[0001] 本发明涉及含水状态的生物试样的电子显微镜观察用保护剂、电子显微镜观察用试剂盒、利用电子显微镜进行观察的方法以及试样台。

[0002] 为了使用扫描电子显微镜及透射电子显微镜进行试样观察，要预先将试样置于真空下，因此，有必要对试样赋予耐真空性和为了获得图像所需要的导电性。

[0003] 扫描电子显微镜的试样的制备可以如下进行：通过预先对试样进行真空干燥而除去水分后，为了赋予导电性、提高二次电子的产生效率，利用蒸镀、溅射等手段对试样表面包覆导电性材料(铂、碳、金、钯、锇等)。

[0004] 对于金属、半导体等之类的具有导电性、有耐真空性的材料而言，这样的前处理并不是必须的，但对于没有导电性的材料而言，必须利用导电性材料进行导电膜包覆。另外，耐真空性等差的材料、即在真空干燥以及电子显微镜观察时的真空中会由于电子束照射而变形的材料的情况下，必须利用导电性材料进行导电膜包覆。

[0005] 生物试样含有大量的水分，因此多数情况下需要预先进行真空干燥。因此，表面的形状有时也会显著改变，难以在存活状态下进行电子显微镜观察。

[0006] 凝胶状物质、食品等湿润试样的含水状态可以使用低真空SEM、冷冻SEM、环境控制型SEM(ESEM)等在常温下观察。根据这些方法，不仅能够观察湿润试样，还能够在未处理的状态下观察试样。但是，为了进行高倍率下的观察，必须抽成高真空，试样的耐真空性或导电性是必须的。因此，在观察生物试样时，也难以获得存活状态下的高倍率的成像。

[0007] 近年来，提出了使用离子液体的电子显微镜观察方法。专利文献1 和非专利文献1、2记载了：使用SEM观察用离子液体润湿的试样。关于应用于细胞，在非专利文献2有记载。
另外，专利文献2公开了将离子液体的技术用于透射电子显微镜观察的方法。

[0008] 现有技术文献

[0009] 专利文献

[0010] 专利文献1:国际公开WO2007/083756号小册子

[0011] 专利文献2:日本特开2009－266741号公报

[0012] 非专利文献

[0013] 非专利文献1:Langmuir,2011,27,9671-9675

[0014] 非专利文献2:Microsc.Res.Tech.2011,74,415-420

[0015] 发明要解决的课题

[0016] 但是，即便是使用环境SEM的观察、利用上述各文献的方法，对于生物试样，也不能实现直接以高倍率对存活状态进行电子显微镜观察。

[0017] 即，对于生物试样而言，没有实现对存活状态的活动情况进行电子显微镜观察。

[0018] 另外，在用电子显微镜观察后，所回收的试样不能继续成长、继续生存。即生还的电子显微镜观察尚未实现。

[0019] 由于电子显微镜的测定环境为真空状态，因此试样被置于极度的干燥状态。因而试样发生变形、变质，不能观察接近存活状态的状态。

[0020] 进而，含水试样置于真空下时瞬间冻结，试样由于冰晶而发生变形、变质，不能观察接近原本状态的状态。

[0021] 对于生物试样而言，由于置于真空下而隔绝来自外界的氧气供给，陷入缺氧状态。另外，由于处于干燥状态，变成像干物一样(墨鱼变成墨鱼干一样。)，难以将生物试样在存活状态下放入电子显微镜的壳体内。

[0022] 即使是能够耐干燥状态的生物，由于生物内所含的水冻结，其在观察活动状态之前或在观察中死亡。

[0023] 虽然为了进行利用电子显微镜的观察而照射电子束，但必须在不引起由于该电子束的照射而带来的电气因素、热因素等而变形、变性的条件下，在生物试样存活的状态下得到电子显微镜图像。

[0024] 对于阻隔性能而言，虽然迄今为止已提出使用有机物、无机物、有机/无机混合材料，通过旋涂、蒸镀、涂布等手段在试样表面制作膜，从而对试样赋予阻隔性能的技术，但目前还没有在电子显微镜的试样制作中应用这样的阻隔性能的例子。

[0025] 因此，本发明人此前提出了：一种蒸发抑制用组合物，其含有选自两亲性化合物、油脂类、及离子液体中的至少1种；将该蒸发抑制用组合物用于生物/生物体试样的表面而形成薄膜，通过用薄膜包覆试样，从而对收容在真空下的试样室中的该用薄膜包覆的试样在存活状态、原本的状态下用电子显微镜观察的方法(日本特愿2011－197685号、日本特愿2012 －044383号、PCT/JP2012/072982号)。另外，本发明人提出了一种以难以制成膜状的生物体顺应性化合物等为原料制作新型薄膜的技术(PCT/JP2013/074141号)。

[0026] 本发明人的上述在先发明主要是如下技术：使用表皮被牢固的角质膜层包覆的昆虫作为生物/生物体试样，对收容在真空下的试样室的试样能够在存活状态、原本的状态下利用电子显微镜进行观察。

[0027] 即，关于对于上述昆虫以外的生物/生物体试样、例如哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等不具有包覆表面的牢固层的脆弱生物试样能否应用在先发明的技术的研究，并不能说是充分的。

[0028] 本发明是鉴于上述情况反复进行了深入研究的成果，课题在于，提供一种在真空下也能够保护哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等含水状态的生物试样使其不变形、维持存活状态的真空下的电子显微镜观察用保护剂和使用其的试剂盒，利用电子显微镜进行试样的观察、诊断、评价、定量的方法，及观察中使用的试样台。

[0029] 用于解决课题的手段

[0030] 为了解决上述课题，本发明的电子显微镜观察用保护剂，其特征在于，含有生存环境赋予成分、糖类及电解质。

[0031] 生存环境赋予成分优选为选自多元醇及其衍生物中的1种以上。

[0032] 糖类优选为选自单糖类、二糖类、寡糖、多糖类和它们的衍生物中的 1种以上。

[0033] 电解质优选为选自金属化合物、金属络合物、无机盐、有机盐、酸碱 (acid-base)中的1种以上。

[0034] 另外，本发明的含水状态的生物试样的电子显微镜观察用试剂盒，其特征在于，含有(A)电子显微镜观察用保护剂和(B)含有表面活性剂的溶液，所述(A)电子显微镜观察用保护剂含有生存环境赋予成分、糖类及电解质。

[0035] 生存环境赋予成分优选为选自多元醇及其衍生物中的1种以上。

[0036] 糖类优选为选自单糖类、二糖类、寡糖、多糖类和它们的衍生物中的 1种以上。

[0037] 电解质优选为选自金属化合物、金属络合物、无机盐、有机盐、酸碱中的1种以上。

[0038] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法，其特征在于，含有如下工序：将含有生存环境赋予成分、糖类及电解质的电子显微镜观察用保护剂涂布于含水状态的生物试样的工序；将涂布有该电子显微镜观察用保护剂的含水状态的生物试样载置于试样台，照射电子束或等离子体，在含水状态的生物试样的表面形成薄膜而包覆含水状态的生物试样的工序；和将收容在真空下的试样室的用薄膜包覆的含水状态的生物试样的电子显微镜图像显示在显示装置中的工序。

[0039] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法中，可以至少在将电子显微镜观察用保护剂涂布于含水状态的生物试样之前、之后，将含有表面活性剂的溶液涂布于含水状态的生物试样。

[0040] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法中，可以在将电子显微镜观察用保护剂涂布于含水状态的生物试样之前，对含水状态的生物试样表面进行水洗。

[0041] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法中优选使用如下试样台：在圆柱形的基构件的上表面载置形成有薄膜的含水状态的生物试样，将具有与圆柱形构件的直径大致相等的圆形开口部、其上表面部具有直径小于开口部的开口部、侧面部有固定孔的环状构件，盖在载置于圆柱形的基构件的上表面的含水状态的生物试样上，将圆柱形的基构件和环状构件用固定材料固定。

[0042] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法中优选使用如下试样台：在中央形成有圆形凹部的圆柱形构件的上表面载置形成有薄膜的含水状态的生物试样，将中央形成有圆形的贯通孔、在贯通口的周围开有多个固定孔的圆盘状构件，盖在载置于圆柱形构件的上表面的含水状态的生物试样上，将圆盘状构件和圆柱形构件用固定材料固定。

[0043] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法中优选：在电子显微镜的试样室内对含水状态的生物试样照射试样观察用的电子束，从而在含水状态的生物试样的表面形成薄膜。

[0044] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法中优选：在利用电子显微镜进行含水状态的生物试样观察前，预先对试样照射电子显微镜的试样室内的电子束之外的电子束或等离子体，从而在含水状态的生物试样的表面形成薄膜。

[0045] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法中优选：在不伴有含水状态的生物试样破坏的条件下，将含水状态的生物试样的电子显微镜图像显示在显示装置中。

[0046] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法中优选：使用扫描电子显微镜，在不引起含水状态的生物试样的电荷积累的条件下，将试样的电子显微镜图像显示在显示装置中。

[0047] 本发明的观察方法中使用的试样台，其特征在于，具备：圆柱形的基构件，具有与圆柱形构件的直径大致相等的圆形开口部、其上表面部具有直径小于开口部的开口部、侧面部有固定孔的环状构件，和固定材料，形成有薄膜的含水状态的生物试样载置于圆柱形的基构件的上表面，环状构件盖在载置于圆柱形的基构件的上表面的含水状态的生物试样上，圆柱形的基构件和环状构件用固定材料进行固定。

[0048] 本发明的观察方法中使用的试样台，其特征在于，具备：中央形成有圆形凹部的圆柱形构件，中央形成有圆形的贯通孔、在贯通口的周围开有多个固定孔的圆盘状构件，和固定材料，形成有薄膜的含水状态的生物试样载置于圆柱形构件的上表面，圆盘状构件盖在载置于圆柱形构件的上表面的含水状态的生物试样上，圆盘状构件和圆柱形构件用固定材料进行固定。

[0049] 本发明的利用电子显微镜对含水状态的癌细胞进行诊断的方法，其特征在于，含有以下工序：对从生物体摘出的含水状态的癌细胞或含有该癌细胞的组织，涂布含有生存环境赋予成分、糖类及电解质的电子显微镜观察用保护剂的工序；将涂布有电子显微镜观察用保护剂的含水状态的癌细胞或含有该癌细胞的组织载置于试样台，照射电子束或等离子体，在含水状态的癌细胞或含有该癌细胞的组织的表面形成薄膜而进行包覆的工序；将收容在真空下的试样室的用薄膜包覆的含水状态的癌细胞或含有该癌细胞的组织的电子显微镜图像显示在显示装置中工序；和对所显示的含水状态的癌细胞或含有该癌细胞的组织进行图像诊断的工序。

[0050] 本发明的利用电子显微镜对含水状态的癌细胞进行诊断的方法中优选：含水状态的癌细胞为接种在正常细胞或细胞片上并经培养而得的癌细胞。

[0051] 本发明的利用电子显微镜对含水状态的癌细胞进行诊断的方法中优选：从生物体摘出的含水状态的癌细胞或含有该癌细胞的组织在摘出后立即进行化学固定。

[0052] 本发明的利用电子显微镜评价生理活性物质或药剂对含水状态的细胞的作用的方法，其特征在于，含有以下工序：对含水状态的细胞或细胞片添加生理活性物质或药剂的工序；对添加有生理活性物质或药剂的含水状态的细胞或细胞片涂布含有生存环境赋予成分、糖类及电解质的电子显微镜观察用保护剂的工序；将涂布有电子显微镜观察用保护剂的含水状态的细胞或细胞片载置于试样台，照射电子束或等离子体，在含水状态的细胞或细胞片的表面形成薄膜而进行包覆的工序；将收容在真空下的试样室的用薄膜包覆的含水状态的细胞或细胞片的电子显微镜图像显示在显示装置中的工序；和对所显示的、生理活性物质或药剂对含水状态的细胞或细胞片的效果进行图像诊断的工序。

[0053] 本发明的利用电子显微镜评价生理活性物质或药剂对含水状态的细胞的作用的方法中优选：细胞为含水状态的正常细胞，以正常细胞的形态变化为指标来筛选副作用少的生理活性物质或药剂。

[0054] 本发明的利用电子显微镜评价生理活性物质或药剂对含水状态的细胞的作用的方法中优选：生理活性物质或药剂为抗癌剂。

[0055] 本发明的利用电子显微镜评价生理活性物质或药剂对含水状态的细胞的作用的方法中优选：细胞为含水状态的病变细胞，以含水状态的病变细胞的形态变化为指标来筛选有活性的药剂。

[0056] 本发明的利用电子显微镜评价药剂对含水状态的细胞的作用的方法中优选：含水状态的病变细胞为癌细胞，药剂为抗癌剂。

[0057] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法，其特征在于，含有以下工序：使含水状态的细胞与一抗接触的工序；使一抗与金胶体修饰后的二抗接触的工序；对结合有一抗和二抗的含水状态的细胞涂布含有生存环境赋予成分、糖类及电解质的电子显微镜观察用保护剂的工序；将涂布有电子显微镜观察用保护剂的含水状态的细胞载置于试样台，照射电子束或等离子体，在含水状态的细胞的表面形成薄膜而包覆含水状态的细胞的工序；和将收容在真空下的试样室的用薄膜包覆的含水状态的细胞的电子显微镜图像显示在显示装置中的工序；所述方法对含水状态的细胞的与一抗的结合部位进行观察。

[0058] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法中优选：与一抗反应的抗原为含水状态的细胞的膜蛋白，对含水状态的细胞的与一抗的结合部位进行观察。

[0059] 本发明的利用电子显微镜对含水状态的病毒粒子进行定量的方法，其特征在于，含有以下工序：使含水状态的病毒粒子在基板上浓缩的工序；对在基板上浓缩的含水状态的病毒粒子涂布含有生存环境赋予成分、糖类及电解质的电子显微镜观察用保护剂的工序；将涂布有电子显微镜观察用保护剂的含水状态的病毒粒子与基板一起载置于试样台，照射电子束或等离子体，在含水状态的病毒粒子的表面形成薄膜而包覆试样的工序；将收容在真空下的试样室的用薄膜包覆的含水状态的病毒粒子的电子显微镜图像显示在显示装置中的工序；和在所显示的含水状态的病毒粒子的电子显微镜图像中对病毒粒子进行计数的工序。

[0060] 本发明的利用电子显微镜对含水状态的病毒粒子进行定量的方法中，使含水状态的病毒粒子在基板上浓缩的工序优选为：对含水状态的病毒粒子的表面赋予电荷，使其吸附在表面赋予了与该被赋予的电荷相反的电荷的基板上，从而将病毒粒子浓缩。

[0061] 本发明的利用电子显微镜对含水状态的病毒粒子进行定量的方法中优选：对含水状态的病毒粒子表面进行聚凝胺处理而赋予正电荷。

[0062] 本发明的利用电子显微镜对含水状态的病毒粒子进行定量的方法中优选：通过等离子体照射而对基板的表面赋予负电荷。

[0063] 发明效果

[0064] 根据本发明，能够提供在真空下也能够保护哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等含水状态的生物试样使其不变形、维持存活状态的真空下的电子显微镜观察用保护剂和使用其的试剂盒，利用电子显微镜进行试样的观察、诊断、评价、定量的方法，及观察中使用的试样台。附图说明

[0065] [图1](a)为实施例1的SEM图像，(b)为比较例1的SEM图像。 (a)、(b)分别为对试样以50倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0066] [图2](a)为实施例1的SEM图像，(b)为比较例1的SEM图像。 (a)、(b)分别为对图1的试样以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0067] [图3](a)、(b)分别为实施例2的SEM图像。(a)为对不进行化学固定而用电子显微镜观察用保护剂处理、用含有表面活性剂的溶液处理的含水状态的小鼠腹膜上皮侧以100倍的倍率进行观察、拍摄而得的 SEM图像。另外，(b)为对(a)的一部分以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0068] [图4](a)、(b)分别为实施例3的SEM图像。(a)为对进行以往的一次化学固定之后用电子显微镜观察用保护剂处理、用含有表面活性剂的溶液处理的人胃癌的病理切片以500倍的倍率进行观察、拍摄而得的 SEM图像。另外，(b)为对(a)的一部分以1500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0069] [图5]为对图4所示的实施例3的人胃癌的病理切片的一部分以2,000 倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0070] [图6](a)为实施例4的SEM图像，(b)为比较例2的SEM图像。 (a)、(b)分别为对试样以100倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM 图像。

[0071] [图7](a)为对图6(a)所示的实施例4的一部分以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。(b)为对图6(b)所示的比较例 2的一部分以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0072] [图8]为将图6(a)所示的实施例4的人胃癌的病理切片沿厚度方向切割，对切面部以200倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0073] [图9](a)、(b)分别为实施例5的SEM图像。(a)为对接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞非转移株以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的图像。另外，(b)为对(a)的边缘部的微纤维以10,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0074] [图10](a)、(b)分别为实施例6的SEM图像。(a)为对接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞转移株以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的图像。另外，(b)为对(a)的边缘部的微纤维以10,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0075] [图11](a)、(b)分别为实施例7的SEM图像。(a)为对接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞转移株在接种起 20分钟后以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b) 为对(a)以5,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0076] [图12]为对图11(a)所示的实施例7的人黑素瘤细胞的边缘部的微纤维以10,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0077] [图13](a)、(b)分别为实施例8的SEM图像。(a)为对接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞转移株在接种起 30分钟后以500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b) 为对(a)以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0078] [图14](a)、(b)分别为实施例9的SEM图像。(a)为对接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞转移株在接种起 60分钟后以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的图像。另外，(b)为对(a)以5,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0079] [图15](a)、(b)分别为实施例10的SEM图像，是对接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞非转移株在接种起60 分钟后以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0080] [图16](a)、(b)分别为对图15(a)、(b)所示的人黑素瘤细胞非转移株以5,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0081] [图17](a)、(b)分别为实施例11的SEM图像。(a)为对接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞转移株在添加抗癌剂之一的索拉非尼(ソラフェニブ)60分钟后以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b)为对(a)以5,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0082] [图18]A、B分别为后述实施例12中使用的人人工皮肤的照片。A 为示出培养中的人人工皮肤和培养容器的照片。另外，B为对A的人人工皮肤的病理切片进行HE染色而得的照片。

[0083] [图19](a)为实施例12的SEM图像，(b)为比较例3的SEM图像。(a)为在对图18A所示的人人工皮肤添加溶解于二甲基亚砜(DMSO) 的吉非替尼(ゲフィチニブ)60分钟后以2,500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b)为对照区，是在对图18A所示的人人工皮肤添加DMSO 60分钟后以2,500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM 图像。

[0084] [图20](a)、(b)分别为实施例13的基于免疫电子显微法的SEM 图像，是使来自人皮肤的成纤维细胞与一抗、和进行金胶体修饰后的二抗结合并用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理后，以10,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的基于免疫电子显微法的SEM 图像。

[0085] [图21](a)、(b)分别为实施例14的基于免疫电子显微法的SEM 图像。(a)为使接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞转移株与一抗、和进行金胶体修饰后的二抗结合并用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理后，以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的基于免疫电子显微法的SEM图像。另外，(b)为对 (a)以
10,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的基于免疫电子显微法的 SEM图像。

[0086] [图22]为对图21(a)所示的人黑素瘤细胞的边缘部的微纤维以7,000 倍的倍率进行观察、拍摄而得的基于免疫电子显微法的SEM图像。

[0087] [图23](a)、(b)分别为示出本发明的电子显微镜观察用试样台的照片。(a)为示出由圆柱状的构件、环状的构件和固定材料构成的试样台的一实施方式的图。另外，(b)为示出由圆柱状的构件和圆盘状构件和固定材料构成的试样台的另一实施方式的图。

[0088] [图24](a)、(b)分别为实施例15的SEM图像。(a)为将从小鼠摘出的腹膜载置于图23(a)所示的试样台上，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理，对含水状态的小鼠腹膜上皮侧以100倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b)为对(a)的一部分以1500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0089] [图25](a)、(b)分别为比较例4的SEM图像。(a)为从小鼠摘出的腹膜在经过以往的电子显微镜观察用标本制作方法、即化学固定、脱水、干燥、金属蒸镀工序后载置于图23(a)所示的试样台上，以50 倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b)为对(a)的一部分以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0090] [图26](a)、(b)分别为实施例16的SEM图像。(a)为将从小鼠摘出的含水状态的腹膜载置于图23(a)所示的试样台上，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理，以100倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b)为对(a)的一部分以 1,300倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0091] [图27](a)、(b)分别为比较例5的SEM图像。(a)为从小鼠摘出的腹膜在经过以往的电子显微镜观察用标本制作方法、即化学固定、脱水、干燥、金属蒸镀工序后载置于图23(a)所示的试样台上，以50 倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b)为对(a)的一部分以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0092] [图28](a)、(b)分别为比较例6的SEM图像，是将从小鼠摘出的腹膜载置于图23(a)所示的试样台上并在未处理的状态下导入电子显微镜内并以1500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0093] [图29](a)、(b)分别为示出实施例17的SEM图像的照片。(a) 为将从小鼠摘出的含水状态的横隔膜载置于图23(b)所示的试样台上，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理，以 500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b)为对(a) 的一部分以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0094] [图30]为对图29所示的含水状态的小鼠横隔膜腹侧以20,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0095] [图31](a)为实施例18的SEM图像，(b)为比较例7的SEM图像。(a)为将从引发了炎症的小鼠摘出的含水状态的腹膜载置于图23(a) 所示的试样台上，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理，以30倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外， (b)为将从对照区的小鼠摘出的含水状态的腹膜载置于图23(a)所示的试样台上并立即用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理，以30倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0096] [图32](a)、(b)分别为对图31(a)、(b)所示的含水状态的小鼠腹膜上皮侧以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0097] [图33](a)、(b)分别为对图31(a)、(b)所示的含水状态的小鼠腹膜上皮侧以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0098] [图34](a)、(b)分别为实施例19的SEM图像。(a)为将作为培养细胞的来自小鼠的成纤维细胞在玻璃平板上培养、在从培养基捞出后立即用含有表面活性剂的溶液处理、用电子显微镜观察用保护剂处理并以 450倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b)为对(a) 的一部分以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0099] [图35](a)、(b)分别为比较例8的SEM图像。(a)为将作为培养细胞的来自小鼠的成纤维细胞在玻璃平板上培养、在从培养基捞出后在未处理的状态下导入电子显微镜内并以1500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b)为对(a)的一部分以1,800倍的倍率进行观察、拍摄而得的图像。

