一种防治蔬菜真菌病害微生物农药的制备方法
阅读：349发布：2024-02-02
专利汇可以提供一种防治蔬菜真菌病害微生物农药的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种防治蔬菜 真菌 病害 微 生物 农药 的制备方法，属于微生物技术领域。该方法利用一种从浙江杭州临安天目山采集的土样中分离筛选出的 淀粉 酶产色链霉菌D，经过菌种的活化培养； 发酵 培养；发酵物提取；将所提纯的活性化合物配以农用药物辅料等步骤，制备成多种剂型的农用药物。该微 生物农药 可用于防治黄瓜枯萎病、番茄灰霉病或番茄早疫病等蔬菜真菌病害，其防治效果较常规化学药剂相当或略优，且安全。，下面是一种防治蔬菜真菌病害微生物农药的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种防治黄瓜枯萎病、番茄早疫病或番茄灰霉病的微生物农药的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种的活化培养：将淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)D菌种移至试管内高氏一号斜面上，在28℃±1℃条件下，培养至试管斜面长满孢子，所述的淀粉酶产色链霉菌D菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.2060；
(2)发酵培养：发酵培养液为每1000mL中含有玉米粉21.5g，可溶性淀粉10g，麸皮5g，CaCO3 2.5g，NH4NO3 1.5g，FeSO4 0.5g，KH2PO4 1.5g，待冷却至40℃，在无菌条件下接种淀粉酶产色链霉菌D至发酵培养液中，在28℃±1℃条件下，培养5天；
(3)发酵物提取：发酵完毕，收集发酵液，按常规化学方法提取、层析，分离纯化获得活性化合物丰加霉素；此活性化合物的结构式如下：
(4)将此化合物配以农用药物辅料，制备成多种剂型的农用药物。
2.根据权利要求1的方法，其中在步骤(3)的发酵物提取中，具体步骤为：发酵完毕后收集发酵液，向发酵液中加入等体积的正丁醇进行萃取，取上层，并在真空条件下浓缩至浸膏，再以蒸馏水溶解，离心取上清液，而后上Sephadex LH20柱层析，以体积比10％～90％的乙醇和蒸馏水梯度洗脱，分离纯化得活性化合物。
3.根据权利要求1的制备方法，其中在步骤(4)中，制备成可湿性粉剂或乳油的农用药物。
一种防治蔬菜真菌病害微生物农药的制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 放线菌(Actinomycetes)与人类的关系极为密切。据统计，在已发现的抗生素中，有70％约为放线菌所产生。土壤是放线菌栖居的重要场所，从土壤中获得具有高效抗菌活性的放线菌产生抗生素是目前世界范围内研制开发新医药和新农药必不可少的基础工作。
[0003] 目前对植物病害的防治，主要采用化学农药防治的方法。化学农药虽然对多种病害有较理想的防治效果，但长期使用会诱发病菌的抗药性。另外，农药的频繁使用不仅增加了农产品的生产成本，农药残留问题也十分严重。利用放线菌产生的抗病原真菌的活性物质进行植物真菌病害的生物防治，则具有周期短、易于研究、便于生产、无毒无害等优点。
[0004] 本发明从杭州的土壤中分离到一株生防放线菌，经微生物分类学鉴定为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)，并对此生防放线菌发酵代谢产物中的抗菌成分进行分离，得到了活性成分，经四大光谱分析，证明为已知核苷类抗生素，丰加霉素(Toyocamycin)。该发明为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株和生物活性化合物。
[0005] 以往对丰加霉素活性的报道主要集中在抗肿瘤方面，但由于其对人正常细胞的毒性太大，无法应用于临床。在抗菌活性的报道方面，丰加霉素主要抑制白假丝酵母，新隐球酵母，草分支杆菌和金黄色葡萄球菌等，几乎没有对植物病原菌(稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)除外)抑制作用的相关报道(陈伊，李舟，魏玉珍，等.根际放线菌I06-03431产生的核苷类抗生素3431的研究.生物学杂志，2009，26(4)：17-20)。本研究通过对淀粉酶产色链霉菌抗菌活性成分丰加霉素的研究发现，丰加霉素在低浓度就能强烈抑制黄瓜枯萎病菌(FusariumOxysporum)、番茄灰霉病菌(Botrytis Cinerea)和番茄早疫病菌(Alternaria solani)孢子萌发和菌丝生长。本发明正是填补了这项空白，拓宽了丰加霉素的应用。同时本发明中淀粉酶产色链霉菌产丰加霉素的发酵水平在105.6mg/L，相比文献(M.C.Flickinger，M.Greenstein，C.Bremmon，et al.Strain selection，medium development and scale-up of toyocamycin production byStreptomyces chrestomyceticus.Bioprocess Engineering，5(1990)：143-153)报道的产素水平约12mg/L要高出7.8倍。
