一种降钙素原（PCT）的检测试剂及其制备方法
阅读：1033发布：2020-05-25
专利汇可以提供一种降钙素原（PCT）的检测试剂及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种降 钙 素原（PCT,Procalcitonin）的胶乳增强免疫比浊检测单 试剂 以及制备方法。该试剂包括PCT 抗体 致敏胶乳颗粒、 乙二胺四乙酸 二钠、精 氨 酸、 牛 血清 白蛋白 、聚乙烯磺酸钠、十二烷基聚乙二醇醚以及Proclin300，聚乙烯磺酸钠与十二烷基聚乙二醇醚的比例为5：1。本发明还公开了合适的 表面活性剂 组合可提高降钙素原检测单试剂的检测灵敏度的制备方法。本发明采用单一试剂，无需混合，灵敏度高，检测速度快，能够直接测量 全血 、血清和 血浆 等各种样本，因此可广泛应用于各种透射或者散射分析仪，包括普通生化分析仪、特定蛋白分析仪等。，下面是一种降钙素原（PCT）的检测试剂及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种降钙素原（PCT）胶乳增强免疫比浊检测单试剂，其特征在于所述单试剂包括
0.15mg/mL的PCT抗体致敏胶乳颗粒、10mM乙二胺四乙酸二钠、10g/L精氨酸、3g/L牛血清白蛋白、5-10g/L聚乙烯磺酸钠、1-2g/L十二烷基聚乙二醇醚以及1g/L Proclin300，pH=6.5，其中聚乙烯磺酸钠与十二烷基聚乙二醇醚的比例为5：1；
其中所述的PCT抗体致敏胶乳颗粒是按照如下方法制备的：
（1）制备活化胶乳颗粒：取粒径309nm、浓度为10mg/mL的羧基化聚苯乙烯微球0.18mL，加入25mM pH6.5的MES 3.6mL,搅拌10min，加入EDC活化剂粉末7.04mg，室温搅拌2.5h后
12000rpm离心收集沉淀，25mM pH6.5的MES 1.8mL 重悬沉淀；
（2）制备致敏胶乳颗粒：1.8mL 25mM pH6.5的MES中放入0.18mL浓度为4.0mg/mL的PCT多克隆抗体，搅拌1min，制成待偶联抗体溶液；将（1）中的活化胶乳颗粒快速倒入待偶联抗体溶液中，搅拌2.5h；12000rpm离心收集沉淀，120mL封闭液重悬后搅拌2.5h即得单试剂降钙素原（PCT）胶乳增强免疫比浊试剂；封闭液的组分为10mM乙二胺四乙酸二钠、10g/L精氨酸、3g/L牛血清白蛋白、5-10g/L聚乙烯磺酸钠、1-2g/L十二烷基聚乙二醇醚以及1g/L Proclin300，pH=6.5，聚乙烯磺酸钠与十二烷基聚乙二醇醚的比例为5：1。
一种降钙素原（PCT）的检测试剂及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于医学免疫诊断领域，具体涉及一种降钙素原（PCT）的胶乳增强免疫比浊检测单试剂的制备及其应用。
背景技术
[0002] 降钙素原（ procalcitonin -简称PCT）是降钙素的前体激素，正常情况下由甲状腺C细胞分泌，经细胞内蛋白水解酶水解后形成的活性成分，其多肽链有114或116个氨基酸组成。严重全身性细菌、真菌和寄生虫感染时，PCT异位生成、水平异常升高，且升高程度与感染严重度及预后相关。PCT在不同医学领域对诊断和指导治疗有很高的价值，与目前所应用的诊断指标相比，PCT在鉴别诊断和控制感染及严重炎症方面提供了额外的信息。近年来发现，在全身细菌感染和脓毒症的辅助和鉴别诊断方面降钙素原是一个具有高特异性和敏感性的新指标。
