피부 각질 줄기세포 증식 및 활성화 활성을 갖는 트리펩티드 및 이의 용도{Tripeptide with activities of growth and activation of skin keratinocyte stem cell and use thereof}

본 발명은 인간 피부 각질 줄기세포 증식 효능이 있는 펩티드, 또는 이의 변이체와 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 인간 피부 각질 세포의 다양한 성장인자의 발현을 촉진제 및 피부 각질 줄기세포의 증식 촉진제로 사용할 수 있으며, 상기 증식 촉진제를 함유하는 의약 또는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체를 구성하는 가장 큰 기관으로, 우리 몸 부피의 약 18%를 차지하며, 표피(epidermis), 진피(dermis) 및 피하지방층으로 구성되어 있다. 이러한 피부는 외부 환경과 직접 접하고 있으면서 인체 유해 미생물과 같은 다양한 유해인자들과 자외선 등과 같은 외부 자극으로부터 인체를 보호하는 중요한 보호막 역할을 담당하는 동시에 전신의 대사에 필요한 생화학적 기능을 영위하는 생명유지에 필수 불가결한 기관이다.

피부는 구조적으로 크게 표피(epidermis) 및 진피(dermis)를 포함하며, 표피는 납작한 육각형 모양의 죽은 세포로 구성된 각질층(Stratum Corneum)과 살아있는 표피로 나눌 수 있다. 살아있는 표피는 기저층(Stratum Spinosum), 과립층(Stratum Granulosum), 및 투명층(stratum Iucidum)의 4 개의 층을 포함한다. 이 중에서 재생능력을 보이는 것으로 알려진 것은, 기저층에 존재하는 피부의 각질 줄기세포(Keratinocyte stem cell, KSC)이다.

피부 각질 줄기세포가 지속적으로 분열하여 크게 두 가지 종류의 세포를 생성하는데, 하나는 자기 복제(self-renewal)를 하여 만드는 똑 같은 피부 각질 줄기세포이고, 다른 하나는 전이-증폭 세포(Transit Amplifying Cells, TA cells)를 만들게 된다. 이 세포들은 수 차례의 분열을 하며, 피부 발생학적으로 중/후반부에 해당되는 피부 장벽기능에 중추역할을 하는 각질 세포 또는 각질 형성 세포(Keratinocyte cells)를 형성한다. 각질 세포는 분화(differentiation)를 진행하여, 피부 발생학적으로 마지막 단계인, 피부 표면으로 밀려 올라가게 된다. 이 과정에서 각질 세포의 분화와 각화(Keratinization)가 일어나면서 각질층을 만들게 되며, 결국에는 각질 세포는 각질층에서 떨어져 나간다.

상기 각질 줄기세포 및 전이-증폭 세포는 보통 기저층 세포들의 약 4~7% 정도로 극히 낮은 수로 분포되며, 사람이 나이가 들어가게 됨에 따라, 피부 각질 줄기세포와 전이-증폭 세포를 증식하는 능력이 저하된다. 각질세포를 만드는 능력이 저하되면, 결국에는 피부재생 능력이 감퇴되면서 피부탄력 저하등의 노화 현상이 심화된다. 그래서 피부 각질 줄기세포의 증식능력을 촉진하는 조성물의 개발이 필요하다.

본 발명의 일예는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부에 자극이 없으면서 피부 각질 줄기세포의 증식 촉진제를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 일예는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 각질 줄기세포의 다양한 성장인자의 발현 또는 생산을 촉진하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는 상기 피부 각질 줄기세포의 증식 촉진제 또는 피부 각질 줄기세포의 다양한 성장인자의 발현 또는 생산 촉진제를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이며, 상기 화장료 조성물은 피부 재생력 향상, 피부 보습력 향상, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 및 피부 노화 개선을 달성할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예는 상기 피부 각질 줄기세포의 증식 촉진제 또는 피부 각질 줄기세포의 다양한 성장인자의 발현 또는 생산 촉진제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이며, 상기 화장료 조성물은 피부 재생력 향상, 피부 보습력 향상, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 및 피부 노화 개선을 달성할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 펩티드를 유효성분으로 함유하는 피부 각질 줄기세포의 증식 촉진제, 피부 각질 줄기세포의 다양한 성장인자의 발현 또는 생산 촉진제, 상기 촉진제를 포함하는 피부 재생력 향상, 피부 보습력 향상, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 및 피부 노화 개선용 화장료 또는 약학 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명에 따른 펩티드는 페닐알라닌-히스티딘-아르기닌 (FHR)의 트리펩티드 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.