[0100] [图36](a)、(b)分别为实施例20的SEM图像。(a)为将作为培养细胞的来自人的成纤维细胞在玻璃平板上培养、在从培养基捞出后立即用蒸馏水洗涤、用电子显微镜观察用保护剂处理并以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b)为对(a)的一部分以5,000 倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0101] [图37](a)、(b)分别为比较例9的SEM图像。(a)为将含有作为单细胞的人红细胞的生理盐水滴加于玻璃平板、并在未处理的状态下导入电子显微镜内并以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b)为对(a)的一部分以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的 SEM图像。

[0102] [图38](a)、(b)、(c)分别为实施例21的SEM图像。(a) 为将含有作为单细胞的人血球细胞及血小板的生理盐水滴加于玻璃平板，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，以1,000倍的倍率对含水状态的人血球细胞及血小板进行观察、拍摄而得的SEM图像。(b)为将含有作为单细胞的人红细胞的生理盐水滴加于玻璃平板，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，以7,000倍的倍率对含水状态的人红细胞进行观察、拍摄而得的SEM图像。(c)为将含有作为单细胞的人白细胞的生理盐水滴加于玻璃平板，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，以7,000倍的倍率对含水状态的人白细胞进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0103] [图39](a)、(b)、(c)(d)分别为实施例22的SEM图像。 (a)为将含有作为单细胞的酵母的培养液滴加于玻璃平板，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，以5,000倍的倍率对含水状态的酵母进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b)为对(a)的一部分以20,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。(c)为将含有作为单细胞的纳豆菌的培养液滴加于玻璃平板，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，以15,000倍的倍率对含水状态的纳豆菌进行观察、拍摄而得的SEM图像。 (d)为将含有作为单细胞的大肠杆菌的培养液滴加于玻璃平板，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，以10,000倍的倍率对含水状态的大肠杆菌进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0104] [图40](a)、(b)、(c)(d)分别为实施例23的SEM图像。 (a)为将含有作为单细胞的网柄菌(タマホコリカビ)的子实体的培养液滴加于玻璃平板，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，对含水状态的盘基网柄菌(キイロタマホコリカビ)子实体以50倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。(b)为对(a)的一部分以300倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。(c)为对(a)的一部分以3,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。(d)为对(a)的一部分以6,000倍进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0105] [图41](a)、(b)分别为实施例24的含水状态的MCMV感染小鼠成纤维细胞的SEM图像。(a)为感染起10分钟后的SEM图像，(b) 为将(a)的一部分放大而得的SEM图像。

[0106] [图42](a)、(b)分别为对图41(a)、(b)所示的含水状态的 MCMV感染小鼠成纤维细胞以高倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0107] [图43](a)、(b)、(c)分别为实施例25的含水状态的MCMV 感染小鼠成纤维细胞的SEM图像。(a)为感染起10分钟后的SEM图像，(b)为(a)的感染起15分钟后、(c)为(a)的感染起20分钟后的SEM图像。

[0108] [图44](a)～(f)分别为实施例26的含水状态的人脊髓灰质炎病毒感染人咽喉癌细胞(Hep－2细胞)的SEM图像。(a)为感染起15 分钟后的SEM图像，(b)为将(a)图中被框包围的区域放大观察的SEM 图像。(c)为(b)的感染起30分钟后、(d)为(b)的感染起45分钟后、(e)为(b)的感染起60分钟后、(f)为(b)的感染起75分钟后的SEM图像。

[0109] [图45](a)、(b)分别为实施例27的使盖玻片的表面吸附进行了聚凝胺处理的MCMV后进行观察、拍摄而得的荧光显微镜照片。(a) 为使进行了等离子体处理的盖玻片的表面吸附进行了聚凝胺处理的小鼠巨细胞病毒(MCMV)后进行观察、拍摄而得的照片。图中的发出荧光的绿色斑点表示吸附于盖玻片的含水状态的MCMV。(b)为对照区，是使未处理的盖玻片的表面吸附进行了聚凝胺处理的MCMV后进行观察、拍摄而得的照片。

[0110] [图46](a)、(b)分别为示出实施例27的使用进行了聚凝胺处理的MCMV和盖玻片的MCMV浓缩方法的示意图。(a)示出进行了聚凝胺处理的MCMV的电荷赋予，(b)示意性示出使进行了等离子体处理的盖玻片的表面吸附进行了聚凝胺处理的鼠巨细胞病毒(MCMV)而浓缩的原理。

[0111] [图47]为示出实施例28的测定MCMV粒子在盖玻片上的吸附率的结果的图表。

[0112] [图48](a)、(b)分别为实施例28的吸附于盖玻片而浓缩的MCMV 的SEM图像。(a)为对进行了聚凝胺处理而赋予正电的MCMV粒子照射等离子体，使其吸附于赋予负电的盖玻片而浓缩，对该MCMV以15,000 倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。(b)为对(a)的一部分以 35,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0113] [图49](a)～(j)分别为实施例29的在多个不同视野中对病毒粒子进行拍摄而得的SEM图像。

[0114] [图50]为示出将与实施例29同样的实验重复5次时的平均病毒粒子数的图表。

[0115] [图51](a)、(b)、(c)分别为实施例30的含水状态的MCMV 的SEM图像。(a)为对照区的MCMV的SEM图像，(b)为进行了乙酸铀处理的MCMV的SEM图像。另外，(c)为进行了顺铂处理的MCMV 的SEM图像，图中箭头表示含DNA的病毒粒子。均为以10,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0116] [图52]为实施例31的SEM图像，是MCMV与作为一抗的抗DNA 抗体结合、与作为二抗的与一抗具有结合性且进行金胶体修饰后的抗体结合后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理，对含水状态的MCMV进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0117] [图53](a)、(b)分别为实施例32的SEM图像。(a)为采集作为植物的生物体组织的含水状态的福寿草(フクジュソウ)的花瓣，载置于图23(a)所示的试样台上，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理，以30倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM 图像。另外，(b)为对(a)的一部分以5,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0118] [图54](a)、(b)分别为实施例33的SEM图像。(a)为采集作为植物的生物体组织的含水状态的鸭跖草(ツユクサ)叶并进行一次化学固定处理后，用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理，对鸭跖草叶的表侧的叶肉细胞以30倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，(b)为在一次化学固定处理后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理，对该含水状态的鸭跖草叶的背侧的叶肉细胞以30倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0119] [图55]为对图54(a)、(b)所示的含水状态的鸭跖草叶的叶肉细胞以500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像，(a)表示叶的表侧、 (b)表示叶的背侧。

[0120] [图56]为对图54(a)、(b)所示的含水状态的鸭跖草叶的叶肉细胞以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像，(a)表示叶的表侧、(b)表示叶的背侧。

[0121] [图57]为示出实施例34的SEM图像的照片。为对活涡虫(プラナリア)上滴加电子显微镜观察用保护剂，用含有表面活性剂的溶液处理，对含水状态的涡虫进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0122] [图58]为示出实施例35的SEM图像的照片。为在猩猩蝇(ショウジョウバエ)的复眼发生过程中，对活猩猩蝇滴加电子显微镜观察用保护剂，用含有表面活性剂的溶液处理，对含水状态的猩猩蝇复眼的发生边缘部位进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0123] [图59]为示出实施例36的SEM图像的照片。为在水螅(ヒドラ)的再生过程中，对活水螅滴加电子显微镜观察用保护剂，用含有表面活性剂的溶液处理，对含水状态的水螅头部的再生前端进行观察、拍摄而得的 SEM图像。

[0124] [图60](a)～(c)分别为实施例37的SEM图像，(d)为实施例 37的TEM像。(a)为含水状态的原核生物的SEM图像。(b)为含水状态的椰果(nata de coco))菌的SEM图像，(c)为含水状态的酵母的 SEM图像。另外，(d)为含水状态的大肠杆菌的TEM像。

[0125] [图61](a)为实施例38的SEM图像，(b)为示出实施例38中进行EDS解析的部位的图，(c)为实施例38的EDS解析图。

[0126] [图62](a)为比较例10的SEM图像，(b)为示出比较例10中进行EDS解析的部位的图，(c)为比较例10的EDS解析图。

[0127] [图63](a)为实施例39的SEM图像，(b)为示出实施例39中进行EDS解析的部位的图，(c)为实施例39的EDS解析图。

[0128] [图64](a)为比较例11的SEM图像，(b)为示出比较例11中进行EDS解析的部位的图，(c)为比较例11的EDS解析图。

[0129] 以下对本发明进行详细说明。

[0130] 前述在先发明中，关于对于哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等不具有包覆表面的牢固层的脆弱生物试样能否在电子显微镜的镜体内的真空下生存、观察的研究，尚不充分。因此，本发明人反复进行了深入研究，发现通过涂布本发明的电子显微镜观察用保护剂，能够在存活状态下，对研究尚不充分的哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等不具有包覆表面的牢固层的脆弱生物试样进行电子显微镜观察。这是由本发明人获得的新见解。

[0131] 本发明人将本发明的电子显微镜观察用保护剂称为使在先发明的蒸发抑制用组合物所带来的水/气体阻隔性能(Surface Shielding Effect，SS 效果)增强的Surface Shielding Enhancer(SSE)。

[0132] 根据本发明的电子显微镜观察用保护剂，能够在存活状态下对哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等不具有包覆表面的牢固层的脆弱生物试样进行电子显微镜观察。另外，本发明不仅限于提供用于生物试样的电子显微镜观察的溶液，还提供广义上发挥SSE作用的溶液(SSE溶液) 的组成。

[0133] 根据本发明，SSE溶液含有作为主要成分的生存环境赋予成分、糖类及电解质，能够在各种用途中使用。

[0134] 需要说明的是，本发明中，“生存环境赋予成分”是指在进行电子显微镜观察的真空下也具有保水能力、从而可提供模拟含水状态的生物试样的生活环境或生存环境的化合物。

[0135] 另外，本发明中，“真空”是指例如10－1Pa以下、进而10－2Pa～10－8Pa、特别是10－4Pa～10－8Pa的范围。

[0136] 作为上述生存环境赋予成分，可以例示出例如多元醇及其衍生物等。优选分子内具有羟基且蒸气压低的物质。另外，优选具有粘性。具体而言，可以列举例如甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、甘油三酯、聚间苯二酚、多酚、鞣酸、漆酚、皂甙等，特别优选使用甘油。

[0137] 作为上述糖类，可以例示出单糖类、二糖类、寡糖、多糖类和它们的衍生物等。具体而言，作为单糖类，可以列举葡萄糖、果糖等。作为二糖类，可以列举蔗糖、海藻糖等，另外作为多糖类，可以列举肝素、硫酸软骨素、普鲁兰多糖、果胶、瓜尔胶、黄原胶、角叉菜胶、丙二醇、羧甲基纤维素、菊糖(イヌリン)等。特别优选葡萄糖之类的单糖类。另外，还可以使用焦糖、蜂蜜、蜜蜡等。另外，还可以使用：哺乳动物的泪液，毛囊分泌的蜡酯、角鲨烯、甘油三酯、脂肪酸等皮脂，神经酰胺、甾醇、游离脂肪酸、硫酸甾醇等角质细胞间脂质，唾液、消化器官所分泌的消化液，存在于以呼吸道、消化器官为中心的上皮细胞的膜表面的膜型黏蛋白、分泌型黏蛋白等。另外，还可以使用节肢动物等无脊椎动物分泌到角质膜表面的蜡成分、水可溶性物质，脊椎动物的毛囊分泌的油脂、水可溶性物质。另外，还可以使用鲨鱼、鳕鱼、鳐鱼等的肝脏中所含的肝油，水母、海参等的体液。另外，还可以使用植物、菌类所分泌的天然分泌液，植物来源的情况下，可以使用桉树油、薄荷油、葵花籽油等从各种植物种子所能采集的油、松油，漆树、樱树、橡树、柳树等的树液。还可以使用原核生物所分泌形成生物被膜的初期分泌物、生物被膜本身。

[0138] 作为上述电解质，可以例示出金属化合物、金属络合物、无机盐、有机盐、酸碱等。

[0139] 作为金属化合物，只要是含有金属离子的化合物就可以广泛使用。

[0140] 上述金属化合物可以是包含阳离子和阴离子的盐(单盐)，也可以是包含两种以上的盐(复盐)。

[0141] 上述金属化合物可以是氧化物、氢氧化物、卤化物、硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐、磷酸盐、乳酸盐等化合物。具体而言，可以列举例如氯化钠、氯化镁、氯化钙、碳酸氢钠、氯化钾、氯化锶、氯化锂、氯化铪、氯化铁、氯化铝、氯化锌、氯化铜、氯化钴、氯化硫酸镁、碳酸镁、磷酸一氢钠、乳酸钙等。

[0142] 上述金属化合物可以是金属氧化物。金属醇盐是用MOR表示的化合物，由金属(M)和烷氧基(RO-)(R为烃)构成。作为金属(M)，具体而言，可以列举硅、钛、铝、硼、锆、钒、钨、磷、锗、铟、铪、钼等，可以由各种醇获得金属醇盐。可以直接使用这些金属醇盐，也可以使用使这些金属醇盐在酸或碱存在下进行溶胶凝胶反应的反应产物。作为金属醇盐，可以不使用单一成分而将两种以上混合。

[0143] 上述金属化合物可以是金属络合物。具体而言，可以列举乙二胺镍络合物、四胺钴络合物等。

[0144] 上述酸碱具体可以例示出例如盐酸、乙酸、柠檬酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、葡糖酸等，特别优选使用柠檬酸。

[0145] 另外，作为上述电解质，还可以使用市售的运动饮品粉末、粉末的林格氏液等。特别是，市售的运动饮品粉末含有糖类，因此仅通过溶解于甘油等即可调制本发明的电子显微镜观察用保护剂。

[0146] 本发明的电子显微镜观察用保护剂在涂布于试样整体后，用纸质的滤纸等将多余的液体彻底擦除。从而，能够在存活状态下对迄今为止研究尚不充分的哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等不具有包覆表面的牢固层的脆弱生物试样进行电子显微镜观察。另外，不限于涂布，也可以采用浸渍、滴加等各种方法。进而，在使用时，有时根据试样的特性将原液稀释后使用。例如，就已剥离了上皮组织等的部位或从个体切出的器官和组织等使生物受损伤等、进行了极大地损害本来结构的处理的试样而言，为了获得更好的保护效果，优选以原液状态来使用电子显微镜观察用保护剂。另一方面，就作为试样特性的结构稳定性、气密性优异的生物(例如，可以例示出细胞、组织、器官等)而言，优选将电子显微镜观察用保护剂在10倍～10,000倍的范围内稀释后使用。即，将电子显微镜观察用保护剂薄薄地涂布的方式在用电子显微镜解析微细结构及其变化方面更有效。但是，在以原液形态利用电子显微镜观察用保护剂时，未必不适合于微细结构的观察。终究是考虑试样特性，对各试样以产生保护效果的最佳稀释率使用本发明的电子显微镜观察用保护剂，从而在维持存活状态的状态下获得用于持续的且以高分辨率·高解像度进行电子显微镜观察的最佳条件。

[0147] 通过将本发明的电子显微镜观察用保护剂涂布于试样整体，从而即使对于生物试样的发生过程、再生过程，也能够在维持存活状态的状态下持续地进行电子显微镜观察。

[0148] 另外，通过将本发明的电子显微镜观察用保护剂涂布于试样整体，从而能够以由于疾病、添加生理活性物质或药剂而导致的正常细胞和病变细胞的形态差异、变化为指标，进行图像诊断、药剂对细胞、组织的效果、副作用的评价、药剂的筛选。

[0149] 进而，另外，通过将本发明的电子显微镜观察用保护剂涂布于试样整体，从而能够进行免疫电子显微法，所述免疫电子显微法使针对活细胞的抗原的一抗和与该一抗结合且进行了修饰、标记的二抗结合。

[0150] 并且，通过将本发明的电子显微镜观察用保护剂涂布于试样整体，从而能够通过在电子显微镜下对活细胞、病毒等进行观察、计数而进行细胞、病毒等的定量。

[0151] 需要说明的是，上述中的“生物试样”包括原核生物及真核生物。

[0152] 原核生物中包括细菌、古细菌。

[0153] 细菌包括酸杆菌门、产水菌门、放线菌门、依鲁司(Elusimicrobia) 门、卡尔第(Caldiserica)门、衣原体门、绿菌门、绿屈挠菌门、产金菌门、热脱硫杆菌门、热微菌门、蓝藻门、芽单胞菌门、互养菌门、螺旋菌门、网络球杆菌门、异常球菌-栖热菌门、软壁菌门、脱铁杆菌门、热袍菌门、硝化螺旋菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、纤维杆菌门、梭杆菌门、浮霉菌门、变形菌门、疣微菌门、黏胶球形菌门。

[0154] 古菌包括泉古菌门(界)、广古菌门(界)、初古菌门(界)、纳古菌门、奇古菌门。

[0155] 真核生物包括原生生物界、植物界、菌界、动物界。

[0156] 原生生物界包括藻类(绿藻、褐藻、红藻、硅藻类、裸藻门、隐藻门、涡鞭毛藻门)、原生动物(绒毛虫门、根足亚类(变形虫、有孔虫、太阳虫、放射虫)、孢子虫门(顶复门、微孢子虫、粘液孢子虫)、鞭毛虫(锥体虫类、襟鞭毛虫、超鞭毛虫、多鞭毛虫))、以及变形菌门、细胞性粘菌、盘根足虫纲、二毛菌门。

[0157] 植物界包括绿藻门、苔藓植物门、车轴藻门、维管束植物界(古生松叶兰门、石松门、木贼门、瓶尔小草门、蕨类植物门、裸子植物(松柏门)、苏铁门、银杏门、麻黄属门、被子植物门(紫玉兰门(双子叶植物纲(紫玉兰纲)、单子叶植物纲(百合纲)))。

[0158] 菌界包括壶菌门(壶菌)、接合菌门(毛霉、根霉)、子囊菌门(酵母、粉色面包霉)、担子菌门(蕈)、半知菌、地衣植物门。

[0159] 动物界包括多孔动物门、扁盘动物门(丝盘虫)、刺胞动物门(水母、海葵、珊瑚)、栉水母动物门(栉水母)、中生动物门(菱形虫)、扁形动物门(涡虫纲、涡虫)、纽形动物门(纽虫)、颚胃动物门、腹毛动物门、轮形动物门(轮虫)、动吻动物门、棘头动物门、内肛动物门、线虫动物门(蛔虫、秀丽隐杆线虫)、线形虫动物门(针金虫)、外肛动物门、帚虫动物门、腕足动物门、软体动物门(贝、乌贼、章鱼)、鳃曳动物门、星虫动物门(星虫)、螠虫动物门、环节动物门(蚯蚓、沙蚕)、缓步动物门(熊虫)、五口动物门、有爪动物门(钩虫)、节肢动动物门 (螫肢亚门(海蜘蛛纲、鲎科(鲎)、肢口纲(蜘蛛、蝎子))、甲壳亚门(虾、蟹)、多足亚门(百足纲(唇足纲、蜈蚣)、综合纲(结合纲、小蜈蚣)、少足纲(少脚纲、少足虫)、马陆纲(倍足纲、马陆))、六足亚门(内颚纲、外颚纲(昆虫纲)))、须腕动物门、棘皮动物门(海胆、海星、蛇尾、海参、海百合)、毛颚动物门(肥胖箭虫)、半索动物门(拟宝珠虫)、脊索动物门(尾索动物亚门(海鞘)、头索动物亚门 (文昌鱼)、脊椎动物亚门(无颌上纲(盲鳗纲、头甲鱼纲(八目鳗))、有颌上纲(软骨鱼纲(鲨鱼、鲟鱼、黑线银鲛)、肉鳍亚纲(腔棘鱼、肺鱼)、辐鳍鱼纲、两栖纲、爬行纲、哺乳纲、鸟纲)))。

[0160] 特别是哺乳纲，作为哺乳动物，可以例示出兔科(野兔，兔子)，鼠科(小鼠，大鼠)，犬科，猫科(猫)，牛科(牛，水牛，山羊，绵羊)，野猪科(野猪，猪)，马科(马，驴)，猴科(恒河猴，食蟹猴，日本猴) 等猴科、人科(人，黑猩猩)等。