[0003] 鉴别诊断细菌性与非细菌性炎性反应在细菌引起的全身性炎性反应时，血清PCT浓度会出现明显增高，但在病毒感染、自身免疫性疾病、器官移植排斥反应等炎性反应时，血清PCT浓度仅维持低水平，提示血清PCT浓度可以鉴别诊断细菌性或非细菌性炎症。
[0004] 判断脓毒症和全身炎性反应的严重程度脓毒症是重症监护室最常见的严重疾病之一，是引起全身炎性反应综合征、多器官功能障碍综合征的常见原因，也是致残、致死率非常高的疾病之一，所以对脓毒症及早确诊，让患者及时得到治疗是重症监护室医生的主要任务。研究发现，脓毒症患者血清PCT值明显高于非脓毒症患者，认为PCT优于目前临床上应用的炎性反应指标，可作为早期鉴别全身感染，尤其是细菌感染的快捷、敏感、准确的检测手段。
[0005] PCT的常见检测方法有酶联免疫法（一种降钙素原检测试剂盒；CN201410110849.4）、化学发光法（一种降钙素原的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法；CN201410143487.9）、胶乳增强免疫比浊法（一种定量检测降钙素原PCT的胶乳增强免疫比浊试剂盒：CN201210273085.1）以及荧光层析检测。这些方法中罗氏化学发光检测法为金标准，但设备为全封闭且昂贵，标本测试时间从9-27min不等，报告结果的时间长。
[0006] 现在市场上已有的PCT胶乳增强免疫比浊试剂采用的是稀释液和胶乳溶液的双试剂形式。在测试时，测试样品必须先在稀释液中稀释，再和胶乳溶液进行混合反应。三甲医院常用仪器平台上，稀释和混合的操作可由稍大型全自动生化分析仪完成，但是在小型半自动平台上尤其是POCT类的便携式平台（三级以下医院以及县乡一级医疗服务单位常用）上进行的测试则需要操作人员手动实施，带来了额外的操作步骤，也引入了更多的操作误差，影响了测试的精密度。
[0007] 荧光层析检测方法，是将抗体以及部分检测液喷涂于NC膜上，属于干式POCT，其优点是检测速度快，但是不同厂家制作水平差异，其灵敏度在0.5-2ng/mL之间。按罗氏化学发光法归纳的参考标准，0.5ng/mL水平处提示有炎症可能来判断，荧光层析检测在0.5ng/mL处的重复性低可能会导致检测结果出现假阴或假阳情况。
发明内容
[0008] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种单一试剂，无需混合试剂，灵敏度高，检测速度快的降钙素原（PCT）的胶乳增强免疫比浊检测试剂。该试剂既可以在大型自动生化分析仪上进行测试，也可以在特定蛋白仪等小型POCT设备上进行测试。
[0009] 在背景技术的介绍中提到，市场上已有的PCT胶乳增强免疫检测试剂采用的是双试剂的检测形式。其中稀释液常被称为R1,胶乳溶液常被称为R2。纯粹的抗体或者抗原包被的微球的胶乳溶液是热力学不稳定体系，如果没有特殊的处理，胶乳会自发地凝集。因此，一般地，检测试剂中的胶乳溶液（R2）需要通过优化溶液的组成来保证胶乳溶液的稳定，阻止胶乳在储存时发生自发凝集。常见的优化手段包括选用不同的缓冲体系、改变微球表面电荷、改变溶液离子强度、添加稳定剂等手段（J.A. Molina Bolivar et al, Journal of Macromolecular Science Part C - Polymer Reviews, 2005, 45:59-98）。然而当胶乳溶液用于测试时，由抗原抗体的特异性结合导致的胶乳凝集就不应该被阻止，这就要求稀释液（R1）能够在一定程度上有益于胶乳凝集的形成。所以一般稀释液（R1）和胶乳储存液（R2）在配方上有很大的区别。直接将R1和R2混合，一般会导致胶乳不稳定。这也是市场上胶乳试剂一般都采用双试剂形式的主要原因。