본 발명의 트리펩티드, 예를 들어, 페닐알라닌-히스티딘-아르기닌 (FHR) 또는 이의 변이체는 하나의 거울상 형태 또는 두 가지 거울상 형태의 조합인 아미노산 잔기를 함유하여 L- 또는 D-아미노산 거울상체를 포함한다. 또한, 일차 아미노산 서열이 유지되는 한 다양한 변형이 본 발명의 트리펩티드에 도입될 수 있다. 일부 변형은 펩티드의 효능을 증가시키는데 사용될 수 있는 반면, 다른 변형은 펩티드 조작을 용이하게 할 수 있다. 예를 들면, 펩티드에 도입 가능한 작용기는 히드록실, 아세틸화, 에스테르, 또는 아미드기를 포함한다. 예를 들면, 상기 작용기의 도입을 위한 반응은, 알킬 할로겐화물에 의한 히드록실기의 아세틸화; 카르복실기의 에스테르화 또는 아미드화를 포함한다. 펩티드의 카르복시-말단의 아미드화는 프로테아제 분해에 덜 민감한 펩티드를 제공할 수 있으며, 그것의 유리산 형태와 비교하여 그것의 용해도를 증가시키고, 치료 효능을 높일 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드의 변형예는, 예를 들면, 트리펩티드의 C-말단의 아미드화 및 N-말단의 아세틸화로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 그룹을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 페닐알라닌의 히드록시기가 아세틸기로 치환되거나, 아르기닌의 카르복시기가 아미드화된 형태일 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 하기 화학식 1을 갖는 화합물일 수 있다:

[화학식 1]

X-페닐알라닌-히스티딘-아르기닌-Y

상기 화학식 1에서,

X는 히드록시기 또는 아세틸기이며,

Y는 카르복시기, -NH _2, -NHR ¹ , 또는 -NR ¹ R ² 이고, R ¹ 및 R ² 는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬기일 수 있다.

본 발명의 펩타이드의 합성은 예를 들어 기기를 이용하거나 유전공학 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 기기를 이용하여 합성하는 경우, 자동 펩타이드 합성기(PeptrEX-R48, Peptron, Daejeon, Korea)에서 원하는 펩타이드를 Fmoc 고체상(Fmoc solid-phase) 방법으로 합성한다. 수지(resin)에서 합성 펩타이드를 분리한 후, 시세이도 캡셀 팩 C18 분석 RP 칼럼(Shiseideo capcell pak C18 analytical RP column)을 이용한 역상 HPLC(reverse-phase HPLC, Prominence LC-20AB, Shimadzu, Japan)에 의해 펩타이드를 순수분리 및 분석한다. 최종 펩타이드는 질량분광계(mass spectrometer, HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard, Roseville, USA)를 사용하여 동정한다. 유전공학적 기법을 이용하는 경우, 원하는 펩타이드의 해당 염기 서열을 단백질 발현 벡터(vector)에 도입한 후, BL21(λDE3)와 BL21(λDE3)pLys와 같은 단백질 분해효소(protease)가 결핍된 박테리아(bacteria)에서 IPTG를 이용하여 발현을 유도하고 순수 분리한다.

본 발명에 따른 트리펩티드 또는 이의 변이체는, 피부 각질 줄기세포의 증식을 통해, 피부 재생력 향상, 피부 보습력 향상, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 및 피부 노화 개선 등 피부 상태를 개선시킨다.