[0161] 另外，“生物试样”不仅包括从上述动物体内摘出的组织，还包括从植物摘出的组织、培养细胞、单细胞等。

[0162] 作为从动物体内摘出的组织，可以例示出例如皮肤、血管、毛发、肌肉、胃、肠、肺、心脏、肝脏、胰脏、肾脏、脑、眼球、角膜、神经、脐带、胎盘、腹膜、横隔膜、筋膜、心膜等。

[0163] 作为从植物摘出的组织，可以例示出例如花瓣、种子、果实、叶、茎、根、根毛、茎顶分生组织、根端分生组织、导管、筛管、维管束、叶肉细胞等。

[0164] 作为培养细胞，包括例如从来自人或非人动物的组织分离的干细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、粘膜细胞、肝细胞、胰岛细胞、神经细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、骨细胞、肌细胞，以及家畜等动物和鱼类的精子、卵子或受精卵等生殖细胞、肿瘤细胞，对昆虫细胞、植物细胞等进行原代培养或继代培养的产物。进而，还可以使用已经细胞株化的市售细胞株。另外，作为细胞，既可以使用贴壁细胞，也可以使用浮游细胞。进而，既可以使用培养成平板状的细胞、细胞片，也可以使用立体地三维培养的细胞。

[0165] 作为单细胞，可以例示出血细胞、血小板、红细胞、白细胞等。另外，作为单细胞，还可以例示出酵母、大肠杆菌、枯草杆菌、纳豆菌、细胞性粘菌等单细胞生物。

[0166] 进而，另外，“生物试样”包括病毒、类病毒。作为病毒的种类，可以是DNA病毒，也可以是RNA病毒。

[0167] 作为DNA病毒，可以例示出例如痘病毒科(天花病毒，猴痘病毒等)，疱疹病毒科(单纯疱疹病毒，水痘·带状疱疹病毒，巨细胞病毒，EB病毒等)，腺病毒科(腺病毒)，乳多空病毒(乳头状瘤病毒，JC病毒等)，细小病毒科(细小病毒)，嗜肝病毒科(B型肝炎病毒等)。

[0168] 作为RNA病毒，可以例示出例如例如沙粒病毒科(Lassa病毒等)，正粘病毒科(流感病毒等)，杯状病毒科(诺罗病毒，札幌病毒等)，冠状病毒科(SARS病毒等)，披膜病毒科(风疹病毒等)，野田病毒科(病毒性神经坏死病毒等)，副粘病毒科(腮腺炎病毒，麻疹病毒，RS病毒等)，小RNA病毒科(脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒，埃可病毒等)，丝状病毒科(马尔堡病毒，埃博拉病毒等)，布尼亚病毒科(克里米亚- 刚果出血热病毒，发热伴血小板减少综合征病毒等)，黄病毒科(黄热病病毒，登革热病毒，丙型肝炎病毒，G肝炎病毒等)，弹状病毒科(狂犬病毒等)，呼肠孤病毒，逆转录病毒科(人类免疫缺陷病毒，人类T淋巴细胞病毒，猿猴免疫缺陷病毒，STLV等)。

[0169] 在使用病毒、类病毒作为生物试样时，可以观察结晶状的病毒粒子。另外，以病毒粒子和宿主细胞共存的状态供于电子显微镜观察，还能够经时地、详细地观察病毒对宿主细胞的感染过程、增殖过程。

[0170] 上述生物试样可以是存活状态，也可以是进行了以往的一次化学固定处理后的状态。就从动物体内摘出的组织而言，组织的变化会由于化学固定处理而停止，因此能制作状态良好的电子显微镜试样，另外，还能够实现电子显微镜试样制作技术的标准化。

[0171] 上述“发生过程”的术语不仅是指胚胎发生，还包括ES细胞、iPS细胞等干细胞的分化过程。

[0172] 上述“再生过程”的术语包括生物组织、细胞的缺损部分被同一细胞·组织修复的过程，还包括生理性再生、病理性再生中的任一者。

[0173] 上述“病变细胞”的的术语包括癌细胞、炎症细胞等。

[0174] 上述“图像诊断”的术语包括基于SEM图像进行的病理诊断、病变细胞的转移、浸润的诊断等。

[0175] 上述“生理活性物质”包括神经性氨基酸、生理活性胺、生理活性核苷酸·核苷、生理活性肽、来自血管内皮的松弛因子、类花生酸和其他脂质介质(メディエーター)、细胞因子和趋化因子、维生素、激素。

[0176] 上述“药剂”的术语包括包括胆碱能剂，抗胆碱能药，肾上腺素能激动剂，抗肾上腺素激动剂，局部麻醉剂，抗精神病药，抗抑郁药，情绪稳定剂，精神兴奋剂(中枢兴奋剂)，帕金森氏病剂治疗剂，抗痴呆药物，脑循环和代谢改善药，抗癫痫药，中枢骨骼肌松弛剂，抗焦虑药，安眠药，全身麻醉剂，麻醉性镇痛药，中枢抑制药，中枢兴奋剂，大麻类，致幻剂，有机溶剂，尼古丁，禁烟辅助药物，兴奋剂，心脏药(抗心律失常药物，心脏衰竭治疗药，抗心绞痛药)，抗高血压药，低血压治疗药，升压药，血管扩张剂，头痛药，止血剂，抗血栓形成剂，造血剂，利尿药，排尿障碍治疗药，前列腺增生治疗药，磷酸二酯酶-5(PDE5)抑制剂，激素抑制剂，子宫收缩药，子宫松弛药，免疫抑制剂，细胞毒性剂，免疫刺激剂，抗过敏药，单克隆抗体之类的生物制品，抗炎药及其相关药物(非甾体抗炎药，解热镇痛药，甾体抗炎药，抗风湿药，关节功能改善药，感觉器官用药)，呼吸系统药物(呼吸兴奋剂，镇咳药，祛痰药，支气管扩张药，支气管哮喘治疗剂)，胃肠道药物(胃消化药，促胃动力药，催吐药和止吐药，消化性溃疡治疗药，止泻药，肠蠕动抑制药，泻药，溃疡性结肠炎治疗药，肝病治疗药，胆道疾病治疗药，胰腺疾病治疗药)，糖尿病药物，脂质异常治疗药，高尿酸血症/痛风治疗药，骨质疏松症治疗药，抗感染药物(抗生素，合成抗菌剂，抗结核药，抗真菌剂，抗病毒剂，消毒剂)，抗肿瘤剂，分子靶向药物等。

[0177] 本发明的电子显微镜观察用保护剂中，对生存环境赋予成分与糖类和电解质的配合比例没有特别限定，作为优选的比例，可以例示出例如下述组成。需要说明的是，可以将这些组成的电子显微镜观察用保护剂作为原液，根据试样的特性等进行稀释。另外，本发明的电子显微镜用保护剂的组成(生存环境赋予成分与糖类与电解质的配合比例)可以考虑作为观察对象的哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等含水状态的生物试样中含有的物质(有机物、无机物等)的种类、含量等适当调整。

[0178] (1)生存环境赋予成分(甘油)：(水)：糖类(葡萄糖)：电解质(氯化钠)＝20：10：0.7：0.03～20：10：0.4：0.01

[0179] (2)生存环境赋予成分(甘油)：糖类(葡萄糖)：电解质(氯化钠)＝20：0.7：0.03～20：0.4：0.01

[0180] (3)生存环境赋予成分(甘油)：(水)：糖类(葡萄糖)：电解质(磷酸一氢钠)＝20：10：0.7：0.03～20：10：0.4：0.01

[0181] (4)生存环境赋予成分(甘油)：糖类(葡萄糖)：电解质(磷酸一氢钠)＝20：0.7：0.03～20：0.4：0.01

[0182] (5)生存环境赋予成分(甘油)：(水)：糖类(葡萄糖)：电解质(柠檬酸)＝20：10：0.7：0.03～20：10：0.4：0.01

[0183] (6)生存环境赋予成分(甘油)：糖类(葡萄糖)：电解质(柠檬酸)＝20：0.7：0.03～20：0.4：0.01

[0184] (7)生存环境赋予成分(甘油)：(水)：糖类(葡萄糖)：电解质(乳酸钙)＝20：10：1：0.03～20：10：0.4：0.01

[0185] (8)生存环境赋予成分(甘油)：糖类(葡萄糖)：电解质(乳酸钙)＝20：1：0.03～20：0.4：0.01

[0186] 需要说明的是，就生存环境赋予成分而言，含有水的方式容易调制，容易涂布于试样，故而优选。

[0187] 另外，上述配合比例(3)和(4)中，也可以使用磷酸二氢钠作为电解质成分。

[0188] SSE中，甘油等生存环境赋予成分是自身缺乏导电性的化合物，通过添加氯化钠等电解质而能够赋予导电性。从而我们认为，低倍率时也能够获得SEM图像，与在先发明中使用的离子液体具有同等功能。另外我们认为，生存环境赋予成分本身虽然具有保水性，但通过添加糖类而产生协同效应，保水性更高。我们认为，利用这样的兼具高保水性和导电性的生存环境赋予成分，能够在存活状态下对迄今为止研究尚不充分的哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等不具有包覆表面的牢固层的脆弱生物试样进行电子显微镜观察。

[0189] 另外，试样特性方面，在作为观察对象的哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等含水状态的生物试样中存在与构成本发明的电子显微镜用保护剂的成分发挥同等作用效果(生存环境的赋予、保水性的赋予、导电性的赋予等)的物质时，上述例示的组成包括应用本发明的电子显微镜用保护剂后的该生物试样的表面满足上述例示的组成的状态，为形成这样的状态而使用的组合物包括在本发明的电子显微镜用保护剂中。

[0190] 需要说明的是，本发明的电子显微镜用保护剂中，除了上述那样的生存环境赋予成分、糖类及电解质的组合以外，还可以使用例如具有生存环境赋予成分、糖链和可电解官能团的高分子化合物。即，本发明的电子显微镜用保护剂中含有的生存环境赋予成分、糖类及电解质可以是各自单独的物质，另外，也可以是在一种物质中具有这些构成要素或与其有同等功能的分子结构的物质。

[0191] 本发明的电子显微镜观察用保护剂可以是固体状态或液状，为了在真空下保持试样组织的水环境，优选为液状、高粘性的状态。另外，为固体状态时，可以在使用时制成液状后使用。

[0192] 本发明的电子显微镜观察用保护剂在涂布于生物试样后，将多余的液体用无尘布之类的柔软的布状的纸、滤纸等吸除。通过介质的涂布、附着、涂覆、包覆、包埋等，对用于TEM观察的试样进行处理。

[0193] 另外，根据本发明，还能够提供含有(A)电子显微镜观察用保护剂和(B)含有表面活性剂的溶液的电子显微镜观察用试剂盒，其中，所述 (A)电子显微镜观察用保护剂含有生存环境赋予成分、糖类及电解质。

[0194] 本发明中的含有表面活性剂的溶液是代替在先发明中的蒸发抑制用组合物的、发挥水/气体阻隔性能(Surface Shielding Effect，SS效果)的溶液。

[0195] 含有表面活性剂的溶液以表面活性剂为主要成分(基材)。表面活性剂根据分子结构大致分为：阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、非离子性表面活性剂、两性表面活性剂、天然来源的表面活性剂、微生物来源的两亲性化合物(生物表面活性剂)等。在工业、食品、医疗品等广泛领域中使用，但基本上无论使用何种表面活性剂都能体现一定的阻隔性能。

[0196] 上述表面活性剂中，作为阴离子性表面活性剂，可分类为例如羧酸型、硫酸酯型、磺酸型、磷酸酯型。其中，具体可以举出例如十二烷基硫酸钠、月桂酸钠、α-磺基脂肪酸甲酯钠、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基乙氧基化物硫酸钠等，其中，优选使用十二烷基苯磺酸钠。

[0197] 上述表面活性剂中，作为阳离子性表面活性活性剂，可分类为例如季铵盐型、烷胺型、杂环胺型。具体可以举出例如硬脂基三甲基氯化铵、二硬脂基二甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、十六烷基三吡啶氯化物、十二烷基二甲基苯甲基铵氯化物等。。

[0198] 上述表面活性剂中，作为非离子性表面活性剂，可以列举例如聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚氧乙烯单脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚丙三醇脂肪酸酯、烷基聚苷、N- 甲基烷基葡糖酰胺等。其中，优选十二烷基醇乙氧基TM TM化物、壬基酚乙氧基化物、月桂酰基二乙醇酰胺，以及以Triton X(Triton X-100等)、 pluronic(R)(pluronic(R)F-123、F-68等)、吐温(Tween 20、40、 60、65、80、85等)、Brij(R)(Brij(R)35、58、98等)、Span(Span 20、 40、60、80、83、85)的名称市售的化合物。

[0199] 上述表面活性剂中，作为两性表面活性剂，有例如十二烷基二甲基氨基乙酸甜菜碱、十二烷基氨基甲基二甲基磺基丙基甜菜碱、3-(四癸基二甲基铵)丙烷-1-磺酸酯等，但优选使用3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙烷磺酸酯((3-〔(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio〕 -1-propanesulfonate),CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-2-羟基-1- 丙烷磺酸酯((3-〔(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio〕 -2-hydroxy-1-propanesulfonate),CHAPSO)等。

[0200] 上述表面活性剂中，作为天然来源的表面活性剂，优选例如卵磷脂、皂甙，被称为卵磷脂的化合物中，具体优选磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油等。另外，作为皂甙优选皂树皂甙。

[0201] 上述表面活性剂中，作为来源于微生物的两亲性化合物(生物表面活性剂)，优选使用鼠李糖脂(rhamnolipid)、槐糖脂(sophorolipid)、甘露糖赤藓糖醇脂(mannosylerythritol lipid)等。

