技术领域
[0001] 本
发明属于动物细胞培养领域，具体地，涉及一种用于原代细胞培养的试剂盒及其应用。
背景技术
[0002] 原代培养也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的首次培养，较为严格地说，原代培养是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
[0003] 原代培养的细胞因为组织刚刚离体，其
生物学特性未发生很大变化，仍保留原二倍体遗传性，基因保留量在90％以上，适用于药物敏感性试验及机制探究相关试验，其数据更具有说服
力，同时通过原代培养技术建立相应病变细胞系或株，研究其病变、分子遗传以及转移演变机制等，对多种
疾病研究与
治疗起着举足轻重的作用。原代细胞作为分子生物学研究中的重要工具细胞，随着生物科学研究的急速发展，原代细胞在生物学实验中使用越来越广泛，与之相适应，原代细胞的需求量也呈现持续增长的趋势。因此，有必要发展能够快速培养原大量代细胞的方法以适应当今的科学发展需求。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于原代细胞培养的试剂盒及其应用，以快速地获取大量的原代细胞。
[0005] 根据本发明的一个方面，提供一种用于原代细胞培养的试剂盒，包括：培养液A、胎
牛血清、GlutaMAXTM补充液、青霉素-
链霉素-新霉素溶液、EGF、bFGF、胶原酶IV、DNA酶I、青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液；培养液A中添加有无机盐、
氨基酸和维生素；无机盐包括氯化
钙、
硫酸铜、
硝酸铁、硫酸亚铁、
硫酸镁、氯化
钾、
碳酸氢钠、
氯化钠、
磷酸一钠，磷酸二钠、硫酸锌中的至少一种；氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸
盐酸盐、L-天
门冬酰胺一
水物、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水物、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐一水物、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-
色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水物、L-缬氨酸中的至少一种；维生素包括维生素H、氯化胆
碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、维生素B5、维生素B6、维生素B2、维生素B1、维生素B12中的至少一种。
[0006] 本
发明人经过多次改进和尝试，发现培养于含有EGF或bFGF的培养基质中的原代细胞表现出优异的增殖潜能，本发明提供的用于原代细胞培养的试剂盒中提供了包括EGF、bFGF在内的试剂组，利用所提供的试剂组进行原代细胞培养，能够在短时间内高效地培养得到大量的原代细胞。
[0007] 优选地，无机盐包括的种类及其对应的在培养液A中的浓度如下：
氯化钙0.1–0.15g/L，硫酸铜0.5–1μg/L，硝酸铁10–80μg/L，硫酸亚铁0.2–0.5mg/L，硫酸镁0.05–1g/L，
氯化钾0.2–0.5g/L，
碳酸氢钠1–1.5g/L，氯化钠5–10g/L，磷酸一钠0.05–0.1g/L，磷酸二钠
0.05–0.1g/L，硫酸锌0.3–0.7mg/L。
[0008] 优选地，氨基酸包括的种类及其对应的在培养液A中的浓度如下：L-丙氨酸3–4mg/L，L-精氨酸盐酸盐0.1–0.2g/L，L-天门冬酰胺一水物5–10mg/L，L-天冬氨酸5–8mg/L，L-半胱氨酸盐酸盐一水物0.01–0.02g/L，L-胱氨酸二盐酸盐0.02–0.05g/L，L-谷氨酸5–10m g/L，L-谷氨酰胺0.2–0.5g/L，甘氨酸0.01–0.03g/L，L-组氨酸盐酸盐一水物0.02–0.05g/L，L-异亮氨酸0.03–0.07g/L，L-亮氨酸0.03–0.07g/L，L-赖氨酸盐酸盐0.07–0.12g/L，L-蛋氨酸15–20m g/L，L-苯丙氨酸0.02-0.05g/L，L-脯氨酸0.01–0.03g/L，L-丝氨酸0.02–0.05g/L，L-苏氨酸0.04–0.06g/L，L-色氨酸8–10mg/L，L-酪氨酸二钠盐二水物0.04–0.06g/L，L-缬氨酸0.04–0.06g/L。
