羰基还原酶CLEAs催化合成阿扎那韦中间体的方法
阅读：2发布：2020-11-15
专利汇可以提供羰基还原酶CLEAs催化合成阿扎那韦中间体的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及医药领域，尤其涉及一种羰基还原酶CLEAs催化合成阿扎那韦中间体的方法。该方法以(S)‑叔丁基(4‑氯‑3‑羰基‑1‑苯丁基‑2‑基) 氨 基 甲酸 酯为底物，以羰基还原酶NaSDR交联聚集体为催化剂，在共底物、助 溶剂 和缓冲液存在的体系中催化合成叔丁基((2S,3R)‑4‑氯‑3‑羟基‑1‑苯丁基‑2‑基)氨基甲酸酯。本发明公开的方法中的反应体系更加简单，无需额外添加昂贵的辅酶，也不需要 葡萄糖 参与辅酶循环。此外反应 温度 更接近室温；羰基还原酶NaSDR交联聚集体作为 生物 催化剂，温度 稳定性 与pH稳定性更好，可以重复使用>6批次，使得本发明更加节能环保，进一步降低成本。，下面是羰基还原酶CLEAs催化合成阿扎那韦中间体的方法专利的具体信息内容。
1.一种催化合成阿扎那韦中间体的方法，其特征在于，以(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯为底物，以羰基还原酶NaSDR交联聚集体为催化剂，在共底物、助溶剂和缓冲液存在的体系中催化合成叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生成所述羰基还原酶NaSDR交联聚集体的方法包括以下步骤：
S1：得到羰基还原酶NaSDR的粗酶液；
S2：使用沉淀剂沉淀羰基还原酶NaSDR的粗酶液；
S3：同时加入交联剂和添加剂进行交联反应得到羰基还原酶NaSDR交联聚集体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述沉淀剂为叔丁醇，所述交联剂为戊二醇。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在S3中，交联时间为1h-3h，交联温度为0-4℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共底物为异丙醇，所述共底物投量为底物质量的四分之一至三分之一，助溶剂为甲苯，缓冲液为三乙醇胺缓冲液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，催化合成反应的温度为30-35℃，底物添加量为：50-80g/L的反应体系总体积，反应pH值为8.5-9.5，反应的时间为10-15个小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应结束后对叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯产物进行纯化和精制处理。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述纯化步骤包括：首先将反应液温度提升至40-50℃后加入硅藻土，缓慢搅拌后将反应液室温静置，冷却至室温后，在4℃的条件下冷却至产物充分析出；接着进行抽滤以获得吸附了叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的硅藻土；
所述精制步骤包括：
(1)使用乙酸乙酯浸泡吸附了叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的硅藻土，并干燥处理；
(2)得到产物的粗提物；
(3)用正庚烷溶解产物的粗提物，正庚烷用量为8-20ml/g粗产物，待产物的粗提物完全溶解后，加入活性炭，水浴，并搅拌；
(4)滤去活性炭，在冰水浴中使产物重结晶，滤去结晶余液后洗涤晶体；
(5)滤干后减压干燥过夜即得到产物叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯晶体。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的方法制备得到的阿扎那韦中间体叔丁基((2S,
3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。
10.根据权利要求1-8中所述的方法或者权利要求9所述的叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯在制备治疗艾滋病药物中的应用。
羰基还原酶CLEAs催化合成阿扎那韦中间体的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及医药领域，尤其涉及一种羰基还原酶CLEAs催化合成阿扎那韦中间体的方法。
背景技术
