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具有改善的 铁硫簇递送的细胞工厂

阅读：285发布：2020-05-12

专利汇可以提供具有改善的铁硫簇递送的细胞工厂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种能够改善铁硫簇递送的经遗传修饰的细菌细胞，其特征在于编码突变的铁硫簇调节因子(IscR)的经修饰的基因以及编码增强生物素、硫辛酸或硫胺素的生物合成的多肽的一种或多种转基因。本发明提供了一种使用本发明的经遗传修饰的细菌生产生物素、硫辛酸或硫胺素的方法；以及所述经遗传修饰的细菌细胞在生产生物素、硫辛酸或硫胺素中的应用。，下面是具有改善的铁硫簇递送的细胞工厂专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于增强生物素或硫辛酸或硫胺素的生产的经遗传修饰的细菌；其中，所述细菌包含：
a.编码突变IscR多肽的经遗传修饰的内源iscR基因，其中所述突变IscR多肽的氨基酸序列与选自由SEQ ID No:2、4、6、8、10、12和14组成的组的序列具有至少80％的氨基酸序列同一性，并且其中，所述氨基酸序列具有选自由以下组成的组的至少一种氨基酸置换：
i.L15X、C92X、C98X、C104X和H107X；其中X是除SEQ ID No:2、4、6、8、10、12和14中的对应氨基酸残基以外的任何氨基酸，
和
b.编码选自由以下组成的组的多肽的至少一种转基因：
ii.具有生物素合酶活性(EC 2.8.1.6)的多肽，
iii.具有硫辛酸合酶活性(EC 2.8.1.8)的多肽，
iv.具有HMP-P合酶活性(EC 4.1.99.17)的多肽，和
v.具有酪氨酸裂解酶活性(EC 4.1.99.19)的多肽。
2.如权利要求1所述的用于增强生物素或硫辛酸或硫胺素的生产的经遗传修饰的细菌，其中，所述突变IscR多肽中的所述至少一种氨基酸置换选自由以下组成的组：
a.L15X，其中X是F、Y、M和W中的任一个；
b.C92X，其中X是Y、A、M、F和W中的任一个；
c.C98X，其中X是A、V、I、L、F和W中的任一个；
d.C104X，其中X是A、V、I、L、F和W中的任一个；和
e.H107X，其中X是A、Y、V、I和L中的任一个。
3.如权利要求1或2所述的经遗传修饰的细菌，其中，所述至少一种转基因编码具有生物素合酶活性(EC 2.8.1.6)的多肽，所述细菌还包含编码一种或多种选自由以下组成的组的多肽的其他转基因：
a.具有SAM(S-腺苷甲硫氨酸)依赖性甲基转移酶活性(EC 2.1.1.197)的多肽；
b.具有7-酮-8-氨基壬酸(KAPA)合酶活性(EC 2.3.1.47)的多肽；
c.具有7,8-二氨基壬酸(DAPA)合酶活性(EC:2.6.1.62或EC:2.6.1.105)的多肽；和d.具有脱硫生物素(DTB)合酶活性(EC 6.3.3.3)的多肽，
e.具有庚二酰基-[酰基-载体蛋白]甲基酯酯酶活性(EC 3.1.1.85)的多肽，和f.具有6-羧基己酸-CoA连接酶活性(EC 6.2.1.14)的多肽；
其中，所述细菌用于增强生物素的生产。
4.如权利要求1或2所述的经遗传修饰的细菌，其中，所述至少一种转基因编码具有硫辛酸合酶活性(EC 2.8.1.8)的多肽，所述细菌还包含编码一种或多种选自由以下组成的组的多肽的其他转基因：
a.具有辛酰基转移酶活性(EC 2.3.1.181)的多肽，
b.包含丙酮酸脱氢酶(EC 2.3.1.12)的二氢硫辛酰基赖氨酸残基乙酰转移酶组分的多肽，和
c.具有硫辛酸-蛋白连接酶A活性(EC:6.3.1.20)的多肽。
其中，所述细菌用于增强硫辛酸的生产。
5.如权利要求1或2所述的经遗传修饰的细菌，其中，所述至少一种转基因编码具有HMP-P合酶活性(EC 4.1.99.17)的多肽，和/或一种转基因编码具有酪氨酸裂解酶活性(EC
4.1.99.19)的多肽，所述细菌还包含编码一种或多种选自由以下组成的组的多肽的其他转基因：
a.具有ThiS腺苷酰基转移酶活性(EC 2.7.7.73)的ThiF多肽；
b.具有硫胺素磷酸合酶活性(EC 2.5.1.3)的ThiE多肽；
c.具有噻唑合酶活性(E.C 2.8.1.10)的ThiG多肽；
d.具有磷酸羟甲基嘧啶激酶活性(EC 2.7.4.7)的ThiD多肽；
e.具有甘氨酸氧化酶活性(EC1.4.3.19)的ThiO多肽；
f.具有硫载体蛋白活性的ThiS多肽；
g.具有羟乙基噻唑激酶活性(2.7.1.50)的ThiM多肽；
和
h.具有硫胺素单磷酸磷酸酶活性(E.C 3.1.3.-)的多肽；
其中，所述细菌用于增强硫胺素的生产。
6.如权利要求5所述的经遗传修饰的细菌，其中，所述细菌包含编码以下多肽的其他转基因：
a.具有HMP-P合酶活性(EC 4.1.99.17)的ThiC多肽；
b.具有酪氨酸裂解酶活性(EC 4.1.99.19)的ThiH多肽或具有甘氨酸氧化酶活性(EC
1.4.3.19)的ThiO多肽；
c.具有ThiS腺苷酰基转移酶活性(EC 2.7.7.73)的ThiF多肽；
d.具有硫胺素磷酸合酶活性(EC 2.5.1.3)的ThiE多肽；
e.具有噻唑合酶活性(E.C 2.8.1.10)的ThiG多肽；
f.具有磷酸羟甲基嘧啶激酶活性(EC 2.7.4.7)的ThiD多肽；
g.具有硫载体蛋白活性的ThiS多肽；和
h.具有硫胺素单磷酸磷酸酶(E.C 3.1.3.-)活性的多肽。
7.如权利要求1至6中任一项所述的经遗传修饰的细菌，其中，所述至少一种转基因和所述一种或多种其他转基因与组成型启动子可操作地连接。
8.如权利要求1至7中任一项所述的经遗传修饰的细菌，其中，所述细菌是选自由埃希氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、伯霍尔德杆菌属、弯曲杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、沙雷菌属、乳杆菌属、乳球菌属、不动杆菌属、假单胞菌属和醋杆菌属组成的组的属的细菌。
9.一种生产生物素的方法，其包括以下步骤：
a.将权利要求1至3、7和8中任一项所述的经遗传修饰的细菌导入生长培养基以产生培养物；其中，所述至少一种转基因编码具有生物素合酶活性(EC 2.8.1.6)的多肽；
b.培养所述培养物；和
c.回收由所述培养物产生的生物素，并可选地纯化所回收的生物素。
10.一种生产硫辛酸的方法，其包括以下步骤：
a.将权利要求1、2、4、7和8中任一项所述的经遗传修饰的细菌导入生长培养基以产生培养物；其中，所述至少一种转基因编码具有硫辛酸合酶活性(EC 2.8.1.6)的多肽；
b.培养所述培养物；和
c.回收由所述培养物产生的硫辛酸，并可选地纯化所回收的硫辛酸。
11.一种生产硫胺素的方法，其包括以下步骤：
a.将权利要求1、2、5至8中任一项所述的经遗传修饰的细菌导入生长培养基以产生培养物；其中，所述至少一种转基因编码具有HMP-P合酶活性(EC 4.1.99.17)的多肽，和/或转基因编码具有酪氨酸裂解酶活性(EC 4.1.99.19)的多肽；
b.培养所述培养物；和
c.回收由所述培养物产生的硫胺素，并可选地纯化所回收的硫胺素。
12.如权利要求9至11中任一项所述的生产生物素、硫辛酸和硫胺素中任一种的方法，其中，所述生长培养基包含选自葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、棉子糖、甘露糖和乳糖或其任意组合的碳源。
13.编码突变iscR多肽的经遗传修饰的基因在经遗传修饰的细菌中增强生物素、硫辛酸或硫胺素中任一种的生产的用途，其中，所述细菌包含并表达编码选自由以下组成的组的多肽的至少一种转基因：
i.具有生物素合酶活性(EC 2.8.1.6)的多肽，
ii.具有硫辛酸合酶活性(EC 2.8.1.8)的多肽，
iii.具有HMP-P合酶活性(EC 4.1.99.17)的多肽，和
iv.具有酪氨酸裂解酶活性(EC 4.1.99.19)的多肽，并且
其中，所述经遗传修饰的基因是编码突变IscR多肽的内源性iscR基因，其中，所述突变IscR多肽的氨基酸序列与SEQ ID No:2、4、6、8、10、12和14具有至少80％的氨基酸序列同一性，并且
其中，所述氨基酸序列具有选自由L15X、C92X、C98X、C104X和H107X组成的组的至少一种氨基酸置换；其中X是除SEQ ID No:2、4、6、8、10、12和14中的对应氨基酸残基以外的任何氨基酸。
14.如权利要求13所述的编码突变iscR多肽的经遗传修饰的基因在经遗传修饰的细菌中增强生物素、硫辛酸或硫胺素中任一种的生产的用途，其中，所述突变IscR多肽中的所述至少一种氨基酸置换选自由以下组成的组：
a.L15X，其中X是F、Y、M和W中的任一个；
b.C92X，其中X是Y、A、M、F和W中的任一个；
c.C98X，其中X是A、V、I、L、F和W中的任一个；
d.C104X，其中X是A、V、I、L、F和W中的任一个；和
e.H107X，其中X是A、Y、V、I和L中的任一个。
15.权利要求1至8中任一项所述的经遗传修饰的细菌在增强生物素、硫辛酸或硫胺素中任一种的生产中的用途。
16.如权利要求1至8中任一项所述的经遗传修饰的细菌，其中，所述细菌还包含选自以下组的一种或多种基因：
a.编码黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白-NADP还原酶(EC:1.18.1.2和EC 1.19.1.1)的基因；
b.编码丙酮酸-黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白氧化还原酶(EC 1.2.7)的基因；
c.编码黄素氧还蛋白的基因；
d.编码铁氧还蛋白的基因；和
e.编码黄素氧还蛋白和铁氧还蛋白-NADP还原酶的基因；
其中，所述一种或多种基因可操作地连接至能够增强所述一种或多种基因在所述细菌中的表达的非天然启动子；并且其中，所述一种或多种基因可以是天然基因或转基因。
17.权利要求16所述的经遗传修饰的细菌在增强生物素、硫辛酸或硫胺素中任一种的生产中的用途。
18.如权利要求9至12中任一项所述的生产生物素、硫辛酸和硫胺素中任一种的方法，其中，所述经遗传修饰的细菌还包含选自以下组的一种或多种基因：
a.编码黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白-NADP还原酶(EC:1.18.1.2和EC 1.19.1.1)的基因；
b.编码丙酮酸-黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白氧化还原酶(EC 1.2.7)的基因；
c.编码黄素氧还蛋白的基因；
d.编码铁氧还蛋白的基因；和
e.编码黄素氧还蛋白和铁氧还蛋白-NADP还原酶的基因；
其中，所述一种或多种基因可操作地连接至能够增强所述一种或多种基因在所述细菌中的表达的非天然启动子；并且其中，所述一种或多种基因可以是天然基因或转基因。

