一种生物杀菌制剂及其在防治豆芽炭疽病中的应用
阅读：1037发布：2020-05-24
专利汇可以提供一种生物杀菌制剂及其在防治豆芽炭疽病中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于蔬菜杀菌技术领域，公开了一种针对豆芽 炭疽病 的特异性的 生物 杀菌制剂DY-6，该生物杀菌制剂DY-6包括羧甲基壳聚糖、脱乙酰化壳聚糖和苯 甲酸 钠，其中，羧甲基壳聚糖、壳聚糖和 苯甲酸 钠的 质量 比为1～5:5～12:15～24。该生物杀菌制剂能够显著抑制豆芽炭疽病菌的菌丝生长和孢子萌发，适用于豆芽生产中对豆芽炭疽病的控制，并且相对于市面上常用的多菌灵和百菌清等 杀菌剂 ，具有安全性高，无 农药 残留的优点，保证了豆芽的食用安全性和良好品相。，下面是一种生物杀菌制剂及其在防治豆芽炭疽病中的应用专利的具体信息内容。
1.一种生物杀菌制剂，其特征在于，所述生物杀菌制剂包括羧甲基壳聚糖、壳聚糖和苯甲酸钠。
2.根据权利要求1所述的生物杀菌制剂，其特征在于，所述的壳聚糖为脱乙酰化壳聚糖。
3.根据权利要求2所述的生物杀菌制剂，其特征在于，所述的脱乙酰化壳聚糖的脱乙酰度≥95％。
4.根据权利要求1所述的生物杀菌制剂，其特征在于，所述生物杀菌制剂中羧甲基壳聚糖、壳聚糖和苯甲酸钠的质量比为1～5:5～12:15～24。
5.根据权利要求4所述的生物杀菌制剂，其特征在于，所述生物杀菌制剂中羧甲基壳聚糖、壳聚糖和苯甲酸钠的质量比为1:8:20。
6.根据权利要求1所述的生物杀菌制剂，其特征在于，所述生物杀菌制剂的剂型为水剂、水分散粒剂、可湿性粉剂或微胶囊剂。
7.如权利要求1～6任一项所述的生物杀菌制剂在防治豆芽炭疽病病害方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)将羧甲基壳聚糖、壳聚糖和苯甲酸钠按比例复配，制备得到所述生物杀菌制剂；
2)将所制备的生物杀菌制剂加水配置成药液，将用于制备豆芽的原料种子放置于所述药液中，搅拌浸泡1～3h后，于24～32℃条件下培育，获得豆芽。
一种生物杀菌制剂及其在防治豆芽炭疽病中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于蔬菜杀菌技术领域，具体涉及一种生物杀菌制剂及其在防治豆芽炭疽病中的应用。
背景技术
[0002] 豆芽，又称芽苗菜，是由各种谷类、豆类或树类的种子在适宜的水分、温度、空气和黑暗的环境条件下培育而成，以鲜嫩的幼芽(下胚轴或胚根或未展开的子叶)供食，包括黄豆芽、绿豆芽、黑豆芽、豌豆芽、蚕豆芽等。传统的豆芽生产工艺，通过采用控制温度、淋水等技术手段，以生产出下胚轴粗壮、脆嫩、胚根短的产品。随着生活水平的提高，人们对豆芽的适口性有了更高的要求，粗壮、白嫩、甜脆、无胚根的豆芽越来越受到消费者的青睐，已成为大众消费者主要购买的菜品，经济效益显著，发展潜力巨大。
[0003] 然而，豆芽生产过程中炭疽病的发生严重制约了豆芽产业的发展。豆芽炭疽病是豆芽出芽期的主要病害，是一种由炭疽病菌引起的普遍性的真菌病害。炭疽病菌是一种典型的高温高湿性病菌，其主要危害豆芽的胚根，在豆芽胚根的不同位置均可发病，发病初期为水渍状大斑，后慢慢扩大引起腐烂。由于豆芽出芽时需要大量水分，炭疽病一旦发生，在温湿度适宜的情况下，会大面积迅速蔓延，发病率达80％以上，严重影响豆芽的品相和口感。
