技术领域
[0001] 本
发明涉及类黄酮色素的提取方法，具体地说，涉及月季花瓣中类黄酮色素的高效快速提取及测定方法。
背景技术
[0002] 月季属于蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)，是世界四大切花之一，同时还是一种重要的中药材。月季花瓣拥有除蓝色以外的所有色谱，类黄酮色素是赋予其
颜色的主要物质。在
植物体内，黄酮化合物具有抗逆、抗病虫害、抗
氧化等重要的生理功能。在食品和医药领域，黄酮化合物不仅是一种重要的天然色素，同时还具有抗衰老、抗
炎症、抗
肿瘤等潜能。因此，研究类黄酮色素的种类和含量，对有效评估和利用月季种质资源具有重要意义。
[0003] 根据
申请人所做的资料检索，现有的月季花瓣类黄酮提取测定方法存在操作步骤繁琐、样品浪费多、耗时较长等缺点。Mikanagi等 (2000)取新鲜月季花瓣1.0kg，用10L甲醇-
醋酸-
水(9:10:1)提取，然后经过一系列浓缩、纯化等步骤后进行HPLC分析，鉴定出了11中花青苷，但未对
黄酮醇进行分离鉴定。Kumar等(2009)、Sarangowa 等(2014)利用甲醇或甲醇-水(1:1)提取突厥蔷薇、复伞房蔷薇和法国蔷薇花瓣中的黄酮醇，但由于浸提剂pH太高，提取不到样品中的花青苷。张玲(2015)取250mg玫瑰花瓣干样，用1％的醋酸甲醇溶液低温避光静置过夜提取三次，最后在50ml容量瓶中定容，整个提取过程长达十几个小时。因此急需建立一种月季花瓣中类黄酮色素的高效提取和测定方法，使其具备操作简单、节约时间、提取效率高以及可同时测定花青苷和黄酮醇的特点。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供月季花瓣中类黄酮色素的高效快速提取及测定方法。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明提供的月季花瓣中类黄酮色素的高效快速提取及测定方法，包括以下步骤：
[0006] S1、称取类黄酮标准品，用浸提剂溶解，制备类黄酮标准品溶液；
[0007] S2、向月季花瓣样品中加入浸提剂，在均质
破碎仪上
研磨，利用
超声波辅助提取，制备类黄酮待测样品溶液；
[0008] S3、高效液相色谱分析(HPLC)；
[0009] S4、液质联用分析(LC-MS)，获得月季花瓣中类黄酮的质谱信息；
[0010] S5、根据保留时间、紫外可见吸收
光谱图、质谱图、类黄酮标准品和和文献资料对月季花瓣样品中类黄酮的结构进行鉴定；
[0011] S6、根据类黄酮标准品的线性回归方程，对月季花瓣样品中的类黄酮进行定量分析。
[0012] 本发明中使用的浸提剂为甲醇、水、
甲酸和三氟乙酸按70：27： 2：1体积比的配制的
混合液。
[0013] 本发明中使用的均质破碎仪为MP FastPrep-24，运行速度5m/s，研磨时间30s。
[0014] 本发明中利用
超声波清洗器(KQ-250DA)进行超声辅助提取，功率100％，提取时间30min，期间通过加入
冰块降温使提取
温度不超过25℃。
[0015] 本发明中采用Waters 2695的HPLC，Waters 996PDA检测器，进行HPLC检测分析。所用色谱柱为XBridge BEH C18，规格150mm× 4.6mm，2.5μm(Waters，Milford，MA)，流动相为乙腈和0.5％甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.5ml/min，进样量10μl，柱温箱温度25℃， 200-600nm全
波长扫描，花青苷检测波长520nm；黄酮醇检测波长350 nm。
[0016] 优选地，梯度洗脱条件为：0min，5％乙腈；5min，10％乙腈； 30min，19％乙腈；50min，40％乙腈；50.01-60min，5％乙腈。
[0017] 本发明中采用HPLC-microTOF-Q MS液质联用仪获得质谱信息。全扫描电喷雾电离(ESI)，正/负离子模式，扫描范围100-1000m/z，毛细管
电压3500V，毛细管出口电压500V，干燥温度350℃，干燥和喷
雾气体为氮气，流速为8.0L/min，正、负离子模式的碰撞电压分别为8.0eV和10.0eV。
[0018] 对正/负离子模式下的扫描结果基于保留时间进行离子提取，得到每个峰对应的质谱信息。例如36.02min，负离子模式可检测到 447.0851和285.0328两个离子，正离子模式可检测到449.1206和 287.0553两个离子。
[0019] 本发明中制备类黄酮标准品溶液的具体方法为：称取2mg类黄酮标准品，加入4ml浸提剂(甲醇-水-甲酸-三氟乙酸，体积比70：27： 2：1)配制成浓度500μg/ml的母液，然后依次稀释2倍，得到6个浓度梯度的标准品溶液，用以绘制标准曲线。
