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用于由人干细胞分化人外周感觉神经元的方法及其用途

阅读：100发布：2020-05-11

专利汇可以提供用于由人干细胞分化人外周感觉神经元的方法及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及干细胞生物学领域，特别是多能或多潜能干细胞的谱系特异性分化。具体描述了使用新型培养条件引导hiPSC谱系特异性分化为支配人皮肤的敏感神经元或神经元纤维 (诸如神经嵴干细胞(NCPC)以及本文中所称的外周感觉神经元(PSN))的方法。还描述了用于体外筛选生物剂的方法。进一步考虑将使用本发明的方法获得的PSN用于各种用途，包括但限于，在体外试验或疾病建模中的用途，诸如药物发现测定，较大规模的细胞疗法，检测一系列皮肤刺激物和其他目标化合物，研究皮肤衰老机制，和制备皮肤化妆品。还考虑了体外配体用于检查通过本发明的方法制备的PSN细胞的分化和/或激活的用途以及通过本发明的方法制备的PSN细胞。，下面是用于由人干细胞分化人外周感觉神经元的方法及其用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于诱导向外周感觉神经元(PSN)细胞的分化的方法，所述方法包括：
(a)提供：
(i)包含人干细胞的细胞培养物；
(ii)3N培养基；
(iii)至少一种SMAD通路抑制剂；
(b)在第一培养容器上使(i)的所述干细胞与(ii)和(iii)体外接触2至22天；
(c)在补充有至少一种促分裂原、涂布有聚鸟氨酸/层粘连蛋白的情况下，在第二培养容器中使初次分化的细胞与3N培养基接触，其中使所述初次分化的细胞保持所述培养多至
12天；
(d)使所述初次分化的细胞与补充有至少一种神经营养因子、至少一种分化诱导剂和至少一种细胞转导诱导剂的3N培养基接触，使所述初次分化的细胞保持培养5至25天以获得二次分化的细胞；
(e)将所述二次分化的细胞在来自新生人表皮角质形成细胞(HEKn)的条件培养基中培养2至22天。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人干细胞是人诱导性多能干细胞(hiPSC)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述SMAD通路抑制剂选自LDN193189、SB431542和CHIR，或其任何混合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述LDN193189为约100至约700nM，所述SB431542为约0.1至约100μM并且所述CHIR为约0.1至约10μM。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述初次分化的细胞是神经嵴祖细胞(NCPC)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述促分裂原选自成纤维细胞生长因子(诸如FGF-
2)和EGF，或其任何混合物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经营养因子选自脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、NT-3、神经生长因子(NGF)或其任何混合物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述分化诱导剂选自抗坏血酸。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞转导诱导剂选自环单磷酸腺苷(cAMP)。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述二次分化的细胞是外周感觉神经元(PSN)细胞。
11.根据权利要求5所述的方法，其中所述NCPC表达选自由巢蛋白、TRPV1、外周蛋白、Pax 6和BRN3a组成的组的一种或多种标记物。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述外周感觉神经元表达选自由TRPV1和P物质组成的组的一种或多种标记物。
13.一种体外筛选生物剂的方法，所述方法包括：
(a)提供：
(i)体外来源于如在权利要求1至12中任一项中所限定的用于诱导向外周感觉神经元(PSN)细胞的分化的方法的外周感觉神经元；
(ii)试验化合物；和
(b)使所述外周感觉神经元与所述试验化合物接触并且测量外周感觉神经元功能，其中所述功能是至少一种标记物的活性的量度。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述外周感觉神经元来源于人诱导性多能干细胞(hiPSC)。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述标记物选自TRPV1和P物质。
16.外周感觉神经元(PSN)用于进行体外试验的用途，所述外周感觉神经元通过如在权利要求1至12中的一项中所限定的用于诱导向外周感觉神经元(PSN)细胞的分化的方法制备。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述体外试验是检测一系列皮肤刺激物、过敏原、抗衰老剂、皮肤舒缓剂和/或抗炎剂。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述刺激物选自香精、防腐剂、溶剂、作为去角质素和皮肤细胞更新剂的推进剂、抗痤疮药、止汗剂化合物、抗组胺剂、抗炎剂、皮肤保护剂、驱虫化学品、防晒剂、表面活性剂、防腐剂、皮肤舒缓剂、抗衰老药、伤口愈合药、在化妆品和/或皮肤化妆品中使用的外用生物化合物、或其任何混合物。
19.根据权利要求16所述的用途，其中所述体外试验是研究皮肤衰老机制。
20.外周感觉神经元(PSN)用于制备化妆品的用途，所述外周感觉神经元通过如在权利要求1至12中的一项中所限定的用于诱导干细胞的分化的方法制备。
21.体外配体用于检查细胞的分化和/或激活的用途，所述细胞通过如在权利要求1至
12中的一项中所限定的用于诱导向外周感觉神经元(PSN)细胞的分化的方法制备。
22.根据权利要求21所述的用途，其中通过分析TRPV1活性和/或P物质释放来检查所述细胞的所述分化和/或激活。
23.根据权利要求21所述的用途，其中所述配体选自花生四烯酸乙醇胺、辣椒素、树脂毒素、红钌、辣椒素、樟脑、辣椒平和/或利莫那班。
24.一种外周感觉神经元(PSN)细胞，所述外周感觉神经元细胞通过如在权利要求1至
12中的一项中所限定的用于诱导向外周感觉神经元(PSN)细胞的分化的方法制备。

说明书全文

用于由人干细胞分化人外周感觉神经元的方法及其用途

发明领域

[0001] 本发明涉及干细胞生物学领域，特别是多能(pluripotent)或多潜能(multipotent)干细胞的谱系特异性分化(linage specific differentiation)，其可以包括但不限于，人胚胎干细胞(hESC)、人诱导性多能干细胞(hiPSC)、体干细胞、癌干细胞、或任何其他能够进行谱系特异性分化的细胞。具体描述了使用新型培养条件引导hiPSC谱系特异性分化为支配人皮肤的敏感神经元或神经元纤维(诸如神经嵴干细胞(NCPC)以及本文中所称的外周感觉神经元(PSN))的方法。还考虑将使用本发明的方法制备的PSN用于各种用途，包括但不限于，在体外药物发现测定和细胞疗法中的用途。此外，可以将该方法应用于来源于患者的hiPSC并且因此充当对人类疾病建模的有力工具。

[0002] 发明背景

[0003] 细胞微环境(由可溶性信号、不溶性/物理信号和细胞-细胞相互作用组成)在调节干细胞分化中起到决定性作用。然而，研究干细胞微环境因子在分化方面的功能极其困难，因为这些研究需要广泛了解多种调节信号以及它们如何相互作用以影响细胞功能。尽管已经做出了大量进步以尝试解决这些担忧，但是目前可用于这样的研究的常规方法仍然有限。

[0004] 胚胎干细胞和体干细胞具有分化为任何细胞类型的能力，例如用于产生不同神经元类型的人诱导性多能干细胞(hiPSC)，从而研究其生物学、药理学并且筛选潜在的新型药物。

[0005] hiPSC可以分化为神经嵴前体细胞(NCPC)，其进而在胚胎发育期间分化为各种细胞类型和组织，包括平滑肌、结缔组织、骨骼、软骨、脂肪、内分泌细胞、黑素细胞、神经元和神经胶质以及许多其他细胞类型和组织。不仅对于致力于新型镇痛药的疼痛研究人员和化学家来说，而且还对于化妆品行业来说，NCPC分化为外周感觉神经元(PSN)的高潜能使这些细胞转变为研究各种躯体感觉病症的有力工具和用于药物筛选的可靠模型，从而代替某些动物试验，诸如皮肤刺激和皮肤衰老。然而，来自hiPSC的神经元的体外衍生需要长的培养周期，通常持续30天以上。

