技术领域
[0001] 本
发明属于
生物学领域，涉及一种细胞冻存液，具体涉及一种临床级树突状细胞冻存液。
背景技术
[0002] 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，其目的是在低温环境下减缓细胞的代谢活动并维持生命。在细胞悬液的冷冻过程中，
冰晶的形成是导致细胞死亡的主要原因之一。影响细胞冻存的主要因素包括细胞冻存液和冻存速率。细胞冻存液作为细胞冻存时必须使用的一种溶液，其作用是将需要冻存的细胞悬浮，并供给细胞生命代谢所需的营养物质，同时防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤。冻存速率对细胞存活率的影响有两种，一种是慢速冻存下的损伤，由于细胞脱
水和细胞外培养基浓度过高所致；一种是快速冻存下的损伤，细胞死亡和冰晶的形成有较大相关性，不同的细胞所需的冻存速率不同。
[0003] 在
现有技术中冻存细胞常使用血清与DMSO混合的方法。传统方法具有以下
缺陷：
[0004] (1)DMSO用量为10％，过低的DMSO浓度会导致冻存效果欠佳，但高浓度的DMSO有较大毒性，会对细胞体造成伤害；
[0005] (2)传统冻存液配方中使用血清，因动物个体不同，血清产地、批号不同，每批
质量差异甚大，其成分不能保持一致；血清成本高，每500mL血清价格可高达3000-4000元；取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性；血清的活体采集对动物有一定损害增加动物病原。另外，有研究表明长期与胎
牛血清
接触的细胞会对溶液介质中的胎牛血清发生内吞，内吞胎牛血清后的间充质干细胞有可能发生某些蛋白表达的变化，应用于人体后可发生异种动物蛋白引起的免疫反应，不能直接用于临床输注。因此，利用含有血清的冻存液冻存的细胞会给临床使用带来一定的
风险。
[0006] (3)操作不便，每次冻存细胞需要先融化血清，而且冻存复苏之后的细胞成活率相对较低，特别是一些相对脆弱的细胞，并且复苏后需要换液，使用起来不方便。
[0007] 因此，针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种临床级无血清细胞冻存液，该无血清细胞冻存液具有高效、低毒、无外源因子和易于使用等优点可广泛用于各种
哺乳动物细胞的冷冻保存。
发明内容
[0008] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种临床级树突状细胞冻存液，所述细胞冻存液包括以下组分：
白蛋白、
氨基酸、pH缓冲体系、渗透性保护剂、非渗透性保护剂。
[0009] 在本发明的具体实施方案中，白蛋白是重组人血白蛋白；重组人血白蛋白浓度为0.07g/mL，即7％(w/v)。
[0010] 进一步，可用于本发明的氨基酸包括赖氨酸、
色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、天
门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、或丙氨酰-谷氨酰胺中的一种或几种。
[0011] 在本发明的具体实施方案中，氨基酸是甘氨酸、脯氨酸、天门冬氨酸、丙氨酰-谷氨酰胺的组合；优选地，甘氨酸浓度为1*10-4g/mL、脯氨酸浓度为1.2*10-4g/mL、天门冬氨酸浓度为1.2*10-4g/mL、丙氨酰-谷氨酰胺浓度为1*10-4g/mL。
[0012] 进一步，可用于本发明的非渗透性保护剂包括
蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、羟乙基
淀粉、聚乙烯吡咯烷
酮。
[0013] 在本发明的具体实施方案中，非渗透性保护剂使用的是蔗糖、海藻糖、右旋糖酐的-3 -3 -2组合，蔗糖浓度为12*10 g/mL、海藻糖浓度为2*10 g/mL、右旋糖酐浓度为2*10 g/mL。
[0014] 进一步，可用于本发明的pH缓冲体系包括无机盐。
[0015] 更进一步，无机盐包括
钙、磷、
钾、钠、氯、镁、硫的
磷酸盐、
硝酸盐、
硫酸盐、
碳酸盐、或
盐酸盐中的一种或几种。
[0016] 在本发明的具体实施方案中，pH缓冲体系中含有
氯化钠、
氯化钾、
氯化钙、
硫酸镁、
碳酸氢钠、HEPES；优选地，氯化钠浓度为5*10-3g/mL、氯化钾浓度为4*10-4g/mL、氯化钙浓度为4*10-4g/mL、硫酸镁浓度为4*10-5g/mL、碳酸氢钠浓度为4*10-4g/mL、HEPES浓度为5*10-3g/mL。
[0017] 进一步，可用于本发明的渗透性保护剂包括DMSO、二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇。
[0018] 在本发明的具体实施方案中，渗透性保护剂是DMSO；优选地，本发明的细胞冻存液中含有5％DMSO。