[0002] 硫酸阿扎那韦(CAS：198904-31-3)是目前世界上主要的抗艾滋病药物，由美国百时美施贵宝公司研制开发，2003年6月首次在美国上市，主要与其他抗逆转录病毒药物联用治疗HIV病毒感染。由于它具有每日仅服用1次，比其他抗HIV病毒感染药物吸收迅速、不良反应少等优势，而且与其它蛋白酶抑制剂相比，阿扎那韦在服药期间不干扰正常的饮食。2003年FDA批准上市后，2009年该药全球销售额为52亿美元，排名第70位。随着全球范围内病毒疫情的频繁爆发以及艾滋病防控工作的深入，人们对抗病毒药物的需求不断加大。可以预见的是，该类药物的销售额和排名还会进一步上升。
[0003] 其合成路线中关键中间体(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇(b)的手性中心有两个，其中之一来自天然苯丙氨酸，而另一个手性中心的合成一直较为困难。针对这一困难，酶法合成该关键中间体表现出显著优势。
[0004] 然而现有的生物合成阿扎那韦中间体的方法中，存在反应条件要求高、羰基还原酶不能重复利用、反应效率低等问题。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种稳定性好，重复利用次数多，产物累积浓度高的无载体固定化羰基还原酶交联酶聚集体(CLEAs)，并提供应用该交联酶聚集体制备阿扎那韦中间体的方法。
[0006] 具体的，本发明的技术方案如下：
[0007] 本发明一方面提供了一种催化合成阿扎那韦中间体的方法，以(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯为底物，以羰基还原酶NaSDR交联聚集体为催化剂，在共底物、助溶剂和缓冲液存在的体系中催化合成叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-
2-基)氨基甲酸酯。
2-基)氨基甲酸酯。
[0008] 优选的，生成所述羰基还原酶NaSDR交联聚集体的方法包括以下步骤：
[0009] S1：得到羰基还原酶NaSDR的粗酶液；
[0010] S2：使用沉淀剂沉淀羰基还原酶NaSDR的粗酶液；
[0011] S3：同时加入交联剂和添加剂进行交联反应得到羰基还原酶NaSDR交联聚集体。
[0012] 应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S1之前、步骤S1和S2之间、步骤S2和S3之间、步骤S3之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。
[0013] 更优选的，所述沉淀剂为叔丁醇，所述交联剂为戊二醇。
[0014] 应当理解，发明并不限于叔丁醇和戊二醇，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适的沉淀剂和交联剂来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。
[0015] 在本发明的一些优选实施例中，叔丁醇的体积的分数为60-65％，戊二醇的浓度为0.01-0.04％。
[0016] 更优选的，在S3中，交联时间为1h-3h，交联温度为0-4℃。
[0017] 最佳的，羰基还原酶NaSDR在用叔丁醇体积分数为60％为沉淀剂时酶活回收率最高。最适戊二醛浓度为0.025％，最适交联时间为2h，最优添加剂选择为吐温80，其最适体积比为0.083％，此时活力回收率达88％。
[0019] 应当理解，发明并不限于异丙醇、甲苯和三乙醇胺缓冲液，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适的共底物、助溶剂和缓冲液来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。
[0020] 更优选的，所述甲苯的体积分数为40-50％，缓冲液为0.1M的三乙醇胺缓冲液。
[0021] 优选的，催化合成反应的最适温度为30-35℃，底物添加量为：50-80g/L的反应体系总体积，反应pH值为8.5-9.5，反应的时间为10-15个小时。
[0022] 优选的，反应结束后对叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯产物进行纯化和精制处理。
[0023] 更优选的，所述纯化步骤包括：首先将反应液温度提升至40-50℃后加入硅藻土，缓慢搅拌后将反应液室温静置，冷却至室温后，在4℃的条件下冷却至产物充分析出；接着进行抽滤以获得吸附了叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的硅藻土；
[0024] 所述精制步骤包括：
[0025] (1)使用乙酸乙酯浸泡吸附了叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的硅藻土，并干燥处理；
[0026] (2)得到产物的粗提物；
[0028] (4)滤去活性炭，在冰水浴中使产物重结晶，滤去结晶余液后洗涤晶体；