[0006] 仅有少量研究探讨了由胚胎干细胞(ESC)或人诱导性多能干细胞(hiPSC)产生NCSC和PSN。这些研究中的大多数基于鼠基质细胞和共同培养，其促进干细胞的神经分化以及神经花结(neural rosette)或神经球(neurosphere)的形成。除了分化收率和神经元功能性以外，在那些培养体系中，细胞类型不均一性是主要阻碍之一。最近的研究试图克服这些问题。然而，结果得到昂贵或耗时的方案，并且在产生NCPC或成熟PSN方面效率低。

[0007] 此外，已经多次尝试开发有效的干细胞分化方案，以在体外获得外周神经元。

[0008] 在2012年，Chambers等(Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors(组合小分子抑制使发育时机加速并且将人多能干细胞转化为伤害感受器).Nat Biotechnol 2012；30:715-720)使用基于组合小分子的方法确定产生伤害感受器的必需因子，诸如人β-神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)。

[0009] 其他尝试接下来优化了更进一步的分化方案并且能够在来源于hPSC的感觉神经元中显示出典型外周标记物如BRN3A、外周蛋白和TUJ1的表达。辣椒素受体(TRPV1)的表达揭示了，大多数TUJ1阳性细胞具有伤害感受器特性，并且在神经节样簇内83％的TUJ1阳性细胞对于TRPV1是阳性的。功能性分析通过全细胞膜片钳实验测试神经元兴奋性，显示出来源于hiPSC的伤害感受器在电子诱发时紧张性或时相性地激发(Eberhardt等，Pattern of Functional TTX-Resistant Sodium Channels Reveals a Developmental Stage of Human iPSC-and ESC-Derived Nociceptors(功能性TTX抗性钠通道模式揭示来源于人iPSC和ESC的伤害感受器的发育阶段).Stem Cell Reports Journal Vol.5j 305-313j,2015)。已经在各种各样的组织中显示了TRPV1/TRPA1通道表达，但是对于所有这些受体来说尚未证实功能性的证据(Fernandes等，The functions of TRPA1 and TRPV1:moving away from sensory nerves.(TRPA1和TRPV1的功能：远离感觉神经).British Journal of Pharmacology.2012；166(2):510-521)。

[0010] 其中首先在表皮角质形成细胞中确定功能性的第一种细胞类型中的一种(Inoue等，Functional vanilloid receptors in cultured normal human epidermal keratinocytes(在培养的正常人表皮角质形成细胞中的功能性类香草素受体).Biochem Biophys Res Commun.2002；291:124-129.)证实，辣椒素和酸化二者产生在培养的人表皮角质形成细胞中的细胞内钙浓度的升高。此外，通过TRPV1拮抗剂、辣椒平抑制了这些增加(Inoue等，2002)。类似地，用辣椒素处理人皮肤成纤维细胞引起由辣椒平拮抗的膜电流和细胞内钙水平的明显变化(Kim等，Expression of vanilloid receptor 1in cultured fibroblast(在培养的成纤维细胞中的类香草素受体1的表达).Exp Dermatol.2006；15:362-367)。

[0011] Kreitzer等(A robust method to derive functional neural crest cells from human pluripotent stem cells(由人多能干细胞得到功能性神经嵴细胞的稳健方法).Am J Stem Cells.2013；2(2):119-31)能够将多种人多能干细胞系分化为神经嵴(NC)细胞。通过在神经前体形成不久之后引发NC分化，它们能够产生高百分比的NC细胞(平均为80％，并且在一些NC分化中高达～90％)。这些NC细胞可以增殖，自我更新，向适当的信号迁移，并且自发分化为各种NC谱系和外周神经，在总计8天内表达适当的NC标记物，包括HNK1和p75，其明显快于先前描述的方案(Chambers等，Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling(借助SMAD信号传导的双重抑制的人ES和iPS细胞的高效神经转化).Nat.Biotechnol.27,275-280(2009)；
Menendez等，Directed differentiation of human pluripotent cells to neural crest stem cells(人多能细胞向神经嵴干细胞的定向分化).Nature Protoc.2013；8:
203-212；Lee等，Human Sensory Neurons Derived from Induced Pluripotent Stem Cells Support Varicella-Zoster Virus Infection(来源于诱导性多能干细胞的人感觉神经元支持水痘带状疱疹病毒感染).PLoS ONE 7(12):e53010)。

[0012] 在2014年，Young和同事(Characterizing human stem cell-derived sensory neurons at the single-cell level reveals their ion channel expression and utility in pain research(在单细胞水平表征来源于人干细胞的感觉神经元揭示了它们的离子通道表达和在疼痛研究中的效用).Mol.Ther.2014；22,1530-1543)报道了用于通过小分子抑制由人胚胎干细胞产生感觉神经元的优化方案，其能够产生感觉神经元的高度富集群体，所述感觉神经元表达在成人背根神经节(DRG)中发现的离子通道中的多于80％。使干细胞在基质胶上生长并且用含有驱使朝向神经元命运分化的多种小分子药物的培养基处理10天。所检验的许多个体细胞早在分化的16天即表达指示DRG的标记物。然而，根据该分析也显而易见的是，在第16天的细胞群体仍然是不均一的(Young等，Characterizing human stem cell-derived sensory neurons at the single-cell level reveals their ion channel expression and utility in pain research(在单细胞水平表征来源于人干细胞的感觉神经元揭示了它们的离子通道表达和在疼痛研究中的效用).Mol.Ther.2014；22,1530-1543)。

[0013] 根据前述内容，已经进行了开发有效干细胞分化方案的多种尝试，以在体外获得外周神经元，然而，仍然需要具有增加的纯度(均一性)、收率和/或神经元功能性的制备外周感觉神经元的改进方法。

[0014] 发明概述

[0015] 本发明公开了用于使hiPSC分化为支配人皮肤的敏感神经元或神经元纤维如神经嵴祖细胞(NCPC)和外周感觉神经元(PSN)的新型且有效的谱系特异性方法，所述方法具有高分化收率并且劳动密集度低、不易错误并且更加稳健和可重复。

[0016] 因此，本发明的第一目的是一种用于诱导向外周感觉神经元(PSN)细胞的分化的方法，所述方法包括以下步骤：

[0017] (a)提供：

[0018] (i)包含人干细胞的细胞培养物；

[0019] (ii)3N培养基；

[0020] (iii)至少一种SMAD通路抑制剂；

[0021] (b)在第一培养容器上使(i)的所述干细胞与(ii)和(iii)体外接触2至22天；

[0022] (c)在补充有至少一种促分裂原、涂布有聚鸟氨酸/层粘连蛋白的情况下，在第二培养容器中使初次分化的细胞与3N培养基接触，其中使初次分化的细胞保持所述培养多至12天；

[0023] (d)使初次分化的细胞与补充有至少一种神经营养因子、至少一种分化诱导剂和至少一种细胞转导诱导剂的3N培养基接触，使初次分化的细胞保持培养5至25天以获得二次分化的细胞；

[0024] (e)将二次分化的细胞在来自新生人表皮角质形成细胞(HEKn)的条件培养基中培养2至22天。

[0025] 在本发明的方法的优选实施方案中，人干细胞是人诱导性多能干细胞(hiPSC)。

[0026] 优选地，SMAD通路抑制剂选自LDN193189、SB431542和CHIR，或其任何混合物，其中优选地，LDN193189为约100至约700nM，SB431542为约0.1至约100μM并且CHIR为约0.1至约10μM。