본 명세서에 정의된 용어 "피부 재생"은 전반적인 피부 노화 및 피부 표피 등에 유발된 상처 등에 대응하여 새로운 각질세포를 생성하는 능력을 포함하는 광의의 개념으로, 구체적으로, 피부 표피의 기저층에 존재하는 각질 줄기세포의 분열에 의해 생성된 전이-증폭 세포들이 더욱 증폭하고, 초기 분화하여 각질 세포가 되고, 피부 표면으로 밀려 올라가 분화(Differentiation)와 각화(Keratinazation)를 일으키면서 각질층을 이루게 되는 모든 과정을 의미한다. 그 중에서 피부 재생의 핵심 과정은 기저층에 존재하는 각질 줄기세포와 이 세포의 딸 세포인 전이-증폭 세포의 증식에 있다. 피부 외부의 물리적, 화학적 환경에 의해 일어나는 피부 손상이 일어났을 때, 이를 빠른 시간에 회복하기 위해서는 피부 기저층에 존재하며 피부 재생을 담당하고 있는 각질 줄기세포와 전이-증폭세포들의 활발한 증식이 필요하다. 보통 어릴 때는 피부 손상이 일어나더라도 흉터가 남지 않는 반면, 나이가 들어 피부 손상이 일어나게 되면 흉터가 남는 이유도 피부 재생에 필요한 각질 줄기세포와 전이-증폭 세포의 증식의 수준 정도가 나이 정도에 따라 현저하게 낮아지기 때문이다. 즉, 노화가 진행하게 되면, 이러한 세포들의 증식 정도가 낮아지게 되며, 이는 피부 재생 능력이 감퇴하는 것으로, 상처 등의 회복이 지연되거나, 피부 탄력 감소가 심화될 수 있다. 따라서, 피부 각질 줄기세포(Keratinocyte Stem Cells, KSC)의 증식을 통해 피부를 재생시키거나 피부노화를 방지할 수 있다.

나아가, 본 발명에서 용어, "피부 탄력"이란, 진피층에 존재하는 엘라스틴(elastin)으로 구성된 탄력섬유에 의해 나타나는 것으로, "피부 탄력 증진"이란 엘라스틴으로 구성된 탄력섬유와 교원섬유인 콜라겐이 충분히 존재하는 상태에서 피부 탄력이 유지되는 것을 말한다.

본 발명에 따른 본 발명에 따른 트리펩티드 또는 이의 변이체는 피부 각질 줄기세포의 세포 성장인자의 발현 또는 생산을 촉진시킬 수 있다. 상기 펩티드-1과 펩티드-2 모두에 의해 증가된 성장인자는 AR, bFGF, EGFR, FGF-4, FGF-6, FGF-7, IGFBP-2, IGFBP-4, IGFBP-6, IGF-I, IGF-ISR, M-CSF, M-CSFR, TGF-beta, VEGF, VEGFR3이며, 펩티드-1에 의해 단독으로 증가된 성장인자는 GDNF, GM-CSF, HB-EGF, IGFBP-3, IGF-II, NT-3, PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-beta3, 그리고 펩티드-2에 의해 단독으로 증가된 성장인자는 b-NGF, GCSF일 수 있다.

EGF(Epidermal Growth Factor, 상피세포성장인자)는 섬유아세포(Fibroblast) 및 각질형성세포(Keratinocyte)의 성장을 촉진하고, 콜라겐 생합성과 피부장벽의 재생을 유도한다. IGF(Insulin like Growth Factor, 인슐린유사성장인자)은 세포분열을 촉진하고 손상된 세포를 재생하는 것으로 알려져 있다. FGF(Fibroblast Growth Factor, 섬유아세포성장인자)는 매우 다양한 종류의 신호전달물질(Cytokine)의 총칭으로, 세포와 조직의 증식 및 분화에 깊이 관여하는 성장인자로 알려져 있습니다. 섬유아세포의 증식은 물론 콜라겐이나 엘라스틴 섬유 및 히알루론산과 같은 기질물질(ECM, Extracellular Material)의 합성을 증가시킨다고 알려져 있다. VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor, 혈관내피세포성장인자)는 주로 혈소판에서 유래되며, 혈관내피세포의 분열을 촉진하여 신혈관 생성에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 혈관을 보호하고 세포의 분화와 이동에 관여하며 모발성장 및 모낭강화에도 영향을 주는 것으로 알려져 있다. PDGF(Platelet-Derived Growth Factor, 혈소판유래성장인자)는 줄기세포의 복제하고 뼈의 생성과 재생에 관여하는 조골세포의 증식과 골양조직생성을 촉진하고, 내피세포 증식을 촉진하여 새로운 혈관을 생성하는데 관여하고, 섬유아세포 증식을 촉진하여 콜라겐 생성에도 관여하는 것으로 알려져 있다. TGF(Transforming Growth Factor, 형질전환성장인자)는 콜라겐의 합성에 큰 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, ECM 물질의 생성을 촉진시키고, 세포분열 및 혈관 생성을 촉진시키고, 줄기세포를 조골세포로 분화하도록 촉진하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 따른 펩티드는 모든 단백질의 구성 성분으로서, 피부에 대한 부작용이 없이 피부 재생을 활성화시키며, 단백질의 구성 성분으로서 다량 사용한다 하더라도 부작용이 없어서, 눈가와 같은 민감한 부위에도 안심하고 사용될 수 있다는 장점이 있다. 본 발명에 따른 펩티드는 분자량이 작기 때문에, 피부 침투율이 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 화장품 조성물을 국소적으로 피부에 도포하는 경우 피부상태를 효과적으로 개선할 것이다.