[0202] 除上述表面活性剂中例示的以外，作为通常公知的物质使用的表面活性剂中，尤其作为用于化状品类的表面活性剂，可以列举例如杏仁油 PEG-6、酰基(C12，14)天冬氨酸Na、酰基(C12、14)天冬氨酸TEA、 ARACHIDETH-20、硬脂基醇、烷基(C11、13、15)硫酸钠、烷基(C11， 13，15)硫酸TEA、烷基(C11，13，15)磷酸钾、烷基(C12，13) 硫酸DEA、烷基(C12，13)硫酸钠、烷基(C12，13)硫酸TEA、烷基(C12，14，16)硫酸铵、烷基(C12-14)氧羟基丙基精氨酸盐酸盐、烷基(C12-14)二氨基乙基甘氨酸盐酸盐、烷基(C12-14)硫酸TEA、烷基(C12-15)硫酸TEA、烷基(C14-18)磺酸钠、烷基(C16，18) 三甲基氯化铵、烷基(C28)三甲基氯化铵、异硬脂酰胺DEA、异硬脂基醇、异硬脂基甘油酯、异硬脂基十二烷基二甲基氯化铵、异硬脂酸 PEG-2、异硬脂酸PEG-3、异硬脂酸PEG-4、异硬脂酸PEG-6、异硬脂酸PEG-8、异硬脂酸PEG-10、异硬脂酸PEG-12、异硬脂酸PEG-15甘油酯、异硬脂酸PEG-20、异硬脂酸PEG-20甘油酯、异硬脂酸PEG-20氢化蓖麻油、异硬脂酸PEG-20山梨糖醇酐酯、异硬脂酸PEG-30、异硬脂酸PEG-30 甘油酯、异硬脂酸PEG-40、异硬脂酸PEG-50氢化蓖麻油、异硬脂酸 PEG-58氢化蓖麻油、异硬脂酸PEG-60甘油酯、异硬脂酸PG、异硬脂酸山梨糖醇酐酯、异硬脂酸山梨醇聚醚-3、异硬脂酸聚甘油酯-2、异硬脂酸聚甘油酯-3、异硬脂酸聚甘油酯-4、异硬脂酸聚甘油酯-5、异硬脂酸聚甘油酯-6、异硬脂酸聚甘油酯-10、异硬脂醇聚醚-2、异硬脂醇聚醚-10、异硬脂醇聚醚-
15、异硬脂醇聚醚-22、异硬脂酰基水解胶原、异硬脂酰基水解胶原AMPD、异硬脂酰基乳酸钠、异鲸蜡醇聚醚-10、异鲸蜡醇聚醚-20、异棕榈酸辛酯、异棕榈酸聚甘油酯-2、异丁酸乙酸蔗糖、十一碳烯酰基水解胶原钾、亚乙基二胺四羟基异丙基二油酸、环氧酯-1、环氧酯-2、环氧酯-3、环氧酯-4、环氧酯-5、芥酸甘油酯、辛烷酸PEG-4、壬基酚聚醚-14、辛基十二醇聚醚-
2、辛基十二醇聚醚-5、辛基十二醇聚醚-10、辛基十二醇聚醚-30、辛烯基琥珀酸糊精TEA、辛基酚聚醚-1、辛基酚聚醚-2乙烷磺酸钠、辛基酚聚醚-10、辛基酚聚醚-25、辛基酚聚醚-70、橄榄油PEG-6、低聚琥珀酸PEG-3-PPG-20、油酰胺DEA、油胺氧化物、油醇甜菜碱、油醇硫酸钠、油醇硫酸TEA、油酸PEG-2、油酸PEG-10、油酸PEG-10 甘油酯、油酸PEG-15甘油酯、油酸PEG-20甘油酯、油酸PEG-30甘油酯、油酸PEG-36、油酸PEG-40山梨醇酯、油酸PEG-75、油酸PEG-150、油酸PG、油酸蔗糖酯、油酸羟基{二(羟乙基)氨基}丙酯、油酸聚甘油酯-2、油酸聚甘油酯-5、油酸聚甘油酯-10、油酰基水解胶原、油酰基肌氨酸、油酰基甲基牛磺酸钠、油醇聚醚-2、油醇聚醚-3磷酸DEA、油醇聚醚-7磷酸钠、油醇聚醚-8磷酸钠、油醇聚醚-10、油醇聚醚-10磷酸、油醇聚醚-10磷酸DEA、油醇聚醚-20、油醇聚醚-20磷酸、油醇聚醚-30、油醇聚醚-50、烯烃(C14-16)磺酸钠、阳离子化水解小麦蛋白 -1、阳离子化水解小麦蛋白-3、阳离子化水解贝壳硬蛋白-2、阳离子化水解大豆蛋白-1、阳离子化水解大豆蛋白-2、阳离子化水解大豆蛋白-3、阳离子化右旋糖酐-2、癸酰胺DEA、牛脂脂肪酸甘油酯、杏仁油PEG-6、柠檬酸二硬脂酯、柠檬酸脂肪酸甘油酯、季铵盐-14、季铵盐-18、季铵盐 -18水辉石、季铵盐18膨润土、季铵盐-22、季铵盐-33、粟米油PEG-6、粟米油PEG-8、椰油酰胺、椰油酰胺DEA、椰油酰胺MEA、椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油胺氧化物、椰油酰两性基乙酸钠、椰油酰两性基二乙酸二钠、聚氧乙烯三癸基硫酸钠、椰油酰两性基二丙酸二钠、椰油酰两性基丙酸钠、椰油酰丙氨酸TEA、椰油酰精氨酸乙基PCA、椰油酰羟乙磺酸钠、椰油酰水解酪蛋白钾、椰油酰水解角蛋白钾、椰油酰水解酵母钾、椰油酰水解酵母蛋白钾、椰油酰水解小麦蛋白钾、椰油酰水解胶原、椰油酰水解胶原钾、椰油酰水解胶原钠、椰油酰水解胶原TEA、椰油酰水解土豆蛋白钾、椰油酰水解大豆蛋白钾、椰油酰水解玉米蛋白钾、椰油酰水解马铃薯蛋白钾、椰油酰甘氨酸钾、椰油酰甘氨酸TEA、椰油酰谷氨酸、椰油酰谷氨酸钾、椰油酰谷氨酸钠、椰油酰谷氨酸TEA、椰油酰肌氨酸、椰油酰肌氨酸钠、椰油酰肌氨酸TEA、椰油酰牛磺酸钠、椰油酰甲基丙氨酸、椰油酰甲基丙氨酸钠、椰油酰甲基牛磺酸钾、椰油酰甲基牛磺酸镁、椰油酰甲基牛磺酸钠、椰油基甘油酯硫酸钠、椰油基二甲基铵羟丙基水解角蛋白、椰油基二甲基铵羟丙基水解胶原蛋白、椰油基二甲基铵羟丙基水解丝、椰油基甜菜碱、琥珀酸PEG-50氢化蓖麻油、琥珀酸脂肪酸甘油酯、胆甾醇聚醚-10、胆甾醇聚醚-15、异鲸蜡醇聚醚-3-乙酸酯、鲸蜡醇聚醚-
3- 乙酸酯、乙酸异丁酯、乙酸乙酯、乙酸甘油酯、乙酸脂肪酸甘油酯、乙酸硬脂酸蔗糖酯、十三烷醇聚醚-3-乙酸酯、十三烷醇聚醚-15-乙酸酯、乙酸丁酯、乙酸单硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇聚醚-9乙酸酯、二乙酰酒石酸脂肪酸甘油酯、二烷基(C12-15)二甲基氯化铵、二烷基(C12-18)二甲基氯化铵、二异硬脂酸PEG-8、二异硬脂酸PG、二异硬脂酸聚甘油酯-2、二油酸PEG-4、二油酸PEG-10、二油酸PEG-32、二油酸PEG-75、二油酸PEG-120甲基葡萄糖、二油酸PEG-150、二油酸PG、二油酸甘醇酯、二油酸聚甘油酯-6、二牛脂烷基二甲基铵硫酸纤维素、二椰油基二甲基氯化铵、二乙酸硬脂酸甘油酯、二硬脂基二甲基氯化铵、二硬脂酸PEG-2、二硬脂酸PEG-12、二硬脂酸PEG-20甲基葡萄糖、二硬脂酸PEG-120、二硬脂酸PEG-250、二硬脂酸PEG-三羟甲基丙烷、二硬脂酸PG、二硬脂酸PPG-20甲基葡萄糖、二硬脂酸甘醇、二硬脂酸甘油酯、二硬脂酸蔗糖、二硬脂酸山梨糖醇酐酯、二硬脂酸聚甘油酯-6、二硬脂酸聚甘油酯-
10、二鲸蜡二甲基氯化铵、二鲸蜡硬脂醇磷酸双酯MEA盐、二羟乙基硬脂基甜菜碱、二棕榈酸PEG-3、二羟乙基月桂胺氧化物、(二羟基甲基甲硅烷基丙氧基)羟丙基水解酪蛋白、(二羟基甲基甲硅烷基丙氧基)羟丙基水解胶原、(二羟基甲基甲硅烷基丙氧基)羟丙基水解丝、二氢胆甾醇聚醚 -15、脂肪酸(C8-22)聚甘油酯-10、二甲基硅氧烷共聚醇、二甲基硅氧烷共聚醇乙基、二甲基硅氧烷共聚醇丁酯、二甲基硬脂胺、二月桂酸 PEG-4、二月桂酸PEG-12、二月桂酸PEG-32、二月桂酸蔗糖酯、二月桂醇聚醚-4磷酸、二月桂醇聚醚-10磷酸、二月桂酰基谷氨酸镁、水酸化卵磷脂、氢化椰油基甘油酯、氢化大豆脂肪酸甘油酯、氢化牛脂酰胺DEA、氢化牛脂谷氨酸二钠、氢化牛脂谷氨酸TEA、氢化羊毛脂、氢化羊毛脂醇、氢化溶血卵磷脂、氢化卵磷脂、硬脂酰胺、硬脂酰胺DEA、硬脂酰胺MEA、硬脂酰胺乙基二乙胺、硬脂酰胺丙基二甲胺、硬脂胺氧化物、司拉氯铵、司拉氯铵水辉石、硬脂基二甲基甜菜碱钠、硬脂基三甲基铵糖精、硬脂基三甲基溴化铵、硬脂基甜菜碱、硬脂基硫酸钠、硬脂酸PEG-2、硬脂酸PEG-6山梨醇酯、硬脂酸PEG-10、硬脂酸PEG-10甘油酯、硬脂酸PEG-14、硬脂酸PEG-20甘油酯、硬脂酸PEG-
23、硬脂酸PEG-25、硬脂酸PEG-40、硬脂酸PEG-100、硬脂酸PEG-120甘油酯、硬脂酸 PEG-
150、硬脂酸PEG-200甘油酯、硬脂酸PG、硬脂酸TEA、硬脂酸甘醇酯、硬脂酸甘油酯、硬脂酸蔗糖酯、硬脂酸硬脂醇聚醚-4、硬脂酸硬脂酰基二羟基异丁酰胺、硬脂酸山梨糖醇酐酯、硬脂酸聚氧乙烯鲸蜡醚、硬脂酸聚甘油酯-2、硬脂酸聚甘油酯-10、硬脂酸/苹果酸甘油酯、月桂基二甲基铵羟基二丙基水解角蛋白、月桂基二甲基铵羟基二丙基水解胶原、月桂基二甲基铵羟基二丙基水解丝、月桂基三甲基氯化铵、硬脂醇聚醚-2 磷酸、硬脂醇聚醚-3、硬脂醇聚醚-10、硬脂醇聚醚-16、硬脂醇聚醚-50、硬脂醇聚醚-80、硬脂醇聚醚-100、硬脂酰基水解胶原钾、硬脂酰基水解胶原钠、硬脂酰基谷氨酸、硬脂酰基谷氨酸二钠、硬脂酰基谷氨酸钾、硬脂酰基谷氨酸钠、硬脂酰基谷氨酸二辛基十二烷基酯、司吡氯铵、硬脂酰基乳酸钙、硬脂基乳酸钠、硬脂基甲基牛磺酸钠、磺基琥珀酸(C12-14) 链烷醇聚醚二钠、磺基琥珀酸PEG-2油酰胺二钠、磺基琥珀酸PEG-4椰油酰异丙醇酰胺二钠、磺基琥珀酸PEG-5月桂酰胺二钠、磺基琥珀酸二辛基钠、磺基琥珀酸谷甾醇聚醚-14-二钠、磺基琥珀酸十二烷基二钠、磺基琥珀酸月桂醇聚醚二钠、倍半异硬脂酸山梨糖醇酐酯、倍半油酸甘油酯、倍半油酸山梨糖醇酐酯、倍半油酸二甘油酯、倍半硬脂酸PEG-20甲基葡萄糖、倍半硬脂酸山梨糖醇酐酯、倍半硬脂酸甲基葡萄糖、鲸蜡二甲基硅氧烷共聚醇、鲸蜡氯化吡啶、鲸蜡硫酸钠、鲸蜡磷酸DEA、鲸蜡磷酸钾、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡硬脂基葡糖苷·鲸蜡硬脂醇、鲸蜡硬脂基硫酸钠、鲸蜡硬脂醇聚醚-
10、鲸蜡硬脂醇聚醚-15、鲸蜡硬脂醇聚醚-22、鲸蜡硬脂醇聚醚-34、鲸蜡硬脂醇聚醚-55、鲸蜡硬脂醇聚醚-60、鲸蜡硬脂醇聚醚-60肉豆蔻基甘醇、鲸蜡硬脂醇聚醚-100、鲸蜡醇聚醚-8磷酸、鲸蜡醇聚醚-10、鲸蜡醇聚醚-10磷酸、鲸蜡醇聚醚-12、鲸蜡醇聚醚-24、鲸蜡醇聚醚-
45、西曲氯铵、西曲铵糖精盐、西曲溴铵、鲸蜡油醇聚醚-10、鲸蜡油醇聚醚 -20、鲸蜡油醇聚醚-25、牛脂酰胺MEA、十异硬脂酸聚甘油酯-10、十油酸聚甘油酯-10、十硬脂酸聚甘油酯-
10、癸基葡糖苷、四辛烷酸二甘油山梨糖醇酐、四油酸山梨醇聚醚-30、四油酸山梨醇聚醚-
40、四油酸山梨醇聚醚-60、四硬脂酸山梨醇聚醚-60、十二烷基苯磺酸TEA、三PEG-8烷基(C12-15)磷酸、三(异硬脂酸PEG-3)三羟甲基丙烷、三异硬脂酸 PEG-10甘油酯、三异硬脂酸PEG-15氢化蓖麻油、三异硬脂酸PEG-20 氢化蓖麻油、三异硬脂酸PEG-30甘油酯、三异硬脂酸PEG-30氢化蓖麻油、三异硬脂酸PEG-50甘油酯、三异硬脂酸PEG-50氢化蓖麻油、三异硬脂酸PEG-160山梨糖醇酐、三异硬脂酸聚甘油酯-2、三油酸山梨糖醇酐酯、三油酸聚甘油酯-
10、三硬脂酸PEG-3山梨醇酯、三硬脂酸PEG-140 甘油酯、三硬脂酸PEG-160山梨糖醇酐酯、三硬脂酸蔗糖酯、三硬脂酸山梨糖醇酐酯、三硬脂酸聚甘油酯-10十三烷醇聚醚-三乙酸钠、十三烷醇聚醚-六乙酸钠、十三烷醇聚醚-9、十三烷醇聚醚-10、十三烷醇聚醚-11、十三烷醇聚醚-20、十三烷醇聚醚-21、三羟基硬脂精、三廿二烷酸蔗糖酯、三(十二烷胺)、三月桂醇聚醚-四磷酸、三月桂醇聚醚-四磷酸钠、乳酸脂肪酸甘油酯、壬基壬基酚聚醚-10、壬基壬基酚聚醚-100、壬基酚聚醚-3、壬基酚聚醚-4硫酸钠、壬基酚聚醚-6磷酸、壬基酚聚醚-6磷酸钠、壬基酚聚醚-10、壬基酚聚醚-10磷酸、壬基酚聚醚-23、壬基酚聚醚-50、壬基酚聚醚-120、全氟烷基PEG磷酸、全氟烷基磷酸DEA、棕榈仁脂肪酸酰胺DEA、棕榈仁脂肪酸酰胺乙基羟乙基氨基丙酸钠、棕榈仁脂肪酸酰胺丙基甜菜碱、棕榈脂肪酸谷氨酸钠、棕榈酰胺MEA、棕榈酸PEG-6、棕榈酸PEG-18、棕榈酸PEG-20、棕榈酸蔗糖酯、棕榈酸山梨糖醇酐酯、棕榈酰天冬氨酸二TEA、棕榈酰甲基牛磺酸钠、花生油PEG-6、羟基硬脂酸甘油酯、羟丙基三甲基铵水解酪蛋白、羟丙基三甲基铵水解角蛋白、羟丙基三甲基铵水解小麦蛋白、羟丙基三甲基铵水解胶原、羟丙基三甲基铵水解丝、羟基羊毛脂、丙酸PPG-2肉豆蔻酯、七硬脂酸聚甘油酯-10、十七烷基羟乙基羧酸甲酯甲基咪唑鎓盐、山嵛酰胺丙基PG二甲基氯化铵、山嵛胺氧化物、山嵛醇聚醚-10、山嵛醇聚醚-30、二十二烷酸甘油酯、二十二烷三甲基氯化铵、苯扎氯铵、五异硬脂酸聚甘油酯-10、五辛烷酸二甘油山梨糖醇酐、五油酸PEG-40山梨醇、五油酸聚甘油酯-6、五油酸聚甘油酯-10、五硬脂酸聚甘油酯-10、聚丙烯酸钾、聚丙烯酸钠、聚丙烯酸铵、聚氧乙烯烷基苯基醚磷酸TEA、聚氧乙烯醚磷酸钠、聚氧乙烯辛基醚磷酸、聚氧乙烯鲸蜡硬脂基二醚、聚氧乙烯植物甾醇、聚氧乙烯丁基醚、聚氧乙烯椰油脂肪酸二乙醇酰胺、聚氧乙烯十二烷基醚磷酸TEA、聚氧丙烯羧基烷基(C14-18)二葡糖苷、聚氧丙烯甘油酯醚磷酸、聚氧丙烯山梨醇、聚油酸蔗糖酯、聚甘油酯-2油醇、聚硬脂酸蔗糖酯、乙酸鲸蜡酯、乙酸羊毛脂醇酯、聚棕榈脂肪酸蔗糖酯、聚月桂酸蔗糖酯、聚蓖麻醇酸聚甘油酯、聚亚油酸蔗糖泊洛沙姆181、泊洛沙姆(Poroxamer)333、泊洛沙胺304、泊洛沙胺901、泊洛沙胺1104、泊洛沙胺1302、泊洛沙胺 
1508、麦芽糖醇羟基烷基(C12，14)、肉豆蔻酰胺DEA、肉豆蔻胺氧化物、肉豆蔻基苄基二甲基氯化铵、肉豆蔻基PG羟乙基癸酰胺、肉豆蔻基甜菜碱、肉豆蔻基硫酸钠、肉豆蔻酸PEG-8、肉豆蔻酸PEG-20、肉豆蔻酸甘油酯、肉豆蔻酸蔗糖酯、肉豆蔻酸聚甘油酯-10、肉豆蔻酸肉豆蔻醇聚醚-3、肉豆蔻酰水解胶原、肉豆蔻酰水解胶原钾、肉豆蔻酰谷氨酸、肉豆蔻酰谷氨酸钾、肉豆蔻酰谷氨酸钠、肉豆蔻酰肌氨酸钠、肉豆蔻酰甲基丙氨酸钠、肉豆蔻酰甲基牛磺酸钠、肉豆蔻醇聚醚-3、肉豆蔻醇聚醚-3 硫酸钠、单乙酸单硬脂酸甘油酯、椰油脂肪酸TEA、椰油脂肪酸甘油酯、椰油脂肪酸蔗糖酯、椰油脂肪酸山梨糖醇酐酯、椰油脂肪酸赖氨酸、月桂酰胺DEA、月桂酰胺MEA、月桂酰胺丙基甜菜碱、月桂氨基二乙酸钠、月桂氨基丙酸、月桂氨基丙酸钠、月桂胺氧化物、月桂亚氨基二丙酸钠、十二烷基DEA、十二烷基异喹啉鎓糖精、十二烷基异喹啉鎓溴化物、十二烷基葡糖苷、十二烷基二氨基乙基甘氨酸钠、十二烷基二甲基铵羟丙基水解角蛋白、十二烷基二甲基铵羟丙基水解胶原、十二烷基二甲基铵羟丙基水解丝、十二烷基磺基乙酸钠、十二烷基羟基乙酸酰胺硫酸钠、十二烷基羟基磺基甜菜碱、十二烷基氯化吡啶鎓、十二烷基甜菜碱、十二烷基硫酸DEA、十二烷基硫酸钾、十二烷基硫酸MEA、十二烷基硫酸镁、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸TEA、十二烷基硫酸铵、十二烷基磷酸、十二烷基磷酸二钠、十二烷基磷酸钠、月桂酸PEG-2、月桂酸PEG-4DEA、月桂酸PEG-6、月桂酸PEG-8、月桂酸PEG-8甘油酯、月桂酸PEG-9、月桂酸PEG-10、月桂酸PEG-12甘油酯、月桂酸PEG-23甘油酯、月桂酸 PEG-32、月桂酸PEG-75、月桂酸PEG-150、月桂酸PEG山梨醇酯、月桂酸PG、月桂酸TEA、月桂酸甘油酯、月桂酸蔗糖酯、月桂酸聚氧乙烯氢化蓖麻油、月桂酸聚甘油酯-6、月桂酸聚甘油酯-10、月桂酸麦芽糖醇酯、月桂基三甲基氯化铵、月桂基三甲基铵溴化物、月桂醇聚醚-2-硫酸铵、月桂醇聚醚-3乙酸、月桂醇聚醚-3硫酸TEA、月桂醇聚醚-3硫酸铵、月桂醇聚醚-3磷酸、月桂醇聚醚-4磷酸、月桂醇聚醚-4磷酸钠、月桂醇聚醚-4.5乙酸钾、月桂醇聚醚-5乙酸、月桂醇聚醚-5硫酸钠、月桂醇聚醚-6乙酸、月桂醇聚醚-6乙酸钠、月桂醇聚醚-7磷酸、月桂醇聚醚-9、月桂醇聚醚-10、月桂醇聚醚-10乙酸、月桂醇聚醚-10乙酸钾、月桂醇聚醚-16乙酸钠、月桂醇聚醚-17乙酸钠、月桂醇聚醚-40、月桂醇聚醚硫酸 TEA、月桂酰两性基PG乙酸磷酸钠、月桂酰两性基乙酸钠、月桂酰基天冬氨酸、月桂酰基水解胶原钾、月桂酰基水解胶原钠、月桂酰基水解丝钠、月桂酰基谷氨酸、月桂酰基谷氨酸钾、月桂酰基谷氨酸钠、月桂酰基谷氨酸TEA、月桂酰基谷氨酸二辛基十二烷酯、月桂酰基谷氨酸二辛基十二醇聚醚-2、月桂酰基谷氨酸二辛基十二烷酯、月桂酰基谷氨酸二胆甾酯、月桂酰基谷氨酸二硬脂醇聚醚-2、月桂酰基谷氨酸二硬脂醇聚醚-5、月桂酰基肌氨酸、月桂酰基肌氨酸钠、月桂酰基肌氨酸TEA、月桂酰基苏氨酸钾、月桂酰基乳酸钠、月桂酰基甲基丙氨酸、月桂酰基甲基丙氨酸钠、月桂酰基甲基丙氨酸TEA、月桂酰基甲基牛磺酸钠、羊毛脂醇聚醚-10、羊毛脂醇聚醚-25、羊毛脂醇聚醚-40、羊毛脂醇聚醚-75、羊毛脂脂肪酸 PEG-4、羊毛脂脂肪酸PEG-
12、羊毛脂脂肪酸酰胺DEA、羊毛脂脂肪酸异丙酯、羊毛脂脂肪酸辛基十二烷基酯、羊毛脂脂肪酸甘油酯、胆甾醇羊毛脂脂肪酸酯、拉匹氯铵、蓖麻醇酸酰胺丙基甜菜碱、蓖麻醇酸甘油酯、蓖麻醇酸蔗糖酯、蓖麻醇酸聚氧丙烯山梨醇、蓖麻醇酸聚甘油酯-6、亚油酸羊毛脂酯、亚油酰胺DEA、硫酸化蓖麻油、苹果酸月桂酰胺、松脂水解胶原、松脂水解胶原AMPD等。

[0203] 上述表面活性剂之外，还可以使用氟系的表面活性剂。具体可以列举例如十七氟-1-辛烷磺酸铵、十五氟辛烷酸铵、十七氟辛烷磺酸、十七氟-1-辛烷磺酸锂、十五氟辛烷酸、十五氟辛烷酸水合物、十七氟-1-辛烷磺酸钾等。

[0204] 上述表面活性剂之外，可以使用例如N-长链酰基谷氨酸盐、N-长链酰基天冬氨酸盐、N-长链酰基甘氨酸盐、N-长链酰基丙氨酸盐、N-长链酰基苏氨酸盐、N-长链酰基肌氨酸盐等N-长链酰基中性氨基酸盐等N-长链酰基氨基酸盐，N-长链脂肪酸酰基-N-甲基牛磺酸盐、烷基硫酸盐及其氧化烯烃加成物、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、脂肪酸的金属盐、磺基琥珀酸系表面活性剂、烷基磷酸盐及其氧化烯烃加成物、高级烷基硫酸酯盐、烷基醚硫酸酯盐、烷基羟基醚羧酸盐、烷基醚羧酸等阴离子表面活性剂，丙三醇醚及其氧化烯烃加成物等醚型表面活性剂，丙三醇酯及其氧化烯烃加成物等酯型表面活性剂，山梨糖醇酐酯及其氧化烯烃加成物等醚酯型表面活性剂，脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸二乙醇酰胺等脂肪酸烷醇酰胺、聚氧化烯脂肪酸酯、聚氧化烯多元醇脂肪酸酯、聚氧化烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧化烯氢化蓖麻油、单硬脂酸丙三醇、丙三醇酯、脂肪酸聚丙三醇酯、酰基氨基酸聚丙三醇酯、山梨糖醇酐酯、蔗糖脂肪酸酯等酯型表面活性剂，烷基葡糖苷类、硬化蓖麻油焦谷氨酸二酯及其氧化乙烯加成物、脂肪酸烷醇酰胺等含氮型的非离子性表面活性剂等非离子性表面活性剂，烷基氯化铵、二烷基氯化铵、氯化烷基三甲基铵(C16-C22)、二烷基二甲基铵甲基硫酸盐等脂肪族胺盐、其季铵盐、苯二甲烃盐等芳香族季铵盐、脂肪酸酰基精氨酸酯、N-长链酰基精氨酸乙基吡咯烷酮羧酸盐、酰胺胺类、硬脂酰胺丙基二甲胺谷氨酸盐、硬脂酰胺丙基二甲胺乳酸盐、硬脂酰胺丙基二甲胺吡咯烷酮羧酸盐、山嵛酰胺丙基二甲胺谷氨酸盐、山嵛酰胺丙基二甲胺乳酸盐、山嵛酰胺丙基二甲胺吡咯烷酮羧酸盐等阳离子两亲性化合物以及烷基甜菜碱、烷基酰胺甜菜碱、磺基甜菜碱、咪唑鎓盐甜菜碱、氨基丙酸酯、羧基甜菜碱等甜菜碱型两亲性化合物、N-长链酰基精氨酸、N- (3-烷基(12，14)氧代-2-羟丙基)精氨酸盐酸盐、氨基羧酸型表面活性剂，咪唑啉型表面活性剂等两性表面活性剂等。

[0205] 另外，含有表面活性剂的溶液除了表面活性剂以外，还可以含有金属化合物。作为金属化合物，只要是含有金属离子的化合物则可以广泛使用。

[0206] 上述金属化合物可以是包含阳离子和阴离子的盐(单盐)，也可以是包含两种以上的盐(复盐)。

[0207] 上述金属化合物可以是氧化物、氢氧化物、卤化物、硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐、磷酸盐、乳酸盐等化合物。具体而言，可以列举例如氯化钠、氯化镁、氯化钙、碳酸氢钠、氯化钾、氯化锶、氯化锂、氯化铪、氯化铁、氯化铝、氯化锌、氯化铜、氯化钴、氯化硫酸镁、碳酸镁、磷酸一氢钠、乳酸钙等。