说明书全文

具有改善的铁硫簇递送的细胞工厂

技术领域

[0001] 本发明涉及能够改善铁硫簇递送的经遗传修饰的细菌细胞，其特征在于编码突变的铁硫簇调节因子(IscR)的经修饰的基因以及编码增强生物素、硫辛酸或硫胺素的生物合成的多肽的一种或多种转基因。本发明还涉及一种使用本发明的经遗传修饰的细菌生产生物素、硫辛酸或硫胺素的方法；以及所述经遗传修饰的细菌细胞在生产生物素、硫辛酸或硫胺素中的用途。

背景技术

[0002] 生物素(又称为维生素B7或维生素H)和硫胺素(又称为维生素B1)是人类必需的饮食维生素，因为人类与其他后生动物一样不能产生生物素或硫胺素。硫辛酸(LA)是一种含硫的类维生素抗氧化剂，其在细菌、植物和动物中少量合成。这三种都被广泛用作饮食补充剂。目前，这些维生素或类维生素化合物的生产依赖于化学合成，这是昂贵的。制造它们的生物合成方法将提供一种替代性的、更具成本效益的方式来满足当前和未来的需求。

[0003] 生物素是催化某些羧化反应的酶(例如乙酰辅酶A羧化酶(ACC))的必需辅因子。ACC存在于所有生命形式中，其产生丙二酰辅酶A，丙二酰辅酶A是脂肪酸生物合成的关键组成要素。在自然界中，生物素是通过涉及脂肪酸生物合成途径的线性途径合成的。大肠杆菌(E.coli)中生物素合成的最初底物是丙二酰-ACP，它也是脂肪酸合成的起始代谢物。在进入脂肪酸循环之前，丙二酰-ACP被SAM(S-腺苷甲硫氨酸)依赖性甲基转移酶BioC掩盖，从而生成丙二酰-ACP甲酯。随后，两轮脂肪酸链延长反应产生了庚二酰基酯-ACP分子。庚二酰基酯-ACP的O-甲基被专门的酯酶BioH 水解，使该分子退出脂肪酸延伸循环。

[0004] 随后，中间体庚二酰基酯-ACP通过生物素特异性途径转化为生物素(图1A)。在该途径中，BioF催化庚二酰-ACP与丙氨酸的PLP依赖性脱羧醛醇缩合反应，生成KAPA(8-氨基-7-氧代壬酸)。BioA(和BioK)催化KAPA的PLP依赖性转氨作用，生成DAPA(7,8-二氨基壬酸)，其中供体为SAM；以及副产物S-腺苷-氧代甲硫氨酸。BioD催化ATP驱动的羧化反应和DAPA的闭环反应，以在脱硫生物素(DTB)中形成噻吩烷环。生物素合成途径的最后一步是已知的最复杂的反应之一，因为它涉及通过BioB(生物素合酶)在两种烃之间引入硫桥，以产生生物素。BioB是S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM或AdoMet)自由基酶，被发现为二聚体，并在其活性位点包含两个铁硫簇：[2Fe-2S]2+和[4Fe-4S]2+。认为在DTB中形成噻吩烷环所需的硫原子是从BioB的[2Fe-2S]2+簇中募集的。结果，DTB的合成中所消耗的BioB二聚体中的铁硫簇被认为在每一轮催化后都再生。

[0005] 硫辛酸(LA)不仅是强效的活性氧物质清除剂(因此是一种重要的抗氧化剂)，还是α-酮酸脱氢酶的辅因子。LA是从脂肪酸代谢的中间体从新合成的(图2)。参与大肠杆菌的LA合成的三种酶是LplA(硫辛酸-蛋白连接酶)、LipB(辛酰蛋白ACP载体蛋白：蛋白转移酶)和LipA(硫辛酸合酶)。由lplA基因编码的LplA能够以ATP依赖性方式催化外源辛酸与靶酶的E2亚基的未硫辛酰化的脱辅硫辛酰基结构域的结合。由lipB基因编码的LipB能够催化辛酰基残基从ACP转移到靶酶的E2亚基的脱辅硫辛酰基结构域。AceF基因编码丙酮酸脱氢酶的E2亚基的硫辛酰基结构域。由lipA基因编码的LipA负责形成两个C-S键。LipA驱动的反应需要铁硫簇(4Fe-4S)和SAM(由metK基因产生)来执行其功能。硫辛酸主要作为多种多酶复合体中的与蛋白结合的硫辛酰胺部分存在于细胞中。

[0006] 硫胺素的生物合成已经在细菌、某些原生动物、植物和真菌中得到了表征。硫胺素的噻唑和嘧啶部分是分别合成的(图3)。嘧啶部分，即4-氨基-5-羟甲基-2-甲基嘧啶磷酸(HMP-P)源自5-氨基咪唑核糖核苷酸(AIR)，其是嘌呤从新生物合成途径中的中间体。在革兰氏阴性细菌中，thiC基因产物HMP-P合酶(其结合1个[4Fe-4S]簇/亚基)在自由基S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依赖性反应中催化AIR向HMP-P的转化。

[0007] 然后，在与噻唑单元偶联之前，HMP-P被ThiD激酶磷酸化为HMP-PP。噻唑部分5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑磷酸(HET-P)源自L-酪氨酸和1-脱氧-D-木酮糖磷酸(DXP)和半胱氨酸；其中硫原子可能来自L-半胱氨酸。由thiH基因编码的酪氨酸裂解酶以每个亚基结合1个[4Fe-4S]簇，并催化酪氨酸发生自由基介导的裂解，变为2-亚氨基乙酸和4-甲酚。噻唑部分的合成需要至少五种基因thiF、thiS、thiG、thiH和thiI的表达。

[0008] 然后，thiE编码的硫胺素-磷酸合酶(EC 2.5.1.3)的作用使嘧啶和噻唑部分结合形成TMP。因此，TMP是所有已知的硫胺素生物合成途径的第一个产物。在大肠杆菌和其他肠杆菌科菌(Enterobacteriaceae)中，在ATP存在下，thiL编码的硫胺素-磷酸激酶(EC 2.7.4.16)可以将TMP磷酸化为辅因子TPP。包含表达硫胺素单磷酸磷酸酶(E.C3.1.3-)的转基因的细菌菌株能够将TMP转化为硫胺素，从而提高硫胺素产量。

[0009] 基于细菌的细胞工厂的应用是生物素、硫辛酸和硫胺素的生物合成生产的潜在途径。由于以下事实，重组大肠杆菌作为生产生物产品的细胞工厂的优势得到了广泛认可：(i)其具有无与伦比的快速生长动力学；在葡萄糖-盐培养基中和最佳环境条件下培养时，其倍增时间约为20分钟；(ii)容易获得高细胞密度；其中大肠杆菌液体培养物的理论密度极限据估算为约200g细胞干重/l或约1×1013个活细菌/mL。此外，有许多分子工具和操作规程可用于大肠杆菌的遗传修饰，并且其是适合表达异源蛋白的生物体；这两点对于获得所需生物产品的高产量而言可能是必不可少的。

[0010] 在大肠杆菌中，生物素操纵子结构在相反链(bioO基因座)上的重叠启动子的控制下分割为bioA和bioBFCD，而bioH位于大肠杆菌染色体上的其他位置。生物素操纵子的表达被结合生物素的阻遏物(BirA)下调，BirA与生物素操纵子中的操纵基因结合。BirA还起到生物素连接酶的作用，将生物素转移至细胞羧化酶。BirA的功能从生物素连接酶到转录阻遏物的切换受到相应的细胞内生物素和脱辅羧化酶库的调节。据报道，在大肠杆菌中过表达生物素操纵子(bioA和bioBFCD)对生长有抑制作用(Ifuku,O等，1995)。由于这种抑制的原因尚不清楚，这对增强生物素合成产生了阻碍。