[0020] 本发明中使用的类黄酮标准品包括但不限于矢车菊-3,5-双氧
葡萄糖苷、天竺葵-3,5-双氧葡萄糖苷、
芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素和山奈酚。
[0021] 本发明中制备类黄酮待测样品溶液的具体方法为：称量0.15-0.25 g月季花瓣样品，置于液氮速冻后的2ml研磨管中，迅速加入0.9ml 浸提剂(甲醇-水-甲酸-三氟乙酸，体积比70：27：2：1)，进行自动研磨；然后再加入0.9ml浸提剂，进行超声波辅助提取；然后将提取液进行离心(15000g离心10min)；最后将上清液用0.22μm微孔滤
膜过滤，装于2ml安捷伦上样小瓶中，用于HPLC检测分析。
[0022] 对类黄酮待测样品进行定性定量分析的方法如下：
[0023] (1)定性分析
[0024] 根据高效液相色谱图中每个峰的保留时间、紫外可见吸收光谱图信息、质谱信息，同时参考8种类黄酮标准品和文献资料对类黄酮化合物的结构进行鉴定。
[0025] (2)定量分析
[0026] 记录8种类黄酮色素标准品每个浓度对应的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制8种标准品的标准曲线，得到相应的线性回归方程。然后将鉴定出的类黄酮色素的峰面积代入对应标准品的回归方程中，计算得到待测液中对应物质的含量，如果鉴定出的类黄酮色素与8种标准品均不相同，则利用与其结构最相近的标准品的回归方程来计算含量。
[0027] 利用本发明方法在月季花瓣中共鉴定出19种类黄酮(表1)，其中包括4种花青苷，15种黄酮醇。
[0028] 表1
[0029]
[0030] 注：[M-H]-和[M+H]+分别代表母离子去掉1个氢离子和加上1个氢离子的质核比。
[0031] 本发明具有以下优点：
[0032] (一)本发明只需0.15-0.25g新鲜样品，采用均质破碎仪自动研磨样品，利用移液器准确加入1.8ml浸提剂，省去定容等繁琐操作，利用超声波辅助提取，一个提取流程只需30-40min，实现了月季花瓣中类黄酮色素的高效快速提取。
[0033] (二)本发明利用高效液相色谱分析和液质联用分析，得到每种物质的保留时间、紫外可见吸收光信息、质谱信息，然后结合标准品和参考文献等进行联合分析，对类黄酮色素的结构进行推测鉴定，本发明在月季花瓣中分离鉴定出4种花青苷和15种黄酮醇，实现了月季花瓣中花青苷和黄酮醇的同时分离测定。
附图说明
[0034] 图1为本发明
实施例1中六种洗脱方案效果比较图。
[0035] 图2为本发明实施例1中不同浸提剂对花青苷浸提的影响，其中a、 b、c代表方差分析邓肯新复极差检验在P＝0.05显著性水平下的差异显著。
[0036] 图3为本发明实施例1中不同浸提剂对黄酮醇浸提的影响，其中a、 b、c代表方差分析邓肯新复极差检验在P＝0.05显著性水平下的差异显著。
[0037] 图4为本发明实施例1中不同浸提方式对花青苷浸提的影响，其中 *和**分别代表方差分析F检验在P＝0.05和P＝0.01显著性水平下差异显著。
[0038] 图5为本发明实施例1中不同浸提方式对黄酮醇浸提的影响。
[0039] 图6为本发明实施例2中混合类黄酮标准溶液的高效液相色谱图。
[0040] 图7为本发明实施例2中类黄酮标准品的标准曲线。
[0041] 图8为本发明实施例3中黄色月季‘太阳城’花瓣类黄酮提取液高效液相色谱图。
[0042] 图9为本发明实施例4中橙色月季3-3花瓣类黄酮提取液高效液相色谱图。
具体实施方式
[0043] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0044] 本发明中所用
试剂：
有机溶剂均为色谱纯级别，甲醇、甲酸购自美国Fisher公司，三氟乙酸购自美国Sigma-Aldrich公司，超纯水由 PALL Cascada LS实验室超纯水系统制备得到；8种类黄酮标准品矢车菊-3,5-双氧葡萄糖苷、天竺葵-3,5-双氧葡萄糖苷、芦丁、槲皮素-3-O- 葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素和山奈酚均购自美国Sigma-Aldrich公司。
[0045] 实施例1类黄酮提取测定条件优化
[0046] 1.高效液相色谱洗脱条件优化
[0047] (1)制备待测液
[0048] 用
电子分析天枰准确称量红色现代月季品种‘口红’盛花期花瓣 0.1500g，置于液氮速冻后的2ml研磨管中，迅速加入0.9ml浸提剂，然后在均质破碎仪(MP FastPrep-24)上研磨30s；然后再加入0.9ml 浸提剂，置于超声波清洗器(KQ-250DA)超声辅助提取，功率100％， 30min，期间通过加入冰块降温使提取温度不超过25℃；将提取液进行离心，
