技术领域
[0001] 本
发明属于
水产养殖病害防控领域，涉及
水产养殖动物病原的分子检测方法，具体涉及一种斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及其检测方法。
背景技术
[0002] 斑点叉尾鮰(Letalurus Punetaus)，原产于北美，是一种温水性的
淡水养殖鱼类，1984年引入中国后，养殖面积和总产量不断增加，目前已在我国20多个省份养殖，2016年总产量达28.5万吨，我国已经成为世界最主要的斑点叉尾鮰养殖国家之一。斑点叉尾鮰病毒(Channel Catfish Virus，CCV)是一种有囊膜的双链DNA病毒，又称鮰疱疹病毒I型(Ictalurid herpesvirus 1)，能够对斑点叉尾鮰鱼苗和鱼种造成致死性感染。随着斑点叉尾鮰养殖规模的不断扩大，集约化程度日益提高，养殖环境恶化，斑点叉尾鮰病害日趋严重，特别是由斑点叉尾鮰病毒(CCV)引起的斑点叉尾鮰疱疹病毒病(Channel Catfish Virus Disease，CCVD)危害最大，给斑点叉尾鮰养殖业造成严重的经济损失。
[0003] 目前，CCVD的传统检测方法主要是采用细胞培养技术进行CCVD的诊断，然后结合血清中和试验、
荧光抗体技术、ELISA或PCR鉴定，以上方法虽然准确可靠，但需要昂贵的仪器设备、较高检测
费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于斑点叉尾鮰现场普及推广使用。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于公开一种斑点叉尾鮰疱疹病毒病病原的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。本研究以斑点叉尾鮰CCVD病原的ORF77保守基因序列设计LAMP引物，以实时荧光定量PCR仪为恒温反应及检测平台，通过吸收荧光来实时判断反应的进行，建立一种对CCVD病原的LAMP检测试剂盒和检测方法。该检测方法能快速、特异检测ORF77基因的存在，从而准确确定检测样品中是否存在CCVD病原，比传统的通过
浊度或
颜色变化来判断LAMP结果更加客观可靠；该检测方法的检测平台可使用国产恒温荧光检测仪，该仪器便携、易操作，相比定量PCR仪，节约了大量成本；综述所述，本研究建立的方法能特异、快速检测CCVD病原，能在斑点叉尾鮰疱疹病毒病早期快速诊断和实时监测方面发挥重要作用，同时适合斑点叉尾鮰养殖现场快速检测使用。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0006] 一种斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测引物组，所述引物包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；
[0007] 所述外引物包括ORF77-F3序列和ORF77-B3序列，所述外引物ORF77-F3序列如SEQ ID NO:1所示，所述外引物ORF77-B3序列如SEQ ID NO:2所示；
[0008] 所述内引物包括ORF77-FIP序列和ORF77-BIP序列，所述内引物ORF77-FIP序列如SEQ ID NO:3所示，所述内引物ORF77-BIP序列如SEQ ID NO:4所示；
[0009] 所述环引物包括ORF77-LF序列和ORF77-LB序列，所述环引物ORF77-LF序列如SEQ ID NO:5所示，所述环引物ORF77-LB序列如SEQ ID NO:6所示。
[0010] 进一步的，所述外引物、内引物与环引物的摩尔比为1:8:4。
[0011] 本发明还提供了一种斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包括如
权利要求1所述的引物组，还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照、阴性对照和
显色剂SYT0-9。
[0012] 进一步的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
[0013] 进一步的，所述LAMP反应液包括：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和150mM MgSO4水溶液，三者的体积比为8:5:2。
[0014] 进一步的，所述阳性对照为将ORF77
片段序列连接到T载体中得到的质粒，所述ORF77片段序列如SEQ ID NO:7所示；所述阴性对照为超纯水。
[0015] 本发明还提供了一种斑点叉尾鮰疱疹病毒的快速检测方法，所述方法包括如下步骤：
[0016] 从待检测斑点叉尾鮰组织中提取DNA；
[0017] 采用权利要求1所述的引物组对提取到的DNA进行恒温基因扩增反应；
[0018] 根据扩增结果判断样品是否具有斑点叉尾鮰疱疹病毒。
[0019] 进一步的，结果判断方法为：将反应管放置在实时荧光定量PCR仪中进行反应，观察实时荧光定量PCR仪
软件判断扩增结果，如果出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