본 발명에 따른 일 실시예에서, 본 발명의 트리펩티드는 세포 독성을 거의 나타내지 않으면서도, 음성 및 양성대조군에 비해 인간 피부 각질 줄기세포에 대한 탁월한 세포 증식률을 나타내고 다양한 세포성장인자, 특히 섬유아세포 성장인자의 분비를 효과적으로 증가시켰다. 이와 같이, 본 발명에 따른 트리펩티드는 탁월한 피부 재생력 향상 및 피부 탄력 증가 효과를 나타내는 특징을 가지고 있어, 화장료 또는 약물로서의 유용성이 크다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 트리펩티드 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는, 피부 상태 개선용 조성물로서 구체적으로 피부 재생력 향상, 피부 보습력 향상, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 및 피부 노화 개선으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 개선 효과를 가진다. 상기 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있으나, 본 발명의 목적을 고려하면, 피부 외용제 형태로 제형화되는 것이 바람직하다. 이러한 조성물은 약학적 또는 화장료로서 사용될 수 있다.

따라서, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 트리펩티드 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는, 피부 상태 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 트리펩티드 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는, 피부 상태 개선용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 나아가, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 다이펩타이드 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는, 피부 각질 줄기세포의 촉진에 의한 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나 상기 “피부 각질 줄기세포의 증식 촉진에 의한 피부질환”은 주름(wrinkle), 기미(melisma), 주근깨(Freckle), 튼살(striae distensae), 또는 상처(wound)를 들 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 본 발명에 따른 조성물의 경우 유효 성분인 트리펩티드는 피부외용 제제 형태인 것이 바람직하다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 또는 약학적 조성물은 피부 재생 또는 피부 탄력 개선 기능을 갖는 물질을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 화장료 또는 약학적 조성물에는 상기 피부 각질 줄기세포의 증식 촉진제가 10 내지 4,000ppm 범위로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 트리펩티드 또는 이의 변이체를 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하여 개체의 피부상태를 개선하는 방법을 제공한다.

상기 대상은 피부가 좋지 않은 상태, 예를 들어 주름, 노화, 피부 저탄력, 상처, 흉터 등을 개선 또는 예방하고자 하는 인간을 포함한 포유동물, 예를 들어 개, 돼지, 말, 소 등을 의미한다.

본 발명의 상기 방법에 의하여 상술한 개체의 피부 주름, 피부 노화, 피부 저탄력, 상처, 흉터 등과 같은 피부상태 또는 이들로부터 발생하는 질환, 질병 또는 이상은 본 발명의 피부상태 개선용 조성물의 개체 내 투여에 의하여 개선, 호전, 예방 또는 치료 등의 목적을 달성할 수 있음은 상술한 내용 및 하기에 기술된 실시예 등을 통하여 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 이해될 것임은 물론이다.

본 발명에 있어서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 대상, 예를 들어, 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 피부 각질 줄기세포의 증식을 유도함으로써, 피부 재생력 향상, 피부 보습력 향상, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 및 피부 노화 개선과 같은 피부 상태 개선 효과를 나타내며, 이를 통해 화장품 또는 의약 분야에서 다양하게 활용 가능하다.