[0004] 在豆芽生产过程中芽菜的安全性是人们关注的主要问题。目前，很多工厂在豆芽生产过程中通过添加化学药品来抑制豆芽炭疽病的发生，例如百菌清和多菌灵等。上述化学药品的使用虽然遏制了炭疽病的发生率，使豆芽在外观上有了较大的改善，但在豆芽生产中也产生了一些潜在的安全问题，例如农药残留量使豆芽菜变成了“毒豆芽”，造成了较大的安全隐患。因此，为确保豆芽的食用安全性，需要对传统豆芽生产过程中使用的杀菌剂进行改进，以期制备一种安全、无毒副作用、并能高效防治炭疽病的生物杀菌制剂，为无毒豆芽的生产和豆芽产业的更好发展提供技术指导。
发明内容
[0005] 本发明目的在于提供一种在豆芽生产过程中的生物杀菌制剂DY-6，该生物杀菌制剂DY-6可以有效抑制豆芽炭疽病的发生，并且具有较高的安全性。
[0006] 在一些优选的方式中，所述生物杀菌制剂包括羧甲基壳聚糖、壳聚糖和苯甲酸钠。
[0007] 在一些优选的方式中，所述的壳聚糖为脱乙酰化壳聚糖。
[0008] 在一些优选的方式中，所述的脱乙酰化壳聚糖的脱乙酰度≥95％。
[0010] 在一些优选的方式中，所述生物杀菌制剂中羧甲基壳聚糖、壳聚糖和苯甲酸钠的质量比为1:8:20。
[0011] 在一些优选的方式中，所述生物杀菌制剂的剂型为水剂、水分散粒剂、可湿性粉剂或微胶囊剂。
[0012] 可通过将本发明的生物杀菌制剂与本领域允许使用和可以接受的填料，和/或助剂例如湿润剂、分散剂等复配以制备形成便于运输和保存的剂型，例如可湿性粉剂等。其中，填料包括膨润土、高岭土、白炭黑、滑石粉、硅藻土、淀粉、轻质碳酸钙、凹凸棒土等，助剂包括十二烷基磺酸钠、丙二醇、丙三醇、甘油等。
[0013] 在一些优选的方式中，本发明提供了上述的生物杀菌制剂DY-6在防治豆芽炭疽病病害方面的应用。
[0014] 在一些优选的方式中，应用本发明的生物杀菌制剂DY-6进行豆芽培育主要包括以下步骤：
[0015] 1)将羧甲基壳聚糖、壳聚糖和苯甲酸钠按比例复配，制备得到所述生物杀菌制剂；
[0016] 2)将所制备的生物杀菌制剂加水配置成药液，将用于制备豆芽的原料种子放置于所述药液中，搅拌浸泡1～3h后，于24～32℃条件下培育，获得豆芽。
[0017] 其中，生物杀菌制剂加水配制药液时，水的加入量可根据实际情况进行选择，优选每0.1mg杀菌制剂加10～40mL无菌水充分溶解。
[0018] 羧甲基壳聚糖和脱乙酰化壳聚糖是常见的水溶性壳聚糖衍生物，具有广谱抗菌性，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的多数菌属都有很好的抑制作用，对由病毒、真菌、细菌等引起的病害均具有有效的防治作用。壳聚糖无味无毒，抗菌性强，并且具有保鲜作用，能够通过抑制炭疽病菌而防治豆芽炭疽病，使豆芽具有良好的外观形态，并且无有害物质残留，可以直接食用，保证了食品的安全性。
[0019] 苯甲酸钠是食品中常用的防腐剂，能有效防止食物腐烂变质，延长保质期。豆芽的生长需要足够高的水分和温度，极易发生腐烂，本发明通过将食品中常用的防腐剂苯甲酸钠与壳聚糖复配，所制备的生物杀菌制剂能有效防治豆芽腐烂，并且具有较高的安全性。
[0020] 本发明的有益效果为：
[0021] (1)本发明针对豆芽的常见病害和食用特点，公开了一种针对豆芽炭疽病的特异性的生物杀菌制剂DY-6，该生物杀菌制剂DY-6包括羧甲基壳聚糖、脱乙酰化壳聚糖和苯甲酸钠，这三种物质发挥协同增效，使得复配形成的杀菌制剂能够显著抑制豆芽炭疽病菌的菌丝生长和孢子萌发，适用于豆芽生产中对豆芽炭疽病的控制，并且相对于市面上常用的多菌灵和百菌清等杀菌剂，具有安全性高，无农药残留的优点，保证了豆芽的食用安全性。