[0027] 此外，根据本发明的方法的优选实施方案，初次分化的细胞是神经嵴祖细胞(NCPC)，其中优选地，NCPC表达选自由巢蛋白、TRPV1、外周蛋白、Pax 6和BRN3a组成的组的一种或多种标记物。

[0028] 优选地，促分裂原选自成纤维细胞生长因子(诸如FGF-2)和EGF，或其任何混合物。

[0029] 优选地，神经营养因子选自脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、NT-3、神经生长因子(NGF)或其任何混合物。

[0030] 优选地，分化诱导剂选自抗坏血酸。

[0031] 优选地，细胞转导诱导剂选自环单磷酸腺苷(cAMP)。

[0032] 优选地，二次分化的细胞是外周感觉神经元(PSN)细胞。

[0033] 优选地，外周感觉神经元表达选自由TRPV1和P物质组成的组的一种或多种标记物。

[0034] 本发明的第二目的是一种体外筛选生物剂的方法，所述方法包括：

[0035] (a)提供：

[0036] (i)体外来源于如在本申请中所限定的用于诱导向外周感觉神经元(PSN)细胞的分化的方法的外周感觉神经元；

[0037] (ii)试验化合物；和

[0038] (b)使所述外周感觉神经元与所述试验化合物接触并且测量外周感觉神经元功能，其中所述功能是至少一种标记物的活性的量度。

[0039] 在本发明的第二目的的优选实施方案中，外周感觉神经元来源于人诱导性多能干细胞(hiPSC)。

[0040] 优选地，标记物选自TRPV1和P物质。

[0041] 本发明的第三目的是外周感觉神经元(PSN)用于进行体外试验的用途，所述外周感觉神经元通过如在本发明中所限定的用于诱导向外周感觉神经元(PSN)细胞的分化的方法制备，其中根据本发明的优选实施方案，体外试验是检测一系列皮肤刺激物、过敏原、抗衰老剂、皮肤舒缓剂和/或抗炎剂。

[0042] 优选地，刺激物选自香精、防腐剂、溶剂、作为去角质素和皮肤细胞更新剂的推进剂、抗痤疮药、止汗剂化合物、抗组胺剂、抗炎剂、皮肤保护剂、驱虫化学品、防晒剂、表面活性剂、防腐剂、皮肤舒缓剂、抗衰老药、伤口愈合药、在化妆品和/或皮肤化妆品中使用的外用生物化合物、或其任何混合物。

[0043] 此外，根据本发明的优选实施方案，体外试验是研究皮肤衰老机制。

[0044] 本发明的第五目的是体外配体用于检查细胞的分化和/或激活的用途，所述细胞通过如在本发明中所限定的用于诱导向外周感觉神经元(PSN)细胞的分化的方法制备。

[0045] 优选地，通过分析TRPV1活性和/或P物质释放来检查细胞的分化和/或激活。

[0046] 优选地，配体选自花生四烯酸乙醇胺(anandamide)、辣椒素(capsaicin)、树脂毒素(resiniferotixin)、红钌(red ruthenium)、利多卡因(lidocaine)、杨梅苷(myricitrin)、慢性辣椒素、樟脑、riamiloride、辣椒平(capsazepine)、利诺吡啶(linopirdine)和/或利莫那班(rimonabant)。

[0047] 本发明的第六目的是外周感觉神经元(PSN)细胞用于制备化妆品的用途，所述外周感觉神经元细胞通过如在本发明中所限定的用于诱导向外周感觉神经元(PSN)细胞的分化的方法制备。

[0048] 本发明的第七目的是一种外周感觉神经元(PSN)细胞，所述外周感觉神经元细胞通过如在本发明中所限定的用于诱导向外周感觉神经元(PSN)细胞的分化的方法制备。

[0049] 附图简述

[0050] 图1示出了外周感觉神经元分化步骤时间进程。向感觉神经元的分化方案的示意性模型。第0天(D0)：分化使用呈现全部主要多能性标记物的hiPS细胞开始；D5：神经管样结构的形成；D10：细胞定型为NCPC表型；D13：替换为补充有脑源性神经营养因子(BDNF)、抗坏血酸(AA)、胶质源性神经营养因子(GDNF)、神经营养蛋白3(NT-3)和环AMP(cAMP)的培养基以诱导NCPC向感觉神经元分化；D13-D33：感觉神经元的成熟。

[0051] 图2示出了具有特异性标记物的NCPC的表征。在第10天，细胞呈现神经祖细胞的形态和对巢蛋白(a、d、g和j)、TRPV1(b)、外周蛋白(e)、Pax6(h)、和BRN3a(k)的阳性染色。NCPC对Islet1和Oct4是阴性的。细胞核用DAPI染色(c、f、I和l)。阳性细胞相对于DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)染色的细胞核进行量化(m)。

[0052] 图3示出了感觉神经元分化。在用75％HEKn培养基调节的神经元培养基中2、5或10天之后，III型β-微管蛋白(绿色)将神经元染色。细胞核用DAPI染色(a-c)。在外周感觉神经元中的轴突长度进行量化。基于III型β-微管蛋白(绿色)免疫染色测量轴突长度。计算机辅助的图像分割确定全部轴突并且在每个时间点测量总长度。轴突长度在使用75％HEKn条件培养基培养5天之后增加328％并且在10天之后增加514％(d)。分化的神经元的百分比。HEKn细胞条件培养基在培养10天之后使神经元数量增加17.4％(e)。

[0053] 图4示出了外周感觉神经元成熟。在75％HEKn细胞培养基中培养的神经元呈现TRPV1(a、c和e)、外周蛋白(h、j和l)和Islet-1(o、q和s)的时间相关的增加的表达。在全部情况(b、d、f、I、k、m、p、r和t)中，III型β-微管蛋白(绿色)和DAPI共染色。TRPV1荧光强度在5天和10天之后分别增加328％和514％(g)；外周蛋白在5天和10天之后分别显示出118％和165％的增加(n)并且Islet-1在5天和10天之后也分别呈现205％和276％的增加(u)。

[0054] 图5示出了在来源于hiPS细胞的感觉神经元中的钙释放测定。用于细胞定位的相差图像(a)，基础钙水平的荧光图像(b)。在100nM辣椒素(c)和70mM KCL处理(d)之后在感觉神经元中的钙响应。根据在每个图像左边的比例尺，将Fura-2激发比(340/380nm)转换为伪彩色的感觉神经元的钙成像。箭头表示活性细胞。

[0055] 图6示出了在用激动剂和拮抗剂进行体外处理之后的P物质释放。在37℃在配体存在下温育1小时之后在感觉神经元培养物的上清液中测量的P物质释放。CAP：辣椒素；CPZ：辣椒平；RR：钌红；AEA：花生四烯酸乙醇胺(10μM)；KCl：高钾溶液(70mM)。AEA与对照相比呈现887％的增加。