[0011] 通常，需要确定这些复杂的生物合成途径中的瓶颈以例如促进细菌类细胞工厂(例如大肠杆菌)中的生物素、硫辛酸和硫胺素的生产，定制这些途径来克服可能限制其生长和产生高水平的相应途径酶的能力的多种因素。

发明内容

[0012] 根据第一实施方式，本发明提供了一种经遗传修饰的细菌，其用于增强生物素、硫辛酸或硫胺素中任一种的生产；其中，所述细菌包含：

[0013] · 编码突变IscR多肽的经遗传修饰的内源iscR基因，其中所述突变IscR多肽的氨基酸序列与SEQ ID No:2、4、6、8、10、12和14具有至少80％的序列同一性，并且其中所述氨基酸序列具有至少一个选自由以下组成的组的氨基酸置换：

[0014] о L15X、C92X、C98X、C104X和H107X；其中X是除SEQ ID No:2、4、6、8、10、12和14中的对应氨基酸残基以外的任何氨基酸，和

[0015] · 至少一种编码选自以下多肽的多肽的转基因：

[0016] о 具有用于增强生物素生产的生物素合酶活性(EC 2.8.1.6)的多肽，

[0017] о 具有用于增强硫辛酸生产的硫辛酸合酶活性(EC 2.8.1.8)的多肽，

[0018] о 具有用于增强硫胺素生产的HMP-P合酶活性(EC 4.1.99.17)的多肽，和

[0019] о 具有用于增强硫胺素生产的酪氨酸裂解酶活性(EC 4.1.99.19)的多肽。

[0020] 优选地，所述突变IscR多肽中的至少一个氨基酸置换选自由以下组成的组：

[0021] о L15X，其中X是F、Y、M和W中的任一个；

[0022] о C92X，其中X是Y、A、V、I、G、L、M、F和W中的任一个；

[0023] о C98X，其中X是A、V、I、G、L、F和W中的任一个；

[0024] о C104X，其中X是A、V、I、G、L、F和W中的任一个；和

[0025] о H107X，其中X是A、Y、M、F、W、V、I、G和L中的任一个。

[0026] 本发明的包含一种编码具有生物素合酶活性(EC 2.8.1.6)的多肽的转基因的用于增强生物素生产的经遗传修饰的细菌，还可以包含编码一种或多种选自由以下组成的组的多肽的其他转基因：

[0027] о 具有SAM(S-腺苷甲硫氨酸)依赖性甲基转移酶活性(BioC；EC 2.1.1.197)的多肽；

[0028] о 具有7-酮-8-氨基壬酸(KAPA)合酶活性(BioF；EC 2.3.1.47)的多肽；

[0029] о 具有7,8-二氨基壬酸(DAPA)合酶活性(BioA；EC 2.6.1.62)或具有L-赖氨酸：8-氨基-7-氧代壬酸酯氨基转移酶活性(BioK；EC：2.6.1.105)的多肽；

[0030] о 具有脱硫生物素(DTB)合酶活性(BioD；EC 6.3.3.3)的多肽，和

[0031] о 具有庚二酰基-[酰基-载体蛋白]甲基酯酯酶活性(BioH；EC 3.1.1.85)的多肽或具有6-羧基己酸-CoA连接酶活性(BioW；EC 6.2.1.14)的多肽。

[0032] 优选地，本发明的包含一种编码具有生物素合酶活性(EC 2.8.1.6)的多肽的转基因的用于增强生物素生产的经遗传修饰的细菌，还包含编码具有SAM(S-腺苷甲硫氨酸)依赖性甲基转移酶活性(BioC；EC 2.1.1.197)、7-酮-8-氨基壬酸(KAPA)合酶活性(BioF；EC 2.3.1.47)和7,8-二氨基壬酸(DAPA)合酶活性(BioA；EC:2.6.1.62)的多肽的其他转基因。

[0033] 本发明的包含一种编码具有硫辛酸合酶活性(EC 2.8.1.8)的多肽的转基因的用于增强硫辛酸生产的经遗传修饰的细菌，还可包含编码一种或多种选自由以下组成的组的多肽的其他转基因：

[0034] о 具有辛酰基转移酶活性(EC 2.3.1.181)的多肽，和

[0035] о 包含具有丙酮酸脱氢酶活性(EC 2.3.1.12)的二氢硫辛酰基赖氨酸残基乙酰转移酶组分的多肽，和

[0036] о 具有硫辛酸-蛋白连接酶A(LplA；EC:6.3.1.20)的多肽。

[0037] 本发明的包含一种编码具有HMP-P合酶活性(EC 4.1.99.17)的ThiC多肽的转基因和/或一种编码具有酪氨酸裂解酶活性(EC 4.1.99.19)的ThiH多肽的转基因的用于增强硫胺素生产的经遗传修饰的细菌，还可以包含编码一种或多种选自由以下组成的组的多肽的其他转基因：

[0038] о 具有ThiS腺苷酰基转移酶(EC 2.7.7.73)活性的ThiF多肽；

[0039] о 具有硫胺素磷酸合酶(EC 2.5.1.3)活性的ThiE多肽；

[0040] о 具有噻唑合酶(E.C.2.8.1.10)活性的ThiG多肽；

[0041] о 具有磷酸羟甲基嘧啶激酶(EC 2.7.4.7)活性的ThiD多肽；

[0042] о 具有硫载体蛋白活性的ThiS多肽；

[0043] о 具有硫胺素单磷酸磷酸酶(E.C.3.1.3.-)活性的多肽；和

[0044] о 具有甘氨酸氧化酶(EC 1.4.3.19)活性的ThiO多肽；

[0045] 以及可选的下述其他转基因，其

[0046] о 编码具有羟乙基噻唑激酶活性(2.7.1.50)的ThiM多肽。

[0047] 优选地，所述经遗传修饰的细菌细胞包含编码以下多肽的转基因：ThiC(由thiC基因编码)；ThiD(由thiD基因编码)，ThiE(由thiE基因编码)，ThiF(由thiF基因编码)，硫载体蛋白(由thiS基因编码)，ThiG(由thiG基因编码)，TMP磷酸酶(由TMP磷酸酶基因编码)；以及ThiH(由thiH基因编码)或ThiO(由thiO基因编码)。根据一个实施方式，所述细胞可以进一步包含编码酶ThiM(由thiM基因编码)的转基因。

[0048] 优选地，本发明的经遗传修饰的细菌中的至少一种转基因和一种或多种其他转基因中的每一个均与组成型启动子可操作地连接(其中，该启动子可以与包含所述转基因的操纵子可操作地连接)。

[0049] 本发明的经遗传修饰的细菌优选是选自由埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、棒状杆菌属(Carynebacterium)、沙雷菌属(Serratia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、醋杆菌属(Acetobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)组成的组的属的物种；更优选地是埃希氏菌属或棒状杆菌属的物种；例如大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

[0050] 根据第二实施方式，本发明提供了一种生产生物素的方法，其包括以下步骤：

[0051] о 将本发明的包含一种编码具有生物素合酶活性(EC 2.8.1.6)的多肽的转基因的经遗传修饰的细菌导入生长培养基以产生培养物；

[0052] о 培养所述培养物；和

[0053] о 回收由所述培养物产生的生物素，并可选地纯化所回收的生物素。

[0054] 根据第三实施方式，本发明提供了一种生产硫辛酸的方法，其包括以下步骤：

[0055] о 将本发明的包含一种编码具有硫辛酸合酶活性(EC 2.8.1.8)的多肽的转基因的经遗传修饰的细菌导入生长培养基中以产生培养物；

[0056] о 培养所述培养物；和

[0057] о 回收由所述培养物产生的硫辛酸，并可选地纯化所回收的硫辛酸。

[0058] 根据第四实施方式，本发明提供了一种生产硫胺素的方法，其包括以下步骤：

[0059] о 将本发明的包含一种编码具有HMP-P合酶活性(EC 4.1.99.17)的多肽的转基因和/或一种编码具有酪氨酸裂解酶活性(EC 4.1.99.19)的多肽的转基因的经遗传修饰的细菌导入生长培养基中以产生培养物；

[0060] о 培养所述培养物；和

[0061] о 回收由所述培养物产生的硫胺素，并可选地纯化所回收的硫胺素。

[0062] 优选地，生产生物素、硫辛酸和硫胺素中任一种的方法中所用的生长培养基包含选自葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、棉子糖、甘露糖、乳糖或其任意组合的碳源。

[0063] 根据第四实施方式，本发明提供了编码突变iscR多肽的经遗传修饰的基因在表达编码生物素合酶的转基因的细菌细胞中增强生物素生产的用途，其中，所述突变iscR多肽的氨基酸序列与SEQ ID No:2、4、6、8、10、12和14具有至少80％的序列同一性；其中，所述氨基酸序列具有选自由L15X、Cys92X、Cys98X、Cys104X和His107X组成的组的至少一种氨基酸置换；其中X是除SEQ ID No:2、4、6、8、10、12和14中的对应氨基酸残基以外的任何氨基酸。

[0064] 根据第四实施方式，本发明提供了编码突变iscR多肽的经遗传修饰的基因在增强细菌中的生物素、硫辛酸或硫胺素中任一种的生产中的用途，其中，所述细菌包含并表达编码选自以下的多肽的至少一种转基因：

[0065] · 具有生物素合酶活性(EC 2.8.1.6)的多肽，

[0066] · 具有硫辛酸合酶活性(EC 2.8.1.8)的多肽，

[0067] · 具有HMP-P合酶活性(EC 4.1.99.17)的多肽和具有酪氨酸裂解酶活性(EC4.1.99.19)的多肽，

[0068] 其中，所述经遗传修饰的基因是编码突变IscR多肽的内源性iscR基因，其中，所述突变IscR多肽的氨基酸序列与SEQ ID No:2、4、6、8、10、12和14具有至少80％的序列同一性，并且