[0022] (2)本发明的生物杀菌制剂DY-6包括水溶性壳聚糖，在发挥抗菌作用的同时具有保鲜作用，能够增加豆芽的品相，使豆芽具有正常的外形、色泽及固有形态，无打蔫或腐烂，能够使豆芽在上架的3天内保持新鲜状态。
[0024] (4)本发明的生物杀菌制剂DY-6使用便捷、省时、安全，具有较好的实际应用价值。
具体实施方式
[0025] 下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0026] 在本发明中，若无特别指明，实施例中采用的方法为本领域通用技术，所有的设备和原料等均为本行业常用产品，可从市场中购得。其中，羧甲基壳聚糖：取代度：≥80％，CAS：83512-85-0，上海麦克林生物有限公司；脱乙酰化壳聚糖：粘度100-200mpa.s，上海麦克林生物有限公司；苯甲酸钠：纯度＞99％，重金属含量＜20ppm，CAS：532-32-1，上海生工生物有限公司；多菌灵(蓝丰)：50％可湿性粉剂，江苏蓝丰生物化工股份有限公司；百菌清(达科宁)：75％可湿性粉剂，先正达(苏州)作物保护有限公司。
[0027] 在本发明中所述的豆芽炭疽病菌由浙江省农业科学院植物保护微生物研究所经济作物病害室从发病豆芽植株上分离并低温保存，经鉴定该病毒为炭疽菌属Colletotrichum尖孢炭疽菌(C.acutatum)。
[0028] 实施例1：不同脱乙酰度的脱乙酰化壳聚糖对豆芽炭疽病菌生长的影响[0029] 采用生长速率法，测定不同脱乙酰度的脱乙酰化壳聚糖对豆芽炭疽病菌菌丝生长的影响，其中，供试脱乙酰化壳聚糖的脱乙酰度分别为54％、66％、88％、90％、95％和97％，将供试脱乙酰化壳聚糖分别配制1×103mg·L-1质量浓度，加入PDA培养基中混匀制成含不同脱乙酰化壳聚糖的含药PDA平板。将在PDA平板中培养好的豆芽炭疽病菌菌株菌落用打孔器打取直径为5mm大小的菌饼，菌丝面朝下接种于含药PDA平板中央，并不含药的PDA平板为空白对照，将上述PDA平板置于26℃恒温培养箱内连续培养5d后，采用十字交叉法测量供试菌株菌落直径，并记录数据。
[0030] 进一步测定不同脱乙酰度的脱乙酰化壳聚糖对豆芽炭疽病菌孢子萌发的影响，分别称取0.1mg的不同脱乙酰化壳聚糖，将其充分溶解在10mL无菌蒸馏水中用于孢子萌发试验，豆芽炭疽菌孢子液浓度为107个/mL。吸取5mL配置好的药液加入5mL孢子悬液中，等比例混合。加好药剂的混合液置于26℃恒温水浴锅内连续培养24h、48h后测量孢子萌发个数，表中数值为3次重复平均值。
[0031] 表1不同脱乙酰化壳聚糖对豆芽炭疽病菌菌丝生长的影响
[0032]
[0033] 注：菌落直径为3次重复，表1种菌落直径长径短径均为平均值
[0034] 表2不同脱乙酰化壳聚糖对豆芽炭疽病菌孢子萌发的影响
[0035]
[0036] 从表1和表2的数据可以看出，不同脱乙酰度的脱乙酰化壳聚糖对炭疽病病原菌菌丝生长和孢子萌发具有不同的影响，对菌丝生长和孢子萌发的影响随着脱乙酰度的增大而呈现增大的趋势，当脱乙酰度≥95％时，对菌丝生长和孢子萌发的抑制显著高于54％、66％、88％、90％脱乙酰度的壳聚糖，由此认为脱乙酰度≥95％的脱乙酰化壳聚糖对炭疽病病菌具有更为显著的抑制效果。
[0037] 实施例2：羧甲基壳聚糖、脱乙酰化壳聚糖、苯甲酸钠以及三者复配对豆芽炭疽病菌生长的影响