发明内容
[0006] 本发明的目的是针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的不足，提供一种从杭州土壤中分离筛选出的放线菌-淀粉酶产色链霉菌D；本发明的另一目的是提供利用该菌株通过发酵提取其代谢产物制备成防治部分植物真菌病害的微生物农药及其制备方法。
[0007] 本发明淀粉酶产色链霉菌的分离、筛选与鉴定：
[0008] 是于2006年8月在浙江杭州临安天目山采集的土样中，经分离、培养、发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤获得并保存；经微生物分类学鉴定为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)，定名为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)D。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCC No.2060。保藏文件参见专利ZL200710156833.7的公开文本，公开号为CN101225368A。
[0009] 淀粉酶产色链霉菌D显微形态特征：孢子丝直、钩状、松散螺旋形，孢子长圆、椭圆或卵圆形。
[0010] 本发明所述的淀粉酶产色链霉菌D，经发酵提取可获得对部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的活性化合物丰加霉素(Toyocamycin)。
[0011] 本发明目的通过以下技术方案来实现：
[0012] 一种防治番茄灰霉病、黄瓜枯萎病或番茄早疫病等植物真菌病害微生物农药的制备方法，按以下步骤进行：
[0013] (1)菌种的活化培养：将分离保存的淀粉酶产色链霉菌D菌种移至试管内高氏一号斜面上，在28℃±1℃条件下，培养至试管斜面长满孢子；
[0014] (2)发酵培养：发酵培养液为每1000mL中含有玉米粉21.5g，可溶性淀粉10g，麸皮5g，CaCO32.5g，NH4NO31.5g，FeSO40.5g，KH2PO41.5g，灭菌；待冷却至40℃，在无菌条件下接种淀粉酶产色链霉菌D至发酵培养液中，在28℃±1℃条件下，培养5天；
[0015] (3)发酵物提取：发酵完毕，收集发酵液，按常规化学方法提取、层析，分离纯化获得活性化合物Toyocamycin，该化合物分子式为C12H13N5O4，结构式见下式；
[0016]
[0017] (4)将此活性化合物配以农用药物辅料，制备成多种剂型的农用药物。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 一是本发明从杭州土壤分离筛选出代谢物产量高、并对部分植物真菌病害病原菌具有较强抑制作用的淀粉酶产色链霉菌D，这为农业上防治植物真菌病害病原菌提供了一种微生物菌株；
[0020] 二是本发明提供了从淀粉酶产色链霉菌D的发酵物中提取其活性代谢产物丰加霉素Toyocamycin，并进而制备成可防治植物真菌病害的微生物源农药的制备方法；该农药应用于植物真菌病害的防治，其效果较常规化学药剂相仿或略优(见试验例表1-3)，为农用杀菌剂的开发增添了新的途径。
具体实施方式
[0021] 实施例1：(淀粉酶产色链霉菌D的分离与筛选)
[0022] 本发明于2006年8月在浙江临安天目山采集的土样中，经分离、培养、发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤，从中获得淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)D，保存。