[0069] 其中，所述氨基酸序列具有选自由L15X、Cys92X、Cys98X、Cys104X和His107X组成的组的至少一种氨基酸置换；其中X是除SEQ ID No:2、4、6、8、10、12和14中的对应氨基酸残基以外的任何氨基酸。

[0070] 根据第五实施方式，本发明提供了本发明的经遗传修饰的细菌在增强生物素、硫辛酸或硫胺素生产中的用途。

[0071] 根据第六实施方式，本发明提供了本发明的经遗传修饰的细菌，其用于增强生物素、硫辛酸或硫胺素中任一种的生产，其中，所述细菌进一步包含一种或多种基因，所述基因编码能够介导增强的从电子供体NADPH到SAM自由基铁硫簇酶的[4Fe-4S]2+簇的电子传递的肽；例如，黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白还原酶和黄素氧还蛋白还原系统或丙酮酸-黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白氧化还原酶系统的多肽。附图说明

[0072] 图1是显示以下内容的卡通图：A)细菌中的生物素途径的中间体以及导致生物素合成的相应酶促步骤。SAM：S-腺苷-L-甲硫氨酸，SAH：S-腺苷-L-高半胱氨酸，CoA：辅酶A，ACP：酰基载体蛋白，KAPA：7-酮-8-氨基壬酸，AMTOD：S-腺苷-2-氧代-4-硫代甲基丁酸，DAPA：7,8-二氨基壬酸，DTB：脱硫生物素，5'DOA：5'-脱氧腺苷。B)isc-操纵子的结构及其在Fe-S簇形成中的作用，以及IscR的调节机制。isc操纵子包含编码IscR的iscR基因，IscR调节以下基因的表达：iscS(半胱氨酸脱硫酶)，iscU(支架)，iscA(A型蛋白)，HscB(Dnaj样共伴侣蛋白)，HscA(DnaK样伴侣蛋白)，和fdx(铁氧还蛋白)。IscR还调节超过40个基因，包括基因hyaA、ydiU、erpA和sufA。

[0073] 图2是显示以下内容的卡通图：细菌中的硫辛酸途径的中间体以及导致硫辛酰化的硫辛酰基结构域的相应酶促步骤(硫辛酸合成)。该途径中的关键酶包括LipA(硫辛酸合酶)和LipB(辛酸蛋白ACP载体蛋白:蛋白转移酶)，以及底物SAM：S-腺苷-L-甲硫氨酸。LplA是硫辛酸-蛋白连接酶A；EC:6.3.1.20。

[0074] 图3是显示以下内容的卡通图：细菌中的硫胺素途径的中间体和导致硫胺素(THI)、硫胺素一磷酸(TMP)和硫胺素二磷酸(TPP)的合成的相应酶促步骤。各中间体的缩写：5-氨基咪唑核糖核苷酸(AIR)，4-氨基-2-甲基-5-(磷酸氧甲基)嘧啶(HMP-P)，4-氨基-
2-甲基-5-(二磷酸甲基)嘧啶(HMP-PP)，1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)，脱氢甘氨酸(DHG)，
4-甲基-5-(2-磷酸氧乙基)噻唑(THZ-P)，三磷酸腺苷(ATP)，一磷酸腺苷(AMP)，S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，还原型铁氧还蛋白(Fdx red)，氧化型铁氧还蛋白(Fdx ox)。

[0075] 图4是随时间测量的包含IPTG诱导性bioB表达质粒的大肠杆菌BW25113ΔbioB株(右图)以及包含IPTG诱导性移码bioB(提前终止密码子)表达质粒的参照大肠杆菌BW25113株(左图)的细胞密度(以OD600度量)的图表。对于在200μL mMOPS(含有0.1μg/LDTB、50μg/mL卡那霉素以及0(点)、0.01(三角形)或0.1(方形)mM IPTG)中生长的4份生物菌株重复样品，使用Multiskan测量OD620并将其换算为OD600。相应的指数生长速率值显示在相邻的框中。

[0076] 图5是显示以下内容的散点图：在37℃下以275rpm摇动温育20小时后，在150μL mMOPS培养基上生长的包含质粒pBS451的大肠杆菌BS1011的培养物的最终细胞密度(以OD600度量)，该培养基具有40μg/ml博来霉素(zeocin)，且补充有零或递增浓度的生物素，至多为0.244μg生物素/mL(如生物素定量方法所述)。断点状的垂直灰线表示生物素生物测定的最佳浓度范围0.024至0.24μg生物素/L。

[0077] 图6是显示以下内容的柱状图：表达具有氨基酸突变的突变IscR的3种不同的iscR突变株(BS1377,L15F)、(BS1375,C92Y)和(BS1353,H107Y)以及大肠杆菌BW25113ΔbioB株(BS1011,Ref)的生物素产生(菌株见表1)，以4个生物学重复样品进行，每个包含IPTG诱导性bioB表达质粒(pBS412)。在37℃和275rpm摇动下，使菌株在具有0.1g/l DTB和50μg/mL卡那霉素的400μL mMOPS中生长24小时。条表示平均生物素生产值(高度)和IPTG诱导水平(灰色阴影)，黑点表示单个重复样品培养物中的生物素产量，水平断点线表示参照野生型菌株的最大生物素产量。注意当在没有IPTG的情况下培养时，没有菌株产生可检测水平的生物素。

[0078] 图7是表达突变IscR的iscR突变株(BS1353,H107Y)和大肠杆菌BW25113ΔbioB株(BS1011,Ref)的细胞密度和生物素产生的图表，其中每株均包含IPTG诱导性bioB基因表达质粒(pBS412)。数据表示iscR H107Y突变株(深色实线)和参照菌株大肠杆菌BW25113ΔbioB株(断点浅灰色)各自的三个生物学重复样品的平均测得OD600，以及监测了25H时段的相应的iscR H107Y突变株(深色实心点)和参照菌株大肠杆菌BW25113ΔbioB株(浅灰色点)的生物素产生量。在37℃和275rpm摇动下，使菌株在250mL带挡板的摇瓶中的具有0.1g/l DTB、0.01(A)或0.5mM IPTG(B)和50μg/mL卡那霉素的50mL mMOPS中生长。生长速率显示在黑框中。

[0079] 图8是显示出IscR编码序列的卡通图，其中的注释显示了已鉴定的突变株的iscR基因中的核苷酸和氨基酸序列突变的位置。

[0080] 图9是显示出与hya DNA结合位点(黑色)结合的IscR二聚体(灰色)的晶体结构(PDB代码4HF1)的卡通图，其中L15F和H107Y iscR突变标为棒状图(WT氨基酸为灰色，突变氨基酸为黑色)；放大的图像突出显示了突变的残基。

[0081] 图10是显示出大肠杆菌菌株的生物素产生的柱状图，该菌株包含IPTG诱导性bioB表达质粒，且还包含对照质粒或者含有isc操纵子(iscSUA-hscBA-fdx，对应于缺乏iscR基因的天然大肠杆菌isc操纵子结构)或大肠杆菌suf操纵子(sufABCDSE)(其可操作地连接至强核糖体结合位点(RBS)和来自中等拷贝数质粒(p15A ori)的T5 LacO抑制启动子)的质粒。所述对照质粒包含编码GFP而不是suf或isc操纵子的IPTG诱导性基因。在低诱导(0.01mM IPTG)和高诱导(0.1mM IPTG)下，且提供0.1g/L(DTB)作为底物，在含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL大观霉素的mMOPS中培养每个菌株的一式三份生物样品。在37℃和
275rpm下，使菌株在深孔板中生长24小时，然后使用基于生长的生物测定法评估生物素产量。条柱表示生物素的平均产量值(高度)和IPTG诱导水平(灰色阴影)，黑点表示单个重复样品的生物素产量，十字线表示每种菌株的终点(终末)细胞密度，以OD600度量。注意当用
0.01m MIPTG诱导时，没有菌株产生可检测水平的生物素。

[0082] 图11是显示了一式三份进行的4种不同的样品中的BioB蛋白表达水平与生物素产量之间的相关性的图。菌株是具有pBS430(bioB移码IPTG诱导性质粒)的BS1013(大肠杆菌BW25113，背景菌株)，具有pBS412(bioB IPTG诱导性质粒)的BS1011(具有ΔbioB的BS1013)，具有pBS412的BS1353(具有iscR H107Y突变的BS1011)。如图所示，使菌株在具有
0.1g/l DTB和IPTG的mMOPS中生长。

[0083] 图12是显示出大肠杆菌ΔbioB菌株的生物素产量的柱状图，该菌株包含IPTG诱导性bioB表达质粒和以下iscR基因组变异之一：野生型(iscR WT)；敲除突变(其编码已在22位突变为终止密码子的E22*谷氨酸)(iscR KO)；在92位编码半胱氨酸→酪氨酸置换的突变(iscR C92Y)。条柱表示在给定IPTG诱导水平下的平均生物素产量值(高度)(灰色阴影)，点表示生单个重复样品的生物素产量。在无诱导(0mM IPTG)、低诱导(0.01mM IPTG)和高诱导(0.1mM IPTG)下，提供0.1g/L(DTB)作为底物，在含有100μg/mL氨苄青霉素的mMOPS中培养每个菌株的一式三份生物样品。在37℃和275rpm下，使每种菌株在深孔板中生长24小时，然后使用基于生长的生物测定法评估生物素产量。