[0009] 优选地，维生素包括的种类及其对应的在培养液A中的浓度如下：维生素H 2–5μg/L，氯化胆碱7–10mg/L，叶酸1.5–3mg/L，肌醇0.1–0.2g/L，烟酰胺1–4mg/L，维生素B5 1–4mg/L，维生素B6 1–4mg/L，维生素B2 0.1–0.3mg/L，维生素B1 1–3mg/L，维生素B12 0.5–1mg/L。
[0010] 针对原代
细胞增殖的营养需求，本发明的用于原代细胞培养的试剂盒提供了满足原代细胞增殖所需营养的培养液A，通过对其中所含有的氨基酸、无机盐以及维生素的种类以及含量进行限定，使培养液A提供的营养均衡，有利于原代细胞的吸收转化。
[0011] 优选地，培养液A中还添加有其他添加物，其他添加物包括D-
葡萄糖、羟乙基哌秦乙硫磺酸、次黄嘌呤、亚油酸、酚红、腐胺、丙
酮酸钠、DL-硫辛酸、胸腺嘧啶核苷中的至少一种。
[0012] 优选地，其他添加物包括DL-硫辛酸；在培养液A中，DL-硫辛酸的浓度为0.05–0.15mg/L。在原代细胞增殖生长的过程中，维生素，尤其是维生素C和维生素E的消耗速度较快，而在培养基质中的维生素C和维生素E的含量偏低，不足以满足原代细胞的利用需求时，DL-硫辛酸能够作为暂时的补给。
[0013] 优选地，其他添加物包括羟乙基哌秦乙硫磺酸和腐胺；在培养液A中，羟乙基哌秦乙硫磺酸的浓度为3–5g/L，腐胺的浓度为50–100μg/L。
[0014] 在原代细胞增殖的过程中，对培养基质的酸碱度水平具有严格的要求，在培养液A中，以羟乙基哌秦乙硫磺酸和腐胺协同地调节培养基质的酸碱度水平，使培养基质的pH值稳定在一定的范围内，避免因培养基质中的营养物质消耗导致培养基质的酸碱度水平剧变。另外，发明人还发现，腐胺的加入，也能够显著地提高原代细胞增殖的速度，其中原因有可能是因为腐胺能够与NMDA受体的多胺调控位点结合，加强NMDA诱导的发生，促进了
机体对微量元素的吸收和利用，但是详细的作用机制尚有待研究。
[0015] 优选地，其他添加物包括次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷；在培养液A中，次黄嘌呤的浓度为2–4mg/L，胸腺嘧啶核苷的浓度为0.2-0.5mg/L。
[0016] 根据细胞中的DNA合成途径，在原代细胞的增殖过程中，利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷作为原料，使这两者在酶的催化下生成相应的核苷酸，以此作为由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸这一主要的核苷酸生产途径的补充途径。由此，可以保证在原代细胞的生长、增殖过程中由足够的氨基酸供给。
[0017] 根据本发明的另一个方面，提供一种利用上述用于原代细胞培养的试剂盒培养原代细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.配制培养液B和解离液：培养液B包括以下组分:培养液A+5–20％胎牛血清1X GlutaMAXTM补充液+1X青霉素-链霉素-青霉素溶液+70–120ng/mL EGF+70–120ng/mL bFGF，解离液包括以下组分：培养液A、胎牛血清、胶原酶IV、DNA酶I、青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液，其中，培养液A、胎牛血清、DNA酶I、青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液的用量体积比为：培养液A：胎牛血清：DNA酶I：青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液＝35–4：6–15：2–3：0.1–1，胶原酶IV在解离液中的浓度为0.4–0.5g/L；S2.在培养液A中剪碎组织样本；S3.将经过S2处理后的组织样本置于解离液中消化，消化完毕后收集细胞；S4.将S3得到的细胞置于培养液B中进行培养。
[0018] 优选地，S1还包括以下步骤：配制保存液，保存液包括以下组分：培养液A+5–20％胎牛血清+1X青霉素-链霉素-新霉素溶液，配制清洗液，清洗液包括以下组分：生理盐水+0.5–1.2％青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液；S2的具体操作为：将取得的组织样本保存于保存液中带至细胞培养场所，将组织样本置于培养液A中，并在培养液A中剔除组织样本表面的血
块、脂肪，利用清洗液清洗组织样本，将组织样本再次置于培养液A中，并在培养液A中剪碎组织样本。