[0010] 在本发明中，除了常规的稳定胶乳试剂的方法以外，我们还引入了表面活性剂来优化试剂配方稳定胶乳溶液。表面活性剂可以提供空间位阻，离子型的表面活性剂还可以提供额外的静电斥力，从而阻止胶乳的凝聚，在储存时稳定胶乳试剂。 同时，通过优化试剂配方，当含有PCT的样本接触胶乳试剂时，合适的表面活性剂能够促进PCT抗原和PCT抗体的相互作用，有利于形成特异性的胶乳凝集。这样我们就制备了一种单试剂形式的PCT胶乳试剂。在储存时，该试剂可以稳定存放，在接触样品时，该试剂可以迅速发生凝集反应， 不再需要混合其他的稀释液来促进凝集反应。 而且优选的表面活性剂种类和浓度可以有效溶解血液中血细胞，从而使得本发明中的检测试剂可以直接测量全血的样本，具备了同时检测全血、血清和血浆的能力。
[0011] 本发明所述的降钙素原（PCT）检测试剂包括PCT抗体致敏胶乳颗粒、乙二胺四乙酸二钠、精氨酸、牛血清白蛋白、聚乙烯磺酸钠、十二烷基聚乙二醇醚以及Proclin300，聚乙烯磺酸钠与十二烷基聚乙二醇醚的比例为5：1。
[0012] 所述的PCT抗体致敏胶乳颗粒的浓度为0.15mg/mL。
[0013] 所述的乙二胺四乙酸二钠浓度为10mM。
[0014] 所述的精氨酸浓度为10g/L。
[0015] 所述的牛血清白蛋白浓度为3g/L。
[0016] 所述的聚乙烯磺酸钠浓度为5-10g/L。
[0017] 所述的十二烷基聚乙二醇醚浓度为1-2g/L。
[0018] 所述的Proclin300浓度为1g/L。
[0019] 优选的，PCT抗体致敏胶乳颗粒是按照如下方法制备的：（1）制备活化胶乳颗粒：取粒径309nm、浓度为10mg/mL的羧基化聚苯乙烯微球0.18mL，加入25mM pH6.5的MES 3.6mL,搅拌10min，加入EDC活化剂粉末7.04mg，室温搅拌2.5h后
12000rpm离心收集沉淀，25mM pH6.5的MES 1.8mL 重悬沉淀。
12000rpm离心收集沉淀，25mM pH6.5的MES 1.8mL 重悬沉淀。
[0020] （2）制备致敏胶乳颗粒：1.8mL 25mM pH6.5的MES中放入0.18mL浓度为4.0mg/mL的PCT多克隆抗体，搅拌1min，制成待偶联抗体溶液。将（1）中的活化胶乳颗粒快速倒入待偶联抗体溶液中，搅拌2.5h。12000rpm离心收集沉淀，120mL封闭液重悬后搅拌2.5h即得单试剂降钙素原（PCT）胶乳增强免疫比浊试剂。封闭液的组分为10mM乙二胺四乙酸二钠、10g/L精氨酸、3g/L牛血清白蛋白、5-10g/L聚乙烯磺酸钠、1-2g/L十二烷基聚乙二醇醚以及1g/L Proclin300，pH=6.5，聚乙烯磺酸钠与十二烷基聚乙二醇醚的比例为5：1。
[0021] 本发明所述的试剂检测方法如下：检测样品时，本发明提供的试剂中胶乳颗粒上的PCT抗体与样品中的PCT抗原发生抗体抗原反应，从而使得胶乳逐渐凝聚，改变了测试液的浊度。浊度的变化可以通过透射仪或者散射仪来测定。 透射的吸光度或者散射光强度与样品中的PCT浓度在一定浓度范围内成线性关系。 通过参考PCT校准品建立的定标曲线，可以定量地计算出被测样品中PCT的浓度。
[0022] 本发明的有益效果包括：1.检测试剂的组成简单，只有单一试剂，不需要像市场现有试剂那样在测试时进行R1、R2的混合操作，简化了操作程序。尤其是在使用半自动POCT设备的时候，为操作人员带来极大的便利，同时也更好地保障了测试的精确性。