[0029] (5)滤干后减压干燥过夜即得到产物叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯晶体。
[0030] 在本发明一具体实施例中，所述纯化步骤包括：首先将反应液温度提升至40-50℃后加入硅藻土，缓慢搅拌后将反应液室温静置，冷却至室温后，放入4℃冰箱中冷却2小时至产物充分析出；接着进行抽滤以获得吸附了叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的硅藻土。
[0031] 在本发明一具体实施例中，所述精制步骤包括：
[0032] 使用3-5倍质量的乙酸乙酯浸泡硅藻土，并加入一定量的无水硫酸钠进行干燥，缓慢室温搅拌1小时后，用减压过滤滤去滤饼，将滤液中的乙酸乙酯用旋转蒸发仪蒸干得到固体即为产物的粗提物。在65℃水浴中，用正庚烷溶解产物的粗提物，正庚烷用量为10ml/g粗产物。待产物的粗提物完全溶解后，加入正庚烷用量1％的活性炭，在65℃水浴中搅拌5分钟。快速趁热滤去活性炭，在冰水浴中使产物重结晶。滤去结晶余液，用预冷的正庚烷与去离子水洗涤晶体一次，滤干产物晶体。减压干燥过夜即得到产物叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯晶体，纯度为99.5％。
[0033] 本发明第二个方面公开了上述的方法制备得到的阿扎那韦中间体叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。
[0034] 本发明第三个方面公开了上述的方法或者上述的叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯在制备治疗艾滋病药物中的应用。
[0035] 本发明中使用的羰基还原酶CLEAs对多个手性中间体均具备良好的立体选择性，如表1所示。
[0036] 表1不同手性中间体的转化率
[0037]
[0038]
[0039] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
[0040] 本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
[0041] 相较于已公开的制备叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的方法，本发明公开的方法中的反应体系更加简单，无需额外添加昂贵的辅酶，也不需要葡萄糖参与辅酶循环。此外反应温度更接近室温；羰基还原酶NaSDR交联聚集体作为生物催化剂，温度稳定性与pH稳定性更好，可以重复使用>6批次，使得本发明更加节能环保，进一步降低成本。此外，本发明还公开了对叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯产物进行纯化和精制处理的步骤，该纯化和精制处理步骤简单，成本低，得到的产物叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯纯度高，能够满足工业需求。附图说明
[0042] 图1为本发明实施例中不同的戊二醛体积分数对酶活和酶活回收率影响的示意图；
[0043] 图2为本发明实施例中不同交联时间对酶活和酶活回收率影响的示意图；
[0044] 图3为本发明实施例中不同pH值对酶活回收率影响的示意图；
[0045] 图4为本发明实施例中不同温度对酶活回收率影响的示意图；
[0046] 图5为本发明实施例中不同温度对8％投料量的转化率影响的示意图。
具体实施方式
[0047] 下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
[0049] 实施例1
[0050] 本实施例公开了一种催化合成阿扎那韦中间体的方法，以(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯为底物，以羰基还原酶NaSDR交联聚集体为催化剂，在共底物、助溶剂和缓冲液存在的体系中催化合成叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。
[0051] 其中，生成所述羰基还原酶NaSDR交联聚集体的方法包括以下步骤：
[0052] S1：得到羰基还原酶NaSDR的粗酶液；
[0053] S2：使用沉淀剂沉淀羰基还原酶NaSDR的粗酶液；
[0054] S3：同时加入交联剂和添加剂进行交联反应得到羰基还原酶NaSDR交联聚集体。
[0055] 所述沉淀剂为叔丁醇，所述交联剂为戊二醇。
[0056] 在S3中，交联时间为1h-3h，交联温度为0-4℃。
[0057] 所述共底物为异丙醇，所述共底物投量为底物质量的四分之一至三分之一，助溶剂为甲苯，缓冲液为三乙醇胺缓冲液。
[0058] 催化合成反应的温度为30-35℃，底物添加量为：50-80g/L的反应体系总体积，反应pH值为8.5-9.5，反应的时间为10-15个小时。