[0084] 图13是显示出大肠杆菌ΔbioAΔbioBFCD菌株的生物素产量的柱状图，该菌株包含生物素操纵子质粒和以下iscR基因组变异之一：野生型(iscR WT)；突变iscRH107Y(编码107位的组氨酸→酪氨酸置换)；或在92位编码半胱氨酸→酪氨酸置换的突变(iscR C92Y)。
在提供和不提供0.1g/L脱硫生物素(DTB)作为底物的情况下，将每种菌株的生物学样品一式四份在含10μg/mL 四环素的mMOPS中培养。在37℃和275rpm下，使菌株在深孔板中生长24小时，然后使用基于生长的生物测定法评估生物素产量。条柱表示平均生物素产量值(高度)以及是否饲喂了DTB(灰色阴影)，黑点表示单个重复样品的生物素产量。

[0085] 图14是显示出表达具有氨基酸突变的突变IscR的两种不同的iscR突变株(BS1375,C92Y)和(BS1353,H107Y)以及对照菌株(BS1011,IscR WT)生产24小时后的的硫辛酸产量(灰色柱)和终点(终末)OD600(×)(菌株见表1)的柱状图，以一式三份生物学样品进行，每个样品均包含表达IPTG诱导性lipA的质粒(pBS993，见表4)。在37℃和275rpm摇动下，使菌株在含有100μg/mL氨苄青霉素、0.1mM生物素、0.6g/l辛酸和0.01mM IPTG的400μL mMOPS中生长24小时。条柱表示平均硫辛酸产量值(高度)，黑点表示来自单个重复样品培养物的硫辛酸产量。可以看出平均硫辛酸产量增加至1.79倍，而终点OD600保持不变。

[0086] 图15是随时间测量的参照菌株(大肠杆菌BW25113)ΔlipΑ(WT,三角形)以及具有突变iscR(C92Y)的ΔlipA菌株(C92Y,正方形)的细胞密度(以OD620度量)的图，两种菌株均包含IPTG诱导性lipA表达质粒(pBS1037)。对于在含有0.6μg/L辛酸、100μg/mL氨苄青霉素和0至0.04mM IPTG(灰色阴影的递增暗度)的200μL mMOPS中生长的6个菌株生物学重复样品，使用Multiskan测量OD620。右侧显示了相应的生长速率(GR)。

[0087] 图16是显示出表达具有氨基酸突变的突变IscR的两种不同的iscR突变株(BS2019,C92Y)和(BS2020,H107Y)以及大肠杆菌BW25113ΔthiP,thiL*菌株(BS750,Ref)的硫胺素产量的柱状图(菌株见表5)，以4个生物学重复样品进行，每个样品均包含表达完整硫胺素途径基因thiCEFSGHMD的质粒(pBS140)。在37℃和275rpm摇动下，使菌株在含有50μg/mL卡那霉素的400μL mMOPS中生长24小时。条柱表示上清液中的平均硫胺素产量值(高度)，用硫胺荧测定法(包括硫胺素、TMP和TPP)测量，并针对终点OD600校正；黑点表示单个重复样品培养物中的硫胺素产量。可以看出，与参照菌株(BS750)相比，突变菌株(BS2019和BS2020)中的OD归一化效价提高至1.43倍。

[0088] 图17是显示出大肠杆菌ΔbioABFCD iscR H107Y(编码107位的组氨酸→酪氨酸置换)菌株的生物素产量的柱状图，菌株包含仅IPTG诱导性BioB过表达质粒pBS679(BS1937)，或还包含组成性过表达FldA-Fpr的pBS1112(BS2185)或组成性过表达GFP的pBS1054(BS2707)。将每种菌株在具有100μg/ml氨苄青霉素、0.1g/L作为底物的脱硫生物素(DTB)以及0、0.01、0.025、0.05、0.075或0.1mM IPTG的mMOPS中培养。BS2185和BS2707的培养基相同，除了包含50μg/ml卡那霉素之外。在37℃和275rpm下，使菌株在深孔板中生长24小时，然后使用基于生长的生物测定法评估生物素产量。条柱表示各个菌株的生物素产量值(高度)：BS1937(黑色条柱)；BS2185(灰色条柱)；和BS2707(带方格图案的灰色条柱)。

[0089] 图18是显示出包含IPTG诱导性BioB过表达质粒pBS679的大肠杆菌ΔbioABFCD iscR H107Y(编码107位的组氨酸→酪氨酸置换)菌株的生物素产量的柱状图。BS2185另外包含具有组成型过表达FldA-Fpr的pBS1112。在含有100μg/ml氨苄青霉素、0.1g/L作为底物的脱硫生物素(DTB)以及0.025mM IPTG诱导的mMOPS中培养BS1937。BS2185的培养基相同，但另外包括50μg/ml卡那霉素。在37℃和275rpm下，使菌株在深孔板中生长24小时，然后使用基于生长的生物测定法评估生物素产量。深灰色条柱表示平均生物素产量值(高度)
(BS1937 n＝6且BS2185n＝8)，浅灰色条柱表示终点OD600。黑点表示单个重复样品的生物素产量和终点OD600。

[0090] 定义：

[0091] 氨基酸序列同一性：本文所用的术语“序列同一性”表示长度基本相等的两条氨基酸序列之间的同源程度的定量量度。待比较的两条序列必须通过插入空位或在蛋白序列末端进行截短来给出尽可能最佳的匹配。序列同一性可用((Nref-Ndif)100)/(Nref)来计算，其中Ndif是所比对的两条序列中的差异残基总数，Nref是其中一条序列的残基数。序列同一性计算优选使用BLAST程序自动进行，例如BLASTP程序(PearsonW.R和D.J.Lipman(1988))(www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)。多重序列比对用用序列比对方法
ClustalW以默认参数进行，如Thompson J.等，1994所述，可获自http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/。

[0092] 优选地，与比较用多肽相比，多肽中的一个或多个氨基酸残基的置换、插入、添加或缺失的数目是有限的，即不超过1、2、3、4、5、6、7、8，9或10个置换，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个插入，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个添加，且不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个缺失。优选地，置换是保守性氨基酸置换：限于以下组的成员内的交换：第1组：甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸；第2组：丝氨酸，半胱氨酸，硒代半胱氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸；第3组：脯氨酸；第4组：苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸；第5组：天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺。

[0093] 氨基酸缩写：亮氨酸(L)，半胱氨酸(C)和组氨酸(H)。

[0094] 内源基因：是细菌细胞基因组中与宿主细菌同源的基因(即宿主细菌的天然基因)。可以使用本领域已知的工具对内源基因进行遗传修饰，由此使经遗传修饰的内源基因编码突变多肽，其氨基酸序列在一个或多个位置与该多肽所源自的亲本内源基因所编码的多肽不同。

[0095] 基因组：存在于细胞或生物体中的遗传物质；基因组包含构建和维持该细胞或生物体所需的所有信息；并且包括存在于细胞或生物体内的染色体和质粒中的遗传物质。

[0096] GFP：绿色荧光蛋白。

[0097] gi号：(genInfo标识符)是识别特定序列的唯一性整数，与数据库源无关，由NCBI 指定给输入Entrez的所有序列，包括来自DDBJ/EMBL/GenBank的核苷酸序列，来自SWISS-PROT、PIR的蛋白序列，等等。

[0098] Isc途径：铁硫簇途径；由包含iscR基因的isc操纵子编码。

[0099] Multiskan：基于过滤器的微孔板光度计；用于在340至850nm(包括600至620nm)的波长范围内测量96或384孔板格式的吸光度。将平板在光度计中于选定的温度(最高50℃)下温育。该光度计由Thermo Scientific提供。

[0100] 天然基因：细菌细胞基因组中的与宿主细菌同源的内源基因。

[0101] 非天然启动子：在本发明的经遗传修饰的细菌的背景下，其是与所述细胞中的基因或转基因可操作地连接的启动子，其中在自然界中发现的细菌细胞中不会发现所述启动子与所述基因或转基因可操作地连接。

[0102] OD：光密度

[0103] 转基因：是已通过基因工程手段导入细菌基因组中的外源基因。在本发明的上下文中，所述基因组包括染色体和游离基因遗传元件。

具体实施方式

[0104] 生物素、硫辛酸和硫胺素合成的生物合成途径的共同特征是需要一种或多种SAM或AdoMet自由基酶来催化复杂的自由基介导的分子重排。生物素合酶、硫辛酸合酶、HMP-P合酶和酪氨酸裂解酶是已知催化这些途径中这些基本步骤的相应的酶。通过过表达生物素操纵子或甚至使用对BirA阻遏物的反馈调节不敏感的突变生物素操纵子来提高大肠杆菌中的生物素生物合成的早期尝试失败的原因是对生长的强烈抑制(Ifuku,O.等，1995)。在对所观察到的生长抑制缺乏任何基于证据的解释的情况下，需要替代性方法来鉴定可能解释生物素合酶过表达毒性的细胞因子。

[0105] 本发明提供的针对该问题的解决方案据显示能够等同地适用于增强细菌细胞工厂(例如大肠杆菌)的细胞中的生物素合酶、硫辛酸合酶、HMP-P合酶和酪氨酸裂解酶的表达。解决该问题的方法是产生大肠杆菌细胞文库，由于不完善的纠错聚合酶所产生的背景突变的积累，这些文库具有进化的基因组多样性。用包含IPTG诱导性bioB基因表达盒的质粒转化这些文库的细胞。候选突变体是库中的那些能够在IPTG存在下生长的细胞，其浓度足以在这些突变细胞所源自的亲本大肠杆菌菌株中诱导BioB表达毒性。