[0019] 依据上述方法，将本发明的原代细胞培养的试剂盒提供的试剂配制成各个阶段所需的溶液，并将其应用于原代细胞的培养中，能够有效地提高原代细胞培养的效率。
附图说明
[0020] 图1为根据表1提供的数据绘制的细胞数量统计图。
具体实施方式
[0021] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明
实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
[0022] 实施例1
[0023] 1.试剂盒的组装
[0024] 组装本实施例的用于原代细胞培养的试剂盒所需试剂如下：培养液A、胎牛血清(FBS)、GlutaMAXTM补充液、青霉素-链霉素-新霉素溶液、EGF(表皮细胞生长因子、bFGF(碱性
成纤维细胞生长因子)、胶原酶IV、DNA酶I、青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液、生理盐水，其中，GlutaMAXTM补充液的主要成分L-丙氨酸-L-谷氨酰胺二肽，购于ThermoFisherScientific。而培养液A的组分组成如表1所示。
[0025] 表1本实施例中涉及的培养液A的具体组分组成
[0026]
[0027]
[0028] 上述试剂组成的试剂组即为本实施例提供的用于原代细胞培养的试剂盒的核心组成部分。
[0029] 2.用于原代细胞培养的组织样本来源
[0030] 本实施例采用的组织样本为收集于某医科大学总医院普胸外科因
肺癌进行手术
切除的肺组织。
[0031] 3.原代细胞培养实验
[0032] 3.1配制所需试剂
[0033] 在常温下，按照以下组分组成配制培养液B、保存液、解离液和清洗液，其中，培养液B需要在每次使用前现配现用，若解离液为预配备用，则将解离液置于0℃以下冻存。
[0034] 培养液B:培养液A+10％FBS+1X GlutaMAXTM补充液+1X青霉素-链霉素-青霉素溶液+100ng/mL EGF+100ng/mL bFGF。
[0035] 保存液：培养液A+10％FBS+1X青霉素-链霉素-新霉素溶液。
[0036] 解离液：40mL培养液A+10mL FBS+0.5mL青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液(三抗)+25mg胶原酶IV+2.5mL DNA酶I(2000U/mg)(每瓶加10mL DMEM溶解)。
[0037] 清洗液：生理盐水+1％三抗。
[0038] 3.2试剂以及设备的预处理
[0039] 3.2.1灭菌：对
剪刀、
镊子、刀片、持针钳、培养瓶、培养皿等实验设备进行高压灭菌并烘干。
[0040] 3.2.2铺瓶：用配置好的0.1％明胶铺满一个培养瓶，放置
培养箱中1小时之后备用。
[0041] 3.2.3预热：实验前先把培养液A、培养液B、保存液在37℃水浴锅预热，解离液室温融解。
[0042] 3.3组织样本的处理
[0043] 3.3.1将手术取得的组织样本放入保存液中放置在
冰盒中带回细胞培养实验室。
[0044] 3.3.2在培养液A中，剔除组织样本表面的血块、脂肪等组织。
[0045] 3.3.3将组织样本在分装有清洗液的离心管中涮洗，涮洗3–4遍，然后将组织样本转移到培养皿中，利用清洗液清洗两遍。
[0046] 3.3.4将经过清洗之后的组织样本放入一个洁净的培养皿中，加入少量培养液A，用剪刀和镊子将组织样本剪碎，至无明显大块组织。
[0047] 3.3.5加入新鲜配制的解离液2mL–5mL(在其他实施例中，根据组织样本的大小添加解离液，标准为1cm3/5mL)，放入37℃培养箱中消化30分钟，期间持续观察消化情况。
[0048] 3.3.6消化完毕后，将组织样本转移到15mL的离心管中，将离心管放入离心机中，1000rpm离心8分钟，细胞位于下层沉淀中，弃去上清收集细胞。
[0049] 3.3.7采用200g的保存液清洗上一步骤收集的细胞，清洗两次，每次5分钟，每次清洗完后离心含有细胞的
混合液，弃去上清收集细胞。
[0050] 3.3.8将上一步骤收集的细胞加入到培养液B中，混匀，将细胞悬液铺置在铺设好0.1％明胶的培养瓶中，并将培养瓶转移到37℃培养箱中。
[0051] 3.4组织样本的培养
[0052] 3.4.1将进入正式进入培养期前三天设为预培养期，在预培养期内，每天对待培养的细胞悬液进行半换液，换液前，将用于换液的培养液B预热至37℃。
[0053] 3.4.2在预培养期后的第二天进入正式培养期，进入正式培养期后，收集经历了预培养期的细胞悬液清液，将清液收集到一个15mL的离心管中，并采用培养液A清洗培养瓶两次。