[0059] 反应结束后对叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯产物进行纯化和精制。
[0060] 所述纯化步骤包括：首先将反应液温度提升至40-50℃后加入硅藻土，缓慢搅拌后将反应液室温静置，冷却至室温后，放入4℃冰箱中冷却2小时至产物充分析出；接着进行抽滤以获得吸附了叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的硅藻土。所述精制步骤包括：使用3-5倍质量的乙酸乙酯浸泡硅藻土，并加入一定量的无水硫酸钠进行干燥，缓慢室温搅拌1小时后，用减压过滤滤去滤饼，将滤液中的乙酸乙酯用旋转蒸发仪蒸干得到固体即为产物的粗提物。在65℃水浴中，用正庚烷溶解产物的粗提物，正庚烷用量为10ml/g粗产物。待产物的粗提物完全溶解后，加入正庚烷用量1％的活性炭，在65℃水浴中搅拌5分钟。快速趁热滤去活性炭，在冰水浴中使产物重结晶。滤去结晶余液，用预冷的正庚烷与去离子水洗涤晶体一次，滤干产物晶体。减压干燥过夜即得到产物叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯晶体，纯度为99.5％。
[0061] 实施例2
[0062] 本实施例公开了一种制备羰基还原酶NaSDR粗酶液的方法，包括以下步骤：
[0063] 一、活化E.coli-NaSDR菌
[0064] 在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB固体平板上用分区划线法或稀释法涂布菌液。经37℃、20小时培养，得到活化后的E.coli-NaSDR的单菌落。
[0067] (2)将5ml一级种子液接种至发酵培养基中(接种量2.5％)，在37℃，220rpm的条件下培养2-3小时。待发酵培养基OD600达到0.9-1.2，加入400μL IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，浓度为100mmol/L)溶液诱导表达。在25℃，220rpm条件下诱导表达8小时左右即完成表达得到发酵液，终浓度OD600约达到3.0-4.0。
[0068] 三、制备粗酶液
[0069] 离心发酵液5min，用生理盐水重悬菌体，洗涤一次后，使用pH9.0的0.1M三乙醇胺缓冲液重悬浮菌体，将400ml发酵液浓缩至30ml，在冰水浴中经600W功率的超声破碎仪处理20min即得到羰基还原酶NaSDR的粗酶液。
[0070] 酶活测定方法：
[0071] 其中酶反应体系200μL，包括：a.0.1mol/L的三乙醇胺缓冲液(pH7.0)120μL，b.10mmol/L NAD+20μL，c.异丙醇10μL，d.酶液50μL。将四种物质混合均匀后放30℃保温，从加入酶液的那一刻开始计时，在酶标仪上测定340nm处吸光度，测定1min内吸光度的变化，一个酶活单位U定义为：1分钟内产生1μmol NADH所需要的酶量。
[0072] 实施例3
[0073] 本实施例公开了制备CLEAs的方法：
[0074] 一、筛选最适沉淀条件
[0075] 发明人筛选了多种沉淀剂，包括丙酮、硫酸铵饱和溶液、叔丁醇和PEG600。4ml的沉淀体系：包括400μL的粗酶液、终体积分数分别为30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％的沉淀剂，并补充TEA-HCL缓冲溶液至4ml。冰水浴下缓慢搅拌1h后，将混合溶液在3000rpm离心2min，弃去上清后用2mL缓冲液重悬，测定沉淀的酶活力。结果显示，叔丁醇体积分数为60％时酶活回收率最高。
[0076] 二、筛选最适交联剂浓度
[0077] 本步骤研究最适戊二醛浓度，分为两大组，具体操作如下：
[0078] 一组添加吐温80，步骤如下：
[0079] 在烧杯中加入9ml TEA-HCL缓冲液和18ml叔丁醇，在冰上搅拌冷却，滴加3ml粗酶液，沉淀1小时后，分别滴加25％戊二醛20、30、45、69和90μL，即戊二醛的体积分数为0.017％、0.025％、0.038％、0.050％和0.075％，10min后加入25％吐温80 100μL在搅拌2h后取2ml，3000转离心2min，去上清，用1MLpH8.5的TEA-HCL缓冲溶液清洗三遍后，用500μL TEA-HCL缓冲溶液重悬，测定酶活。
[0080] 另一组不添加吐温80，步骤如下：
[0081] 在烧杯中加入9ml TEA-HCL缓冲液和18ml叔丁醇，在冰上搅拌冷却，滴加3ml粗酶液，沉淀1小时后，分别滴加25％戊二醛20、30、45、69和90μL，即戊二醛的体积分数为0.017％、0.025％、0.038％、0.050％和0.075％，在搅拌2h后取2ml，3000转离心2min，去上清，用1ML pH8.5的TEA-HCL缓冲溶液清洗三遍后，用500μL TEA-HCL缓冲溶液重悬，测定酶活。
[0082] 结果如图1所示，添加0.025％戊二醛同时添加有吐温80的条件下，酶活和酶活回收率最高。