15000g，10min；将上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，装于2 ml安捷伦上样小瓶中，用于HPLC检测分析。
[0049] (2)高效液相色谱分析(HPLC)
[0050] 液相色谱条件为：Waters 2695的HPLC，Waters 996PDA检测器，色谱柱为XBridge BEH C18(150mm×4.6mm,2.5μm,Waters, Milford,MA)，梯度洗脱，流速为0.5ml/min，进样量10μl，柱温箱温度25℃，200-600nm全波长扫描，花青苷检测波长520nm；黄酮醇检测波长350nm。
[0051] (3)方案设计
[0052] 共设计六种洗脱方案，具体如下：
[0053] 方案1：流动相A为0.5％甲酸水溶液，流动相B为乙腈溶液，洗脱梯度为：0min 10％B，30min 19％B，50min 40％B，50.01-60min 10％B；
[0054] 方案2：流动相A为10％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液，洗脱梯度为：0min 5％B，25-30min 40％B，35min 5％B；
[0055] 方案3：流动相同方案1，洗脱梯度为：0min 5％B，15min 10％B， 30min 19％B，50min 40％B，55-60min 5％B；
[0056] 方案4：流动相同方案1，洗脱梯度为：0min 5％B，5min 10％B， 45-50min 40％B，50.01-60min 5％B；
[0057] 方案5：流动相同方案1，洗脱梯度为：0min 5％B，5min 10％B， 50min 40％B，50.01-60min 5％B；
[0058] 方案6：流动相同方案1，洗脱梯度为：0min 5％B，5min 10％B， 30min 19％B，50min 40％B，50.01-60min 5％B；
[0059] 六种洗脱方案得到的高效液相色谱图如图1所示，洗脱方案6对花色苷和黄酮醇的分离效果都明显优于其他五种洗脱方案，因此选择洗脱方案6对月季花瓣黄酮提取液进行分离。
[0060] 2.浸提剂筛选
[0061] 以‘口红’盛花期花瓣为试材，制备待测液方法同上，高效液相色谱分析(HPLC)方法同上。设计5种浸提液，具体为：
[0062] 浸提剂1：甲醇-水-甲酸-三氟乙酸(体积比70:27:2:1)；
[0063] 浸提剂2：3％甲酸甲醇溶液(含1％BHT)；
[0064] 浸提剂3：甲醇-水-甲酸(体积比80:19:1)；
[0065] 浸提剂4：甲醇-水-甲酸(体积比70:27:3)；
[0066] 浸提剂5：含2％甲酸甲醇溶液。
[0067] 由于样品重量和浸提后体积均相同，因此可以直接用峰面积来评价不同浸提剂的浸提效果，结果如图2-图3所示。图2表明，浸提剂1 对花青苷的提取效果显著优于其他4种浸提剂。图3表明，浸提剂1对保留时间为22.71、27.07、35.99和45.8min时的黄酮醇的提取效果显著好于其他浸提剂。综合考虑，选择浸提剂1对月季花瓣中的黄酮醇进行提取。
[0068] 3.提取方式优化
[0069] 以‘口红’盛花期花瓣为试材，制备待测液方法同上，高效液相色谱分析(HPLC)方法同上。设计两种提取方案，具体为：
[0070] 方案(1)超声波辅助提取：利用超声波清洗器(KQ-250DA) 超声辅助提取，功率100％，30min，期间通过加入冰块降温使提取温度不超过25℃；
[0071] 方案(2)低温提取：将样品于4℃
冰箱内避光浸提24小时，期间每隔六小时震荡一次。
[0072] 两种提取方式结果如图4-图5所示。结果显示超声波辅助提取对花青苷和黄酮醇均显著优于低温提取，因此选择超声波辅助提取进行月季花瓣中黄酮色素的提取。
[0073] 实施例2类黄酮标准曲线绘制
[0074] 准确称取2mg类黄酮标准品，具体为矢车菊-3,5-双氧葡萄糖苷、天竺葵-3,5-双氧葡萄糖苷、芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O- 芸香糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素和山奈酚，加入4ml类黄酮浸提剂得到浓度为500μg/ml的母液，然后依次稀释2倍，得到6个浓度梯度的标准品溶液，用以绘制标准曲线。标准品溶液经高效液相色谱分析得到混合标准溶液高效液相色谱图(图6)，并且记录8种类黄酮色素标准品每个浓度对应的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制8种标准品的标准曲线，得到相应的线性回归方程(图7)。高效液相色谱分析(HPLC)方法同实施例1，采用方案6进行洗脱。