[0023] 淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)D抑菌活性测定：取其发酵上清液1mL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面分别放1个直径为4mm的黄瓜枯萎病菌或番茄灰霉病菌或番茄早疫病菌等供试菌菌饼，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置培养箱中28℃培养36h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率：
[0024]
[0025] 测定结果表明：淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)D代谢产物对黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的抑制率分别为86.9％、83％和85.2％。
[0026] 实施例2：(淀粉酶产色链霉菌D发酵代谢产物的制备方法)
[0027] 按以下步骤进行：
[0028] (1)菌种试管斜面活化培养：斜面培养基为高氏一号培养基，其组分与含量为：K2HPO40.5g、KNO31g、MgSO40.5g、可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、FeSO40.01g、琼脂20g，溶化后补足水至1L；在无菌条件下用接种环挑取少许淀粉酶产色链霉菌D的孢子，至已灭菌的高氏一号培养基试管(15×150mm)中，置培养箱内28℃±1℃，活化培养96h，至试管斜面长满孢子；
[0029] (2)发酵培养：发酵培养液为每1000mL中含有黄玉米粉21.5g，可溶性淀粉10g，麸皮5g，CaCO32.5g，NH4NO31.5g，FeSO40.5g，KH2PO41.5g，余量为水；每300mL三角瓶装40mL发酵培养液，配制后121℃灭菌20min，待冷却至40℃在无菌条件下，挑取一铂金环淀粉酶产色链霉菌D孢子接种，28℃±1℃，发酵培养5天；
[0030] (3)发酵物提取：发酵完毕后收集发酵液，向发酵液中加入等体积的正丁醇进行萃取，取上层，并在真空条件下浓缩至浸膏，再以蒸馏水溶解，离心取上清液，而后上Sephadex LH20柱层析，以体积比10％～90％的乙醇和蒸馏水梯度洗脱，分离纯化得活性化合物Toyocamycin。
[0031] 本发明中淀粉酶产色链霉菌产丰加霉素的发酵水平在105.6mg/L，相比文 献 (M.C.Flickinger，M.Greenstein，C.Bremmon，et al.Strain selection，medium development and scale-upof toyocamycin production by Streptomyces chrestomyceticus.Bioprocess Engineering，5(1990)：143-153)报道的产素水平约12mg/L要高出7.8倍。
[0032] 以下实施例3、4中所述的淀粉酶产色链霉菌D代谢产物均为实施例2所制产品；所述产品的百分含量均为质量百分比。
[0033] 实施例3：(利用淀粉酶产色链霉菌D发酵代谢产物制备成可湿性粉剂)
[0034] 其中：
[0035] 白炭黑：(上海富奇化工有限公司生产)
[0036] 农乳0203-B：(邢台蓝星助剂厂生产)
[0037] 木质素磺酸钠：(上海威呈化工有限公司生产)
[0039] 产品含1.5％活性化合物Toyocamycin，加入2％的白炭黑作为吸附剂，并加入1％的农乳0203-B和3％的木质素磺酸钠辅料，最后用轻质碳酸钙补足到100％，混匀后，经气流粉碎制成可湿性粉剂(以下内容中称“产品A”)。
[0040] 实施例4：(利用淀粉酶产色链霉菌D发酵代谢产物制备成乳油)
[0041] 其中：
[0042] 乙醇(上海申兴制药厂生产)
[0043] 农乳0204(邢台蓝星助剂厂生产)
[0044] 二甲苯(上海申兴制药厂生产)
[0045] 产品2％的活性化合物Toyocamycin，用4％的乙醇溶解，加入质量5％农乳0204-C作为乳化剂，最后用二甲苯补足到100％，搅拌混匀制成乳油(以下内容中称“产品B”)。
[0046] 试验例：(本发明产品与常规农药防治效果对比试验)
[0047] 将“产品A、B”对黄瓜枯萎病或番茄灰霉病或番茄早疫病等植物病害进行防治试验，以常规化学农药、清水为对照，如表1、表2和表3所示，试制的农用杀菌剂“产品A、B”比常规化学农药防治效果相仿或略优。
[0048] 表1产品A对番茄灰霉病防效统计表
[0049] (药效试验均于2009年7月-9月在杭州市郊试验农田进行)
[0050]
[0051] 表2产品B对黄瓜枯萎病防效统计表
[0052] (药效试验均于2009年7月-9月在杭州市郊试验农田进行)
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