一种二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途
专利汇可以提供一种二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种二 酮 哌嗪类化合物及其制备方法和用途，特点是该二酮哌嗪类化合物的结构式如Ⅰ所示，其制备方法步骤包括将保藏号为CCTCC NO：M2019824的海洋细菌（Gallaecimonas mangrovi）通过 微 生物 发酵 培养来获取二酮哌嗪类化合物的发酵物，然后将发酵物用甲醇浸泡、乙酸乙酯提取，得粗浸膏，将该粗浸膏经减压 硅 胶柱层析，凝胶柱层析，中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，优点是该二酮哌嗪类化合物具有抗哈维弧菌作用，可以作为抗鱼类致病菌哈维弧菌作用的新药物成分。，下面是一种二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途专利的具体信息内容。
1.一种二酮哌嗪类化合物，其特征在于该化合物分子式为C15H17N3O3，结构式如（I）所示：
（I）。
2.一种权利要求1所述的二酮哌嗪类化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）发酵培养
将保藏号为CCTCC NO：M2019824的海洋细菌（Gallaecimonas mangrovi）在含有固体MB
2216培养基的平板上划线活化，置于28 ℃培养箱中静置培养2～3天；用灭过菌的移液枪在平板上挑取一个单菌落接种到液体MB 2216培养基中，然后置于摇床上培养，温度25 ℃，转速为150 rpm/min，培养1 d后收集为种子液，然后将种子液接种到含有液体MB 2216培养基的锥形瓶中，然后置于摇床上，于温度25 ℃，转速为150 rpm/min下，发酵培养6 d，获得发酵物；
（2）浸膏提取
将步骤（1）得到的发酵物在5500 rpm/min的条件下离心10 min，分别收集上清液和菌体；将上清液用等体积的乙酸乙酯重复萃取三次，合并三次萃取所得萃取液，然后旋转蒸干，甲醇复溶，备用；将菌体用甲醇超声浸泡，超声破碎30 min后取其上清液旋转蒸干，用水复溶，再用与复溶液等体积的乙酸乙酯重复萃取三次，合并三次萃取所得萃取液，旋蒸蒸干，用甲醇溶解，备用；将两次甲醇复溶发酵提取液合并，旋转蒸干，得发酵液粗浸膏；
（3）化合物的分离制备
将步骤（2）得到的发酵液粗浸膏首先用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200～300目硅胶拌样，采用体积比为5:1～0:1的石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，进行VLC减压柱层析，收集洗脱组分；再采用体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇为洗脱剂对收集的组分进行LH-20凝胶柱层析，收集洗脱组分，共得到3个组分；然后对收集的第2个组分进行中压柱层析，采用甲醇和水为洗脱剂，甲醇从25 60%，洗脱时间150 min；最后将收集的洗脱液经~
过半制备反相高效液相色谱对化合物进行分离纯化，流动相为乙腈与水按体积比20:80的比例混合而成，分离得到二酮哌嗪类化合物，其结构式如（I）所示：
（I）。
3.根据权利要求2所述的一种二酮哌嗪类化合物的制备方法，其特征在于：所述的液体MB 2216培养基的配制方法如下：将蛋白胨5.0 g、酵母提取物1.0 g、氯化钠19.45 g、氯化镁12.6 g、硫酸镁6.64 g、氯化钙1.8 g、氯化钾0.55 g、碳酸氢钠0.16 g、柠檬酸铁0.1 g、氯化锶57.0 mg和配制好的微量元素液加入到1 L纯水中，所述的微量元素液配方为：KBr
80.0 mg，H3BO3 22.0 mg，NaSiO3.9H2O 9.3 mg，NaF 2.4 mg和NH4NO3 2.4 mg；所述的固体MB
2216培养基即在所述的液体MB 2216培养基中再加入15.0 g的琼脂粉。
4.根据权利要求2所述的一种二酮哌嗪类化合物的制备方法，其特征在于：所述的半制备反相高效液相色谱的流动相流速为2.0 mL/min。
5.一种权利要求1-4中任一项所述的二酮哌嗪类化合物的用途，其特征在于所述的二酮哌嗪类化合物具有在制备水产动物致病菌哈维弧菌抑制剂方面的用途。
一种二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途
技术领域
背景技术
发明内容
将保藏号为CCTCC NO：M2019824的海洋细菌（Gallaecimonas mangrovi）在含有固体MB
2216培养基的平板上划线活化，置于28 ℃培养箱中静置培养2～3天；用灭过菌的移液枪在平板上挑取一个单菌落接种到液体MB 2216培养基中，然后置于摇床上培养，温度25 ℃，转速为150 rpm/min，培养1 d后收集为种子液，然后将种子液接种到含有液体MB 2216培养基的锥形瓶中，然后置于摇床上，于温度25 ℃，转速为150 rpm/min下，发酵培养6 d，获得发酵物；
（2）浸膏提取
将步骤（1）得到的发酵物在5500 rpm/min的条件下离心10 min，分别收集上清液和菌体；将上清液用等体积的乙酸乙酯重复萃取三次，合并三次萃取所得萃取液，然后旋转蒸干，甲醇复溶，备用；将菌体用甲醇超声浸泡，超声破碎30 min后取其上清液旋转蒸干，用水复溶，再用与复溶液等体积的乙酸乙酯重复萃取三次，合并三次萃取所得萃取液，旋蒸蒸干，用甲醇溶解，备用；将两次甲醇复溶发酵提取液合并，旋转蒸干，得发酵液粗浸膏；