[0054] 3.4.3离心上一步骤得到的清液，1000rpm，5分钟，弃去离心后得到的上清液。
[0055] 3.4.4向上一步骤收集得到的沉淀物中加入新鲜的培养液B，混匀，加入到原来的培养瓶，
显微镜下观察，然后放入培养箱中培养。
[0056] 3.4.5培养过程中，每隔2–3天进行全换液，换液前，将用于换液的培养液B预热至37℃。
[0057] 对比实施例1
[0058] 作为实施例1的对比实施例，本实施例采用实施例1提供的用于原代细胞培养的试剂盒开展细胞培养实验，与实施例1相比，区别在于：本实施例在细胞培养实验开始前即采用试剂盒中提供的试剂预配培养液B，并且在细胞培养实验过程中皆采用在实验开展前预配的培养液B，而不在每个涉及培养液B的步骤开始前现配培养液B。除了上述区别之外，本实施例开展的细胞培养实验的各个步骤的操作以及参数设置均与实施例1严格保持一致。
[0059] 对比实施例2
[0060] 作为实施例1的对比实施例，本实施例采用商用的DMEM/F-12培养基(购于ThermoFisher Scientific)和RPMI培养基1640(购于ThermoFisher Scientific)开展原代细胞的培养实验。
[0061] 在本实施例中，各试剂的组成如下：
[0062] 培养液C：添加了10％FBS的DMEM/F-12培养基，洗涤液为RPMI培养基1640；
[0063] 消解液：添加有胰蛋白酶的DMEM/F-12培养基；
[0064] 洗涤液：RPMI培养基1640。
[0065] 原代细胞培养的具体过程如下：
[0066] 1.试剂以及设备的预处理
[0067] 1.1灭菌：对剪刀、镊子、刀片、持针钳、培养瓶、培养皿等实验设备进行高压灭菌并烘干。
[0068] 1.2铺瓶：用配置好的0.1％明胶铺满一个培养瓶，放置培养箱中1小时之后备用。
[0069] 2组织样本的处理
[0070] 2.1将手术取得的组织样本放入培养液C中放置在冰盒中带回细胞培养实验室。
[0071] 2.2在培养液C中，剔除组织样本表面的血块、脂肪等组织。
[0072] 2.3将组织样本在分装有洗涤液的离心管中涮洗，涮洗3–4遍，然后将组织样本转移到培养皿中，利用洗涤液清洗两遍。
[0073] 2.4将经过清洗之后的组织样本放入一个洁净的培养皿中，加入少量培养液C，用剪刀和镊子将组织样本剪碎，至无明显大块组织。
[0074] 2.5加入消解液2mL–5mL(在其他实施例中，根据组织样本的大小添加解离液，标准为1cm3/5mL)，放入培养箱中消化30分钟，期间持续观察消化情况。
[0075] 2.6消化完毕后，将组织样本转移到15mL的离心管中，将离心管放入离心机中，1000rpm离心8分钟，细胞位于下层沉淀中，弃去上清收集细胞。
[0076] 2.7采用200g的培养液C清洗上一步骤收集的细胞，清洗两次，每次5分钟，每次清洗完后离心含有细胞的混合液，弃去上清收集细胞。
[0077] 2.8将上一步骤收集的细胞加入到培养液C中，混匀，将细胞悬液铺置在铺设好0.1％明胶的培养瓶中，并将培养瓶转移到培养箱中。
[0078] 3组织样本的培养
[0079] 3.1将进入正式进入培养期前三天设为预培养期，在预培养期内，每天采用培养液C对待培养的细胞悬液进行半换液。
[0080] 3.2在预培养期后的第二天进入正式培养期，进入正式培养期后，收集经历了预培养期的细胞悬液清液，将清液收集到一个15mL的离心管中，并采用培养液C清洗培养瓶两次。
[0081] 3.3离心上一步骤得到的清液，1000rpm，5分钟，弃去离心后得到的上清液。
[0082] 3.4向上一步骤收集得到的沉淀物中加入新鲜的培养液C，混匀，加入到原来的培养瓶，显微镜下观察，然后放入培养箱中培养。
[0083] 3.5培养过程中，每隔2–3天采用培养液C进行全换液。
[0084] 实施例2
[0085] 本实施例为测试实施例，在实施例1、对比实施例1和对比实施例2的实验过程中，对原代培养的细胞进行计数，计数结果如表2和图1所示，由此可以看出，与现有的商用培养基相比，采用实施例1的用于原代细胞培养的试剂盒提供的试剂开展原代细胞培养实验，能够显著地提高原代细胞培养的效率。实施例1、对比实施例1和对比实施例2相比，实施例1提供的原代细胞培养方法最有利于原代细胞的增殖。
[0086] 表2进入正式培养期后各实施例的细胞培养数量(万个)
[0087]
[0088] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行
修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