[0208] 上述金属化合物可以是金属氧化物。金属醇盐是用MOR表示的化合物，由金属(M)和烷氧基(RO-)(R为烃)构成。作为金属(M)，具体而言，可以列举硅、钛、铝、硼、锆、钒、钨、磷、锗、铟、铪、钼等，可以由各种醇获得金属醇盐。可以直接使用这些金属醇盐，也可以使用使这些金属醇盐在酸或碱存在下进行溶胶凝胶反应的反应产物。作为金属醇盐，可以不使用单一成分而将两种以上混合。

[0209] 上述金属化合物可以是金属络合物。具体而言，可以列举乙二胺镍络合物、四胺钴络合物等。

[0210] 另外，含有表面活性剂的溶液可以含有糖类。作为糖类，可以例示出单糖类、二糖类、寡糖、多糖类和它们的衍生物等。具体而言，作为单糖类，可以列举葡萄糖、果糖等。作为二糖类，可以列举蔗糖、海藻糖等，另外作为多糖类，可以列举肝素、硫酸软骨素、普鲁兰多糖、果胶、瓜尔胶、黄原胶、角叉菜胶、丙二醇、羧甲基纤维素、菊糖等，特别优选普鲁兰多糖之类的多糖类。另外，还可以使用焦糖、蜂蜜、蜜蜡等。另外，还可以使用：哺乳动物的泪液，毛囊分泌的蜡酯、角鲨烯、甘油三酯、脂肪酸等皮脂，神经酰胺、甾醇、游离脂肪酸、硫酸甾醇等角质细胞间脂质，唾液、消化器官所分泌的消化液，存在于以呼吸道、消化器官为中心的上皮细胞的膜表面的膜型黏蛋白、分泌型黏蛋白等。另外，还可以使用节肢动物等无脊椎动物分泌到角质膜表面的蜡成分、水可溶性物质，脊椎动物的毛囊分泌的油脂、水可溶性物质。另外，还可以使用鲨鱼、鳕鱼、鳐鱼等的肝脏中所含的肝油，水母、海参等的体液。另外，还可以使用植物、菌类所分泌的天然分泌液，植物来源的情况下，可以使用桉树油、薄荷油、葵花籽油等从各种植物种子所能采集的油、松油，漆树、樱树、橡树、柳树等的树液。还可以使用原核生物所分泌形成生物被膜的初期分泌物、生物被膜本身。

[0211] 另外，含有表面活性剂的溶液还可以含有油脂类。

[0212] 作为油脂类，可以列举例如硅油等。硅油作为用以保持生物试样的组织或细胞的水环境的水分保持剂发挥作用，由此达成存活状态的生物试样的动态观察。即，即使在真空下组织、细胞的水也不流失，可以作为具有阻隔性能的材料。

[0213] 作为硅油，可以使用例如25℃时的粘度为1～100,000mPa·s的硅油。例如可以使用和光纯药工业“636-04001”、信越シリコーン“KF-54”、“KF-96”等。

[0214] 使用硅油的本发明的含有表面活性剂的溶液中，相对于组合物总量优选含有10重量％以上的硅油，作为除此以外的成分，可以配合下述例示的成分。

[0215] 另外，含有表面活性剂的溶液可以含有离子液体。

[0216] 作为离子液体，可以列举例如咪唑鎓盐类、吡啶鎓盐类、哌啶鎓盐类、吡咯鎓盐类、季铵盐类、鏻盐类、锍盐类、吡唑鎓盐类等。

[0217] 作为咪唑鎓盐类，可以列举例如1-烷基-3-烷基咪唑鎓、1,3-二甲基咪唑鎓、1-乙基-3-甲基咪唑鎓、1-丁基-3-甲基咪唑鎓、1-己基-3-甲基咪唑鎓、 3-甲基-1-辛基咪唑鎓、1-十二烷基-3-甲基咪唑鎓、1-十二烷基-3-甲基咪唑鎓、1-甲基-3-四癸基咪唑鎓、1-十六烷基-3-咪唑鎓、1-十八烷基-3-甲基咪唑鎓、1-烯丙基-3-甲基咪唑鎓、1-烯丙基-3-乙基咪唑鎓、1-烯丙基-3-丁基咪唑鎓、1,3-二烯丙基咪唑鎓、1-苯甲基-3-甲基咪唑鎓、1-(2-羟乙基) -3-甲基咪唑鎓等。

[0218] 作为1-烷基-2,3-二烷基咪唑鎓盐，可以列举例如1-乙基-2,3-二甲基咪唑鎓、1,2,3,-三乙基咪唑鎓、1,2-二甲基-3-丙基咪唑鎓、1-丁基-2,3-二甲基咪唑鎓、1-己基-2,3-二甲基咪唑鎓、1,3-二癸基2-甲基咪唑鎓等。

[0219] 作为吡啶鎓盐类，可以列举例如1-甲基吡啶、1-乙基吡啶、1-丁基吡啶、1-己基吡啶、1-乙基-3-甲基吡啶、1-甲基-4-甲基吡啶、1-丙基-4-甲基吡啶、1-丙基-3-甲基吡啶、1-丁基-2-甲基吡啶、1-丁基-3-甲基吡啶、1- 乙基-3-羟基甲基吡啶、1-(3-羟丙基)吡啶等。

[0220] 作为哌啶鎓盐类，可以列举例如1-甲基-1-丙基哌啶鎓、1-丁基-1-甲基哌啶鎓、1-(甲氧基乙基)-1-甲基哌啶鎓等。

[0221] 作为吡咯鎓盐类，可以列举例如1,1-二甲基吡咯、1-乙基-1-甲基吡咯、 1-甲基-1-丙基吡咯、1-丁基-1-甲基吡咯、1-(甲氧基乙基)-1-甲基吡咯等。

[0222] 作为季铵盐类，可以列举例如四甲基铵、四丁基铵、丁基三甲基铵、乙基-二甲基-丙基铵、三丁基甲基铵、甲基三辛基铵、2-羟乙基铵等，以及例如胆碱、N,N-二乙基-N-甲基-N-(2-甲氧基乙基)铵、三甲胺氧化物等。

[0223] 作为鏻盐类，可以列举例如四丁基鏻、三丁基十六烷基鏻、三乙基戊基鏻、三乙基辛基鏻、四辛基鏻、三异丁基甲基鏻、三丁基四癸基鏻、三乙基四癸基鏻等。

[0224] 作为锍盐类，可以列举例如三乙基锍、二乙基甲基锍等。

[0225] 作为吡唑鎓盐类，可以列举例如1-乙基-2,3,5-三甲基吡唑鎓、1-丙基 -2,3,5-三甲基吡唑鎓、1-丁基-2,3,5-三甲基吡唑鎓等，除此之外，例如胍、 N-(甲氧基乙基)-N-甲基吗啉鎓等。

[0226] 上述被称为离子液体的化合物中，阴离子部位可以是以下化合物。即，除饱和/不饱和烃基以外，还可以是芳香族烃基、醚基、烷基羟基、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、乳酸盐、甲氧基磺酸盐、乙氧基磺酸盐、二甲氧基磷酸盐、正丁基磺酸盐、二乙氧基磷酸盐、乙基磺酸盐、正己基磷酸盐、磷酸氢盐、硫氰酸盐、辛基磺酸盐、2-(2-甲氧基乙氧基) 乙基硫酸盐、三氰甲烷、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐、三氟酸盐、双(三氟甲基磺酰基)酰亚胺、三氟甲烷磺酸盐、双(氟磺酰基)酰亚胺、双 (九氟丁烷磺酰基)酰亚胺、乙基硫酸盐、全氟丁烷磺酸盐、二氰基酰胺、三氟乙酸盐、甲酸盐、磷酸二氢离子(磷酸二氢盐)、碳酸氢盐、甲基碳酸盐、二丁基磷酸盐、三(五氟乙基)三氟磷酸盐、双[草酸盐(2-) -O,O’]硼酸盐、癸酸盐、双(2,4,4-三甲基戊基)次膦酸盐、十二烷基苯磺酸盐、P-甲苯磺酸盐、二乙基膦酸盐、苯甲酸盐、硫代琥珀酸盐、四氯高铁酸盐、四氯铝酸盐、六氟锑酸盐等。

[0227] 另外，阴离子部位可以是利用J.AM.Chem.soc.,2005,127,2398-2399 所示的方法通过离子交换得到的任意的氨基酸。此处所述氨基酸可以是单体，也可以是二肽、低聚肽。

[0228] 另外，含有表面活性剂的溶液以表面活性剂为主要成分，或含有表面活性剂以及金属化合物或糖，或含有油脂类，或含有离子液体，除了这些成分以外，还可以以任意比例加入以下项目中所列举的氨基酸及其衍生物、多元醇、维生素类及其衍生物、脂肪酸及其衍生物、高分子材料等。

[0229] 作为提供上述水/气体阻隔性能的含有表面活性剂的溶液的组成成分，可以配合氨基酸及其衍生物。作为氨基酸，可以列举例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、门冬酰胺、谷氨酰胺、脯酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等单体、盐酸盐、以二分子以上而键合的物质、其高分子等。这些可以是单独1种也可以是二种类以上的混合物。还可以是这些的衍生物。

[0230] 作为提供上述水/气体阻隔性能的含有表面活性剂的溶液的组成成分，也可以配合多元醇及其衍生物。优选分子内具有羟基的低蒸汽压物质。具体可以列举例如丙三醇、甘油三脂、聚间苯二酚、聚酚、鞣酸、漆酚等，特别优选使用鞣酸。

[0231] 作为提供上述水/气体阻隔性能的含有表面活性剂的溶液的组成成分，还可以配合维生素类及其衍生物和其相关的物质。具体可以列举例如维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12、维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、或它们的衍生物。其中，优选视黄醛、β-胡萝卜素、维生素B3(烟酸、烟酰胺)、维生素B6(吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺)、维生素B9(叶酸)。其它，作为维生素衍生物，可以列举D-阿拉伯糖型抗坏血酸、硫黄素T、 4-脱氧吡哆醇盐酸盐、二苯甲酰硫胺素、2,6-二-O-棕榈酰-L-抗坏血酸、黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水合物、(+)-5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸、 6-O-棕榈酰-L-抗坏血酸、硫酸原黄素水合物、吡哆醛盐酸盐、5-磷酸吡哆醛一水合物、吡哆醇3,4-棕榈酸盐、异抗坏血酸钠一水合物、二硫化硫胺水合物、二硫化硫胺硝酸盐等。作为维生素相关物质，可以列举氯化胆碱、溴化胆碱、柠檬酸二氢胆碱、重酒石酸胆碱辅酶Q10、辅酶Qo、蛋氨酸甲基磺酰氯、肌醇类等。

[0232] 作为高分子材料，可以列举例如聚乙烯醇、特氟隆(注册商标)、聚偏氟乙烯、四乙氧基硅烷、四甲氧基硅烷、异丙醇钛、丁醇锆等。

[0233] 作为提供上述水/气体阻隔性能的含有表面活性剂的溶液的组成成分，除了金属化合物、糖等上述例示的成分以外，还可以配合下述成分。

[0234] 配位化合物：冠醚、环糊精、间苯二酚环状四聚体、杯芳烃、树状高分子等。

[0235] 脂肪酸和其衍生物：亚油酸、油酸、棕榈酸、亚麻酸等。

[0236] 糖和脂肪酸的衍生物：透明质酸、神经酰胺、两亲性化合物、胶原蛋白、氨基酸、精油、凡士林等。

[0237] 凝胶化剂：聚(吡啶-1,4-二亚氨基羰基-1,4-亚苯基亚甲基氯化物 (Poly(pyridinium-1,4-diyliminocarbonyl-1,4-phenylene methylene  chloride)等。

[0238] 色素：叶绿素、类胡萝卜素(番茄红素)、藻胆素、黑色素等以及红辣椒色素、孔雀石绿等。

[0239] 导电性聚合物：聚乙炔、聚苯胺、聚噻吩等，以及naphion(注册商标)等。

[0240] 纳米粘土：以Nanoclay Nanomer(R)Laponite的名称商品化的物质、蒙脱石等。

[0241] 在质谱分析用试剂中主要用于MALDI法的基底材料：3-氨基-4-羟基苯甲酸、芥子酸、七叶亭、4-羟基偶氮苯-2'-羧酸、3-羟基-2-吡啶羧酸、烟酸、2',4',6'-三羟基苯乙酮、α-氰基-4-羟基肉桂酸、2,5-二羟基苯甲酸等。

[0242] 含有表面活性剂的溶液可以是固体状态或液状，为了在真空下保持试样组织的水环境，优选为液状、高粘性的状态。另外，为固体状态时，可以在使用时制成液状后使用。

[0243] 对于含有表面活性剂的溶液而言，例如，如将上述各成分溶于水、有机溶剂等，在试样上直接涂覆等，则可以在试样的表面形成极薄的膜。

[0244] 含有表面活性剂的溶液中，表面活性剂与金属化合物及糖的配合比例没有特别限定，但作为优选的情况，可列举例如下述组成。

[0245] (1)表面活性剂(十二烷基苯磺酸钠)：金属化合物(乙二胺镍络合物)＝0.005∶0.001～0.05～0.01

[0246] (2)表面活性剂(十二烷基硫酸钠)：金属化合物(乙二胺镍络合物)＝0.005：0.0001～0.05～0.001

[0247] (3)表面活性剂(十二烷基苯磺酸钠)：金属化合物(四胺钴络合物)＝0.005∶0.001～0.05～0.01

[0248] (4)表面活性剂(Tween 20)/糖(海藻糖)＝3/1～20/2

[0249] (5)表面活性剂(Tween 20)/糖(普鲁兰多糖)＝3/0.2～20/2

[0250] (6)表面活性剂(Tween 20/糖(菊糖(イヌリン))＝3/0.1～20/7

[0251] 含有表面活性剂的溶液在涂布于试样后，将多余的液体用无尘布之类的柔软的布状的纸、滤纸等吸除。通过介质的涂布、附着、涂覆、包覆、包埋等，对用于TEM观察的试样进行处理。

[0252] 如此地形成于试样表面的薄膜的膜厚可以设在例如5nm～1000nm的范围内。

[0253] 本发明的电子显微镜观察用试剂盒，其特征在于，含有以上所说明的电子显微镜观察用保护剂和含有表面活性剂的溶液。本发明的电气显微镜观察用试剂盒仅通过使用上述两种溶液，即能够在存活状态下对迄今为止研究尚不充分的哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等不具有包覆表面的牢固层的脆弱生物试样简便地进行电子显微镜观察。

[0254] 根据本发明的利用电子显微镜观察试样的方法，通过将上述电子显微镜观察用保护剂涂布于含水状态的生物试样，将涂布有电子显微镜观察用保护剂的含水状态的生物试样载置于试样台，照射电子束或等离子体，在含水状态的生物试样的表面形成薄膜而包覆含水状态的生物试样，将收容在真空下的试样室的用该薄膜包覆的含水状态的生物试样的电子显微镜图像显示在显示装置中，从而能够在存活状态下对含水状态的生物试样进行观察。

[0255] 另外，根据本发明的利用电子显微镜观察试样的方法，优选至少在将上述电子显微镜观察用保护剂涂布于含水状态的生物试样之前、之后，将含有表面活性剂的溶液用于含水状态的生物试样。

[0256] 即，关于涂布含有表面活性剂的溶液的时机，根据含水状态的生物试样的种类，可以是将电子显微镜观察用保护剂涂布于含水状态的生物试样的之前或之后的任一时机。

[0257] 另外，在本发明的利用电子显微镜观察试样的方法中优选：在涂布于含水状态的生物试样之前，对含水状态的生物试样表面进行水洗。

[0258] 水洗中使用的水只要不影响含水状态的生物试样，则没有特别限制。具体而言，可以例示出例如超纯水、去离子水、蒸馏水等。

[0259] 通常认为，若对细胞滴加上述水，则引起渗透压异常、细胞发生破裂。但是，本发明人发现，即使将对细胞滴加蒸馏水并静置1分钟的洗涤处理重复进行2次，细胞也未见任何异常。进而还确认：就部分细胞而言，通过增加水洗工序，所获得的SEM图像与进行含有表面活性剂的溶液处理后涂布电子显微镜观察用保护剂时的SEM图像相比，变得更清晰。本发明人认为，培养细胞的表面存在性状与含有表面活性剂的溶液类似的物质，其浓度比含有表面活性剂的溶液的浓度高，因此通过水洗而被稀释为能够形成适合观察培养细胞的分泌物的薄膜的浓度。

[0260] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法中优选：在电子显微镜的试样室内对含水状态的生物试样照射试样观察用的电子束，从而在含水状态的生物试样的表面形成薄膜。

[0261] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法中优选：在利用电子显微镜进行含水状态的生物试样观察前，预先对试样照射电子显微镜的试样室内的电子束之外的电子束或等离子体，从而在含水状态的生物试样的表面形成薄膜。

[0262] 特别是，在将电子显微镜观察用保护剂或含有表面活性剂的溶液涂布于含水状态的生物试样的表面后，对含水状态的生物试样照射电子束或等离子体，在含水状态的生物试样的表面形成薄膜而包覆含水状态的生物试样，将收容在真空下的试样室的用该薄膜包覆的含水状态的生物试样的电子显微镜图像显示在显示装置中，从而能够在存活状态下观察含水状态的生物试样。

[0263] 该薄膜可以如下形成，即，在电子显微镜的试样室内对含水状态的生物试样照射试样观察用的电子束，从而形成于含水状态的生物试样的表面。

[0264] 或在利用电子显微镜进行试样观察前，预先对试样照射有别于电子显微镜的试样观察用的电子束的电子束或等离子体，从而能够在含水状态的生物试样的表面形成薄膜。

[0265] 照射条件可以根据所使用的电子显微镜观察用保护剂或含有表面活性剂的溶液等适当选择，没有特别限定，作为一个例子，不进行以往的前处理，而对用电子显微镜观察用保护剂或含有表面活性剂的溶液包覆的含水状态的生物试样在试样室内照射60分钟SEM的电子束(例如5.0kV 左右)，从而能够进行高真空(例如10-4～10-7Pa)下的存活状态的生物试样的SEM观察，例如通常的FE-SEM下的观察。

[0266] 另外，另外一个例子中，不进行以往的前处理，对用电子显微镜观察用保护剂或含有表面活性剂的溶液包覆的含水状态的生物试样预先照射 3分钟等离子体，从而能够进行高真空下的存活状态的生物试样的SEM 观察、TEM观察。

[0267] 通过照射这样的电子束、等离子体，从而含水状态的生物试样的表面被薄膜包覆。在形成于生物试样表面时，该薄膜的厚度可以设在例如 5nm～1000nm的范围内。

[0268] 利用等离子体照射而进行的聚合可以使用例如以往的离子溅射装置等，在压力10-3～105Pa、-20～+80℃、1～10kV DC的条件下进行。或者，可以采用在以往的等离子体聚合中使用的诸如反应管之类的装置、方法来进行。

[0269] 本发明中，为了利用电子显微镜进行观察，可以通过含有表面活性剂的溶液的涂布、附着、涂覆、包覆等，对用于SEM观察的含水状态的生物试样进行处理。例如，就涂布的情况而言，在涂布后，将多余的液体用无尘布之类的柔软的布状的纸、滤纸等吸除。可以通过含有表面活性剂的溶液的涂布、附着、涂覆、包覆、包埋等，对用于TEM观察的含水状态的生物试样进行处理。

[0270] 另外，就部分培养细胞、单细胞而言，有时由于等离子体的照射可见细胞的萎缩，因此优选通过照射电子束而形成薄膜。

[0271] 在将试样导入试样室时，可以使用例如下述试样台：在圆柱形的基构件的上表面载置形成了薄膜的含水状态的生物试样，将具有与圆柱形构件的直径大致相等的圆形开口部、其上表面部具有直径小于该开口部的开口部、侧面部有固定孔的环状构件，盖在载置于圆柱形的基构件的上表面的含水状态的生物试样上，将圆柱形的基构件和环状构件用固定材料固定。

[0272] 另外，还可以使用如下试样台：在中央形成有圆形凹部的圆柱形构件的上表面载置形成有薄膜的含水状态的生物试样，将中央形成有圆形的贯通孔、在该贯通口的周围开有多个固定孔的圆盘状构件，盖在载置于圆柱形构件的上表面的含水状态的生物试样上，将圆盘状构件和圆柱形构件用固定材料固定。

[0273] 通过使用具有上述之类结构的试样台，对膜状的动物组织试样施以张力，能够抑制组织的萎缩、在膜表面进一步展开的接近生物体内的形态的状态下进行观察。

[0274] 本发明的利用电子显微镜对含水状态的癌细胞进行诊断的方法，其特征在于，含有以下工序：对从生物体摘出的含水状态的癌细胞或含有该癌细胞的组织，涂布含有生存环境赋予成分、糖类及电解质的电子显微镜观察用保护剂的工序；将涂布有电子显微镜观察用保护剂的含水状态的癌细胞或含有该癌细胞的组织载置于试样台，照射电子束或等离子体，在含水状态的癌细胞或含有该癌细胞的组织的表面形成薄膜而进行包覆的工序；将收容在真空下的试样室的用薄膜包覆的含水状态的癌细胞或含有该癌细胞的组织的电子显微镜图像显示在显示装置中的工序；和对所显示的含水状态的癌细胞或含有该癌细胞的组织进行图像诊断的工序。