[0038] 本实施例测定了羧甲基壳聚糖、脱乙酰化壳聚糖(脱乙酰度为95％)、苯甲酸钠，以及羧甲基壳聚糖、脱乙酰化壳聚糖(脱乙酰度为95％)和苯甲酸钠三者以不同比例复配后所制备的杀菌剂对豆芽炭疽病菌菌丝生长和孢子萌发的影响，其中，A1为羧甲基壳聚糖；A2为脱乙酰化壳聚糖；A3为苯甲酸钠；A4为羧甲基壳聚糖、脱乙酰化壳聚糖和苯甲酸钠按质量比为1:1:1复配而成；A5为羧甲基壳聚糖、脱乙酰化壳聚糖和苯甲酸钠按质量比为1:5:15复配而成；A6为羧甲基壳聚糖、脱乙酰化壳聚糖和苯甲酸钠按质量比为1:8:20复配而成；A7为羧甲基壳聚糖、脱乙酰化壳聚糖和苯甲酸钠按质量比为5:12:24复配而成；A8为空白对照，将上述实验组的试剂分别配制成1×103mg·L-1质量浓度，加入PDA培养基中混匀制成含药PDA平板，并根据实施例1所述的方法进行炭疽病菌接种及培养，并测定菌落直径。
[0039] 将A1～A8不同处理组的杀菌制剂分别加水配置成药液用于孢子萌发试验，其中，每0.1mg杀菌制剂加10mL无菌水充分溶解。豆芽炭疽菌孢子液浓度为107个/mL，吸取5mL配置好的药液加入5mL孢子悬液中，等比例混合。加好药剂的混合液置于26℃恒温水浴锅内连续培养24h、48h后测量孢子萌发个数。
[0040] 表3不同处理组对豆芽炭疽病菌菌丝生长的影响
[0041]
[0042] 注：菌落直径为3次重复，表1种菌落直径长径短径均为平均值
[0043] 表4不同处理组对豆芽炭疽病菌孢子萌发的影响
[0044]
[0045] 从实验结果可以看出，羧甲基壳聚糖、脱乙酰化壳聚糖和苯甲酸钠对炭疽病菌的菌丝生长和孢子萌发都具有一定的抑制作用，其中，羧甲基壳聚糖和脱乙酰化壳聚糖的抑制作用强于苯甲酸钠。通过将三者按比例复配后发现，抑制作用显著增强，可能是三者之间协同作用，使得抑菌作用显著增强，并且羧甲基壳聚糖、脱乙酰化壳聚糖和苯甲酸钠按质量比为1:5:15、1:8:20和5:12:24复配的效果好于按质量比为1:1:1复配。
[0046] 实施例3：不同杀菌剂对豆芽炭疽病菌菌丝生长的影响
[0047] 采用生长速率法，测定不同杀菌制剂对豆芽炭疽病菌菌丝生长的影响。将供试杀菌制剂分别配制成1×103mg·L-1、1×102mg·L-1、10mg·L-1、1mg·L-1、0.1mg·L-1质量浓度，加入PDA培养基中混匀制成含药平板。将在PDA平板中培养好的供试菌株菌落用打孔器打取直径为5mm大小的菌饼，菌丝面朝下接种于含药PDA平板中央，不含药的PDA平板为空白对照。采用十字交叉法测量供试菌株菌落直径，并记录数据。与对照比较计算各杀菌剂处理对病菌的生长抑制率，抑制率(％)＝(处理组菌落直径-对照组菌落直径)/(对照组菌落直径-菌饼直径)×100％。以浓度自然对数为自变量、Probit(抑制率)为因变量得毒力回归方程，根据方程计算杀菌制剂对病原菌的半数有效浓度(EC50)。
[0048] 试验结果如下表1，其中，A1：本发明生物杀菌制剂，该杀菌制剂由羧甲基壳聚糖、脱乙酰化壳聚糖(脱乙酰度为95％)和苯甲酸钠组成，其中，羧甲基壳聚糖、脱乙酰化壳聚糖和苯甲酸钠的质量比为1:8:20；A2：百菌清；A3：多菌灵；A4：乙蒜素；A5：空白对照。将接种后的不同含药平板置于26℃恒温培养箱内连续培养5d后测量菌丝直径，表中数值为3次重复平均值。
[0049] 表5不同杀菌制剂对豆芽炭疽病菌菌丝生长的影响
[0050]
[0051]
[0052] 注：菌落直径为3次重复，表1种菌落直径长径短径均为平均值
[0053] 由表1中的结果可以看出，本发明的生物杀菌制剂对豆芽炭疽病的菌丝生长抑制效果最好，菌落直径均＜20mm，并且EC50值最低，常用的百菌清和多菌灵对菌丝直径的生长有一定的抑制作用，乙蒜素基本对豆芽炭疽病没有影响。