[0023] 2.试剂同时具有溶血和检测的功能，可以直接测试全血样品，不需要进行血清、血浆提取的工作，简化了操作，大大缩短了包括样品准备在内的整个测试时间。
[0024] 3.该试剂反应快速，反应时间只需要2到3分钟。相比现有双试剂胶乳试剂10到12分钟的检测时间，速度提高接近4倍，从而大大提升了检测效率,尤其有利于门诊的快速检测。
[0025] 4.该试剂线性灵敏度高，灵敏度为0.17ng/mL。
[0026] 5.试剂适用性好，可以在透射或者散射仪上使用。既可以在全自动大型生化仪上使用，也可以在小型POCT设备上使用。可以同时满足大型医院检验科、住院部、小型医院门诊、以及急诊科室的检测需要。附图说明
具体实施方式
[0028] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细阐述。下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。
[0029] 实施例11）胶乳试剂的制备
羧基化聚苯乙烯微球购自日本JSR Life Sciences。
羧基化聚苯乙烯微球购自日本JSR Life Sciences。
[0030] PCT抗体购自芬兰Hytest生物。
[0031] EDC购自sigma。
[0032] 制备方法1与2在表面活性剂的组合上存在差异。
[0033] 制备方法1：制备活化胶乳颗粒：取粒径309nm、浓度为10mg/mL的羧基化聚苯乙烯微球0.18mL，加入25mM pH6.5的MES 3.6mL,搅拌10min，加入EDC活化剂粉末7.04mg，室温搅拌2.5h后12000rpm离心收集沉淀，25mM pH6.5的MES 1.8mL 重悬沉淀。
[0034] 制备致敏胶乳颗粒：1.8mL 25mM pH6.5的MES中放入0.18mL浓度为4.0mg/mL的PCT多克隆抗体，搅拌1min，制成待偶联抗体溶液。将（1）中的活化胶乳颗粒快速倒入待偶联抗体溶液中，搅拌2.5h。12000rpm离心收集沉淀，120mL封闭液重悬后搅拌2.5h即得单试剂降钙素原（PCT）胶乳增强免疫比浊试剂。封闭液的组分为10mM乙二胺四乙酸二钠、10g/L精氨酸、3g/L牛血清白蛋白、5g/L聚乙烯磺酸钠、1g/L十二烷基聚乙二醇醚以及1g/L Proclin300，pH=6.5，聚乙烯磺酸钠与十二烷基聚乙二醇醚的比例为5：1。
[0035] 制备方法2：制备活化胶乳颗粒：取粒径309nm、浓度为10mg/mL的羧基化聚苯乙烯微球0.18mL，加入25mM pH6.5的MES 3.6mL,搅拌10min，加入EDC活化剂粉末7.04mg，室温搅拌2.5h后12000rpm离心收集沉淀，25mM pH6.5的MES 1.8mL 重悬沉淀。
[0036] 制备致敏胶乳颗粒：1.8mL 25mM pH6.5的MES中放入0.18mL浓度为4.0mg/mL的PCT多克隆抗体，搅拌1min，制成待偶联抗体溶液。将（1）中的活化胶乳颗粒快速倒入待偶联抗体溶液中，搅拌2.5h。12000rpm离心收集沉淀，120mL封闭液重悬后搅拌2.5h即得单试剂降钙素原（PCT）胶乳增强免疫比浊试剂。封闭液的组分为10mM乙二胺四乙酸二钠、10g/L精氨酸、3g/L牛血清白蛋白、5g/L Triton X-100以及1g/L Proclin300，pH=6.5。