[0275] 通过使用本发明的含水状态的癌细胞的观察方法确认：正常细胞的情况下，细胞规则地排列，细胞的形状也光滑；而癌细胞的情况下，细胞不规则地存在，层叠为多层状，细胞表面的隆起也多。因此，即使不使用特殊的细胞标志物等，而是着眼于正常细胞和癌细胞的外部形态的差异，也能够进行癌细胞或含有该癌细胞的组织的图像诊断。另外，相对于周边的正常细胞，浸润性、转移性高的癌细胞的微纤维有时会伸长，因此通过着眼于这样的癌细胞特有的形态变化也能够进行癌细胞或含有该癌细胞的组织的图像诊断。

[0276] 本发明的利用电子显微镜对含水状态的癌细胞进行诊断的方法中优选：含水状态的癌细胞为接种在正常细胞或细胞片上并经培养而得的癌细胞。

[0277] 细胞片为将正常细胞培养为平板状而获得的培养细胞的一种形态。通过使用这样的正常细胞、细胞片，能够经时观察癌细胞向正常细胞浸润、转移的过程，另外还能够观察癌细胞向正常细胞浸润、转移时特有的形态变化。作为这样的癌细胞向正常细胞浸润、转移时特有的形态变化，可以例示出来自癌细胞的微纤维的伸长。相对于正常细胞，癌细胞的微纤维会伸长，以该微纤维为立足点逐渐向正常细胞的内部浸润、转移。通过使用本发明的利用电子显微镜对含水状态的癌细胞进行诊断的方法，能够在存活状态下观察含水状态的正常细胞及癌细胞、能够观察该微纤维的伸长。

[0278] 本发明的利用电子显微镜对含水状态的癌细胞进行诊断的方法，对于从生物体摘出的含水状态的癌细胞或含有该癌细胞的组织，在摘出后不进行化学固定的条件下也能够进行观察。从而，通过在不进行化学固定的条件下观察从生物体摘出的含水状态的癌细胞或含有该癌细胞的组织，能够实时观察与癌细胞的浸润、转移相伴随的形态变化。

[0279] 另外，本发明的利用电子显微镜对含水状态的癌细胞进行诊断的方法中，也可以如以往医疗机构中所进行的，将从生物体摘出的含水状态的癌细胞或含有该癌细胞的组织在摘出后立即进行化学固定。从而，通过迅速进行化学固定，能够将细胞的变化降至最低限度，提供再现性高的诊断技术，因此我们认为本发明也有助于诊断技术的标准化。

[0280] 本发明的利用电子显微镜进行生理活性物质或药剂对含水状态的细胞的作用的评价方法，其特征在于，含有以下工序：对含水状态的细胞或细胞片添加生理活性物质或药剂的工序；对添加有生理活性物质或药剂的含水状态的细胞或细胞片涂布含有生存环境赋予成分、糖类及电解质的电子显微镜观察用保护剂的工序；将涂布有电子显微镜观察用保护剂的含水状态的细胞或细胞片载置于试样台，照射电子束或等离子体，在含水状态的细胞或细胞片的表面形成薄膜而进行包覆的工序；将收容在真空下的试样室的用薄膜包覆的含水状态的细胞或细胞片的电子显微镜图像显示在显示装置中的工序；和对所显示的、生理活性物质或药剂对含水状态的细胞或细胞片的效果进行图像诊断的工序。

[0281] 使用本发明的利用电子显微镜评价生理活性物质或药剂对含水状态的细胞的作用的方法，能够在存活状态下经时观察将药剂添加于含水状态的正常细胞或细胞片而产生的形态变化。例如，通过对添加生理活性物质或药剂后的经过时间为20分钟、30分钟、60分钟的不同时刻的细胞涂布本发明的电子显微镜观察用保护剂，能够观察生理活性物质或药剂在施与后的哪一时刻有效地发挥作用。

[0282] 本发明的利用电子显微镜评价生理活性物质或药剂对含水状态的细胞的作用的方法中优选：细胞为含水状态的正常细胞，以正常细胞的形态变化为指标来筛选副作用少的生理活性物质或药剂。

[0283] 本发明的利用电子显微镜评价生理活性物质或药剂对含水状态的细胞的作用的方法中优选：生理活性物质或药剂为新药研发领域中新开发的药品。作为新开发的药品，可以例示出例如抗癌剂等。

[0284] 本发明的利用电子显微镜评价生理活性物质或药剂对含水状态的细胞的作用的方法中优选：细胞为含水状态的病变细胞，以含水状态的病变细胞的形态变化为指标来筛选具有某种活性的生理活性物质或药剂。

[0285] 本发明的利用电子显微镜评价生理活性物质或药剂对含水状态的细胞的作用的方法中优选：含水状态的病变细胞为癌细胞，生理活性物质或药剂为新药研发领域中新开发的药品。作为新开发的药品，可以例示出例如抗癌剂等。

[0286] 添加于含水状态的正常细胞或细胞片的生理活性物质及药剂不限于抗癌剂，还可以应用例如组胺、增殖因子、抗炎症药、抗恶性肿瘤药等各种具有生理活性或药理活性的药剂。就上述多种药剂而言，只要是引起细胞形态变化的药剂，即能够对其效果、活性进行观察、评价，能够进行药剂的筛选。

[0287] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法，其特征在于，包括：使含水状态的细胞与一抗接触的工序；使一抗与金胶体修饰后的二抗接触的工序；对结合有一抗和二抗的含水状态的细胞涂布含有生存环境赋予成分、糖类及电解质的电子显微镜观察用保护剂的工序；将涂布有电子显微镜观察用保护剂的含水状态的细胞载置于试样台，照射电子束或等离子体，在含水状态的细胞的表面形成薄膜而包覆含水状态的细胞的工序；和将收容在真空下的试样室的用薄膜包覆的含水状态的细胞的电子显微镜图像显示在显示装置中的工序，对含水状态的细胞的与一抗的结合部位进行观察。

[0288] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法中优选：与一抗反应的抗原为含水状态的细胞的膜蛋白，对含水状态的细胞的与一抗的结合部位进行观察。

[0289] 以往的免疫电子显微法需要包括化学固定在内的多步骤的试样制作法，SEM的情况下需要1整天，TEM的情况下需要数天。但是，本发明的含水状态的细胞的与一抗的结合部位的观察方法无需对细胞进行化学固定，抗体以外的添加物也仅为电子显微镜观察用保护剂和含有表面活性剂的溶液。因此，能够在数小时内进行含水状态的细胞的与一抗的结合部位的观察。

[0290] 另外，以往的免疫电子显微法中，需要进行超微形态保存和选择染色性良好的部位。并且，为了维持微细结构而加强化学固定时，含水状态的细胞的抗原能力降低，引起灵敏度的降低。为了提高灵敏度而减弱化学固定时，细胞的微细结构受损这一难以同时解决的问题已经被指出。但是，本发明的含水状态的细胞的与一抗的结合部位的观察方法能够极大降低化学固定所致的抗原能力失活，能够将灵敏度提高至以往方法的约100 倍左右。

[0291] 进而，另外在以往的免疫电子显微法中，试样制作时的假阳性和作为本来目标的信号难以区分，准确的抗原蛋白定位的确认较多依赖于实验者的技术和熟练度。另外，免疫染色法所使用的实验仪器的操作也很难，需要足够的训练。但是，如上所述，本发明的含水状态的细胞的与一抗的结合部位的观察方法与以往法相比灵敏度高，因此存在能够在低浓度下进行抗体处理、不易检测到非特异性信号的优点。

[0292] 通过使用本发明的电子显微镜观察用保护剂，能够在不进行细胞的化学固定的条件下与一抗和二抗作用，在极短时间内以良好的灵敏度获得非特异性信号少的免疫电子显微法的SEM图像。若进行使用该新型的免疫电子显微法的观察，例如使用肿瘤标志物作为抗原，从而能够迅速、简便地实现高可靠性的癌症诊断、癌症病理检查。需要说明的是，病变细胞不仅限于癌细胞，对炎症性疾病、自身免疫疾病等也能够进行诊断。

[0293] 本发明人将本发明的含水状态的细胞的与一抗的结合部位的观察方法称为Live免疫电子显微法，这是一种新型的免疫电子显微法。

[0294] 通过使用本发明的电子显微镜观察用保护剂，还能够使用电子显微镜对含水状态的病毒粒子进行观察、计数，对病毒浓度进行定量。

[0295] 作为以往的病毒定量法，利用噬斑测定法、定量PCR法等。但是，噬斑测定法在准备上耗费时间、缺乏再现性，因此需要更好的测定法。定量PCR为非常有效的测定法，但提取病毒DNA的工序中DNA的损失不可避免，这成为一个难题。另外，利用定量PCR进行的病毒定量是对试样溶液中含有的全部的病毒基因组量进行测定，因此不能推测实际的病毒粒子数。

[0296] 因此，理想的是直接定量地测定病毒粒子，但是作为直接测定法的使用TEM、冷冻电子显微镜的病毒定量法在定量性上存在技术困难。

[0297] 作为解决以上课题的手段，本发明人想到了本发明的利用电子显微镜对含水状态的病毒粒子进行定量的方法。

[0298] 即，本发明的利用电子显微镜对含水状态的病毒粒子进行定量的方法，其特征在于，含有以下工序：使含水状态的病毒粒子在基板上浓缩的工序；对在基板上浓缩的含水状态的病毒粒子涂布含有生存环境赋予成分、糖类及电解质的电子显微镜观察用保护剂的工序；将涂布有电子显微镜观察用保护剂的含水状态的病毒粒子与基板一起载置于试样台，照射电子束或等离子体，在含水状态的病毒粒子的表面形成薄膜而包覆试样的工序；将收容在真空下的试样室的用薄膜包覆的含水状态的病毒粒子的电子显微镜图像显示在显示装置中的工序；和在所显示的含水状态的病毒粒子的电子显微镜图像中对病毒粒子进行计数的工序。

[0299] 本发明的利用电子显微镜对含水状态的病毒粒子进行定量的方法中优选：使含水状态的病毒粒子在基板上浓缩的工序为：对含水状态的病毒粒子的表面赋予电荷，使其吸附在表面赋予了与该被赋予的电荷相反的电荷的基板上，从而将病毒粒子浓缩。

[0300] 本发明的利用电子显微镜对含水状态的病毒粒子进行定量的方法中优选：对含水状态的病毒粒子表面进行聚凝胺处理而赋予正电荷。

[0301] 本发明的利用电子显微镜对含水状态的病毒粒子进行定量的方法中优选：通过等离子体照射而对基板的表面赋予负电荷。即，通过对基板表面照射等离子体，从而基板表面的官能团被切断，亲水性基团暴露于表面。作为这些亲水性基团，可以例示出例如羟基等，其能够对基板表面赋予负电荷。

[0302] 本发明的实施方式中，优选预先回收已在宿主细胞中增殖的病毒。作为病毒的回收方法，可以适当使用如下方法：使病毒粒子感染宿主细胞，将存在于培养上清中的病毒粒子回收、或者将感染了病毒的细胞在缓冲液中磨碎并将获得的病毒感染细胞的磨碎液用过滤器过滤、进行蔗糖密度梯度法、超离心处理等公知方法。另外，这些方法可以单独使用或将多个方法组合。

[0303] 作为使含水状态的病毒粒子在基板上浓缩的方法，可以对病毒粒子赋予正电荷、对基板赋予负电荷，也可以对病毒粒子赋予负电荷、对基板赋予正电荷。

[0304] 另外，作为用于对病毒粒子赋予正电荷的化合物，只要不引起含水状态的病毒粒子的形态变化则没有特别限定。如图46(a)所示，聚凝胺是多价季铵高分子化合物，在带负电的玻璃基板表面和病毒之间发挥浆糊的作用，在防止病毒流出方面有显著效果，因此优选使用。

[0305] 需要说明的是，就使含水状态的病毒粒子在基板上浓缩的方法而言，只要不引起含水状态的病毒试样的形态变化，则不限于上述那样的使用电荷的方法。

[0306] 基板不限于玻璃，也可以使用金属制试样台、陶瓷等。

[0307] 本发明的利用电子显微镜对含水状态的病毒粒子进行定量的方法，可以通过对电子显微镜的多个视野中的病毒粒子进行计数并算出平均値、乘以作为测定试样的病毒粒子分散液的稀释倍率、病毒粒子分散液的滴加量等参数而求出。并且，本发明的利用电子显微镜对含水状态的病毒粒子进行定量的方法所求出的病毒浓度与通过以往法即噬斑测定法、定量PCR 法求出的病毒浓度一致。

[0308] 另外，我们认为，通过将本发明的利用电子显微镜对含水状态的病毒粒子进行定量的方法和本发明的含水状态的细胞的与一抗的结合部位的观察方法组合，例如，通过使用抗DNA抗体作为一抗，还能够区分DNA 病毒和RNA病毒。

[0309] 本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法还能够用于将电子显微镜、其它分析方法组合而进行的解析、分析。

[0310] 例如，本发明的利用电子显微镜观察含水状态的生物试样的方法能够用于扫描电子显微镜和能量色散型X射线分析的组合(SEM－EDS)、透射电子显微镜和能量色散型X射线分析的组合(TEM－EDS)等中。通过与EDS组合，例如，能够在不对细胞进行化学固定的状态下进行含水状态的细胞的表面～数百μm左右的深度中的元素分布的解析。

[0311] 另外，通过将利用上述EDS解析获得的元素分布和本发明的利用电子显微镜评价生理活性物质或药剂对含水状态的细胞的作用的方法组合，例如，除了细胞的形态变化以外也考虑元素分布变化的观点，对细胞，在存活状态下经时地分析对含水状态的正常细胞或细胞片添加生理活性物质或药剂而产生的作用机理。

[0312] 本发明的电子显微镜观察用保护剂作为利用电子显微镜观察哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等含水状态的生物试样的良好的电子显微镜观察用保护剂起作用。即，对哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等含水状态的生物试样，能够在不实施以往的脱水、化学固定、电子染色而是在存活状态下将存活的试样放入电子显微镜的镜体内，在观察时也抑制减压下的干燥、冰晶、温度变化所致的损伤，且强化阻隔试样中的水/气体的Surface Shielding Effect(表面屏蔽效果)(SS效果)。

[0313] 根据本发明，能够对本发明人的在先发明中研究尚不充分的哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等含水状态的生物试样在不使其变形、不损害试样原本的状态的条件下进行观察。即，能够增强在先发明所示的阻隔试样中的水/气体的Surface Shielding Effect(SS效果)。

[0314] 即，本发明的电子显微镜观察用保护剂作为利用电子显微镜观察哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等含水状态的生物试样的良好的可视化剂起作用，适合在用扫描电子显微镜、透射电子显微镜观察试样中使用。

[0315] 在将本发明的电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液涂布于培养细胞时，不仅能够包覆存活状态细胞表面，而且包覆细胞表面后细胞仍生存。

[0316] 通过用本发明的电子显微镜观察用保护剂和含有表面活性剂的溶液包覆哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等含水状态的生物试样的表面，能够用扫描电子显微镜观察哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等含水状态的生物试样的存活状态，且能够观察生物微细表面等的结构。

[0317] 并且，根据本发明的电子显微镜观察用保护剂，通过包覆哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等含水状态的生物试样的表面，能够在扫描电子显微镜下直接观察含水状态的生物试样的存活状态，而不用带电 (电荷积累)。

[0318] 另外，在用电子显微镜观察时，无需进行以往必需的含水状态的生物试样的试样制作中必要的化学固定→导电染色→脱水→干燥→涂覆、或化学固定→脱水→包埋→超薄切片→电子染色→涂覆等工序，即能进行高倍率观察。

[0319] 本发明的电子显微镜观察用保护剂在利用电子显微镜的测定中也抑制试样的变形、变质，不会在测定前后对试样造成显著损伤。对于在本发明人的在先发明的蒸发抑制用组合物中研究尚不充分的哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等含水状态的生物试样，通过使用本发明的电子显微镜观察用保护剂，能够真空下增强水/气体阻隔性能、抑制试样内的温度的显著降低。另外，即使在真空下对哺乳动物、植物的组织、培养细胞、单细胞等含水状态的生物试样照射电子束，也能够增强水/气体阻隔性能、抑制试样内的温度的显著降低，另外还能够使防止由于电子束的照射而引起的带电、抑制热损伤等作用增强。试样为含水状态的生物试样时，能够在存活状态下观察存活状态样品，即使从镜体取出后试样也看不到任何变化。

[0320] 特别是通过使用本发明的电子显微镜观察用保护剂，在存活状态下对培养细胞进行电子显微镜观察后，将培养细胞返回培养基中，从而培养细胞在观察后不会立即死亡，能够继续存活一定时间。

[0321] 本发明中，利用扫描电子显微镜及透射型电子显微镜进行的试样观察可以通过迄今为止已知构成的装置来进行。

[0322] 扫描电子显微镜通常由镜筒部(镜体)和操作部构成。在镜筒部，利用电子枪产生电子束、利用电子透镜汇聚电子射线、利用电子探测器进行整形、利用偏转线圈使电子探测器在试样表面的观察区域进行扫描等。载置试样的试样室具备：试样台、和检测由试样放出的信号的检测器。由于必须要将该镜筒部保持于洁净的真空中，因此可设置与目的相对应的真空排气机构。

[0323] 操作部进行对电子束的产生、电子透镜的透镜作用、非点校正、电子探测器在试样面上的扫描范围(倍率)及扫描速度等的控制，并将检测到的信号以映像形式显示在CRT上[0324] 另外，对于静止的扫描电子显微镜图像，通常利用噪音低的低功率扫描图像进行观察、拍摄，但在存活的生物试样的利用扫描电子显微镜的观察中，以TV模式下的观察、即动画的映像为主。因此，也可考虑在扫描电子显微镜中引入噪音低(S/N小)的TV模式图像显示/录像电路，以高画质的TV模式进行扫描电子显微镜图像的显示和录像。

[0325] 实施例

[0326] 以下通过实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不受这些实施例任何限定。

[0327] 以下实施例中，典型的SEM观察使用场致发射型扫描电子显微镜 (FESEM，S－8000(Hitachi))、以5.0kV的加速电压来进行。

[0328] ＜实施例1＞

[0329] 使用作为生存环境赋予成分的甘油和水、作为糖类的葡萄糖、作为电解质的氯化钠，按照生存环境赋予成分(甘油)：(水)：糖类(葡萄糖)：电解质(氯化钠)＝20：10：0.7：0.03的配合比例混合，调制电子显微镜观察用保护剂。

[0330] 另外，调制了1％(v/v)的Tween20溶液，作为含有表面活性剂的溶液。

[0331] 从活小鼠摘出腹膜，用10％(w/w)中性缓冲福尔马林进行一次化学固定后，作为前处理，在电子显微镜观察用保护剂中浸渍1分钟。将进行了前处理的小鼠腹膜剥离部位在含有表面活性剂的溶液中浸渍1分钟，然后取出，擦除多余的溶液，将其表面用含有表面活性剂的溶液包覆。然后，使以含有表面活性剂的溶液包覆的小鼠腹膜的上皮侧为上表面，将其放入 SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0332] 图1(a)为对在以往的一次化学固定之后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理的含水状态的小鼠腹膜上皮侧以 50倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，图2(a)为对图1 (a)的试样以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0333] 实施例1中完全未见电荷积累、腹膜破裂，腹膜表面确认有多个隆起。由此确认：通过在形成薄膜前用本发明的电子显微镜观察用保护剂处理，从而即使生物试样为哺乳动物的生物体组织也能在真空下维持正常的形态。

[0334] ＜比较例1＞

[0335] 与实施例1同样地，从活小鼠摘出腹膜，用10％(w/w)中性缓冲福尔马林进行一次化学固定后，不用本发明的电子显微镜观察用保护剂和含有表面活性剂的溶液处理，使小鼠腹膜的上皮侧为上表面，将其放入SEM 试样室，进行SEM观察。

[0336] 图1(b)为对一次化学固定处理后未用本发明的电子显微镜观察用保护剂和含有表面活性剂的溶液处理的小鼠腹膜上皮侧以50倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，图2(b)为对图1(b)的试样以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0337] 比较例1中确认SEM图像发生电荷积累、腹膜表面破裂。因此可知，利用以往的化学固定处理方法时，难以使哺乳动物的生物体组织在真空下维持正常形态。

[0338] ＜实施例2＞

[0339] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0340] 对从活小鼠摘出的腹膜，不进行化学固定，作为前处理，立即进行用电子显微镜观察用保护剂处理、在含有表面活性剂的溶液中浸渍1分钟。

[0341] 将进行了前处理的小鼠腹膜在含有表面活性剂的溶液中浸渍1分钟，然后取出，擦除多余的溶液，将其表面用含有表面活性剂的溶液包覆。然后，将用含有表面活性剂的溶液包覆的小鼠腹膜放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0342] 图3(a)为以100倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像，另外，图3(b)为对图3(a)的试样以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的 SEM图像。

[0343] 实施例2中与实施例1同样地，腹膜表面维持正常形态，确认有多个隆起结构。由此确认：通过在形成薄膜前用本发明的电子显微镜观察用保护剂处理，即使生物试样为哺乳动物的生物体组织也能在真空下维持正常形态。

[0344] ＜实施例3＞

[0345] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0346] 将用10％(w/w)中性缓冲福尔马林进行了一次化学固定的人胃癌的病理标本用电子显微镜观察用保护剂处理，在含有表面活性剂的溶液中浸渍1分钟。擦除多余的含有表面活性剂的溶液，将试样放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0347] 图4(a)为对在以往的一次化学固定之后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理的含水状态的人胃癌的病理标本以 500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，图4(b)为对图 4(a)的试样以1500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。进而，图5为对图4(a)的试样以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM 图像。