[0020] 进一步的，所述恒温基因扩增反应按照下述反应体系进行：扩增反应体系含有：ORF77-F3 0.2μM，ORF77-B3 0.2μM，ORF77-FIP 1.6μM，ORF77-BIP 1.6μM，ORF77-LF 0.8μM，ORF77-LB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，Bst DNA聚合酶10U，10×SYTO-9 0.5μl，待检DNA 1～
100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照。
[0021] 本发明还提供了上述引物、试剂盒或检测方法在斑点叉尾鮰疱疹病毒检测中的应用。
[0022] 上述技术方案所述的斑点叉尾鮰疱疹病毒的快速检测试剂盒，其中，阳性对照为将ORF77片段序列连接到T载体中得到的质粒，ORF77片段序列如SEQ ID NO:7所示；阴性对照为超纯水。
[0023] 上述技术方案所述的斑点叉尾鮰疱疹病毒的快速检测试剂盒，其中，在25μl由试剂盒制成的反应体系中ORF77-F3终浓度为0.2μM，ORF77-B3终浓度为0.2μM，ORF77-FIP终浓度为1.6μM，ORF77-BIP终浓度为1.6μM，ORF77-LF终浓度为0.8μM，ORF77-LB终浓度为0.8μM，LAMP反应液12.5μl，Bst DNA聚合酶10U，10×SYTO-9 0.5μl，待检DNA 1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；
[0024] 本发明还提供了一种斑点叉尾鮰疱疹病毒的快速检测方法，包括如下步骤：
[0025] (1)鮰疱疹病毒DNA的提取：从待检斑点叉尾鮰组织中切取组织材料置于灭菌后的研钵中，加入液氮
研磨后转入离心管中，加入200μl DNA提取缓冲液，5μl蛋白酶K混匀，置于50～60℃水浴锅中加热2h，冷却至室温，用等体积的酚抽提一次，2500rpm/min离心收集水相，用等体积的酚-氯仿-异丙醇混合物抽提一次，2500rpm/min离心收集水相；加入等体积的异丙醇沉淀，加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠与2倍体积的-20℃预冷的无水
乙醇-20℃，20分钟，12000rpm/min室温离心5分钟，沉淀溶于灭菌纯净水中，置于-20℃备用；
[0026] (2)恒温基因扩增反应：所述恒温基因扩增反应按照下述反应体系进行：
[0027] 25μl反应体系含有：ORF77-F3 0.2μM，ORF77-B3 0.2μM，ORF77-FIP 1.6μM，ORF77-BIP 1.6μM，ORF77-LF 0.8μM，ORF77-LB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，Bst DNA聚合酶10U，10×SYTO-9 0.5μl，待检DNA 1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；
[0028] (3)结果判断：将反应管中置于实时荧光定量PCR仪中，根据仪器实时读取的荧光
信号来判断扩增结果，出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
[0029] 有益效果
[0030] 本发明的检测方法操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度高、结果可靠，能在斑点叉尾鮰疱疹病毒病早期快速诊断和实时监测方面发挥重要作用，适合斑点叉尾鮰养殖现场使用。具体表现在：
[0031] (1)特异性好：对
白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织
坏死病毒(IHHNV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)DNA不发生扩增。
[0032] (2)灵敏度高：最低检测极限可达到101copies/μl。
[0033] (3)操作简单：环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型核酸扩增技术，该技术在保持传统PCR技术优点的
基础上，进一步增强了反应的特异性和缩短了检测时间；特别是它可以不需使用昂贵的热循环仪，凝胶
电泳和紫外检测等设备，降低了成本，已广泛应用于病原
微生物的现场化检测。本发明的技术方案不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定
温度仪就能反应和检测，在研发中通过荧光定量PCR仪实时读取的SYTO-9荧
光信号来判断扩增结果，在推广应用是可使用国产恒温荧光检测仪，后者对操作者技术要求不高，适合斑点叉尾鮰养殖现场使用。
附图说明
[0034] 图1为
实施例3中LAMP检测斑点叉尾鮰疱疹病毒的特异性结果图。
[0035] 图2为实施例4中LAMP检测斑点叉尾鮰疱疹病毒的灵敏性结果图,其中，从左到右依次为108copies/μl～101copies/μl及阴性对照。
[0036] 图3为实施例5中LAMP检测斑点叉尾鮰疱疹病毒的重复性结果图。