[0056] 发明详述

[0057] 神经嵴前体细胞(NCPC)在胚胎发育期间分化为各种细胞类型和组织，包括平滑肌、结缔组织、骨骼、软骨、脂肪、内分泌细胞、黑素细胞、神经元和神经胶质以及许多其他细胞类型和组织。NCPC分化为外周感觉神经元(PSN)的高潜能使这些细胞转变为研究各种躯体感觉病症的有力工具和用于药物/刺激物筛选的可靠模型，但是来自hiPSC的神经元的体外衍生需要长的培养周期，通常持续30天以上。仅有少量研究探讨了由胚胎干细胞(ESC)或人诱导性多能干细胞(hiPSC)产生NCSC和PSN。这些研究中的大多数基于鼠基质细胞和共同培养，其促进干细胞的神经分化以及神经花结(neural rosette)或神经球(neurosphere)的形成。除了分化收率和神经元功能性以外，在那些培养体系中，细胞类型不均一性是主要阻碍之一。最近的出版物试图克服这些问题，然而，结果得到昂贵或耗时的方案，并且在产生NCPC或成熟PSN方面效率低。

[0058] 鉴于以上，尽管已经做出了大量进步以尝试解决这些担忧，但是目前可用于这样的研究的常规方法仍然有限。因此，仍然需要开发用于诱导hiPSC向PSN分化的方法，得到均匀的培养体系，提供分化收率和神经元功能性，尤其是关注药物发现测定和在化妆品行业中代替某些动物试验。

[0059] 本发明涉及具有高分化收率的用于诱导谱系特异性干细胞的分化的高效方法，尤其是由hiPSC分化为支配人皮肤的敏感神经元或神经元纤维，诸如神经嵴干细胞(NCPC)和外周感觉神经元(PSN)，并且涉及通过本发明的方法制备的分化细胞用于检测一系列皮肤刺激物和用于研究皮肤衰老机制的用途。更具体地，本发明提供通过用Smad抑制剂处理2至22天、优选5至18天、更优选7至12天、甚至更优选12天使hiPSC分化为神经嵴祖细胞(NCPC)的方法。

[0060] 在补充有至少一种促分裂原、涂布有聚鸟氨酸/层粘连蛋白的情况下，使初次分化的细胞与3N培养基接触，并且可以使其在所述培养物中保持多至12天，优选2至10天，更优选2天。随后，使初次分化的细胞与补充有至少一种神经营养因子、至少一种分化诱导剂和至少一种细胞转导诱导剂的3N培养基接触，其中使初次分化的细胞保持培养5至25天、优选10至20天、更优选15天，以获得二次分化的细胞。然后，将二次分化的细胞在用50％至
100％、优选用60％至90％、更优选70％至80％、甚至更优选用75％新生人表皮角质形成细胞(HEKn)培养基调节的培养基中培养2至22天，优选2至10天。

[0061] 然后，进行分化方案以在多至35天期间由NCPC获得外周感觉神经元。从PSN分化之后第11天开始，进行功能性试验以证实神经元活性和响应度。在本文中提供的数据显示，典型的Wnt信号传导通路在神经嵴细胞分化期间具有重要作用，而BMP和激活素A/Nodal信号传导通路的抑制导致NPC的高效且快速的产生。

[0062] 该方法的主要目的是避免不得不分选p75/Hnk1+NPC，因为预期这些细胞的高百分比。本发明的方法使分化方案包括BMP I型受体ALK2和ALK3-抑制剂LDN-193189(LDN)，其中与GSK-3抑制剂CHIR平行使用激活素A/Nodal信号传导阻断剂SB431542(SB)，得到双Smad抑制条件。该方法执行起来更简单并且不需要FACS分选步骤，这意味着其劳动密集度显著较低、不易错误并且更加稳健和可重复。从那时起，使用该方法获得的诱导NCPC用于借助用GDNF配体和神经营养蛋白温育、接着在来自新生人表皮角质形成细胞(HEKn)的75％条件培养基中温育10天而分化为外周神经元。所产生的神经元具有响应于花生四烯酸乙醇胺的功能，这导致P物质(substance P，SP)的释放。钙信号适度响应于辣椒素和其他试剂，并且在条件培养基处理之后观察到表达PSN标记物如TRPV1的进一步增加。

[0063] 此外，本发明的另一个实施方案包括用于体外筛选生物剂的方法，所述方法包括所描述的步骤。

[0064] 另外，进一步考虑将使用本发明的方法制备的PSN用于各种用途，包括但限于，在体外试验中的用途，诸如药物发现测定，较大规模的细胞疗法，检测一系列皮肤刺激物和感兴趣的其他化合物，研究皮肤衰老机制，和制备化妆品，如抗衰老皮肤产品。

[0065] 还考虑了体外配体用于检查通过本发明的方法制备的PSN细胞的分化和/或激活的用途以及通过本发明的方法制备的PSN细胞。

[0066] 在借助实施例进一步描述本发明之前，应该理解的是，本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以改变。还应理解的是，在本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求进行限制。

[0067] 在提供数值范围的情况下，应理解的是，在本发明内包括在该范围的上限和下限之间的每个居间值(至下限单位的十分之一，除非上下文另外明确指出)和在该所述范围内的任何其他所述或居间的值。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围中，并且还包括在本发明中，以所述范围中任何具体排除的限值为准。在所述范围包括限值中的一者或二者的情况下，排除那些被包括的限值中的一者或二者的范围也包括在本发明中。

[0068] 除非另外定义，在本文中使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中也可以使用与在本文中所描述的那些相似或等同的任何方法和材料，现在描述优选的方法和材料。在本文中提及的全部出版物通过引用结合在本文中以公开并且描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。

[0069] 在本文中公开并且要求保护的全部方法可以根据本公开在不进行过度实验的情况下做出并执行。尽管已经根据优选的实施方案描述了本发明的方法，对本领域技术人员来说将显而易见的是，可以对方法应用各种改变，并且在本文中所述的方法的步骤中或步骤顺序中应用各种改变，而不脱离本发明的构思、精神和范围。更具体地，将显而易见的是，某些化学和生理均相关的试剂可以代替在本文中所述的试剂，同时将实现相同或相似的结果。对本领域技术人员来说显而易见的全部这样的相似替代和改进被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和构思内。

[0070] 除非另外公开，在本文中使用的全部技术术语、符号和其他科学术语意在具有在本发明领域内的本领域技术人员所通常理解的含义。在一些情况中，出于清楚和/或迅速参考的目的，在本文中定义了具有通常所理解的含义的术语，并且在本文中包括这样的定义并非必须解释为代表在现有技术中通常所理解的定义中的实质差异。

[0071] 定义

[0072] 干细胞是根据它们在单一细胞水平自我更新和分化的能力而定义的未分化的细胞。干细胞可以产生后代细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞。干细胞的特征还在于它们在体外分化为来自多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的各种细胞谱系的功能性细胞的能力。干细胞还在移植之后产生多种胚层的组织并且在注入胚泡之后得到基本上不是全部也是大部分的组织。干细胞通过其发育潜能来分类。

[0073] 如在本文中所使用的，术语“全能”是指产生全部体细胞类型加上组成胚外组织的全部细胞类型的能力。

[0074] 如在本文中所使用的，术语“多潜能”是指发育为多于一种体细胞类型的能力。

[0075] 如在本文中所使用的，术语“多能”是指发育为生物体的三种发育胚层(包括内胚层、中胚层和外胚层)的能力。

[0076] 多能干细胞的特性是本领域技术人员公知的，并且多能干细胞的另外的特性仍在继续确定。多能干细胞标记物包括，例如以下中的一种或多种的表达：ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81。在一个实施方案中，适合在本发明的方法中使用的多能干细胞表达NANOG、SOX2、TRA-1-60和TRA-1-81中的一种或多种，并且缺少针对分化神经标记物Islet1、BRN3A、外周蛋白和TRPV1的标记物的表达。