[0348] 实施例3中，能够清晰地确认表面具有不规则隆起的癌细胞和具有规则结构的正常细胞的形态差异，还观察到癌细胞和正常细胞的界面(Front line)。

[0349] ＜实施例4＞

[0350] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0351] 将用10％(w/w)中性缓冲福尔马林进行了一次化学固定的人胃癌的病理标本用电子显微镜观察用保护剂处理，在含有表面活性剂的溶液中浸渍1分钟。擦除多余的含有表面活性剂的溶液，将试样放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0352] 图6(a)为对在以往的一次化学固定之后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理的含水状态的人胃癌的病理标本以 100倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，图7(a)为对图 6(a)的试样以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。进而，图8为将图6(a)所示的人胃癌的病理标本沿着厚度方向切割、对切断面以200倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0353] 实施例4中能够清晰地确认表面具有不规则隆起和穿孔的癌细胞。另外还确认：如图8所示，将对表面进行了观察的病理标本沿着厚度方向切割，实现了将同一病理标本沿着厚度方向切割并观察病理标本的切断面，这在以往是难以进行的。从而我们认为，能够容易地获得癌细胞从脏器的表面扩散到何种深度的相关信息。

[0354] ＜比较例2＞

[0355] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0356] 将用10％(w/w)中性缓冲福尔马林进行了一次化学固定的正常人胃的病理标本用电子显微镜观察用保护剂处理，在含有表面活性剂的溶液中浸渍1分钟。擦除多余的含有表面活性剂的溶液，将试样放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM 观察。

[0357] 图6(b)为对在以往的一次化学固定之后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理的含水状态的正常人胃的病理标本以100倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，图7(b)为对图6(b)的试样以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0358] ＜实施例5＞

[0359] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0360] 在将人正常皮肤细胞培养为平板状而得的细胞片上，接种人黑素瘤细胞非转移株，培养后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。然后，将用含有表面活性剂的溶液包覆的非转移株的黑素瘤放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0361] 图9(a)为对接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞非转移株以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，图9(b)为对(a)的边缘部的微纤维以10,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0362] 实施例5中确认非转移株的黑素瘤细胞的微纤维几乎没有伸长，因此止步于正常皮肤细胞的表面而没有浸润。另外，能够清晰地区分来自人皮肤的成纤维细胞和人黑素瘤细胞的边界。

[0363] ＜实施例6＞

[0364] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0365] 在将人正常皮肤细胞培养为平板状而得的细胞片上，接种人黑素瘤细胞转移株，培养后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。然后，将用含有表面活性剂的溶液包覆的人黑素瘤细胞转移株放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0366] 图10(a)为对接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞转移株以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的图像。另外，图10 (b)为对图10(a)的边缘部的微纤维以10,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的图像。

[0367] 实施例6中确认：相对于正常皮肤细胞，转移株的黑素瘤细胞的微纤维伸长，以该微纤维为立足点浸润正常皮肤细胞。

[0368] ＜实施例7＞

[0369] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0370] 在将人正常皮肤细胞培养为平板状而得的细胞片上，接种人黑素瘤细胞转移株，20分钟后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。然后，将用含有表面活性剂的溶液包覆的人黑素瘤细胞转移株放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0371] 图11(a)为对接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞转移株以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，图11(b)为对图11(a)以5,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM 图像。图12为对图11(a)以5,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM 图像。

[0372] 实施例7中确认：接种起20分钟时，相对于正常皮肤细胞，转移株的黑素瘤细胞的微纤维伸长，开始以该微纤维为立足点浸润正常皮肤细胞。

[0373] ＜实施例8＞

[0374] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0375] 在将人正常皮肤细胞培养为平板状而得的细胞片上，接种人黑素瘤细胞转移株，30分钟后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。然后，将用含有表面活性剂的溶液包覆的人黑素瘤细胞转移株放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0376] 图13(a)为对接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞转移株以500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，图13(b)为对图13(a)以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的图像。。

[0377] 实施例8中确认：接种起30分钟时，转移株的黑素瘤细胞进行对正常皮肤细胞的浸润，逐渐缓慢地与正常皮肤细胞一体化，另外，转移株的黑素瘤细胞的微纤维与接种后20分钟相比进一步伸长。

[0378] ＜实施例9＞

[0379] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0380] 在将人正常皮肤细胞培养为平板状而得的细胞片上，接种人黑素瘤细胞转移株，60分钟后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。然后，将用含有表面活性剂的溶液包覆的人黑素瘤细胞转移株放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0381] 图14(a)为对接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞转移株以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，图14(b)为对图14(a)以5,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的图像。

[0382] 实施例9中确认：接种起60分钟时，转移株的黑素瘤细胞对正常皮肤细胞的浸润进一步进行，正常皮肤细胞和转移株的黑素瘤细胞完全一体化，另外，转移株的黑素瘤细胞的微纤维与接种后30分钟相比进一步伸长。

[0383] ＜实施例10＞

[0384] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0385] 在将人正常皮肤细胞培养为平板状而得的细胞片上，接种人黑素瘤细胞非转移株，60分钟后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。然后，将用含有表面活性剂的溶液包覆的人黑素瘤细胞非转移株放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0386] 图15(a)、(b)分别为对接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞非转移株以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的 SEM图像。另外，图16(a)、(b)为对图14(a)、(b)以5,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的图像。

[0387] 实施例10中，非转移株的黑素瘤细胞接种到正常皮肤细胞上后，即使经过60分钟，也未观察到微纤维的伸长及黑素瘤细胞的浸润。

[0388] 由以上实施例7～10的结果可知，人黑素瘤细胞向正常皮肤细胞的浸润所需要的时间为接种起仅20分钟～60分钟的短时间。另外，在黑素瘤细胞的情况下，能够以微纤维的伸长为指标从而在形态学上识别非转移株的黑素瘤细胞和转移株的黑素瘤细胞，在将由皮肤癌患者采集的癌细胞培养数十分钟后用本发明的电子显微镜观察用保护剂进行SEM观察，从而能够诊断患者的癌细胞是转移株还是非转移株。进而，我们认为，通过确认微纤维的伸长范围，还能够在通过外科手术切除癌细胞时将切除范围控制在最小限度。

[0389] ＜实施例11＞

[0390] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0391] 在将人正常皮肤细胞培养为平板状而得的细胞片上，接种人黑素瘤细胞转移株，在添加抗癌剂之一的索拉非尼(ソラフェニブ)60分钟后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。然后，将用含有表面活性剂的溶液包覆的人黑素瘤细胞转移株放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0392] 图17(a)为向接种在来自人皮肤的成纤维细胞的细胞片上的人黑素瘤细胞转移株添加索拉非尼并以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的 SEM图像。另外，图17(b)为对图17(a)以5,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的图像。

[0393] 实施例11中确认：通过添加索拉非尼，即使是转移株的黑素瘤细胞，微纤维也不能伸长，浸润受到抑制。

[0394] 因此，通过在由皮肤癌患者采集的癌细胞中添加抗癌剂并培养，然后用本发明的电子显微镜观察用保护剂进行SEM观察，从而能够诊断所添加的抗癌剂对患者的癌细胞是否有效。另外，通过在癌细胞中添加抗癌剂候选物质并培养，然后用本发明的电子显微镜观察用保护剂进行SEM观察，从而还能确认所添加的抗癌剂候选物质实际上是否具有抗癌活性、进行药剂筛选。

[0395] ＜实施例12及比较例3＞

[0396] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0397] 在对人正常皮肤细胞进行立体三维培养而成的人人工皮肤上，添加吉非替尼(ゲフィチニブ)，60分钟后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。然后，将用含有表面活性剂的溶液包覆的人人工皮肤放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察(实施例12)。

[0398] 图18为三维培养的人人工皮肤的照片。图18A为示出培养中的人人工皮肤和培养容器的照片。另外，图18B为制作图18A的人人工皮肤的病理切片并进行HE染色而得的照片。图19(a)为对添加有溶解于二甲基亚砜(DMSO)的吉非替尼的人人工皮肤以2,500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，图19(b)为对照区，是对图19(a)所示的人人工皮肤添加DMSO、60分钟后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理、然后以
2,500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像(比较例3)。

[0399] 实施例12中确认：如图19(a)所示，添加了吉非替尼的人工皮肤细胞的表皮剥离成鱗片状。另一方面，对照区的人工皮肤细胞保持了正常形态。由以上结果可知，对三维培养的人工皮肤细胞添加吉非替尼后，用本发明的电子显微镜观察用保护剂进行SEM观察，从而能够通过培养细胞系评价作为吉非替尼的副作用的皮肤细胞的表面变化。另外，通过添加各种抗癌剂，能够筛选出副作用更少的药剂。进而，不仅限于抗癌剂，添加药剂候选物质并培养，然后用本发明的电子显微镜观察用保护剂进行 SEM观察，从而能够筛选出具有活性的药剂候选物质。

[0400] ＜实施例13＞

[0401] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0402] 在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)制的细胞培养过滤器中，将来自人新生儿皮肤的成纤维细胞培养为4层的层状，然后，在培养的来自人新生儿皮肤的成纤维细胞上接种来自人皮肤的淋巴管内皮细胞，进行共培养。在共培养的细胞上，滴加用适当的抗体稀释缓冲液调整了浓度的、以来自人皮肤的淋巴管内皮细胞的膜蛋白为抗原的一抗溶液，37℃下培养30分钟。用适当的洗涤缓冲液洗去未与共培养的细胞结合的多余的一抗等，滴加用适当的抗体稀释缓冲液调整了浓度的与一抗具有结合性且进行金胶体修饰后的二抗，37℃下培养
30分钟。用适当的洗涤缓冲液洗去未与共培养的细胞结合的多余的二抗等，然后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。然后，将用含有表面活性剂的溶液包覆的抗体结合性的培养细胞放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0403] 图20(a)、(b)为使存活的来自人皮肤的淋巴管内皮细胞与一抗和进行金胶体修饰后的二抗结合并用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理，然后以10,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的基于免疫电子显微法的SEM图像。

[0404] 由该结果可确认：通过使用本发明的电子显微镜观察用保护剂，在不对细胞进行化学固定的条件下与一抗和二抗作用，可在短时间内、灵敏度良好地获得非特异性信号少的免疫电子显微法SEM图像。

[0405] ＜实施例14＞

[0406] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0407] 与实施例11同样地，在将人正常皮肤细胞培养为平板状而得的细胞片上，接种人黑素瘤细胞转移株，滴加用适当的抗体稀释缓冲液调制了浓度的、以人黑素瘤细胞的膜蛋白为抗原的一抗溶液，37℃下培养30分钟。用适当的洗涤缓冲液洗去未与人黑素瘤细胞结合的多余的一抗等，滴加用适当的抗体稀释缓冲液调制了浓度的、与一抗具有结合性且进行金胶体修饰后的二抗，37℃下培养30分钟。用适当的洗涤缓冲液洗去未与一抗结合的多余的二抗等，然后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。然后，将用含有表面活性剂的溶液包覆的人黑素瘤细胞转移株放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0408] 图21(a)为使存活的人黑素瘤细胞与一抗和进行金胶体修饰后的二抗结合并用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理，然后以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的基于免疫电子显微法的 SEM图像。图21(b)为对图21(a)的细胞以10,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的基于免疫电子显微法的SEM图像。另外，图22为图21(a) 的黑素瘤细胞的边缘部的微纤维以7,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的基于免疫电子显微法的SEM图像。

[0409] 由这些结果可确认：通过使用本发明的电子显微镜观察用保护剂，在不对细胞进行化学固定的条件下与一抗和二抗作用，可在短时间内、灵敏度良好地获得非特异性信号少的免疫电子显微法SEM图像。若进行使用该新型的免疫电子显微法的观察，例如，通过使用肿瘤标志物作为抗原，从而能够迅速、简便地实现高可靠性的癌症诊断、癌症病理检查。需要说明的是，病变细胞并不限于癌细胞，对于炎症性的疾病或自身免疫疾病等也能够进行诊断。

[0410] ＜实施例15＞

[0411] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0412] 对从活小鼠摘出的腹膜，使上皮侧为上表面，将其载置于图23所示的试样台(a)上，作为前处理，立即滴加电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液，静置1分钟。

[0413] 对进行了前处理的小鼠腹膜，滴加含有表面活性剂的溶液，静置1 分钟，然后擦除多余的溶液，将其表面用含有表面活性剂的溶液包覆。然后，将用含有表面活性剂的溶液包覆的小鼠腹膜放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0414] 图24(a)为以100倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像，另外，图24(b)为对图24(a)的试样以1500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0415] 图23所示的试样台为用于在对腹膜、横隔膜等膜状组织施以张力的状态下进行观察的夹具。即，通过从上方对试样施加重力而产生张力，从而能够使从生物体摘出后、随着时间推移而逐渐收缩的腹膜、横隔膜等膜状组织与位于生物体内时同样地进行观察。

[0416] 使用该试样台的实施例15的SEM图像中，没有确认到实施例1、2 中所观察到腹膜表面的多个隆起，但高倍率下能够观察到微细的网眼状结构。另外，也完全没有观察到腹膜破裂、存在于腹膜表面下的肌丝的露出。因此，我们认为，通过使用图23所示的试样台，对试样施以张力，能够在维持更接近存在于体内时的状态的形态下进行观察。

[0417] ＜比较例4＞

[0418] 对从活小鼠摘出的腹膜，用10％(w/w)中性缓冲福尔马林进行一次化学固定后，将试样干燥，进行金属蒸镀(JEOL JFC－1100)。将这样的按照以往的电子显微镜观察用标本的制作方法制作的小鼠腹膜标本，使上皮侧为上表面，将其载置于图23(a)所示的试样台上，进行SEM观察。

[0419] 图25(a)为以50倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像，另外，图25(b)为对图25(a)的试样以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0420] 比较例4的SEM图像中确认腹膜破裂、存在于腹膜的表面下的肌丝的露出。

[0421] ＜实施例16＞

[0422] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0423] 对于从小鼠摘出的腹膜，使内脏侧为上表面，将其载置于图23所示的试样台(a)上，除此以外与实施例15同样地制作小鼠腹膜内脏侧的试样，进行SEM观察。

[0424] 图26(a)为以100倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像，另外，图26(b)为对图26(a)的试样以1,300倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0425] 实施例16的SEM图像中，与实施例15同样地未能清晰地确认隆起，在高倍率下能够观察到微细的网眼状的结构。另外，也完全没有观察到腹膜破裂、存在于腹膜的表面下的肌丝的露出。

[0426] ＜比较例5＞

[0427] 对于从小鼠摘出的腹膜，使内脏侧为上表面，将其载置于图23所示的试样台(a)上，除此以外与比较例4同样地制作小鼠腹膜内脏侧的标本，进行SEM观察。

[0428] 图27(a)为以50倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像，另外，图27(b)为对图27(a)的试样以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0429] 比较例5的SEM图像中，与比较例4同样地确认了腹膜破裂、存在于腹膜的表面下的肌丝的露出。

[0430] ＜比较例6＞

[0431] 与实施例15同样地，将从活小鼠摘出的腹膜载置于图23(a)所示的试样台上，在未处理的状态下导入电子显微镜内。图28(a)、(b) 均为以1500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0432] 比较例6的SEM图像中，整体均发生电荷积累，无法正常观察。另外确认：由于暴露于真空下而发生腹膜表面破裂，组织被破坏。

[0433] ＜实施例17＞

[0434] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0435] 除了从小鼠摘出的组织为横隔膜剥离部位以外，与实施例15同样地制作小鼠横隔膜剥离部位的试样、进行SEM观察。

[0436] 图29(a)为以500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像，另外，图29(b)为对图29(a)的试样以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。图30为对图29(a)的试样以20,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0437] 在使用了试样台的实施例17的SEM图像中，与实施例15中观察的腹膜表面同样地，横隔膜剥离部位的表面维持正常形态，图29(b)的倍率2,000倍的SEM图像中，确认有作为微细的孔的多个隆起。另外，也完全没有观察到横隔膜破裂、存在于横隔膜的表面下的肌丝的露出。进而，在超高倍率的20,000倍的SEM图像的图30中，图29(b)中确认的微细的孔看起来是分泌组织，但对这样状态的横隔膜进行观察本发明人也是首次进行，目前还难以推测上述微细的孔的功能等。因此通过使用本发明，能够观察以往在电子显微镜下不能观察的位于膜状组织表面的微细结构，这暗示有可能对医学、生物学领域提供新见解。

[0438] ＜实施例18＞

[0439] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0440] 为了对小鼠引发炎症，重复进行1周1次的腹腔内佐剂注射，3周后从活小鼠摘出腹膜。除了使用上述引发炎症的小鼠腹膜以外，与实施例 15同样地制作试样，进行SEM观察。

[0441] 图31(a)为以30倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像，图32 (a)为对图31(a)的试样以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM 图像。另外，图33(a)为对图31(a)的试样以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0442] 实施例18的SEM图像可确认：能够在含水状态下观察引发炎症的小鼠的腹膜的病理学变化。图31(a)的倍率30倍的SEM图像中，在腹膜表面观察到筋状变化，在图32(a)的倍率1,000倍的SEM图像及图 33(a)的倍率2,000倍的SEM图像中，观察到多个不规则隆起。我们认为，这样的变化是由于为了修复炎症部位而聚集的细胞的增殖、纤维化而产生的。因此，通过使用本发明，能够在极其接近体内的状态下观察以往在电子显微镜下不能观察的动物体内的病理学变化，这暗示有可能对医学、生物学领域提供新见解。

[0443] ＜比较例7＞

[0444] 作为实施例18的对照区，对于小鼠不注射佐剂而是重复进行1周1 次的腹腔内生理盐水注射，3周后，从活小鼠摘出腹膜。除了使用上述对照区小鼠腹膜以外，与实施例15同样地制作小鼠腹膜的标本，进行SEM 观察。

[0445] 图31(b)为以30倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像，图 32(b)为对图31(b)的试样以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的 SEM图像。另外，图33(b)为对图31(b)的试样以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0446] 比较例7的SEM图像中确认：与实施例18的SEM图像对称地，腹膜维持正常形态，细胞规则排列。

[0447] ＜实施例19＞

[0448] 使用作为生存环境赋予成分的甘油和水、作为糖类的葡萄糖、作为电解质的氯化钠，按照生存环境赋予成分(甘油)：(水)：糖类(葡萄糖)：电解质(氯化钠)＝20：10：0.09：0.01的配合比例混合，调制电子显微镜观察用保护剂。

[0449] 作为培养细胞，在玻璃平板上培养来自小鼠的成纤维细胞，连同玻璃平板一起从培养液捞出后，立即滴加含有表面活性剂的溶液，静置1 分钟。然后，将用来自小鼠的成纤维细胞的培养液稀释100倍的电子显微镜观察用保护剂滴加于用含有表面活性剂的溶液处理的来自小鼠的成纤维细胞中，静置1分钟。将滴加了电子显微镜观察用保护剂的来自小鼠的成纤维细胞，连同玻璃平板一起放入SEM试样室，照射电子束，使含有表面活性剂的溶液聚合而形成薄膜，进行SEM观察。

[0450] 图34(a)为以450倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像，另外，图34(b)为对图34(a)的试样以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0451] 可确认：通过在使用含有表面活性剂的溶液后用本发明的电子显微镜观察用保护剂处理，即使是以往在SEM试样室内抽真空时破裂的培养细胞，也能够在真空下观察正常形态。特别应提及的是，特别是能够观察到伪足从成纤维细胞伸出的状态。

[0452] 进而确认：观察后将玻璃平板送回培养液中的情况下，细胞维持存活状态。从而，能够在电子显微镜下进行细胞的存活状态下的观察、且能够使细胞从真空下生还的技术是全新的，我们认为这是生命科学研究中极为重要的技术。

[0453] ＜比较例8＞

[0454] 与实施例19同样地，使用在玻璃平板上培养的来自小鼠的成纤维细胞作为培养细胞，连同玻璃平板一起从培养基捞出后，在未处理的状态下导入电子显微镜内。

[0455] 图35(a)为以1500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像，另外，图35(b)为对图35(a)的试样以1,800倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0456] 任一SEM图像中均确认了细胞萎缩、变形，不能在存活状态下进行观察。

[0457] ＜实施例20＞

[0458] 与实施例19同样地，调制电子显微镜观察用保护剂。

[0459] 作为培养细胞，使用在玻璃平板上培养的来自人的成纤维细胞，连同玻璃平板一起从培养基捞出后，立即重复进行2次滴加蒸馏水并静置1 分钟的洗涤处理，然后，滴加用来自人的成纤维细胞的培养液稀释100 倍的电子显微镜观察用保护剂，静置1分钟。将滴加了电子显微镜观察用保护剂的来自人的成纤维细胞连同玻璃平板一起放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0460] 图36(a)为以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像，另外，图36(b)为对图36(a)的试样以5,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0461] 实施例20中，虽然未进行含有表面活性剂的溶液处理，但也能够观察在真空下为存活状态的培养细胞，与实施例19同样地确认了伪足从成纤维细胞伸出的状态。