이하, 실시예 및 시험예 등을 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1]

인간 피부 각질 줄기세포 증식효과 분석

1-1: 펩티드 합성

본 실시 예에서는 다양한 세포투과 펩타이드 유도체를 합성하기 위하여, 일반적인 펩타이드 고상 합성법(Wang C. Chan, Perter D. White, "Fmoc Solid phase peptide synthesis", Oxford)에 따라서 진행하였다. 보다 구체적으로, 자동합성기(ASP48S, Peptron,Inc.)를 사용하여 Fmoc-SPPS(9-Fluorenyl methyl oxycarbonyl solid phase peptide synthesis) 방법을 이용하여 C-말단부터 하나씩 커플링(coupling)하였다. 펩타이드 유도체 합성에 사용한 모든 단량체 원료는 N-말단이 Fmoc으로 보호되고, 잔기는 트리틸(Trt), t-부틸옥시카보닐(Boc), t-부틸(t-Bu) 등으로 보호된 아미노산을 사용하였다. 커플링제(Coupling reagent)로는 HBTU(2-(1H-Benzotirazloe-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophophate / HOBt(Hydroxybenzo triazloe) / NMM(N- methylmorpholine)을 사용하였다.

(1) 보호된 아미노산(8당량)과 커플링제 HBTU(8당량) / NMM(16당량)을 DMF(Dimethyl formamide)에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 반응시켰다.

(2) Fmoc 제거는 20%(v/v) Piperidine / DMF를 가하여 상온에서 5분간 2회 반응하였다.

상기 (1)과 (2)의 반응을 반복적으로 하여 펩타이드 유도체를 만들었다. 이후, 무수아세트산(Acetic anhydride)과 디이소프로필에틸아민(DIEA)을 이용하여 N-말단 부분에 아세틸화 하였다.

Resin에서의 펩타이드 분리는 TFA(Trifluoroacetic acid) / EDT(1,2-ethanedithiol) / Thioanisole / TIS (Triisopropylsilane) / H ₂ O (혼합비(중량기준)= 90 / 2.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5)을 사용하여 분리하였다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리함으로써 침전물을 생성시킨다. 얻어진 침전물을 원심분리 시켜 완전히 침전 시키고, 과량의 트리플루오로아세트산, 티아니졸 및 에탄디티올 등을 일차로 제거한 후, 동일한 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻었다.

얻은 침전물을 C18 column(250mm × 22 mm, 10μm, Vydac Everest, USA)을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피 기기(Shimadzu Prominence HPLC, Japan)를 이용하여 0.1%(v/v) Trifluoroacetic acid를 포함하는 water - acetonitrile liner gradient(Acetonitrile 농도: 10~75%(v/v)) 방법으로 분리하였다. 정제된 펩타이드 유도체의 분자량은 LC/MS(Agilient HP 1100 series)를 사용하여 확인하였고, 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형태의 TFA(Trifluoroacetic acid)염으로서 하기의 펩타이드를 얻었다.

구체적으로, 합성된 펩타이드 유도체들의 서열과 분자량을 하기에 나타냈다.

펩티드-1: Phe-His-Arg :

Rt= 8.533 분(0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배);

MS(ESI) 458.24 m/e, [M+H] ⁺ = 458

펩티드-2: Acetyl-Phe-His-Arg-NH2 :

Rt= 6.617 분(0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배);

MS(ESI) 499.27 m/e, [M+H] ⁺ = 499

1-2: 인간 피부 각질 줄기세포의 배양

인간 피부 각질 줄기세포를 CO ₂ 배양기(CO ₂ Incubator)에서 37°C, 5% CO ₂ 조건하에서 배양을 하였다. 인간 피부 각질 줄기세포는 셀앤텍(CellnTec, Inc.,USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 배양액은 셀앤텍(CellnTec, Inc.)의 지침서에 따라, 500 ㎖의 기본배양액(CnT-BM)에 첨가물(CnT-57)을 넣어 세포배양에 사용하였다.

1-3: 인간 피부 각질 줄기세포 증식효과 분석

실시예 1-1에서 얻은 펩티드 1 및 2를 각각 20 ppm으로 상기 준비된 인간 피부 각질 줄기세포에 72 시간 동안 처리하여, 세포증식 정도를 CCK-8 kit(WST-8; Dojindo, Japan)을 이용하여 분석하였다.

분석방법은 효소면역분석기(ELx808; BioTek, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도 분석을 통해 수치화 하였다. 해당 인간 피부 줄기세포 증식률(%)은 하기 표 1에 나타냈으며, 표 1은 인간의 피부 각질 줄기 세포에서 펩티드에 의한 인간 각질 줄기세포 증식률(%)을 기록한 결과이다. 음성 대조군은 무 처치군이고, 양성 대조군은 Rutin(quercetin-3-O-rutinoside) 처리군 이었다 .