[0077] 如在本文中所使用的，人诱导性多能干细胞(hiPSC)是指由体细胞例如分化的体细胞诱导并且潜能高于所述体细胞的干细胞。hiPS细胞能够自我更新并且分化为成熟细胞，例如神经嵴祖细胞(NCPC)。

[0078] NCPC在本发明中也称为初次分化的细胞。

[0079] 如在本文中所使用的，术语“外周感觉神经元(PSN)祖细胞”和“二次分化的细胞”意指来源于哺乳动物神经嵴干细胞的细胞，其定型为一种或多种PNS神经元谱系，并且是分裂细胞，但是仍不表达在更加分化的、非分裂的PSN神经元细胞上发现的表面或细胞内标记物。当将这些PSN神经元祖细胞放置在适当培养条件中时，它们分化为表达适当分化标记物例如外周蛋白和TRPV(瞬时受体电位)的成熟PSN神经元。

[0080] “细胞培养”或“培养”通常是指取自活生物体并且在受控条件下生长(“培养中”或“培养的”)的细胞。原代细胞培养是在首次继代培养之前直接取自生物体的细胞、组织或器官的培养。当在促进细胞生长和分裂中的一者或二者的条件下将细胞放置在生长培养基中时，细胞在培养中扩增，得到更大的细胞群体。当细胞在培养中扩增时，有时通过细胞数量翻倍所需的时间量(称为翻倍时间)来测量细胞增殖速率。

[0081] 用于培养一种或多种干细胞的培养容器可以包括，但是不具体限于：烧瓶、用于组织培养的烧瓶、培养皿、陪替氏培养皿(petri dish)、用于组织培养的培养皿、多皿(multi dish)、微培养容器、微孔板、多板(multi plate)、多孔板、微载玻片、腔室载玻片、碗(schale)、试管、托盘、培养袋和转瓶，只要其能够在其中培养干细胞即可。

[0082] 培养容器可以是细胞粘附性的或非粘附性的，并且根据目的进行选择。细胞粘附性培养容器可以涂布有用于细胞粘附的任何基底如细胞外基质(ECM)，以提高容器表面对细胞的粘附性。用于细胞粘附的基底可以是旨在附着干细胞或饲养细胞(如果使用)的任何材料。

[0083] 可以适当地定义培养条件。例如，培养温度可以为约30至40℃并且优选约37℃，但是不具体限于此。CO2浓度可以为约1至10％，并且优选约2至5％。氧张力可以为1-10％。

[0084] 分化是未特化(“未定型”)或特化性较低的细胞通过其获得特化细胞如神经细胞或肌肉细胞的特征的过程。分化细胞或分化诱导细胞是在细胞谱系内占据特化性(“定型性”)较高的位置的细胞。当应用于分化过程时，术语“定型”是指在分化途径中已经进行至这样的点的细胞，其中在正常情况下其将继续分化为特定细胞类型或细胞类型亚组并且在正常情况下不能分化为不同细胞类型或恢复为较不分化的细胞类型。

[0085] 合适的神经诱导培养基可以基于支持神经诱导、神经发生和神经元分化的标准培养基。3N培养基可以包含含有N2和含有B27的培养基的1:1混合物，其中含有N2的培养基包含补充有N2(GIBCO)、胰岛素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸(NEAA)、b-巯基乙醇、青霉素和链霉素的DMEM/F12，并且含有B27的培养基包含补充有B27补充剂(GIBCO)、L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的神经基础培养基(Invitrogen)。

[0086] 上述3N培养基可以补充有TGFβ和BMP信号传导抑制剂以制备神经诱导培养基。

[0087] 如在本文中所使用的，术语“抑制剂”是指通过干扰作为该信号传导通路的一部分的特定靶标或通过干扰两个以上靶标之间的相互作用来降低或消除所记载的信号传导通路的生物功能或活性的化合物。抑制剂可以发挥以下效果中的任何一种或多种，从而降低或消除待抑制的蛋白质的生物功能或活性：(i)降低编码待抑制的蛋白质的基因的转录，即降低mRNA的水平，(ii)降低编码待抑制的蛋白质的mRNA的翻译，(iii)在抑制剂的存在下蛋白质以降低的效率发挥其生物化学功能，和(iv)在抑制剂的存在下蛋白质以降低的效率发挥其细胞功能。

[0088] 这样的化合物可以包括，但不限于，小分子、肽、肽模拟物、天然化合物、siRNA、反义核酸、适体或抗体。例如，在本发明的一个实施方案中，可以使用“小分子”作为抑制剂，如SMAD信号传导的抑制剂。

[0089] 换句话说，抑制剂是改变指定蛋白质(信号传导分子，涉及指定信号传导分子的任何分子，指定的相关分子，诸如糖原合成酶激酶3β(GSK3β)(例如，包括但不限于，在本文中所述的信号传导分子)的任何活性的任何化合物或分子，例如，通过直接接触SMAD信号传导，接触SMAD mRNA，引起SMAD的构象改变，降低SMAD蛋白水平，或干扰与信号传导配偶体(例如，包括在本文中所述的那些)的SMAD相互作用，以及影响SMAD靶基因(例如在本文中所述的那些)的表达。

[0090] 抑制剂还包括通过拦截上游信号传导分子间接调节SMAD生物活性的分子(所述上游信号传导分子例如在细胞外区域中，信号传导分子和作用的实例包括：螯合骨形态发生蛋白的Noggin，其抑制ALK受体1、2、3和6的激活，因此阻止下游SMAD激活。同样地，Chordin、Cerberus、卵泡抑素(follistatin)类似地螯合SMAD信号传导的细胞外激活剂。Bambi是一种跨膜蛋白，也起到螯合细胞外TGFβ信号传导分子的伪受体的作用。考虑将阻断激活素、nodal、TGFβ和BMP的抗体用于中和SMAD信号传导的细胞外激活剂，等等)。因此，在一个实施方案中，本发明的抑制剂诱导(改变)或更改从默认细胞类型向非默认细胞类型的分化。在优选的实施方案中，本发明的抑制剂“更改”或“降低”或“阻断”默认信号传导，从而引导朝向非默认细胞类型的细胞分化，如在本文中所描述的，用于制备本发明的外周感觉神经元细胞。

[0091] 因此，本发明的抑制剂是辅助制备本发明的外周感觉神经元细胞的用于改变信号分子活性的天然化合物或小分子。除了通过结合并且影响指定信号传导分子上游的分子而诱导的抑制(其进而导致指定分子抑制)以外，在竞争性抑制(以排除或降低另一种已知结合化合物的结合的方式与活性位点结合)和变构抑制(以改变蛋白质构象(以干扰化合物与蛋白质的活性位点结合的方式)的方式与蛋白质结合)方面描述了抑制剂。在一些情况中，抑制剂称为“直接抑制剂”，这是指通过实际接触信号传导靶标来抑制信号传导靶标或信号传导靶标通路。示例性直接抑制剂包括但不限于：利多卡因、杨梅苷、慢性辣椒素、樟脑、阿米洛利(amiloride)、辣椒平、利诺吡啶以及阻断一般神经功能的大多数局部麻醉剂。

[0092] 如在本文中所使用的，术语“细胞外信号传导影响”是指细胞外信号传导分子(例如，试验试剂如在本文中所述的小分子、药物试剂、受体的配体、细胞因子、趋化因子、可溶性因子、粘附分子或其他信号传导分子)对细胞(例如，真核细胞)的影响。在一些实施方案中，细胞外信号传导降低信号传导活性如SMAD活性，改变SMAD激活动力学，或者改变SMAD靶基因表达模式。