[0106] 通过全基因组测序确立了所选择的表达BioB的突变菌株生长的遗传基础。出乎意料的是，发现三个所述菌株在天然铁硫簇调节基因(iscR)中具有突变，该基因编码多效性转录因子(IscR)[SEQ ID No:2]。Fe-S簇是许多蛋白和必需酶的辅因子，使它们具有多种多样的生化能力，不仅是合成含S化合物(例如生物素)所必需的，而且还作为氧化还原或铁相关应激条件的传感器。

[0107] IscR以两种状态存在，即Fe-S簇全蛋白或无Fe-S簇的脱辅蛋白。IscR的Fe-S簇的组装由isc操纵子所编码的Isc途径来催化。isc操纵子首先编码调节因子(IscR)，然后编码半胱氨酸脱硫酶(IscS)、支架(IscU)、A型蛋白(IscA)、Dnaj样共伴侣蛋白(HscB)、DnaK样伴侣蛋白(HscA)和铁氧还蛋白(Fdx)。除了对于组装IscR全酶至关重要以外，Isc途径还是大肠杆菌中Fe-S簇生物发生的主要途径(图1B)。

[0108] 两种形式的IscR之间的比例取决于[2Fe-2S]簇的细胞水平，而该细胞水平又受包括铁水平和氧水平在内的若干因素的影响(Py,B.&Barras,2010)。在富铁条件下，IscR主要以全酶形式存在，其然后充当isc操纵子的转录阻遏物。但是，在低铁条件下([2Fe-2S]簇的水平低)，IscR返回其脱辅蛋白状态，从而允许isc操纵子的转录。在其脱辅蛋白状态下，IscR充当sufABCDSE操纵子的激活剂，该操纵子在氧化应激下催化Fe-S团簇的生物发生。

[0109] 除了在大肠杆菌中调节两个Fe-S簇组装系统的表达外，IscR还调节>40个基因，这些基因参与多种作用机制(例如氧化应激机制(例如sodA))、特异性和全局性调节因子(例如yqjI和soxS)、氨基酸生物合成(例如argE)，以及一系列功能未知的基因。IscR的作用由于IscR调节谱在有氧和厌氧条件之间变化这一事实而变得更加复杂(Martin和Imlay,2012；Giel等，2006)。

[0110] 鉴于IscR的稳态作用及其在全局基因调节中的作用，其调节性质的任何改变都会带来不可预测的、对于细胞代谢而言可能是深远的后果。此外，使Fe-S团簇生物发生增加(由于硫形成(suf)和isc途径表达的增加)的细胞条件也产生了累积的Fe-S簇通过芬顿反应而产生过氧化物自由基的风险。

[0111] 鉴于此，非常出乎意料的是，IscR对于细胞BioB的活性和毒性竟如此重要，如三个分离的个体突变体所证明的。此外，突变的IscR蛋白对生物素生物合成的影响是出乎意料的，因为未发现使合成和组装Fe-S簇的能力增强的isc操纵子或suf操纵子的过表达能够增强过表达bioB的细胞中的生物素产生(见实施例1，图10)。此外，通过敲除iscR基因而去除细胞iscR调节作用，也不能增强细胞中的生物素产生(见实施例1，图12)。

[0112] IscR蛋白中的消除了突变细胞中BioB表达毒性的三个不同的突变是氨基酸L15[SEQ ID No:16]、C92[SEQ ID No:18]和H107[SEQ ID No:20]的单氨基酸置换(图8)。这三个突变中的两个正好对应于IscR中的各自已知对于形成IscR全蛋白而言必不可少的那些残基。在大肠杆菌中看出，IscR具有非同寻常的Fe-S簇连接机制，藉此，Fe-S簇连接所必需的残基为C92、C98和C104以及H107。这种非典型连接可以赋予全酶状态的IscR相对于其他Fe-S蛋白更低的稳定性，这进而解释了在低Fe-S条件下向脱辅蛋白状态的转变
(Fleischhacker等，2012)。

[0113] 尽管不希望受到理论的束缚，这表明Fe-S簇生物发生的稳态控制和细胞生长所需的全局基因调节在表达本发明的突变iscR基因的细胞中是独特地保守的，同时促进了含铁硫簇的酶(生物素合酶、硫辛酸合酶、HMP-P合酶和酪氨酸裂解酶)的组装，甚至在它们过表达时也是如此。

[0114] 总之，发明人已经鉴定出编码突变IscR蛋白的突变iscR基因，其特征在于缺乏连接Fe-S簇所需的一个或多个氨基酸残基，使得所表达的突变IscR蛋白仅以脱辅蛋白形式存在。显示包含铁-硫簇的酶的合成在增强细菌中的生物素、硫辛酸或硫胺素生产的努力中构成了严重瓶颈。通过在包含编码以脱辅蛋白状态存在的突变IscR蛋白的基因的细胞工厂中过表达这些酶，促进了本发明所提供的该问题的解决方案。下面将更详细地描述本发明的各种实施方式。

[0115] I.用于生产生物素的经遗传修饰的细菌细胞

[0116] 本发明提供了能够产生升高水平的生物素的经遗传修饰的细菌细胞。对该细菌细胞进行遗传修饰以表达突变IscR来替代野生型IscR，并且该细菌细胞包含编码生物素合酶(具有EC 2.8.1.6的生物素合酶)的转基因。可选地，该经遗传修饰的细菌细胞可以进一步包含一种或多种其他转基因，其编码催化生物素途径中的其他步骤的多肽(图1A)。催化生物素途径中的步骤的这些多肽的水平增加在细菌细胞中增强了生物素途径中的中间体和该途径的最终产物(生物素)。

[0117] 由所述经遗传修饰的细菌细胞表达的突变IscR多肽衍生自以多肽主链(脱辅蛋白)为特征的IscR多肽家族的野生型成员。IscR多肽家族的野生型成员的氨基酸序列与选自SEQ ID No:2、4、6、8、10、12和14的任一序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、98％、100％的氨基酸序列同一性。本发明的突变IscR多肽的氨基酸序列与其所源自的相应野生型IscR多肽的氨基酸序列的区别在于至少一个氨基酸置换；其中所述置换选自L15X、C92X、C98X、C104X和H107X；其中置换的氨基酸X是除了衍生出突变体的野生型IscR的相应位置处的氨基酸以外的任何氨基酸。

[0118] 在替代性实施方式中，突变IscR中的氨基酸置换选自：L15X，其中X是除L以外的任何氨基酸，更优选X选自苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、甲硫氨酸(M)和色氨酸(W)；C92X，其中X是除C以外的任何氨基酸，更优选X选自酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)；C98X，其中X是除C以外的任何氨基酸，更优选X选自丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)；Cys104X，其中X是除C以外的任何氨基酸，更优选X选自丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)；和His107X，其中X是除H以外的任何氨基酸，更优选X选自丙氨酸(A)、酪氨酸(Y)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)和亮氨酸(L)。例如，突变IscR中的氨基酸置换可以选自L15F、C92Y、C92A、C98A、Cys104A、H107Y和H107A。

[0119] 本发明的经遗传修饰的细菌细胞所表达的突变IscR(而不是野生型IscR)由位于细菌细胞基因组中的经遗传修饰的基因编码，该基因位于染色体上或位于自复制质粒上。染色体中的经遗传修饰的iscR基因可以位于基因组中的与天然基因组中野生型iscR基因相同的位置。本发明的经遗传修饰的细菌细胞的基因组缺乏天然野生型iscR基因，因为天然野生型iscR基因要么缺失要么被经遗传修饰的iscR基因直接替代。驱动该经遗传修饰的iscR基因的表达的启动子可以是该经遗传修饰的iscR基因所源自的或替代的野生型iscR基因的天然启动子。或者，启动子可以是异源组成型或诱导型启动子。当启动子是异源组成型启动子时，则合适的启动子包括apFab家族[SEQID No:230-232]，而合适的诱导型启动子包括pBad(阿拉伯糖诱导型[SEQ ID No:233]和LacI[SEQ ID No:234]。合适的终止子包括apFAB终止子家族的成员，包括[SEQ IDNo:235-237]。

[0120] 本发明的具有生物素合酶活性(EC 2.8.1.6)的多肽是催化脱硫生物素(DTB)转化为生物素的具有生物素合酶活性的多肽。该生物素合酶家族的成员由多个属的细菌中发现的基因编码。具有生物素合酶活性的多肽的氨基酸序列与选自以下任一序列的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、98％、100％的氨基酸序列同一性：SEQ ID No:22(来源：大肠杆菌)；SEQ ID No:27(来源：未培养嗜热氯酸杆菌B(Candidatus
Chloracidobacterium thermophilum B)；SEQ ID No:29(来源：利迪链霉菌(Streptomyces lydicus))；SEQ ID No:31(来源：脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans))；SEQ ID No:
33(来源：脱氮副球菌PD1222)；SEQ ID No:35(来源：葡萄土壤杆菌(Agrobacterium
vitis))；SEQ ID No:37(来源：波默罗伊鲁杰氏菌(Ruegeria pomeroyi))；SEQ ID No:39(来源：法氏土壤杆菌(Agrobacterium fabrum))；SEQ ID No:41(来源：温带臭虫(Cimex lectularius)的沃尔巴克氏内共生菌(Wolbachia endosymbiont))；SEQ ID No:43(来源：
少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis))；SEQ ID No:45(来源：耐冷嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus ferrivorans))。SEQ ID No:47(来源：卡普思加立昂菌(Gallionella capsiferriformans))；SEQ ID No:49(来源：富养产碱菌(Ralstonia eutropha))；SEQ ID No:51(来源：副百日咳博代氏菌(Bordetella parapertussis))；SEQ ID No:53(来源：极小单胞菌物种(Pusillimonas sp.))；SEQ ID No:55(来源：共生餐古菌(Cenarchaeum
symbiosum sp.))；SEQ ID No:57(来源：酸热环脂酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus
acidocaldarius sp.))；SEQ ID No:59(来源：热葡糖苷酶地土芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius))；SEQ ID No:61(来源：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))；SEQ ID No:63(来源：球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus))；SEQ ID No:65(来源：荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus))；SEQ ID No:67(来源：非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata))；SEQ ID No:69(来源：需盐色盐杆菌(Chromohalobacter salexigens))；SEQ ID No:71、73、75、77、79、81、83、85、87(来源：假单胞菌属物种)。