[0083] 三、筛选最适交联时间
[0084] 本步骤研究最适交联时间，分为两大组，具体操作如下：
[0085] 一组添加吐温80，步骤如下：
[0086] 在烧杯中加入9ml TEA-HCL缓冲液和18ml叔丁醇，在冰上搅拌冷却，滴加3ml粗酶液，沉淀1小时后，滴加25％戊二醛30μL，即戊二醛的体积分数为0.025％，10min后加入25％吐温80 100μL，分别在搅拌1h、2h、3h、4h、5h和7h时取2ml，3000转离心2min，去上清，用1mL pH8.5的TEA-HCL缓冲溶液清洗三遍后，用500μL TEA-HCL缓冲溶液重悬，测定酶活。
[0087] 一组不添加吐温80，步骤如下：
[0088] 在烧杯中加入9ml TEA-HCL缓冲液和18ml叔丁醇，在冰上搅拌冷却，滴加3ml粗酶液，沉淀1小时后，滴加25％戊二醛30μL，即戊二醛的体积分数为0.025％，分别在搅拌1h、2h、3h、4h、5h和7h时取2ml，3000转离心2min，去上清，用1mL pH8.5的TEA-HCL缓冲溶液清洗三遍后，用500μL TEA-HCL缓冲溶液重悬，测定酶活。
[0089] 结果如图2所示，交联时间为2h同时添加有吐温80的条件下，酶活和酶活回收率最高。
[0090] 筛选最适交联pH
[0091] 本步骤研究最适交联pH，具体操作如下：
[0092] 在烧杯中加入pH值为6、7、8、9、10、11和13的TEA-HCL缓冲液和18ml叔丁醇，在冰上搅拌冷却，滴加3ml粗酶液，沉淀1小时后，滴加25％戊二醛30μL，10min后加入25％吐温80 100μL，1h后取2ml，3000转离心2min,去上清，用对应pH值为6、7、8、9、10、11和13的TEA-HCL缓冲溶液清洗三遍后用500μL TEA-HCL缓冲溶液重悬后测定酶活。
[0093] 比较粗酶液与CLEAs最适pH的差异：400μL粗酶液用pH值为6、7、8、9、10、11和13的缓冲液稀释，用少量盐酸，氢氧化钠调到pH值为6、7、8、9、10、11和13后测酶活，研究粗酶液的pH稳定性。
[0094] 结果如图3所示，pH值为9.0时，CLEAs和粗酶液的酶活均最高，为100％。
[0095] 实施例4
[0096] 本实施例研究CLEAs在不同温度下的稳定性，步骤如下：
[0097] 烧杯中加入9ml TEA缓冲液和18ml叔丁醇，在冰上搅拌冷却，滴加3ml粗酶液，沉淀1小时后，滴加25％戊二醛30μL,10min后加入体积分数25％的吐温80 100μL,交联2h后取
2ml，3000转离心2min,去上清，用pH8.5的TEA缓冲溶液清洗三遍后用500μL TEA缓冲溶液重悬后，分别放在温度为45、50、55、60、65、70和75℃下保温2h后测定酶活。
2ml，3000转离心2min,去上清，用pH8.5的TEA缓冲溶液清洗三遍后用500μL TEA缓冲溶液重悬后，分别放在温度为45、50、55、60、65、70和75℃下保温2h后测定酶活。
[0098] 比较粗酶与CLEAs的温度稳定性：400μL粗酶液用TEA缓冲液稀释到1mL后，也放在45、50、55、60、65、70和75℃下保温2h后测定酶活。
[0099] 结果如图4所示，CLEAs和粗酶液均在55摄氏度时稳定性最好。
[0100] 实施例5
[0101] 本实施例研究CLEAs催化氯酮还原的最适温度，具体步骤如下：
[0102] 称量0.32g底物氯酮，加入1.7ml甲苯，和1ml异丙醇搅拌使其溶解，加入300ul 10mmol/L NADH溶液，分别加入混匀的1mL CLEAs，分别在20、30、35、40和45℃下反应3小时。
取200ul反应液检测，放在89℃水浴放30min使蛋白失活并蒸发大部分甲苯，加入450μL乙酸乙酯萃取后，HPLC分析考察转化率。结果显示，CLEAs最适反应温度为35摄氏度(图5)。
取200ul反应液检测，放在89℃水浴放30min使蛋白失活并蒸发大部分甲苯，加入450μL乙酸乙酯萃取后，HPLC分析考察转化率。结果显示，CLEAs最适反应温度为35摄氏度(图5)。
[0103] 实施例6
[0104] 本实施例研究CLEAs的可重复利用次数，具体步骤如下：
[0105] 称量0.32g底物氯酮，加入1.7ml甲苯，和1ml异丙醇搅拌使其溶解，加入300ul 10mmol/L NAD溶液，加入1mL CLEAs，在35℃下，230rpm转速下反应3小时，4000转离心取出上清，检测转化率。沉淀中的CLEAs洗涤后继续与0.32g底物氯酮反应，加入1.7ml甲苯、1ml异丙醇、300ul 10mmol/L的NAD溶液，在35℃，230转的摇床反应3小时，重复利用八次并考察转化效果。结果显示，经过8次复用，第八次转化率仍然超过55％。
[0106] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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