
[0042] (c)待反应结束后，向反应液中添加20％的BSA至反应液中BSA浓度为0.4％进行封闭反应65min、以10000r/min离心10min；
[0043] (d)收集离心后的沉淀物，并将沉淀物置于浓度为4.5％的甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体偶联的复合物。
[0044] 实施例2
[0045] 本实施例为一种荧光微球与抗体的偶联方法，该偶联方法包括如下步骤：
[0046] (a)向100μL荧光微球中添加1000μL48mM MES缓冲液，超声混匀、离心，弃去上清液，继续添加1000μL48mMMES缓冲液、超声混匀、离心，收集沉淀物；向沉淀物中添加1000μL 48mM MES缓冲液、超声混匀，再向混匀后的混合物中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、超声反应5min、避光旋转混匀、离心弃去上清液，随后添加1000μLpH6.5、0.01M的柠檬酸缓冲、超声混匀、离心，即得活化荧光微球；
[0047] 其中，含有NHS的乙醇溶液中NHS的浓度为8-12mg/ml；含有EDC的乙醇溶液中EDC的浓度为8-12mg/ml；超声混匀为采用40KHz超声波处理3min；离心为在5℃下以12000rpm离心25mnin；避光旋转混匀转速为35r/min，时间为30min；
[0048] (b)向活化荧光微球中添加1100μL含0.5％甘油的MES缓冲液、采用40KHz超声波处理3min，随后再添加25μL0.8mg/ml的抗体溶液，随后采用40KHz超声波处理10min，再以25r/min避光旋转混匀120min；
[0049] (c)待反应结束后，向反应液中添加20％的BSA至反应液中BSA浓度为0.4％进行封闭反应65min、以10000r/min离心10min；
[0050] (d)收集离心后的沉淀物，并将沉淀物置于浓度为4.5％的甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体偶联的复合物。
[0051] 实施例3
[0052] 本实施例为一种荧光微球与抗体的偶联方法，该偶联方法包括如下步骤：
[0053] (a)向100μL荧光微球中添加900μL 50mM MES缓冲液，超声混匀、离心，弃去上清液，继续添加1000μL 50mM MES缓冲液、超声混匀、离心，收集沉淀物；向沉淀物中添加975μL 50mM MES缓冲液、超声混匀，再向混匀后的混合物中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、超声反应5min、避光旋转混匀、离心弃去上清液，随后添加1000μLpH6.5、0.01M的柠檬酸缓冲、超声混匀、离心，即得活化荧光微球；
[0054] 其中，含有NHS的乙醇溶液中NHS的浓度为8-12mg/ml；含有EDC的乙醇溶液中EDC的浓度为8-12mg/ml；超声混匀为采用…超声波处理2min；离心为在4℃下以14000rpm离心20mnin；避光旋转混匀转速为30r/min，时间为40min；
[0055] (b)向活化荧光微球中添加980μL含0.5％甘油的MES缓冲液、采用40KHz超声波处理2min，随后再添加20μL 1.0mg/ml的抗体溶液，随后采用40KHz超声波处理2min，再以30r/min避光旋转混匀120min；
[0056] (c)待反应结束后，向反应液中添加20％的BSA至反应液中BSA浓度为0.4％进行封闭反应65min、以10000r/min离心10min；
[0057] (d)收集离心后的沉淀物，并将沉淀物置于浓度为4.5％的甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体偶联的复合物。
[0058] 对照例1
[0059] 本对照例为常规的荧光微球与抗体的偶联方法，该偶联方法与实施例1中的偶联方法基本相同，区别仅在于步骤(b)中荧光微球稀释在添加抗体前采用MES缓冲液进行稀释，添加抗体后，先在超声处理的条件下反应10min。
[0060] 实验例1
[0061] 采用实施例1制备得到的荧光微球偶联抗体制备免疫荧光
试纸，该制备方法包括如下步骤：
[0062] (a)标记垫的制备：按照实施例1步骤制备荧光微球偶联抗体，用含1％BSA、0.1％曲拉通、10％
蔗糖、0.2％PVP40的PBS溶液(pH)稀释至5％，用三维划膜喷金仪喷到用同样溶液处理过的标记垫上，喷量为4μL/cm；然后将喷好的垫子置于37℃烘箱，干燥4h后置于<20％湿度条件下密闭保存；
[0063] (b)包被膜的制备：分别将抗肌红蛋白单抗和Protein A用划膜稀释液稀释至0.5mg/mL和0.2mg/mL,分别喷到
硝酸纤维素膜上作为检测线(T)和质控线(C)，包被量均为1μL/cm，检测线和质控线间隔4mm；然后置于37℃烘箱，干燥12h后置于<20％湿度条件下密闭保存；所述划膜稀释液为含2％蔗糖的PBS溶液(pH7.4)；
[0064] (c)检测卡组装：将吸
水垫、包被膜、标记垫、样品垫、标识条依次粘于PVC
底板上，裁成4mm宽度的试纸条，装进卡壳，即成一种检测肌红蛋白的免疫荧光检测卡。
[0065] 采用上述方法以对照例1中的荧光微球偶联抗体制备免疫荧光试纸；
[0066] 将实施例1和对照例1的两种不同偶联方法制备的荧光微球抗体偶联物制备的试纸分别进行检测，对比两者的显色荧光强度。
[0067] 检测方法如下：
[0068] 将肌红蛋白抗原用PBS配制成0ng/mL、58ng/mL、580ng/mL，分别用两种检测卡，每个浓度点测试10次，对比检测线(T)、质控线(C)的荧光强度值；实验结果如下：
[0069] 表1采用实施例1中荧光微球偶联抗体制备的试纸条检测结果
[0070]
[0071] 表2采用对照例1中荧光微球偶联抗体制备的试纸条检测结果
[0072]
[0073] 由表1、表2可知：
[0074] 本
申请实施例的偶联方法与对照例1中的偶联方法相比，偶联得到的复合物具有更高的活性，能够更好地提高荧光微球与抗体蛋白的偶联效率和偶联强度，提高免疫荧光的检测效果。
[0075] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明
基础上，可以对之作一些
修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