[0054] 实施例4：不同杀菌剂对豆芽炭疽病菌孢子萌发的影响
[0055] 同实施例3中的杀菌制剂种类，将不同杀菌制剂加水配置成药液用于孢子萌发试验，其中，每0.1mg杀菌制剂加10mL无菌水充分溶解。豆芽炭疽菌孢子液浓度为107个/mL，吸取5mL配置好的杀菌制剂加入5mL孢子悬液中，等比例混合。
[0056] 试验结果如下表2，其中A1：本发明的生物杀菌制剂；A2：百菌清；A3：多菌灵；A4：乙蒜素；A5：空白对照，加好药剂的混合液置于26℃恒温水浴锅内连续培养24h、48h后测量孢子萌发个数，表中数值为3次重复平均值。
[0057] 表6不同杀菌制剂对豆芽炭疽病菌孢子萌发的影响
[0058]
[0059] 由表2中的结果可以看出，本发明的生物杀菌制剂对豆芽炭疽病菌孢子萌发的抑制效果最好，24h后孢子萌发率为0，48h后孢子虽然有萌发，但是萌发率极低，常用的百菌清和多菌灵对豆芽炭疽病孢子萌发有一定的抑制作用，乙蒜素基本对豆芽炭疽病孢子萌发基本没有影响。
[0060] 实施例5：不同杀菌制剂对豆芽品质的影响
[0061] 同实施例3杀菌制剂种类，将不同杀菌制剂加水配置成药液，其中，每0.1mg杀菌制剂加10mL无菌水充分溶解。取500颗饱满绿豆置于配置好的杀菌制剂溶液中，搅拌浸泡2h后沥干后放置于26摄氏度培养箱中催芽，3d、5d、7d后观察豆芽发病情况，并记录豆芽生长状况。
[0062] 试验结果如下表3，其中A1：本发明的生物杀菌制剂；A2：百菌清；A3：多菌灵；A4：乙蒜素；A5：空白对照，表中数值为3次重复平均值。
[0063] 表7不同杀菌剂对豆芽炭疽病菌孢子萌发的影响(％)
[0064]
[0065] 由表3中的结果可以看出，本发明的生物杀菌制剂对豆芽的发芽率没有明显影响，而且对炭疽病的发生具有很强的抑制作用，并且持效性显著好于其他杀菌制剂，7天后豆芽仍没有炭疽病的发生，豆芽的感官指标优质。
[0066] 实施例6：生物杀菌制剂对豆芽安全性的影响
[0067] 分别采用如下方法对本发明的生物杀菌制剂处理后的豆芽的理化指标和微生物指标进行检测：
[0068] (1)理化指标
[0069] 铅按GB/T5009.12规定的方法测定；亚硫酸盐按照GB/T5009.34规定的方法测定；6-苄基腺嘌呤(6-BA)按GB/T 23381的规定的方法测定；赤霉素(酸)(GA3)按照SNT 0350的规定的方法测定；4-氯苯氧乙酸钠按照DBS22/001的规定的方法测定。
[0070] (2)微生物指标
[0071] 沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌分别按照GB/T4789.4、GB/T4789.5和GB/T4789.10规定的方法检验。
[0072] 表8本发明生物杀菌制剂处理后的豆芽的理化指标和微生物指标检测结果[0073]
[0074] 由表8中的结果可以看出，本发明的生物杀菌制剂对豆芽有很好的消毒杀菌作用，在处理的豆芽中均未检出沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌，符合国家标准-豆芽卫生标准GB22556-2008，并且采用本发明的生物杀菌制剂处理后的豆芽的理化指标符合标准，安全性高，可以直接食用。
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