[0121] 由所述经遗传修饰的细菌细胞中的其他转基因编码的具有用于增强生物素途径的中间体和产物合成的活性的多肽如下：

[0122] a)具有SAM(S-腺苷甲硫氨酸)依赖性甲基转移酶活性(BioC；EC 2.1.1.197)的多肽；例如氨基酸序列与SEQ ID No:89具有80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的多肽；

[0123] b)具有7-酮-8-氨基壬酸(KAPA)合酶活性(BioF；EC 2.3.1.47)的多肽，例如氨基酸序列与SEQ ID No:91具有80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的多肽；

[0124] c)具有7,8-二氨基壬酸(DAPA)合酶活性(BioA；EC:2.6.1.62)的多肽，例如氨基酸序列与SEQ ID No:93具有80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的多肽；或具有L-赖氨酸:8-氨基-7-氧代壬酸酯氨基转移酶活性(BioK；EC:2.6.1.105)的多肽，例如氨基酸序列与SEQ ID No:97具有80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的多肽；

[0125] d)具有脱硫生物素(DTB)合酶活性(BioD；EC 6.3.3.3)的多肽，例如氨基酸序列与SEQ ID No:95具有80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的多肽；以及可选的

[0126] f)具有庚二酰基-[酰基-载体蛋白]甲基酯酯酶活性(BioH；EC:3.1.1.85)的多肽，例如氨基酸序列与SEQ ID No:99具有80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的多肽；或[0127] g)具有6-羧基己酸-CoA连接酶活性(BioW；EC 6.2.1.14)的多肽；例如氨基酸序列与SEQ ID No:101具有80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的多肽。

[0128] 编码BioB的转基因以及编码催化生物素途径中其他步骤的多肽的一种或多种其他转基因，位于经遗传修饰的细菌细胞的基因组中，其整合到细菌细胞染色体中或自复制质粒上。编码BioB和生物素途径酶中的一种或多种酶(BioABFCD以及H或W)的转基因可以存在于基因组的一个或多个操纵子中。

[0129] 驱动编码BioB的转基因以及一个或多个其他转基因的表达的启动子优选是非天然启动子，其可以是异源组成型启动子或诱导型启动子。当启动子是异源组成型启动子时，则合适的启动子包括apFab家族[SEQ ID No:230-232]，而合适的诱导型启动子包括pBad(阿拉伯糖诱导型[SEQ ID No:233]和LacI[SEQ ID No:234]。合适的终止子包括apFAB终止子家族的成员，包括[SEQ ID No:235-237]。选定的启动子和终止子可以与BioB的编码序列以及BioC、BioD、BioA、BioF和BioW或BioH多肽的一个或多个编码序列可操作地连接，或可以与编码选定的Bio多肽的一个或多个操纵子可操作地连接。

[0130] II.使用本发明的经遗传修饰的细菌生产和检测生物素的方法

[0131] 使用本发明的经遗传修饰的细菌细胞(例如，经遗传修饰的大肠杆菌细胞)，通过将这些细胞引入适合于支持生长并包含适于生物素生物合成的碳源的培养基中、并最终回收由该培养物产生的生物素，可以产生和输出生物素，如实施例中所示。

[0132] 当所提供的碳源包括脱硫生物素(DTB)时，包含编码生物素合酶(BioB)的转基因的本发明的经遗传修饰的细菌细胞将产生升高水平的生物素。当本发明的经遗传修饰的细菌细胞另外包含编码BioA、BioF、Bio、BioD和BioH或BioW的每一个的转基因时，它们将在所提供的碳源选自葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、棉子糖、甘露糖和乳糖时产生生物素(实施例1，图13)。

[0133] 实施例1.5中描述了由本发明的经遗传修饰的细菌细胞产生的细胞外生物素的定量方法。该方法是一种生物测定法，其基于在缺乏生物素的生长培养基中测量包含质粒pBS451的BS1011的生物素饥饿型过夜培养物的生长，该培养基补充有衍生自本发明的培养细胞的细胞外生长培养基。当补充已知浓度范围的生物素标准品时，通过测量生物素饥饿型过夜培养物的生长来制作生物素生物测定校准曲线，如图5所示。

[0134] III.用于生产硫辛酸的经遗传修饰的细菌细胞

[0135] 本发明提供了能够产生升高水平的硫辛酸的经遗传经遗传修饰的细菌细胞。根据本发明，该细菌细胞被遗传修饰成表达突变的IscR(参见第I部分)，以代替野生型IscR，并且包含编码硫辛酸合酶(EC 2.8.1.8)的转基因。LipA通过促进两个硫键的形成来催化共价连接的辛酰基结构域向硫辛酰基结构域的转化。可选地，经遗传修饰的细菌细胞可以进一步包含一种或多种编码催化硫辛酸合成途径中的其他步骤的多肽的其他转基因(图2)，更具体而言，编码的多肽LipB；EC 2.3.1.181，例如来自lipB基因，和编码的多肽E2；EC 2.3.1.12，例如来自aceF基因。那些催化硫辛酸途径中的步骤的多肽的水平增加会在细菌细胞中增强该途径的中间体以及该途径的最终产物的合成。编码LplA的另一种转基因是硫辛酸-蛋白连接酶A；EC:6.3.1.20，其通过催化辛酰基部分转移到活化的硫辛酰基结构域上来促进辛酸喂饲的细胞中的硫辛酸合成。

[0136] 硫辛酸合酶由属于属的多种细菌和真菌中存在的基因编码。具有硫辛酸合酶活性的多肽的氨基酸序列与选自以下任一序列的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、98％、100％的氨基酸序列同一性：SEQ ID No:103(来源：大肠杆菌)；SEQ ID No:105(来源：枯草芽孢杆菌)；SEQ ID No:107(来源：酿酒酵母(Saccharomyces
cerevisiae))；SEQ ID No:109(来源：恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))；SEQ ID No:
111(来源：脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis))；和SEQ ID No:113(起源：天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor))。

[0137] 由所述经遗传修饰的细菌细胞中的其他转基因编码的具有增强硫辛酸途径的中间体和产物合成的活性的多肽如下：

[0138] a)具有辛酰基转移酶(用于将辛酰基残基从ACP转移到靶酶的E2亚基的脱辅硫辛酰基结构域)活性(LipB；EC:2.3.1.181)的多肽；例如氨基酸序列与SEQ ID No:115(来源：大肠杆菌)或SEQ ID No:117(来源：弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri))具有80％、85％、
90％、95％或100％的序列同一性的多肽；

[0139] b)包含具有丙酮酸脱氢酶(E2；EC:2.3.1.12)的二氢硫辛酰基赖氨酸残基乙酰转移酶组分的多肽，例如氨基酸序列与SEQ ID No:119(来源：大肠杆菌)或SEQ ID No:121(来源：产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca))或SEQ ID No:239(杂交序列)具有80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性的多肽。

[0140] c)具有硫辛酸-蛋白连接酶A(LplA；EC 6.3.1.20)活性的多肽，例如氨基酸序列与SEQ ID No:123(来源：大肠杆菌)或SEQ ID No:125(来源：产酸克雷伯菌)具有80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性的多肽。

[0141] 编码硫辛酸合酶的转基因以及编码催化硫辛酸途径中其他步骤的多肽的一种或多种其他转基因位于经遗传修饰的细菌细胞的基因组中，其整合到细菌细胞染色体中或自复制质粒上。编码LipA的转基因和编码硫辛酸途径中的酶的一种或多种转基因(lpB、lplA和AceF)可以存在于基因组中的一个或多个操纵子内。

[0142] 驱动编码LipA的转基因和一个或多个其他转基因的表达的启动子优选是非天然启动子，其可以是异源组成型启动子或诱导型启动子。当启动子是异源组成型启动子时，则合适的启动子包括apFab家族[SEQ ID No:230-232]，而合适的诱导型启动子包括pBad(阿拉伯糖诱导型[SEQ ID No:233]和LacI[SEQ ID No:234]。合适的终止子包括apFAB终止子家族的成员，包括[SEQ ID No:235-237]。选定的启动子和终止子可以与相应的基因可操作地连接，以提供单个基因的调节或用于调节操纵子。

[0143] IV.使用本发明的经遗传修饰的细菌生产和检测硫辛酸的方法

[0144] 使用本发明的经遗传修饰的细菌细胞(例如，经遗传修饰的大肠杆菌细胞)，通过将这些细胞引入合适的培养基中、并最终回收由该培养物产生的硫辛酸，可以产生硫辛酸，如实施例2和图14中所示。

[0145] 当所提供的碳源包括辛酸(OA)时，包含编码硫辛酸合酶(LipA)的转基因的本发明的经遗传修饰的细菌细胞将产生硫辛酸。当供应有合适的碳源时，例如选自葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、棉子糖、甘露糖和乳糖的碳源，细胞将产生硫辛酸。

[0146] 实施例2中描述了由本发明的经遗传修饰的细菌细胞产生的细胞硫辛酸的定量方法。该方法是生物测定法，其基于测量硫辛酸依赖性营养缺陷型大肠杆菌菌株在最低限度培养基上的生长，所述培养基补充有从本发明的细胞中提取的硫辛酸。