[0075] 实施例3黄色月季花瓣中类黄酮色素提取和测定
[0076] 1、制备待测溶液
[0077] 用电子分析天枰准确称量黄色现代月季品种‘太阳城’盛花期花瓣 0.15-0.25g，制备待测液方法同实施例1。
[0078] 2、分离检测
[0079] (1)高效液相色谱分析(HPLC)
[0080] 利用高效液相色谱对样品进行分离和定量分析。液相色谱条件同实施例1，采用浸提剂1，提取方式为方案(1)。得到的色谱图如图8 所示。
[0081] (2)液质联用分析(LC-MS)
[0082] 采用HPLC-microTOF-Q MS液质联用仪获得质谱信息。全扫描电喷雾电离(ESI)，正/负离子模式，扫描范围100-1000m/z，毛细管电压是3500V，毛细管出口电压是500V，干燥温度350℃，干燥和喷雾气体(N2)流速为8.0L/min，正、负离子模式的碰撞电压分别为8.0 和10.0eV。
[0083] 3、定性定量分析
[0084] (1)定性分析
[0085] 根据高效液相色谱图中每个峰的保留时间、紫外可见吸收光谱图信息、质谱信息，同时参考8种类黄酮标准品和文献资料对类黄酮化合物的结构进行鉴定。结果如表1所示。
[0086] (2)定量分析
[0087] 记录8种类黄酮色素标准品每个浓度对应的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制8种标准品的标准曲线，得到相应的线性回归方程。然后将鉴定出的类黄酮色素的峰面积代入对应标准品的回归方程中，计算得到待测液中对应物质的含量，如果鉴定出的类黄酮色素与8种标准品均不相同，则利用与其结构最相近的标准品的回归方程来计算含量，结果如表2所示，黄色月季花瓣中未检测到花青苷，检测到14种黄酮醇，相对标准偏差均小于3％，说明方法重复性好。
[0088] 实施例4橙色月季花瓣中类黄酮色素提取和测定
[0089] 以‘太阳城’与‘
云蒸霞蔚’杂交得到的橙色子代3-3为试材，用电子分析天枰准确称量0.15-0.25g花瓣，制备待测溶液、分离检测、定性定量分析方法同实施例3，所得样品溶液的色谱图见图9，花青苷和黄酮醇的含量见表2，橙色月季花瓣中共检测到4种花青苷，检测到15 种黄酮醇，相对标准偏差均小于3％，说明方法重复性好。
[0090] 表2月季花瓣中类黄酮色素含量分析
[0091]
[0092] 注：RSD代表相对标准偏差。
[0093] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明
基础上，可以对之做一些
修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0094] 参考文献
[0095] [1]张玲,2015,玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)花瓣显色机理研究,山东农业大学.[0096] [2]Sarangowa,O.,T.Kanazawa,M.Nishizawa,T.Myoda,C.Bai,and T.Yamagishi,2014,Flavonol glycosides in the petal of Rosa species as chemotaxonomic markers:PHYTOCHEMISTRY,v.107,p. 61-68.
[0097] [3]Kumar,N.,P.Bhandari,B.Singh,and S.S.Bari,2009,Antioxidant activity and ultra-performance LC-electrospray ionization-quadrupole time-of-flight mass spectrometry for phenolics-based fingerprinting of Rose species:Rosa damascena,Rosa bourboniana and Rosa brunonii:Food and chemical toxicology,v.47,p.361-367.
[0098] [4]Mikanagi,Y.,N.Saito,M.Yokoi,and F.Tatsuzawa,2000,Anthocyanins in flowers of genus Rosa, sections Cinnamomeae(＝Rosa),Chinenses,Gallicanae and some modern garden roses:Biochemical systematics and ecology,v.28,p.887-902。