[0093] 如在本文中所使用的，术语“Sma Mothers Against Decapentaplegic”或“Small Mothers Against Decapentaplegic”或“SMAD”是指一种信号传导分子。

[0094] 如在本文中所使用的，术语“SB431542”是指能够降低或阻断转化生长因子β(TGFβ)/激活素-Nodal信号传导的分子，CAS编号为301836-41-9，分子式为C22H8N4O3，并且名称为4-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-lH-咪唑-2-基]-苯甲酰胺，例如，参见以下结构：

[0095]

[0096] 待使用的SB431542的优选量为约0.1至约100μM，更优选约1至约50μM，诸如例如，约5至约20μM，并且最优选地，所述量为约10μM。

[0097] 如在本文中所使用的，术语“LDN193189”是指小分子DM-3189，IUPAC名称4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉，化学式为C25H22N6，并且CAS编号为1062368-24-4。LDN193189能够起到SMAD信号传导抑制剂的作用。LDN193189也是ALK2、ALK3和ALK6、蛋白酪氨酸激酶(PTK)的高效小分子抑制剂，其抑制I型TGFβ受体的ALK1和ALK3家族成员的信号传导，引起多种生物信号(包括骨形态发生蛋白(BMP)BMP2、BMP4、BMP6、BMP7和激活素细胞因子信号)的传输以及随后的Smadl、Smad5和Smad8的SMAD磷酸化的抑制(Yu等，Nat Med.2008.14:1363-1369；Cuny等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2008.18:4388-4392，其通过引用结合在本文中)。LDN193189给出以下结构：

[0098]

[0099] 待使用的LDN193189的优选量为约100至约700nM，更优选约150至约650nM，诸如例如，约200至约600nM，并且最优选地，所述量为约500nM。

[0100] 如在本文中所使用的，术语“糖原合成酶激酶3β抑制剂”或“GSK-3抑制剂”或CHIR是指抑制糖原合成酶激酶3β酶的化合物，例如，参见Doble等，J Cell Sci.2003；116:1175-1186，其通过引用结合在本文中。具体地，CHIR99021的CAS编号为252917-06-9，分子式为C22H18Cl2N8，并且名称为6-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基)乙基-氨基)-烟腈，例如，参见以下结构：

[0101]

[0102] 待使用的CHIR99021的优选量为约0.1至约10μM，更优选约1至约7μM，诸如例如，约5至约6μM，并且最优选地，所述量为约3μM。

[0103] 如在本文中所使用的，术语“促分裂原”是指作为成纤维细胞生长因子家族成员的那些化合物，如FGF-2(碱性FGF)和FGF-4。此外，示例性的是表皮生长因子(EGF)、功能性同源物和结合EGF受体的其他因子。其他候选生长因子是血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)。这些促分裂原用于增加谱系细胞的数量，使它们在培养物中进一步增殖。

[0104] 神经营养因子是内源肽，其发现于神经系统中或受神经系统支配的非神经组织中，起到促进存活并且维持神经和/或胶质细胞的表型分化的作用。称为神经营养蛋白的营养因子的家族目前包括脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、NT-4/5和NT-6。所有神经营养因子都可以单独使用或组合使用。

[0105] 待使用的每种神经营养因子的优选量为约1ng/mL至约25ng/mL，更优选约5ng/mL至约15ng/mL，更优选约10ng/mL。

[0106] 如在本文中所使用的，表述“分化诱导剂”是指抗坏血酸(AA)。

[0107] 待使用的分化诱导剂的优选量为约50μM至约500μM，更优选约100μM至约300μM，更优选约200μM。

[0108] 如在本文中所使用的，表述“细胞转导诱导剂”是指介导信号转导的化合物，诸如例如cAMP。

[0109] 待使用的细胞转导诱导剂的优选量为约0.01mM至约1mM，更优选约0.1mM至约0.8mM，更优选约0.5mM。

[0110] 如在本文中所使用的，“标记物”是在目标细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在该上下文中，差异表达意指与未分化细胞相比对于阳性标记物来说增加的水平和对于阴性标记物来说降低的水平。与其他细胞相比，在目标细胞中标记物核酸或多肽的可检测水平足够更高或更低，使得可以使用本领域中已知的多种方法中的任一种来鉴定目标细胞并且将其与其他细胞区分。

[0111] 如在本文中所使用的，当在细胞中充足地检测到特异性标记物时，细胞“对于”特异性标记物是“阳性的”或者细胞是“阳性的”。类似地，当在细胞中未充足地检测到特异性标记物时，细胞“对于”特异性标记物是“阴性的”或者细胞是“阴性的”。

[0112] 如在本文中所使用的，术语“激活剂”、“激活”是指用于使分子激活、引起本发明的细胞的定向分化的化合物。示例性的激活剂包括但不限于：有害的热/冷、机械刺激、化学刺激物(薄荷醇、胡椒碱、急性辣椒素、肉桂醛、树脂毒素、缓激肽、ATP、前列腺素、炎性细胞因子、酸性盐水、成纤维细胞生长因子(FGF)等)。

[0113] 如在本文中提及的生物剂包括在外用产品中使用的许多成分，其为已知的刺激物或具有潜在的刺激性，尤其是对于具有“敏感皮肤”的人群。这些刺激性成分包括香精、防腐剂、溶剂、推进剂和可以在其他方面被认为是产品的惰性组分的许多其他成分。另外，许多外用产品活性成分，包括也可以被分类为药物的化学品，在涂覆至皮肤时产生刺激。这些包括但不限于诸如去角质素和皮肤细胞更新剂、抗痤疮药、止汗剂化合物、抗组胺剂、抗炎剂、皮肤保护剂、驱虫化学品、防晒剂以及许多其他成分的成分。在存在多于一种化学刺激物的情况下，它们的刺激性效果可以是累加的。此外，化学成分可以彼此反应，或者在皮肤的环境中，彼此反应以形成刺激性的新化学品。在其中配制活性药物成分的赋形剂也可能在敏感人群中产生刺激，尤其是在如外用皮质类固醇的药物的情况中。

[0114] 除了直接触发皮肤刺激的化学品以外，一些化学品还间接导致皮肤变得对通常不将导致刺激的其他化学品或环境条件敏感。许多充当皮肤“去角质素”的化学品，诸如类视色素(例如维A酸、视黄醇和视黄醛)，羧酸，包括α-羟基酸(例如乳酸、羟基乙酸)，β-羟基酸(例如水杨酸)，α-酮酸，乙酸和三氯乙酸，1-吡咯烷酮-5-甲酸，辛酰水杨酸，α-羟基癸酸，α-羟基辛酸，葡萄糖酸内酯，甲氧基丙基葡萄糖酰胺，草酸，苹果酸，酒石酸，扁桃酸，苯甲酸(benzylic acid)，葡萄糖酸，过氧化苯甲酰和苯酚等，可以导致皮肤变得对由其他外用涂覆的化学品如保湿剂、防晒剂、香精、防腐剂、表面活性剂(例如皂、剃须膏)和其他外用产品触发的刺激更敏感。