[0037] 2）校准品的制备将市售的PCT抗原用校准品稀释液配制成一系列校准品，浓度分别为0ng/mL，0.5ng/mL，2ng/mL，10ng/mL，40ng/mL，80ng/mL。
[0038] 3）质控品的制备将高浓度的PCT样品（50ng/mL）用校准品稀释液分别稀释两倍和二十倍成25ng/mL和
2.5ng/mL，分别作为高值质控品和低值质控品。
2.5ng/mL，分别作为高值质控品和低值质控品。
[0039] 4）在POCT设备上建立定标曲线。
[0040] 将6个PCT校准品，浓度从0到80ng/mL，分别与配制的PCT胶乳单试剂在反应杯中反应，用POCT设备（本例中使用劳拉电子半自动特定蛋白分析仪EZ-400）进行检测，记录反应度。检测波长为650nm，检测散射光强度，采用两点速率法，反应时间120s，计算两点反应度差值。根据浓度和反应度差值可以建立定标曲线。图1是实施例1中按制备方法1和2得到的胶乳单试剂建立的定标曲线。
[0041] 实施例2试剂的分析灵敏度（空白限）
使用实施例1中的试剂， 选用零值校准品作为空白样本测试，在POCT设备上测试浓度。
重复测试20次，根据实施例1中建立的标准曲线计算20次测试结果的平均值（X）和标准差（SD）， 计算X+2SD作为试剂的分析灵敏度。测试结果如表1所示，显示制备方法1的分析灵敏度为0.17ng/mL，制备方法2的分析灵敏度为0.31ng/mL，说明表面活性剂的组合优化后，能明显的提升试剂检测的灵敏度。降钙素原（PCT）的检测临床参考值在0.5ng/mL左右，本发明中制备方法1中制备的PCT胶乳增强免疫比浊单试剂的分析灵敏度比参考值要小3倍，完全符合使用的需要。
使用实施例1中的试剂， 选用零值校准品作为空白样本测试，在POCT设备上测试浓度。
重复测试20次，根据实施例1中建立的标准曲线计算20次测试结果的平均值（X）和标准差（SD）， 计算X+2SD作为试剂的分析灵敏度。测试结果如表1所示，显示制备方法1的分析灵敏度为0.17ng/mL，制备方法2的分析灵敏度为0.31ng/mL，说明表面活性剂的组合优化后，能明显的提升试剂检测的灵敏度。降钙素原（PCT）的检测临床参考值在0.5ng/mL左右，本发明中制备方法1中制备的PCT胶乳增强免疫比浊单试剂的分析灵敏度比参考值要小3倍，完全符合使用的需要。
[0042] 表1. 实施例1的试剂分析灵敏度测试结果 实施例3
试剂的重复性
用实施例1中制备的单试剂测试PCT浓度为0.3ng/mL左右的正常值水平的控制物质和PCT浓度为7ng/mL左右的异常值水平的控制物质，各重复测试10次，计算测量值的平均值（X）和标准差（SD）。按式（1）计算变异系数（CV）。测试结果见表2。根据测量结果，计算出变异系数CV= 7.11%和4.95%， 符合试剂CV<10%的技术要求。
试剂的重复性
用实施例1中制备的单试剂测试PCT浓度为0.3ng/mL左右的正常值水平的控制物质和PCT浓度为7ng/mL左右的异常值水平的控制物质，各重复测试10次，计算测量值的平均值（X）和标准差（SD）。按式（1）计算变异系数（CV）。测试结果见表2。根据测量结果，计算出变异系数CV= 7.11%和4.95%， 符合试剂CV<10%的技术要求。
[0043] CV =（SD/X）×100%…………………………(1)式中：
CV ——变异系数；
SD ——标准差；
X ——测量值的平均值。
CV ——变异系数；
SD ——标准差；
X ——测量值的平均值。
[0044] 表2. 实施例1的重复性测量结果实施例4