[0019] 根据本发明的另一个方面，本发明提供了前面所述的细胞冻存液的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：取上述的细胞冻存液组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使得各组分终浓度如前面所描述的。
[0020] 进一步，所述制备方法包括如下步骤：
[0021] (1)分别配制pH缓冲体系储液、氨基酸储液、非渗透性保护剂储液；
[0022] (2)取适量pH缓冲体系储液、氨基酸储液、非渗透性保护剂储液加入适量渗透性保护剂、重组人血白蛋白，混匀，加入水使得各组分终浓度如前面所描述的。
[0023] 更进一步，所述制备方法包括如下步骤：
[0024] (1)分别配制pH缓冲体系储液、氨基酸储液、非渗透性保护剂储液；pH缓冲体系储液中氯化钠浓度为25*10-3g/mL、氯化钾浓度为2*10-3g/mL、氯化钙浓度为1*10-3g/mL、硫酸镁浓度为2*10-4g/mL、碳酸氢钠浓度为2*10-3g/mL、HEPES浓度为2.5*10-2g/mL；氨基酸储液中甘氨酸浓度为5*10-4g/mL、脯氨酸浓度为6*10-4g/mL、天门冬氨酸浓度为6*10-4g/mL、丙氨酰-谷氨酰胺浓度为5*10-4g/mL；非渗透性保护剂储液中蔗糖浓度为6*10-2g/mL、海藻糖浓-2度为1*10 g/mL、右旋糖酐浓度为0.1g/mL。
[0025] (2)取4份缓冲体系储液、4份氨基酸储液、4份非渗透性保护剂储液、1份渗透性保护剂、7份重组人血白蛋白溶液，混匀。
[0026] 在本发明的具体实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：
[0027] (1)分别配制pH缓冲体系储液、氨基酸储液、非渗透性保护剂储液；pH缓冲体系储液中氯化钠浓度为25*10-3g/mL、氯化钾浓度为2*10-3g/mL、氯化钙浓度为1*10-3g/mL、硫酸镁浓度为2*10-4g/mL、碳酸氢钠浓度为2*10-3g/mL、HEPES浓度为2.5*10-2g/mL；氨基酸储液中甘氨酸浓度为5*10-4g/mL、脯氨酸浓度为6*10-4g/mL、天门冬氨酸浓度为6*10-4g/mL、丙氨酰-谷氨酰胺浓度为5*10-4g/mL；非渗透性保护剂储液中蔗糖浓度为6*10-2g/mL、海藻糖浓度为1*10-2g/mL、右旋糖酐浓度为0.1g/mL。
[0028] (2)取20mL pH缓冲体系储液、20mL氨基酸储液、20mL非渗透性保护剂储液加入5mL渗透性保护剂、35mL重组人血白蛋白，混匀。
[0029] 根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的细胞冻存液在细胞冻存中的应用。
[0030] 进一步，所述应用包括以下步骤：
[0031] (1)将活细胞和前面所述的细胞冻存液混合均匀，得到细胞冻存悬液；
[0032] (2)用程序降温盒将细胞于-80℃
冰箱中冻存；
[0033] (3)24小时后转入液氮中。
[0034] 更进一步，所述活细胞为哺乳动物单个核细胞。
[0035] 所述的细胞冻存悬液中的活细胞
密度为3*106个/mL。
[0036] 本发明的细胞冻存液适用广泛，可用于多种细胞长期保存，尤其适于树突状细胞冻存。
[0037] 本发明的优点和有益效果：
[0038] (1)本发明提供了一种制备方法简单、成本低廉、低毒性、细胞复苏后成活率高、污染风险低的无血清冻存液。
[0039] (2)本发明的细胞冻存液不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，采用该冻存液经冻存复苏后的细胞，存活率达94％以上，可用于继续培养或临床直接回输，安全有效，在临床上具有良好的应用前景。
[0040] (3)本发明的细胞冻存液含有双重保护成分，从细胞内和细胞外同时保护细胞免受冻存时冰晶的损伤吗，大大提高了细胞复苏率，适用广泛的细胞系保存。
[0041] (4)本发明的细胞冻存液属于临床级细胞冻存液，成分清晰，不含对人体有害且不可用于临床的物质。
具体实施方式
[0042] 以下
实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明
权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种
修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。
[0043] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
[0044] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品
说明书进行。
[0045] 实施例1细胞冻存液配制
[0046] 一、储液配制方法：
[0047] 储液A(5×)：烧杯清洁干净后，用注射用水冲洗干净，加入500mL注射用水。用