[0462] ＜比较例9＞

[0463] 将含有作为单细胞的人红细胞的生理盐水滴加到玻璃平板上，在未处理的状态下导入电子显微镜内。

[0464] 图37(a)为以1,000倍的倍率进行观察、拍摄时的SEM图像，另外，图37(b)为对图37对(a)的一部分以2,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0465] 任一SEM图像均发生电荷积累，另外确认了红细胞发生萎缩、变形，不能在存活状态下进行观察。

[0466] ＜实施例21＞

[0467] 与实施例19同样地，调制电子显微镜观察用保护剂。

[0468] 将含有作为单细胞的人血球细胞、血小板、红细胞及白细胞的生理盐水滴加于玻璃平板，立即滴加电子显微镜观察用保护剂，静置1分钟。将滴加了电子显微镜观察用保护剂的人血球细胞及血小板、红细胞、白细胞连同玻璃平板一起放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0469] 图38(a)为以1,800倍的倍率进行观察、拍摄而得的人血球细胞及血小板的SEM图像。另外，图38(b)为以7,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的人红细胞的SEM图像，图38(c)为以7,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的人白细胞的SEM图像。

[0470] 实施例21中，在电子显微镜下，对人血球细胞及血小板、红细胞、白细胞中的任一者均能够确认存活状态的细胞。

[0471] ＜实施例22＞

[0472] 与实施例19同样地，调制电子显微镜观察用保护剂。

[0473] 将含有作为单细胞的酵母、纳豆菌及大肠杆菌的培养液滴加于玻璃平板，立即用电子显微镜观察用保护剂处理。将滴加了电子显微镜观察用保护剂的酵母、纳豆菌及大肠杆菌连同玻璃平板一起放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0474] 图39(a)为以5,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的含水状态的酵母的SEM图像。另外，图39(b)为对(a)的一部分以20,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。图39(c)为以15,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的含水状态的纳豆菌的SEM图像。图39(d)为以10,000 倍的倍率进行观察、拍摄而得的含水状态的大肠杆菌的SEM图像。

[0475] 实施例22中，在电子显微镜下，对酵母、纳豆菌及大肠杆菌中的任一者均能够确认存活状态的细胞。

[0476] ＜实施例23＞

[0477] 与实施例19同样地，调制电子显微镜观察用保护剂。

[0478] 将含有作为单细胞的细胞性粘菌之一的网柄菌的子实体的培养液滴加于玻璃平板，立即用电子显微镜观察用保护剂处理。将滴加了电子显微镜观察用保护剂的网柄菌的子实体连同玻璃平板一起放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0479] 图40(a)为以50倍的倍率进行观察、拍摄而得的含水状态的盘基网柄菌子实体的SEM图像。另外，图40(b)为对(a)的一部分以300 倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像，图40(c)为以3,000倍的倍率、图40(d)为以6,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0480] 实施例23中，在电子显微镜下，对含水状态的盘基网柄菌子实体能够确认存活状态的细胞。特别是在以高倍率观察时，确认在子实体表面存在微细的网眼状隆起。

[0481] ＜实施例24＞

[0482] 与实施例19同样地，调制电子显微镜观察用保护剂。

[0483] 使小鼠巨细胞病毒(MCMV)感染在玻璃平板上培养的小鼠成纤维细胞，立即用电子显微镜观察用保护剂处理。将滴加了电子显微镜观察用保护剂的MCMV感染小鼠成纤维细胞连同玻璃平板一起放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0484] 图41(a)为实施例24的MCMV感染小鼠成纤维细胞的感染起10 分钟后的SEM图像。图41(b)为对(a)的一部分放大观察、拍摄而得的SEM图像，图42(a)、(b)为对图41(b)以更高倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0485] 实施例24中确认：在含水状态的MCMV感染小鼠成纤维细胞的表面，能够清晰地观察病毒粒子。另外，还确认MCMV对成纤维细胞的感染在10分以内进行。

[0486] ＜实施例25＞

[0487] 与实施例19同样地，调制电子显微镜观察用保护剂。

[0488] 与实施例24同样地，使小鼠巨细胞病毒(MCMV)感染在玻璃平板上培养的小鼠成纤维细胞，立即用电子显微镜观察用保护剂处理。将滴加了电子显微镜观察用保护剂的MCMV感染小鼠成纤维细胞连同玻璃平板一起放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0489] 图43(a)为实施例25的MCMV感染小鼠成纤维细胞的感染起10 分钟后的SEM图像。图43(b)为(a)的感染起15分钟后、图43(c) 为(a)的感染起20分钟后的SEM图像。

[0490] 实施例25中确认：使用SEM能够观察在含水状态的MCMV感染小鼠成纤维细胞的表面、病毒粒子经时地通过内吞作用从宿主细胞的表面向细胞内部逐渐侵入的过程。

[0491] ＜实施例26＞

[0492] 与实施例19同样地，调制电子显微镜观察用保护剂。

[0493] 与实施例24同样地，使人脊髓灰质炎病毒感染在玻璃平板上培养的人咽喉癌细胞Hep－2，立即用电子显微镜观察用保护剂处理。将滴加了电子显微镜观察用保护剂的人脊髓灰质炎病毒感染Hep－2细胞连同玻璃平板一起放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0494] 图44(a)为实施例26的人脊髓灰质炎病毒感染Hep－2细胞的感染起15分钟后的SEM图像。图44(b)为将图(a)中被框包围的区域放大观察、拍摄而得的SEM图像。另外，图44(c)为(b)的感染起30 分钟后、图44(d)为(b)的感染起45分钟后、图44(e)为(b)的感染起60分钟后、图44(f)为(b)的感染起75分钟后的SEM图像。

[0495] 实施例26中确认：使用SEM能够观察在含水状态的人脊髓灰质炎病毒感染Hep－2细胞的表面、病毒粒子经时地通过内吞作用从宿主细胞的表面向细胞内部逐渐侵入的过程。

[0496] ＜实施例27＞

[0497] 作为病毒，制作表达GFP的小鼠巨细胞病毒(GFP－M32－MCMV)，将含有病毒粒子的分散液接种在载玻片上，添加对MCMV粒子赋予正电荷的聚凝胺而进行处理。然后，作为实验区，对盖玻片的表面实施等离子体处理而使羟基暴露于表面从而提高亲水性，制作表面赋予了负电荷的盖玻片。另外，作为对照区，使用未处理的盖玻片。以研究聚凝胺处理是否使实验区及对照区的2种盖玻片产生MCMV粒子的吸附量差异。

[0498] 图45为实施例27的荧光显微镜照片。图45(a)为使等离子体处理的盖玻片的表面吸附进行了聚凝胺处理的鼠巨细胞病毒(MCMV)并观察、拍摄而得的照片。图中的发出荧光的绿色斑点表示吸附于盖玻片的含水状态的MCMV。图45(b)为对照区，是使未处理的盖玻片的表面吸附进行了聚凝胺处理的吸附MCMV并观察、拍摄而得的照片。

[0499] 实施例27中，由图45(a)的荧光显微镜照片确认：通过对盖玻片实施等离子体处理而提高亲水性，从而与未处理的盖玻片相比强烈赋予负电，能够对通过聚凝胺处理而赋予正电的MCMV粒子进行静电吸附、浓缩。另一方面，由图45(b)的荧光显微镜照片确认：在未对盖玻片实施等离子体处理时，与图45(a)的实验区的载玻片相比，MCMV粒子的吸附量少。从而可知，能够将MCMV粒子浓缩到能够在显微镜下进行计测、观察的水平。

[0500] ＜实施例28＞

[0501] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0502] 如图46(b)所示，使进行了等离子体处理的盖玻片的表面吸附进行了聚凝胺处理的小鼠巨细胞病毒(MCMV)而进行浓缩。将吸附于盖玻片而浓缩的MCMV用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。将滴加了含有表面活性剂的溶液的MCMV连同盖玻片一起放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0503] 图47为表示测定MCMV粒子在盖玻片上的吸附率的结果的图表。图表左侧的数据表示使进行了聚凝胺处理而赋予正电的MCMV粒子吸附于进行了等离子体照射而赋予负电的盖玻片前的、病毒粒子在分散液中的病毒浓度。另一方面，图表右侧的数据表示吸附后的洗涤液中的病毒浓度。对吸附前后的病毒浓度进行t检验、统计分析的结果是p＜0.01，确认吸附前后病毒粒子分散液中含有的MCMV粒子的浓度显著降低。由该结果确认：求出的MCMV粒子在盖玻片上的吸附率为99.65％，病毒粒子分散液中含有的MCMV粒子几乎全部吸附于盖玻片。

[0504] 图48为实施例28的SEM图像。图48(a)为进行了聚凝胺处理而赋予正电的MCMV粒子吸附于进行等离子体照射而赋予负电的盖玻片而浓缩的MCMV的、以15,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，图48(b)为对图48(a)的一部分以35,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0505] 实施例28中确认：对于含水状态的MCMV，通过对病毒粒子进行聚凝胺处理而赋予正电，从而使其吸附于进行等离子体照射而赋予负电的盖玻片，能够在电子显微镜下进行观察。

[0506] ＜实施例29＞

[0507] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0508] 预先培养感染了MCMV的小鼠成纤维细胞，回收含有MCMV粒子的培养上清，将其作为样品A。另外，回收含有MCMV粒子的培养上清，通过超离心将病毒粒子和致密体分离，仅回收病毒粒子，将其作为样品B。

[0509] 与实施例28同样地，将吸附于盖玻片而浓缩的MCMV用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。将滴加了含有表面活性剂的溶液的MCMV连同盖玻片一起放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0510] 图49为实施例29的SEM图像，(a)～(j)分别为在不同视野中对病毒粒子进行拍摄而得的SEM图像。(a)～(j)的SEM图像中，对视野内的病毒粒子数进行计数，并算出10个视野中的病毒粒子的平均値。其结果是，使用样品B的病毒粒子分散液时，(a)中为17个、(b)中为21个、(c)中为35个、(d)中为20个、(e)中为15个、(f)中为32个、(g)中为25个、(h)中为17个、(i)中为36个、(j)中为14个，10个视野中的平均病毒粒子数为23.2个/视野。基于该10个视野中的平均病毒粒子数算出病毒分散液中的病毒浓度，结果为8.35x1010个/ml。需要说明的
9
是，虽然未图示，在使用样品A的病毒粒子分散液时，病毒浓度为6.35x10个/ml。

[0511] 图50为示出使用样品B重复进行5次同样实验时的病毒粒子数的图表。对5次实验的平均値进行计算，结果平均病毒粒子数为17.2±2.5个/ 视野。基于该5次实验的平均病毒粒子数算出MCMV病毒的病毒分散液中的病毒浓度，结果为6.55x1010±2.56x1010个/ml。9
需要说明的是，虽然未图示，在使用样品A的病毒粒子分散液时，病毒浓度为 8.73x10 ±
7.14x109个/ml。

[0512] 另外，使用同一病毒粒子分散液作为试样，利用以往法、即噬斑测定法和定量PCR法对病毒浓度进行了定量。结果示于表1。

[0513] [表1]

[0514]

[0515] 结果确认：使用样品A的病毒粒子分散液时，噬斑测定法的病毒浓度为1.3×108±7×107PFU/ml、定量PCR法的病毒浓度为 1.09×1011±9.5×109copies/ml。另外确认：使用样品B的病毒粒子分散液时，噬斑测定法的病毒浓度为2.2×109±6×108PFU/ml、定量PCR法的病毒浓度为1.35×1010±1.0×109copies/ml。与实施例29的结果相比，通过利用使用本发明的电子显微镜观察用保护剂的病毒粒子的电子显微镜观察的计数及定量方法所算出的病毒粒子浓度与以往法、即噬斑测定法、定量PCR 法的结果一致。

[0516] 进而，将以往法和利用使用本发明的电子显微镜观察用保护剂的病毒粒子的电子显微镜观察的计数及定量方法的特征示于表2。

[0517] [表2]

[0518]

[0519] 因此，通过利用使用本发明的电子显微镜观察用保护剂的利用电子显微镜观察对病毒粒子进行计数及定量的方法，能够在短时间内准确地进行病毒浓度定量。

[0520] ＜实施例30＞

[0521] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0522] 实施例30中尝试在含水状态的病毒粒子的电子显微镜观察中检测含 DNA的病毒粒子。与实施例28同样地，对吸附于盖玻片而浓缩的MCMV，作为对照区，仅进行电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液处理。作为实验区，对吸附于盖玻片而浓缩的MCMV，在乙酸铀处理后，进行电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液处理。乙酸铀能够对DNA和肽进行染色。另外，作为实验区，对吸附于盖玻片而浓缩的 MCMV，在顺铂处理后，用电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液处理。顺铂仅能将DNA染色。将这些各处理后的MCMV连同盖玻片一起放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0523] 图51(a)为对照区的MCMV的SEM图像，图51(b)为乙酸铀处理的MCMV的SEM图像。另外，图51(c)为顺铂处理的MCMV的SEM 图像，图中箭头表示含DNA的病毒粒子。均为以10,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的含水状态的MCMV的SEM图像。

[0524] 实施例30中确认：对病毒粒子，也能够在含水状态下进行基于免疫电子显微法的观察。另外，我们认为，能够确认用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理的MCMV含有DNA。

[0525] ＜实施例31＞

[0526] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0527] 与实施例28同样地，使吸附于盖玻片而浓缩的MCMV与作为一抗的抗DNA抗体结合、与作为二抗的与一抗具有结合性且进行金胶体修饰后的抗体结合后，用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。将滴加了含有表面活性剂的溶液的二抗体结合MCMV连同盖玻片一起放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0528] 图52为以10,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的含水状态的二抗体结合MCMV的SEM图像。

[0529] 实施例31中确认：对病毒粒子，也能够在含水状态下利用免疫电子显微法、即Live免疫电子显微进行观察。另外，我们认为，由于使用了抗DNA抗体作为一抗，因此还能够通过电子显微镜观察来区分DNA病毒和RNA病毒。

[0530] ＜实施例32＞

[0531] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0532] 采集作为植物的生物体组织的福寿草的花瓣，载置于图23(a)所示的试样台上，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。将滴加了含有表面活性剂的溶液的福寿草的花瓣放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0533] 图53(a)为以30倍的倍率进行观察、拍摄而得的含水状态的福寿草花瓣的SEM图像。另外，图53(b)为以5,000倍的倍率对图53(a) 的一部分进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0534] 实施例32中，对含水状态的福寿草花瓣，能够在电子显微镜下确认存活状态的细胞。特别是在高倍率的观察中，确认在花瓣的表面规则地形成有沟状的构图。

[0535] ＜实施例33＞

[0536] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0537] 采集作为植物的生物体组织的鸭跖草叶，用10％(w/w)中性缓冲福尔马林进行一次化学固定后，作为前处理，在电子显微镜观察用保护剂中浸渍1分钟。将用电子显微镜观察用保护剂处理的鸭跖草叶用含有表面活性剂的溶液处理。将滴加了含有表面活性剂的溶液的鸭跖草叶放入SEM 试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0538] 图54(a)为以30倍的倍率进行观察、拍摄而得的鸭跖草叶的表侧叶肉细胞的SEM图像。另外，图54(b)为以30倍的倍率进行观察、拍摄而得的鸭跖草叶的背侧叶肉细胞的SEM图像。

[0539] 图55(a)、(b)为对图54(a)、(b)的试样以500倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。另外，图56(a)、(b)为对图54(a)、 (b)的试样以1,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0540] 实施例33中，对鸭跖草叶，能够在电子显微镜下确认含水状态的细胞。特别是在高倍率的观察中，确认叶的表侧和背侧的叶肉细胞的形状、密度差异较大、叶背侧的叶肉细胞的密度低。

[0541] ＜实施例34＞

[0542] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0543] 将活涡虫载置于图23(a)所示的试样台上，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。将滴加了含有表面活性剂的溶液的活涡虫放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0544] 图57为在含水状态下观察、拍摄而得的涡虫的SEM图像。图中的标尺表示500μm。

[0545] 实施例34中，对含水状态的涡虫，在电子显微镜下能够确认存活。

[0546] ＜实施例35＞

[0547] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0548] 在猩猩蝇的复眼发生过程中，对存活状态的猩猩蝇，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。将滴加了含有表面活性剂的溶液的活猩猩蝇放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0549] 图58为对在含水状态下观察、拍摄的猩猩蝇的复眼发生边缘部位以 4,000倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0550] 实施例35中，对含水状态的猩猩蝇，在电子显微镜下能够确认复眼的发生过程。

[0551] ＜实施例36＞

[0552] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0553] 在水螅的头部再生过程中，对存活状态的水螅，立即用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理。将滴加了含有表面活性剂的溶液的活水螅放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。

[0554] 图59为对在含水状态下观察、拍摄的水螅的头部的再生前端以8,000 倍的倍率进行观察、拍摄而得的SEM图像。

[0555] 实施例36中，对含水状态的水螅，在电子显微镜下能够确认头部再生过程。

[0556] ＜实施例37＞

[0557] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0558] 将含有作为单细胞的原核生物、椰果菌及酵母的培养液滴加于玻璃平板，立即用电子显微镜观察用保护剂处理。将滴加了电子显微镜观察用保护剂的原核生物、椰果菌及酵母连同玻璃平板一起放入SEM试样室，照射电子束，进行SEM观察。另外，使用含有作为单细胞的大肠杆菌的培养液进行同样的处理，进行TEM观察。

[0559] 图60(a)为含水状态的原核生物的SEM图像。图中的标尺表示3μm。另外，图60(b)为含水状态的椰果菌的SEM图像。图中的标尺表示10μm。图60(c)为含水状态的酵母的SEM图像。图中的标尺表示10μm。图 60(d)为含水状态的大肠杆菌的TEM像。图中的标尺表示200nm。

[0560] 实施例37中，对于原核生物、椰果菌、酵母及大肠杆菌中的任一种，在电子显微镜下均能够确认存活状态的细胞。

[0561] ＜实施例38及比较例10＞

[0562] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0563] 将对人正常皮肤细胞进行立体三维培养而得的人人工皮肤，用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理(实施例38)。

[0564] 另一方面，作为对照，对人正常皮肤细胞进行立体三维培养而得的人人工皮肤，用通常的电子显微镜观察用固定液即戊二醛进行化学固定(比较例10)。

[0565] 分别用SEM观察实施例38及比较例10的人人工皮肤。进而，从表皮到真皮选择多个部位，对各部位用EDS进行元素分析，测定人工皮肤内部的元素分布(Na、Mg、P、S、Cl、K及Ca)。需要说明的是，本试验例的皮肤内，作为测定对象的元素是以离子化状态被检测的。

[0566] 图61(a)为实施例38的SEM图像，图61(b)为示出实施例38 中进行EDS解析的部位的图，图61(c)为实施例38的EDS解析图。

[0567] 图62(a)为比较例10的SEM图像，图62(b)为示出比较例10 中进行EDS解析的部位的图，图62(c)为比较例10的EDS解析图。

[0568] 如图61(c)及图62(c)所示，确认在人人工皮肤中各离子从表皮侧到真皮侧存在特征性梯度。另一方面，比较图61(c)和图62(c)可知，与各离子对应的峰形不同。例如，实施例38中可见硫离子及钙离子的峰高度变化，而比较例10中看不到这样的变化。

[0569] 以上结果暗示：使用本发明的电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液时，与用以往的电子显微镜观察用固定液进行化学固定时对样品中的元素分布的影响不同。

[0570] ＜实施例39及比较例11＞

[0571] 与实施例1同样地调制电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液。

[0572] 在对人正常皮肤细胞进行立体三维培养而成的人人工皮肤上添加 10μM的GFT(抗癌剂)，然后用电子显微镜观察用保护剂处理，用含有表面活性剂的溶液处理(实施例39)。

[0573] 另一方面，作为对照，在对人正常皮肤细胞进行立体三维培养而成的人人工皮肤上添加10μM的GFT(抗癌剂)，然后用通常的电子显微镜观察用固定液即戊二醛进行化学固定(比较例11)。

[0574] 分别用SEM观察实施例39及比较例11的人人工皮肤。进而，从表皮到真皮选择多个部位，对各部位用EDS进行元素分析，测定人工皮肤内部的元素分布(Na、Mg、P、S、Cl、K及Ca)。需要说明的是，本试验例的皮肤内，作为测定对象的元素是以离子化状态被检测的。

[0575] 图63(a)为实施例39的SEM图像，图63(b)为示出实施例39 中进行EDS解析的部位的图，图63(c)为实施例39的EDS解析图。

[0576] 图64(a)为比较例11的SEM图像，图64(b)为示出比较例11 中进行EDS解析的部位的图，图64(c)为比较例11的EDS解析图。

[0577] 实施例39中，如图63(c)所示，确认在人人工皮肤中从表皮侧到真皮侧存在钾离子梯度，从真皮侧到表皮侧存在钙离子梯度。另一方面，比较例11中，如图64(c)所示，未确认到实施例39中确认的钾离子梯度及钙离子梯度。

[0578] 根据以上结果，通过使用本发明的电子显微镜观察用保护剂及含有表面活性剂的溶液进行SEM观察及EDS解析，与用以往的电子显微镜观察用固定液进行化学固定的相比，能够更准确地测定皮肤组织中的元素分布。从而，例如，通过在皮肤上施与药剂之前、之后进行皮肤的SEM观察及皮肤内部的EDS解析，能够进行该药剂的治疗效果的评价。