具体实施方式
[0037] 下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0038] 实施例1：用于检测斑点叉尾鮰疱疹病毒的试剂盒建立
[0039] 基于LAMP技术建立的用于检测斑点叉尾鮰疱疹病毒的试剂盒，包括LAMP引物组、Bst DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照和显色剂SYTO-9。
[0040] (1)LAMP引物设计：以斑点叉尾鮰疱疹病毒携带的蛋白OFR77基因为靶点进行LAMP引物的设计。引物序列见表1。
[0042]
[0043] (2)LAMP反应液：含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2。
[0044] (3)阳性对照为含有斑点叉尾鮰疱疹病毒ORF77基因片段的质粒DNA，其制备方法为：提取鮰疱疹病毒DNA，利用表1中的外引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)对进行扩增，所得基因片段长度为413bp，序列如SEQ ID NO:7所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，获得的质粒即为阳性对照。
[0045] (4)阴性对照为超纯水。
[0046] 实施例2：使用实时荧光定量PCR仪建立斑点叉尾鮰疱疹病毒检测方法：
[0047] 利用实施例1的试剂盒检测斑点叉尾鮰疱疹病毒的方法，包括如下步骤：
[0048] (1)鮰疱疹病毒DNA的制备：从待检斑点叉尾鮰组织中切取组织材料置于灭菌后的研钵中，加入液氮研磨后转入离心管中，加入200μl DNA提取缓冲液(10mmol/L Tris-cl，0.1mol/L EDTA,05％SDS)，5μl蛋白酶K(100μg/ml)混匀，置于50～60℃水浴锅中加热2h，冷却置室温，用等体积的酚抽提一次，2500rpm/min离心收集水相，用等体积(酚-氯仿-异丙醇)混合物抽提一次，2500rpm/min离心收集水相。加入等体积的异丙醇沉淀，加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(pH 5.2)与2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇-20℃，20分钟，12000rpm/min室温离心5分钟，沉淀溶于灭菌纯净水中，置于-20℃备用。
[0049] (2)恒温基因扩增反应：所述恒温基因扩增反应按照下述反应体系进行：25μl反应体系含有：ORF77-F3 0.2μM，ORF77-B3 0.2μM，ORF77-FIP 1.6μM，ORF77-BIP 1.6μM，ORF77-LF 0.8μM，ORF77-LB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，Bst DNA聚合酶10U，10×SYTO-9 0.5μl，待检DNA 1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；
[0050] (3)结果判断：将反应管放置在实时荧光定量PCR仪中进行反应，观察实时荧光定量PCR仪软件判断扩增结果，如果出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
[0051] 实施例3：检测特异性实验：
[0052] 用实施例1的方法分别对鮰疱疹病毒阳性DNA及白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、真鲷虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、石斑鱼虹彩病毒的DNA进行检测。
[0053] 鉴定结果如图1所示：以斑点叉尾鮰疱疹病毒LAMP引物组进行扩增反应，鮰疱疹病毒阳性DNA正常扩增，阴性水对照及锦鲤疱疹病毒、蛙虹彩病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒没有扩增，显示出良好的特异性。
[0054] 实施例4：检测灵敏度实验：
[0055] 将含有斑点叉尾鮰疱疹病毒ORF77基因片段的质粒进行定量，测定其浓度并根据分子量计算质粒拷贝数，稀释到108copies/μl、107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl。用实施例2的操作方法分别对稀释后的阳性克隆进行检测。鉴定结果如图2所示：对阳性质粒的
检测限达到102copies/μl；
[0056] 实施例5：检测重复性实验：
[0057] 将含有斑点叉尾鮰疱疹病毒ORF77基因片段的质粒进行定量，测定其浓度并根据分子量计算质粒拷贝数，稀释到102copies/μl，用实施例2的操作方法对稀释后的阳性克隆进行检测。鉴定结果如图3所示：同一次实验内，20个平行样品的扩增曲线基本上是重合的，表明所建立的LAMP方法重复性较好。
[0058] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