电子天平一次准确称量，氯化钠25g，氯化钾2g，氯化钙1g，硫酸镁0.2g，碳酸氢钠2g，HEPES 25g，搅拌溶解，转入1L容量瓶中。烧杯中再次加入少量注射用水，以将烧杯内残余组分全部转移如容量瓶中。加入注射用水至950mL，调节pH至7.0-7.2，定容至1L。0.22μm滤膜除菌过滤后，分装转移至无菌
试剂瓶中，配成5×缓冲液A。4℃保存，6个月内使用。
[0048] 储液B(5×)：烧杯清洁干净后，用注射用水冲洗干净，加入500mL注射用水。用电子天平一次准确称量，蔗糖60g，海藻糖10g，右旋糖酐100g，转入1L容量瓶中。烧杯中再次加入少量注射用水，以将烧杯内残余组分全部转移如容量瓶中。加入注射用水，定容至1L。0.22μm滤膜除菌过滤后，分装转移至无菌试剂瓶中，配成5×缓冲液B。4℃保存，6个月内使用。
[0049] 储液C(5×)：烧杯清洁干净后，用注射用水冲洗干净，加入500mL注射用水。用电子天平一次准确称量，甘氨酸0.5g，脯氨酸0.6g，天门冬氨酸0.6g，丙氨酰-谷氨酰胺0.5g，转入1L容量瓶中。烧杯中再次加入少量注射用水，以将烧杯内残余组分全部转移如容量瓶中。加入注射用水，定容至1L。0.22μm滤膜除菌过滤后，分装转移至无菌试剂瓶中，配成5×缓冲液C。4℃保存，3个月内使用。
[0050] 二、100mL细胞保存液配制方法：
[0051] 取储液A、B、C各20mL；
[0052] 加入DMSO 5mL；
[0053] 加入重组人血白蛋白35mL(华北制药股份有限公司，货号：RA-EG002，浓度为20％；
[0054] 混匀后即可使用。
[0055] 实施例2树突状细胞的冻存
[0056] (1)开启生物安全柜，运行10min后操作。
[0057] (2)准备操作所需要的试剂、耗材和记录表。
[0058] (3)准备1支15mL离心管于安全柜的试管架上，打开
盖子。打开培养板盖，用5mL移液管反复轻轻吹打各孔贴壁细胞数遍，尽量避免
泡沫的形成，吸尽孔中的细胞悬液，收集入离心管中。每孔加入2mL冰PBS，静置3-5min后用1mL移液器反复吹打残余的贴壁细胞收集于离心管内，盖紧盖子。配平后离心，设置离心机参数为1800rpm，8min，
加速9，
刹车9。
[0059] (4)准备数支无菌管。取出离心完毕的离心管置于安全柜内，打开盖子，倾弃上清液，盖
上管盖，轻轻拍打离心管底部，使细胞团充分悬起，加入3mL生理盐水，混匀后取1mL于无菌管中，补加生理盐水至10mL，盖紧盖子。配平后离心，设置离心机参数为1800rpm，8min，加速9，刹车9。
[0060] (5)用生理盐水将细胞计数样本按适当比例稀释后计数：
[0061] 细胞总数(×106)＝四个大方格细胞数×稀释倍数×细胞溶液总容量×104。
[0062] (6)取出离心完毕的离心管入安全柜内，打开盖子，倾弃上清液，盖上管盖，轻轻拍打离心管底部，使细胞团充分悬起。加入10mL生理盐水，混匀，盖紧盖子。配平后离心，设置离心机参数为1800rpm，8min，加速9，刹车9。
[0063] (7)取出离心完毕的离心管入安全柜内，打开盖子，倾弃上清液，盖上管盖，轻轻拍打离心管底部，使细胞团充分悬起，加入配置好的细胞冻存液，按照3*106/mL分装，每支1mL加入冻存管中，盖紧冻存管盖子，并用
封口膜封好。
[0064] (8)放入程序降温盒中，放入-80℃冰箱中，24小时后转入液氮。
[0065] 作为对照，配制传统细胞冻存液：90％血清，10％DMSO(血清和DMSO的体积比为9:1)，按照上述步骤冻存树突状细胞。
[0066] 实施例3树突状细胞的复苏及活率检测
[0067] 一、细胞复苏
[0068] (1)开启生物安全柜，运行10min后操作。
[0069] (2)准备操作所需要的试剂、耗材和记录表。
[0070] (3)准备1支15mL离心管于试管架上，标明样本编号，加入9mL PBS。
[0071] (4)配制树突状细胞培养液，混匀。
[0072] (5)将冻存细胞管从-80℃拿出来后迅速置入42℃水浴中，迅速摇动使细胞溶解，用75％酒精消毒冻存管外壁，在安全柜内打开管盖，用移液管吸取细胞悬液呈滴状加入PBS中，吹打混匀，盖紧管盖，配平后离心，设置离心机参数为1800rpm，8min，加速9，刹车9。
[0073] (6)将离心完毕的离心管置入安全柜内的试管架上，打开管盖，倒弃上清液，盖上管盖，轻轻拍打离心管底部，使细胞团充分悬起，用移液管加入6mL树突状培养液，混匀。
[0074] (7)细胞计数，用台盼蓝
染色，记录复苏以后的细胞数量和活率。
[0075] 二、实验结果
[0076] 树突状细胞冻存14d后复苏，与传统冻存液(90％血清，10％DMSO)比较细胞活率统计如表1所示。
[0077] 表1冻存细胞复苏后细胞活率统计
[0078] 冻存细胞编号 1 2 3 4 5 6 7 平均值本发明的冻存液 95.1％ 96.2％ 95.2％ 95.7％ 95.4％ 95.5％ 94.8％ 95.41％传统冻存液 91.3％ 94.3％ 89.7％ 93.9％ 90.9％ 95.0％ 89.1％ 92.03％
[0079] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