[0115] 也可以在本发明的PSN细胞培养物中测试以上引用的刺激物，因为其可以用作用于皮肤敏感性、神经原性炎症和皮肤敏化的体外模型。

[0116] 如在本文中提及的，TRP(瞬时受体电位)通道包括在整个物种的感觉系统中稳健表达的配体门控的、大多数非选择性的阳离子通道的多样性家族(Nilius&Szallasi，Transient receptor potential channels as drug targets from the science of basic research to the art of medicine(从基础研究科学到医学领域的作为药物靶标的瞬时受体电位通道).Pharmacol Rev 2014；66(3):676-814)。在这些中，对TRPV1进行了最充分的研究并且认为其是在躯体感觉神经元中存在的原型TRP通道(Basbaum等，Cellular and molecular mechanisms of pain(疼痛的细胞和分子机制).Cell.；2009；139:267-284,)。TRPV1可以通过外部分子如辣椒素、树脂毒素和胡椒碱直接门控，并且还通过其他受体和第二信使系统的激活如PIP2 水解和PKC磷酸化来正向或负向调节(Julius，TRP channels and pain(TRP通道和疼痛).Annu Rev Cell Dev Biol.2013；29:355-84)。
似乎抑制TRPV1激活的受体中的一种是大麻素1受体(CB1)，其也存在于躯体感觉神经元中(Julius&Basbaum，Molecular mechanisms of nociception(伤害感受的分子机制).Nature.2001；413:203-210)。然而，CB1的内源性激动剂花生四烯酸乙醇胺也是TRPV1的激动剂，尽管在后者中具有高一个数量级的EC50(Zygmunt等，Vanilloid receptors on sensory nerves mediate the vasodilator action of anandamide(在感觉神经上的类香草素受体介导花生四烯酸乙醇胺的血管扩张剂作用).Nature.1999；400:452-457)。

[0117] 在发育期间以及在成熟皮肤内角质形成细胞和感觉神经元具有广泛的相互作用。例如，角质形成细胞释放引起游离神经末梢树枝化和朝向皮肤表面的轴突向外生长的神经营养因子(Albers&Davis，The skin as a neurotrophic organ(作为神经营养器官的皮肤).Neuroscientist.2007；13:371-82)。它们还通过阳离子通道的TRP家族的受体释放涉及对组织损伤和超敏反应的响应以及对冷和热的响应的炎症介质(Chung等，TRPV3and TRPV4 mediate warmth-evoked currents in primary mouse keratinocytes(TRPV3和TRPV4在原代小鼠角质形成细胞中介导温暖诱发的电流).J Biol Chem.2004；279:21569-
75)。另一方面，通过分泌控制血管化和组织更新的促炎性神经肽和炎症介质，感觉末梢不仅转导感觉信号，而且还在皮肤代谢和内稳态中具有积极作用(Roosterman等，Neuronal control of skin function:the skin as a neuroimmunoendocrine organ(皮肤功能的神经元控制：作为神经免疫内分泌器官的皮肤).Physiol Rev.2006；86:1309-79)。特别地，TRPV1阳性伤害感受器还调节皮肤寿命和代谢，以及在衰老期间的免疫应答(Riera等，TRPV1 pain receptors regulate longevity and metabolism by neuropeptide signaling(TRPV1疼痛受体通过神经肽信号传导来调节寿命和代谢).Cell 2014；157,
1023-1036)。

[0118] P物质(SP)是速激肽家族的神经肽成员，由将其延伸部分从DRG发射到皮肤的更表面的层的感觉神经元合成，其介导外周神经元和表皮角质形成细胞之间的通讯(Ribeiro-da-Silva&Hokfelt，Neuroanatomical localization of Substance P in the CNS and sensory neurons(P物质在CNS和感觉神经元中的神经解剖学定位).Neuropeptides.2000；34:256-271)。释放P物质的神经元中的大多数对辣椒素敏感，突出了TRPV1表达和感觉神经元-角质形成细胞相互作用的重要性。
实施例

[0119] 人诱导性多能干细胞(hiPSC)分化为NCPC

[0120] 在标准培养条件(37℃、5％CO2)中，在涂布有基质胶(BD Biosciences)的培养皿上的mTeSRTM1培养基(STEMCELL Technologies，加拿大)中培养人诱导性多能干细胞(hiPSC)。每4-5天使用0.5mM EDTA(Thermo Fisher Scientific，USA)将集落分流。将在40-70％汇合率的人iPS细胞培养物用于NCPC诱导。将hiPSC暴露于新补充有三种小分子化合物的化学成分明确的3N诱导培养基(DMEM+神经基础培养基50:50v/v，1％Glutamax，0.5％N2，
1％B27，0.5％NEAA，55mMβ-巯基乙醇和1％青霉素/链霉素，全部来自Thermo Fisher Scientific，USA)达10天(参见图1)。这些化合物的加入如下：第1天：500nM LDN(Stemgen，USA)+10μMSB(Sigma Aldrich，USA)；第2天：500nM LDN+10μM SB+3μMCHIR(Tocris Bioscience，USA)；第3天：10μM SB+3μM CHIR。在第4、6和8天，仅用3μM CHIR补充培养基。在分化10天之后，将NCPC在扩增培养基(新补充有10ng/mL bFGF和10ng/mL EGF的3N培养基，二者均来自Thermo Fisher Scientific，USA)中进一步培养。在第11天，在37℃使用Accutase(Merck Millipore，USA)将NCPC酶促地传代(第0代)2-3分钟并且以1:3分流至涂布有聚-L-鸟氨酸(100ug/mL，Sigma Aldrich，USA)/层粘连蛋白(Laminine)(20μg/mL，Thermo Fisher Scientific，USA)的培养皿上并且进行培养直到汇合。每隔一天更换一次培养基。当达到70-100％的汇合率时(通常在第0代之后24-48h)，将细胞再次传代并且以特定密度：1x 106个细胞/60mm培养皿或3x 106个细胞/100mm培养皿在培养容器中培养。在传代当天加入10μM ROCK抑制剂(Merck Millipore，USA)并且在24h之后移除。

[0121] 由NCPC产生外周感觉神经元

[0122] 将在大约80％汇合率(通常在第13天，参见图1)的NCPC培养物用于神经元分化。简而言之，将细胞在含有以下分化因子的神经诱导培养基中保持大约23天：0.5mM AMPc(Sigma Aldrich，USA)，200μM AA(Sigma Aldrich，USA)，10ng/mL NT-3(R&D Systems，USA)，10ng/mL NGF(R&D Systems，USA)，10ng/mL BDNF(R&D Systems，USA)和10ng/mL GDNF(R&D Systems，USA)。每3-4天更换一次培养基。在37℃使用Accutase(Merck Millipore，USA)在3-5分钟内将神经元酶促地分流(如果需要)至新制备的聚-L鸟氨酸/层粘连蛋白培养皿上。在每次传代时进行10μM ROCK抑制剂(Merck Millipore，USA)的加入以增加神经元的存活和附着能力。在大约第35天，收获神经元并且将其在培养容器中培养以用于分析和/或进一步实验。

[0123] 人表皮角质形成细胞培养

[0124] 从Cascade Biologics(Portland,OR)获得新生人表皮角质形成细胞(HEKn)并且将其在EpiLife无血清培养基(ThermoFischer)中培养。将细胞以10,000个细胞/孔在培养容器中培养。之前用明胶(Sigma)处理培养容器并且当调节48小时达到70％至75％的汇合率时将培养基EpiLife(Thermo Fisher Scientific)分流，并且之后将其收集并且新鲜加入至神经元培养基，并且离心以去除碎片和死亡细胞。

[0125] 人外周感觉神经元和人表皮角质形成细胞的共同培养以及用条件培养基处理[0126] 在神经分化的第35天，收获外周感觉神经元并且将其在培养容器中以30,000个细胞/孔培养至涂布有聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白的96孔(Perkin-Elmer，USA)培养容器上，在以下条件下持续额外两天、五天和十天：在标准神经诱导培养基中与HEKn细胞共同培养；以及不存在HEKn细胞，但是以三种不同比例(25、50和75％)加入HEKn条件培养基。每3天更换一次条件培养基。