与九强试剂的相关性分析
在本实施例中，我们收集了120个临床血清样本，采用实施例1制备方法1中的单试剂和设备进行检测， 检测结果与九强的试剂检测结果进行了相关性分析。分析结果如图2所示。
相关性直线拟合的结果显示拟合方程为y=1.0047x+0.2194，相关系数R=0.9817。这个结果表明本发明中的单试剂和九强的试剂相关性很好，准确性非常一致。
与九强试剂的相关性分析
在本实施例中，我们收集了120个临床血清样本，采用实施例1制备方法1中的单试剂和设备进行检测， 检测结果与九强的试剂检测结果进行了相关性分析。分析结果如图2所示。
相关性直线拟合的结果显示拟合方程为y=1.0047x+0.2194，相关系数R=0.9817。这个结果表明本发明中的单试剂和九强的试剂相关性很好，准确性非常一致。
[0045] 实施例5与罗氏试剂的相关性分析
在本实施例中，我们收集了120个临床血清样本（罗氏试剂检测后，选择在本发明单试剂的线性范围0.3-80ng/ml以内），采用实施例1制备方法1中的单试剂和设备进行检测， 检测结果与罗氏检测结果进行了相关性分析。分析结果如图3所示。相关性直线拟合的结果显示拟合方程为y=1.0336x+0.0581，相关系数R=0.9808。这个结果表明本发明中的单试剂和罗氏的试剂相关性很好，准确性非常一致。
在本实施例中，我们收集了120个临床血清样本（罗氏试剂检测后，选择在本发明单试剂的线性范围0.3-80ng/ml以内），采用实施例1制备方法1中的单试剂和设备进行检测， 检测结果与罗氏检测结果进行了相关性分析。分析结果如图3所示。相关性直线拟合的结果显示拟合方程为y=1.0336x+0.0581，相关系数R=0.9808。这个结果表明本发明中的单试剂和罗氏的试剂相关性很好，准确性非常一致。
[0046] 实施例6与市场上其他试剂的性能参数对比
本发明单试剂与市场上其他PCT试剂盒性能参数对比情况如表3所列。从表中可以看出，本发明的单试剂主要在检测样本类型、需要的试剂数量和种类、试剂的灵敏度和试剂的检测速度等方面明显优于市场上的对比试剂。
本发明单试剂与市场上其他PCT试剂盒性能参数对比情况如表3所列。从表中可以看出，本发明的单试剂主要在检测样本类型、需要的试剂数量和种类、试剂的灵敏度和试剂的检测速度等方面明显优于市场上的对比试剂。
[0047] 表3. PCT试剂性能参数对比生产厂家 实施例1 国产上市试剂
测试方法 散射比浊法 透射比浊法
样本类型 新鲜血清、血浆和全血 新鲜血清和血浆
试剂类型 液体，聚苯乙烯颗粒 液体，聚苯乙烯颗粒
试剂数量 1 2
试剂种类 单试剂胶乳 胶乳和辅助试剂
线性范围 0.17-80ng/mL 0.3-60ng/mL
检测耗时 2-3min 约10min
精密度 ≤10% ≤10%
准确度 ≤15% 未标明
批间差 ≤10% ≤10%
是否需要配备稀释液 否 是
有效期 12个月 12个月
测试方法 散射比浊法 透射比浊法
样本类型 新鲜血清、血浆和全血 新鲜血清和血浆
试剂类型 液体，聚苯乙烯颗粒 液体，聚苯乙烯颗粒
试剂数量 1 2
试剂种类 单试剂胶乳 胶乳和辅助试剂
线性范围 0.17-80ng/mL 0.3-60ng/mL
检测耗时 2-3min 约10min
精密度 ≤10% ≤10%
准确度 ≤15% 未标明
批间差 ≤10% ≤10%
是否需要配备稀释液 否 是
有效期 12个月 12个月
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