상기 세포 증식률(%)은 음성 대조군의 증식률 100을 기준으로 각 처리 시료에 따른 세포 증식률을 구한 값이다.

펩티드-1 및 펩티드-2에 의한 인간 피부 각질 줄기세포 증식률은 각각 음성 대조군에 비해 1.70배 (펩티드-1) 및, 1.66배 (펩티드-2) 증가하는 것으로 관찰되었으며, 이는 양성대조군 (1.21배)에 의한 세포증식률과 비교하여 더 높은 세포증식률을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 펩티드들은 인간 피부 각질 줄기세포의 증식 촉진제로서 우수한 활성을 나타냄을 확인하였다.

[ 실시예 2]

펩티드 2종의 인간 피부 각질 줄기세포 세포독성 분석

실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 인간 피부 각질 줄기세포를 배양한 후, 펩티드-1 및 펩티드-2의 세포독성을 파악하기 위하여 각각의 펩티드를 100, 200, 400 ppm의 농도로 처리하였다. 이 후 MTT법(Sigma Aldrich, St Louis, USA)을 이용하여 전 처리 후 효소면역분석기(570nm; BioTek)를 이용한 흡광도 분석을 통해 세포독성의 정도를 수치화 하였다. 표 2는 인간의 피부 각질 줄기 세포에서 펩티드-1 및 펩티드-2의 처리에 의한 독성을 확인한 표이다. 음성 대조군은 무 처치군이고, 양성 대조군은 Doxorubicin이었다.

상기 세포 생존율(%)은 음성 대조군의 생존율 100을 기준으로 각 처리 시료에 따른 세포 증식률을 구한 값이다.

펩티드-1 및 펩티드-2에 의한 인간 피부 각질 줄기세포의 사멸은 100, 200, 400 ppm의 농도범위 내에서 나타나지 않았으며, 음성대조군에 비해 세포 생존률이 같거나 높은 것으로 펩티드-1 및 펩티드-2 모두에서 확인되었다. 이는 세포 증식률(표 1)을 보인 20 ppm의 농도보다 5배, 10배, 20배 높은 수준으로 해당 농도까지 세포독성은 나타나지 않는 것으로 확인하였다.

[ 실시예 3]

펩티드 2종의 인간 피부 각질 줄기세포 세포생장인자 발현 분석

시험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 인간의 피부 각질 세포를 배양한 후, 펩티드-1 및 펩티드-2에 의한 세포생장인자 발현 분석을 위하여 각각의 펩티드를 20 ppm의 농도로 처리한 후 72시간 동안 배양한 세포배양액(2ml)을 사용하였다.

세포생장인자 anti-body (Ab) array(ab134002; Abcam, Cambridge, UK)의 사용은 공급처에서 제공하는 지침서에 따랐으며, 결과의 정량은 ImageJ software(NIH, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 각각의 세포생장인자 발현 정도를 확인하였다. 표 3은 인간의 피부 각질 줄기 세포의 배양액에서 펩티드-1 및 펩티드-2 처리에 의해 증가된 세포생장인자를 나타낸 표이다. 음성 대조군은 vehicle이고, 양성 대조군은 루틴(Rutin)을 사용하였다.

세포배양액 내 세포생장인자의 발현 변화는 펩티드-1 및 펩티드-2 모두에서 관찰되었으며, 그 중에서도 특히 섬유아세포 성장인자인 bFGF, FGF-4, FGF-5, FGF-6 그리고 FGF-7의 분비를 효과적으로 증가시키는 것으로 확인되었다.

펩티드-1과 펩티드-2 모두에 의해 증가된 성장인자는 AR, bFGF, EGFR, FGF-4, FGF-6, FGF-7, IGFBP-2, IGFBP-4, IGFBP-6, IGF-I, IGF-ISR, M-CSF, M-CSFR, TGF-beta, VEGF, VEGFR3이며, 펩티드-1에 의해 단독으로 증가된 성장인자는 GDNF, GM-CSF, HB-EGF, IGFBP-3, IGF-II, NT-3, PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-beta3, 그리고 펩티드-2에 의해 단독으로 증가된 성장인자는 b-NGF, GCSF가 해당된다.