[0127] 分化和活性试验

[0128] 1.免疫细胞化学

[0129] 将NCPC和感觉神经元在96孔培养容器中培养并且用4％多聚甲醛固定，用Triton X-100透化，并且用3％牛血清白蛋白(BSA)封闭。将细胞与在3％BSA中稀释的一抗温育2小时。在用PBS洗涤之后，在黑暗中加入缀合二抗达40分钟，用PBS彻底洗涤，接着与用于核染色的DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)进行5分钟温育。在用PBS和水冲洗之后，加入50μl的甘油作为封固剂并且在分析之前将培养容器用铝贴片密封。所使用的一抗为：巢蛋白(1:100，Sigma-Aldrich，USA)，抗III型β-微管蛋白(1:200，Merck-Millipore，德国)，抗Islet1(1:1000，Abcam)，抗TRPV1(1:1000，Abcam)，抗Brn3A(1:250，Abcam)和抗外周蛋白(1:250，Santa Cruz Biotechnology)。将与Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594缀合的二抗(1:
400，Life Technologies，USA)避光温育40分钟。将细胞核用0.5μg/mL的4’-6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5分钟。使用高内涵筛选显微镜Operetta(PerkinElmer，USA)获得图像并且使用高内涵图像分析软件Harmony 5.1(PerkinElmer，USA)进行分析。为了确定NCPC是否定型为感觉神经元命运，进行使用Islet-1/2和Brn3的双染色。针对外周蛋白和Brn3的双染色用于量化与未成熟神经祖细胞相比的感觉神经元的外周感觉神经元成熟水平。

[0130] 2.钙测定

[0131] 将神经元在培养容器中培养至PLO和层粘连蛋白处理的盖玻片上(其中它们用HEKn条件培养基处理10天)。在实验当天，将培养基移除并且用含有5μM Fura-2 AM(Molecular Probes)和0.04％普朗尼克(pluronic)酸的新鲜培养基(不含因子)将细胞在37℃温育1小时。之后用由145NaCl、5KCl、1.2NaHPO4、1.5CaCl2、10D-葡萄糖、5HEPES pH 7.4组成(以mM计)的荧光测定缓冲液替换该溶液。如果使用拮抗剂，则在此时将其加入至该溶液中。在37℃达30分钟之后，将盖玻片放到配备有CCD相机(Orca,Hamamatsu Photonics)和λDG-4 光源(Sutter Instrument)的倒置显微镜(Nikon)。通过MetaFluor软件(Molecular Probes)每500毫秒获得一次图像，并且荧光水平以伪彩色表示。全部药物由储液新制备并且在荧光测定缓冲液中稀释，其中对照刺激含有赋形剂(0.1％乙醇)。

[0132] 3.ELISA

[0133] 根据厂商说明书，使用可商购获得的ELISA试剂盒(Cayman)测定P物质(SP)水平。将感觉神经元在24孔培养容器中的培养容器中以高汇合率培养。在24小时之后，将细胞用荧光测定缓冲液冲洗并且在相同缓冲液中与不同浓度的TRPV1激动剂温育45分钟。当使用拮抗剂时，其在15分钟之前施加，然后溶液变为激动剂+拮抗剂。随后，收集上清液并且立即与ELISA试剂盒一起使用。全部实验一式三份地进行并且在微培养容器读数器中测量吸光度水平。

[0134] 结果

[0135] 在10天期间通过用Smad抑制剂处理将hiPSC分化为神经嵴祖细胞(NCPC)，此时得到NCPC(D10，图1)。之后，将细胞解离，在96孔板中培养并且表征NCPC标记物的表达。NCPC对于巢蛋白(图2a、d、g和j)、TRPV1(图2b)、外周蛋白(图2e)、Pax6(图2h)和BRN3a(图2k)是阳性的，并且对于Islet1是阴性的。

[0136] 在第10天，将NCPC切换为含有FGF和EGF的培养基，持续2天，之后将它们接种至涂布有PLO/层粘连蛋白的板上。之后将细胞保持在加入有BDNF、抗坏血酸、GDNF、NGF、NT-3和cAMP的3N培养基中，结果形成外周感觉神经元。应注意，神经元在3N培养基中7天之后倾向于形成神经节样结构，对于小鼠和大鼠原代培养物也对此进行了描述。在分化的第33天(D33)，将细胞酶促地脱离并且在96孔板上重新培养。

[0137] 将未成熟的外周感觉神经元用HEKn条件培养基处理。将HEKn条件培养基与3N培养基以75％混合，并且加入至神经元中，持续2、5和10天。之后，在这些不同的时间点，借助β微管蛋白III染色来量化神经元成熟。从神经节样结构发出的轴突在该时间内稳健增加，在培养5天之后长度增加大约157％并且在10天之后增加542％(附图3a、b、c和d)。当与对照培养物(图3e)相比时，HEKn条件培养基的存在导致这些细胞的分化的17.4％的增加。

[0138] 存在组成躯体感觉神经元的与众不同的表达特征的若干标记物。评价了TRPV1(图4a-g)、外周蛋白(PRPH，图4h-n)和Islet 1(图4o-u)的表达。在所观察的时间点所有标记物都具有增加的表达(附图4g、n和u)。这些结果显示，条件培养基促进感觉神经元的成熟和生长，因为它们展现出较高的分化标记物的表达，标志转向感觉神经元成熟。

[0139] TRPV1通道是非选择性阳离子可透过通道，具有明显的钙透过性(Szallazi等，The vanilloid receptor TRPV1:10years from channel cloning to antagonist proof-of-concept(类香草素受体TRPV1：从通道克隆到拮抗剂概念证明的10年).Nat Rev Drug Discov,2007；6:357-372)。由于这种原因，已经使用细胞内钙测量结果作为TRPV1激活的代表。通过在个体细胞中获得钙瞬变的动态图像，量化由TRPV1激活介导的钙增加。在这些实验中，可以检测辣椒素诱导的活性(图5)。

[0140] PSN通过在表皮末端处的神经肽的释放以及在髓质背角中的谷氨酸和神经肽的释放而响应于刺激物如辣椒素(Basbaum等，Cellular and molecular mechanisms of pain(疼痛的细胞和分子机制).Cell.2009；139:267-284)。为了确认感觉神经元是否相对于神经肽释放具有功能性，在D33之后将它们接种至24孔板上并且用HEKn条件培养基处理10天。P物质呈现大约3μg/ml/h的基础水平。300nM的辣椒素能够使该量变为三倍，尽管是非统计学上显著的。这种增加通过用1μM的辣椒平共同处理而被高效阻断。施加较高浓度的辣椒素(3μM)，但是未显示出增加的释放，很可能归因于TRPV1脱敏(desensitization)。使用钌红(10μM)接着用辣椒素(3μM)进行预温育似乎使P物质释放降低至低于基础水平。有趣的是，对于这些细胞，花生四烯酸乙醇胺(10μM)诱发最高的P物质释放。最后，当加入高钾溶液(70mM)以使神经元去极化时，得到与辣椒素300ηM相当的P物质释放(图6)。

[0141] 在本发明中示出了重要的TRPV1活性，即由在根据本发明的方法制备的细胞培养物中的辣椒素和花生四烯酸乙醇胺介导的SP的释放，其可以用于筛选刺激物和可能的镇痛药。

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