（3）化合物的分离制备
将步骤（2）得到的发酵液粗浸膏首先用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200～300目硅胶拌样，采用体积比为5:1～0:1的石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，进行VLC减压柱层析，收集洗脱组分；再采用体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇为洗脱剂对收集的组分进行LH-20凝胶柱层析，收集洗脱组分，共得到3个组分；然后对收集的第2个组分进行中压柱层析，采用甲醇和水为洗脱剂，甲醇从25 60%，洗脱时间150 min；最后将收集的洗脱液经~
过半制备反相高效液相色谱对化合物进行分离纯化，流动相为乙腈与水按体积比20:80的比例混合而成，分离得到二酮哌嗪类化合物，其结构式如（I）所示：
（I）。
具体实施方式
（I）。
（1）发酵培养
将保藏号为CCTCC NO：M2019824的海洋细菌（Gallaecimonas mangrovi）在含有固体MB
2216培养基的平板上划线活化，置于28 ℃培养箱中培养2～3天；用灭过菌的移液枪在平板上挑取一个单菌落接种到液体MB 2216培养基中，然后置于摇床上培养，温度25 ℃，转速为
150 rpm/min，培养1 d天后收集为种子液，然后将种子液接种到含有液体MB 2216培养基的
1 L锥形瓶中，向每瓶液体MB 2216培养基中倒入种子液20 mL，然后将液体MB 2216置于摇床上，于温度25 ℃，转速为150 rpm/min下，发酵培养6 d获得发酵物；其中液体MB 2216培养基的配制方法如下：将蛋白胨5.0 g、酵母提取物1.0 g、氯化钠19.45 g、氯化镁12.6 g、硫酸镁6.64 g、氯化钙1.8 g、氯化钾0.55 g、碳酸氢钠0.16 g、柠檬酸铁0.1 g、氯化锶57.0 mg和配制好的微量元素液加入到1 L纯水中，所述的微量元素液配方为：KBr 80.0 mg，H3BO3 22.0 mg，NaSiO3.9H2O 9.3 mg，NaF 2.4 mg和NH4NO3 2.4 mg；固体MB 2216培养基即在液体MB 2216培养基中再加入15.0 g的琼脂粉；
（2）浸膏提取
将步骤（1）得到的发酵物在5500 rpm/min的条件下离心10 min，分别收集上清液和菌体；将上清液用等体积的乙酸乙酯重复萃取三次，合并三次萃取所得萃取液，然后旋转蒸干，甲醇复溶，备用；将菌体用甲醇超声浸泡，超声破碎30 min后取其上清液旋转蒸干，用水复溶，再用与复溶液等体积的乙酸乙酯重复萃取三次，合并三次萃取所得萃取液，旋蒸蒸干，用甲醇溶解，备用；将两次甲醇复溶发酵提取液合并，旋转蒸干，得发酵液粗浸膏；
（3）化合物的分离制备
将上述发酵液粗浸膏首先用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200～
300目硅胶拌样，采用体积比为5:1～0:1的石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，进行VLC减压柱层析，收集洗脱组分；再采用体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇为洗脱剂对收集的组分进行LH-20凝胶柱层析，收集洗脱组分，共得到3个组分；然后对收集的第2个组分进行中压柱层析，采用甲醇和水为洗脱剂，甲醇从25 60%，洗脱时间150 min；最后将收集的洗脱液经过半制备~
反相高效液相色谱对化合物进行分离纯化，流动相为乙腈与水按体积比20:80的比例混合而成，流速为2.0 mL/min，得到二酮哌嗪类化合物，其结构如式（I）所示：
（I）。
注 ：本表信号归属基于DEPT、1H-1H COSY、HSQC及HMBC图谱解析结果。氢信号多重度分别用s（单重峰）、d（二重峰）、t（三重峰）和 m（多重峰）表。
（1）实验样品
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离纯化的化合物1纯品，精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液供测活性。该实验使用的指示菌为哈维弧菌和副溶血弧菌；
（2）实验方法
使用96孔微孔板中的培养基微量稀释，对化合物1进行抗弧菌的实验。将指定的菌株分
6
别在MB 2216培养基中培养，稀释细菌悬浮液（10 CFU /毫升）。为了记录，将一系列不同浓度的试验化合物溶解在DMSO中，置于无菌96孔微孔板上，并分别接种哈维弧菌和副溶血弧菌在28 ℃下培养24小时。 每个平板含有180 μL稀释的细菌悬浮液和20 μL不同浓度的样品化合物。在无菌96孔微孔板中，测试化合物的最终浓度为128 μg/ mL，64 μg/ mL，32 μg/ mL，16 μg/ mL，8 μg/ mL，4 μg/ mL，2 μg/ mL。培养结束后，测定600 nm下吸光值，根据如下公式计算抑制率。抑制率（%）=(ODR-OD)/(ODR-ODB)，其中ODR ：菌液对照孔吸光值；ODB：
空白吸光值；OD：样品测定孔吸光值；
（3）实验结果
在96孔板抗弧菌测试中，不同浓度的化合物（I）对哈维弧菌抑制结果分别见表3。
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