[0147] V.用于生产硫胺素的经遗传修饰的细菌细胞

[0148] 本发明提供了能够产生升高水平的硫胺素的经遗传修饰的细菌细胞。根据本发明，细菌细胞被遗传修饰成表达突变IscR(参见第I部分)以替代野生型IscR，并且包含编码磷酸甲基嘧啶合酶(也称为HMP-P合酶)(EC 4.1.99.17)(由thiC编码)或酪氨酸裂解酶(也称为2-亚氨基乙酸合酶(EC 4.1.99.19))(由thiH编码)的转基因。

[0149] 经遗传修饰的细菌细胞可以进一步包含编码催化硫胺素合成途径中的其他步骤的多肽的一种或多种其他转基因(图3)。那些催化硫胺素途径中的步骤的多肽的水平增加会在细菌细胞中增强该途径的中间体以及该途径的最终产物的合成。例如，细菌细胞可以进一步包含一种或多种转基因，其编码：ThiE硫胺素磷酸合酶(EC 2.5.1.3)；[ThiS]腺苷酰基转移酶(EC 2.7.7.73)(由例如thiF基因编码)；ThiG噻唑合酶(E.C2.8.1.10)；ThiS硫载体蛋白；ThiD磷酸羟甲基嘧啶激酶(EC 2.7.4.7)和硫胺素单磷酸磷酸酶(E.C 3.1.3.-)；ThiO甘氨酸氧化酶(EC1.4.3.19)；和ThiM羟乙基噻唑激酶(2.7.1.50)。

[0150] HMP-P合酶存在于属于多个属的多种细菌和真菌中。具有HMP-P合酶活性的多肽的氨基酸序列与选自以下任一序列的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、98％、100％的氨基酸序列同一性：SEQ ID No:201(来源：大肠杆菌)；SEQ ID No:203(来源：
细长聚球藻(Synechococcus elongates))；SEQ ID No:205(来源：谷氨酸棒状杆菌
(Corynebacterium glutamicum))；SEQ ID No:207(来源：Candidatus Baumannia
cicadellinicola)。

[0151] 酪氨酸裂解酶也称为2-亚氨基乙酸合酶(EC 4.1.99.19)。具有HMP-P合酶活性的多肽的氨基酸序列与SEQ ID No:217的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、98％、100％的氨基酸序列同一性。

[0152] 由经遗传修饰的细菌细胞中的一个或多个其他转基因编码的具有用于增强硫胺素途径的中间体和产物合成的活性的多肽如下：

[0153] a)具有[ThiS]腺苷酰基转移酶(EC 2.7.7.73)活性的多肽，例如氨基酸序列与SEQ ID No:211具有80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性的多肽；

[0154] b)具有硫胺素磷酸合酶(EC 2.5.1.3)的多肽，例如例如氨基酸序列与SEQ ID No:209具有80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性的多肽；

[0155] c)具有噻唑合酶(E.C 2.8.1.10)活性的多肽，例如氨基酸序列与SEQ ID No:215具有80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性的多肽；

[0156] d)具有磷酸羟甲基嘧啶激酶(EC 2.7.4.7)活性的多肽，例如氨基酸序列与SEQ ID No:225具有80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性的多肽；

[0157] e)具有甘氨酸氧化酶(EC1.4.3.19)活性的多肽；例如氨基酸序列与选自SEQ ID No:219、221和223的序列具有80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性的多肽；

[0158] f)具有ThiS硫载体蛋白活性的多肽，例如氨基酸序列与SEQ ID No:213具有80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性的多肽；

[0159] g)具有硫胺素单磷酸磷酸酶(E.C.3.1.3.-)活性的多肽；例如氨基酸序列与选自SEQ ID No:127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、
197、199中的任一序列具有80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性的多肽；和[0160] h)具有ThiM羟乙基噻唑激酶活性(2.7.1.50)的多肽，例如氨基酸序列与SEQ ID No:227具有80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性的多肽。

[0161] 优选地，所述经遗传修饰的细菌细胞包含编码以下酶的转基因：ThiC(由thiC基因编码)；ThiD(由thiD基因编码)，ThiE(由thiE基因编码)，ThiF(由thiF基因编码)，硫载体蛋白(由thiS基因编码)，ThiG(由thiG基因编码)，TMP磷酸酶(由TMP磷酸酶基因编码)；以及ThiH(由thiH基因编码)或ThiO(由thiO基因编码)。根据一个实施方式，所述细胞可以进一步包含编码酶ThiM(由thiM基因编码)的转基因。

[0162] 通过编码硫胺素-磷酸激酶的内源性thiL基因的突变，可以进一步提高本发明的经遗传修饰的细菌中的硫胺素合成水平。突变thiL基因具有SEQ ID No:228的核苷酸序列，并且与亲本野生型基因相比，其在核苷酸133-135处具有突变(从GGT至GAC)，编码具有G133D置换的多肽[SEQ ID No:229]。

[0163] 编码由thiC编码的HMP-P合酶(EC 4.1.99.17)或由thiH编码的酪氨酸裂解酶(EC4.1.99.19)的转基因，以及编码催化硫胺素途径中的其他步骤的多肽的一个或多个其他转基因，位于经遗传修饰的细菌细胞的基因组中，其整合到细菌细胞染色体中或自复制质粒上。thiC或thiH转基因以及编码硫胺素途径中的酶的一种或多种转基因可以存在于基因组中的一个或多个操纵子内。

[0164] 驱动thiC或thiH转基因以及一个或多个其他转基因的表达的启动子优选是非天然启动子，其可以是异源组成型启动子或诱导型启动子。当启动子是异源组成型启动子时，则合适的启动子包括apFab家族[SEQ ID No:230-232]，而合适的诱导型启动子包括pBad(阿拉伯糖诱导型[SEQ ID No:233]和LacI[SEQ ID No:234]。合适的终止子包括apFAB终止子家族的成员，包括[SEQ ID No:235-237]。选定的启动子和终止子可以与相应的基因可操作地连接，以提供单个基因的调节或用于调节操纵子。

[0165] VI.使用本发明的经遗传修饰的细菌来生产和检测硫胺素的方法

[0166] 使用本发明的经遗传修饰的细菌细胞(例如，经遗传修饰的大肠杆菌细胞)，通过将这些细胞引入合适的培养基中、并最终回收由这些细胞产生硫胺素以及额外的硫胺素单磷酸(TMP)和硫胺素二磷酸(TPP)，可以产生硫胺素、TMP和TPP，如实施例3和图16所示。

[0167] 当所提供的碳源选自葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、棉子糖、甘露糖和乳糖时，包含编码HMP-P合酶的转基因的本发明的经遗传修饰的细菌细胞将产生硫胺素、TPP和TMP。

[0168] 实施例3中描述了由本发明的经遗传修饰的细菌细胞产生的硫胺素的定量方法，相对于硫胺素标准品，该方法可以包括使用高压液相色谱法。

[0169] VII.工程化经遗传修饰的细菌细胞以生产生物素、硫辛酸或硫胺素的方法

[0170] 适于在本发明的细菌细胞中克隆和导入编码具有与生物素、硫辛酸或硫胺素的合成相关的酶活性的一种或多种多肽的一种或多种转基因的整合和自复制载体是可商购的并且是本领域技术人员已知的(参见例如Sambrook等，《分子克隆：实验手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，1989)。通过将异源DNA导入细胞而对细菌细胞进行基因工程化。编码具有与生物素、硫辛酸或硫胺素的合成相关的酶活性的一种或多种多肽的基因在本发明的细菌细胞中的异源表达分别在实施例1、2和3中示出。

[0171] 可以通过利用自复制载体将编码具有与生物素、硫辛酸或硫胺素的合成相关的酶活性的一种或多种多肽的核酸分子导入宿主细胞，或者可以可选地用本领域标准的方法和技术将其整合入宿主细胞基因组中。例如，可以通过标准方案导入核酸分子，例如转化(包括化学转化和电穿孔)、转导、粒子轰击等。表达编码所要求保护的本发明的酶的核酸分子也可以通过将核酸分子整合入基因组中来实现。

[0172] 通过对适合的亲本细菌细胞应用标准重组方法(Datsenko KA等；2000)，缺失(敲除)内源iscR基因并用编码第I节中定义的突变IscR多肽的转基因进行插入/置换，由此能够对本发明的细菌细胞中的天然内源iscR基因进行遗传修饰。

[0173] 用于产生生物素、硫辛酸或硫胺素的本发明的经遗传修饰的细菌细胞可以是细菌，合适的细菌的非穷举列表如下：选自由埃希氏菌属、短杆菌属、伯霍尔德杆菌属、弯曲杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、沙雷菌属、乳杆菌属、乳球菌属、醋杆菌属、不动杆菌属和假单胞菌属组成的组的属的物种。

[0174] 本发明的优选细菌物种是大肠肝菌、恶臭假单胞菌、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和谷氨酸棒状杆菌。

[0175] VIII.本发明的经遗传修饰的细菌细胞的生物素生产能力因电子传递增加而增强[0176] 含有氧化型[4Fe-4S]2+簇的SAM自由基铁硫簇酶(例如BioB、ThiC和LipA)需要电子传递来还原为[4Fe-4S]+簇。只有还原型[4Fe-4S]+簇能够产生催化所需的SAM自由基。从电子供体NADPH到[4Fe-4S]2+簇的电子传递可以由黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白还原酶(Fpr)和黄素氧还蛋白(FldA)还原系统或由丙酮酸-黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白氧化还原酶系统来介导。

[0177] 在另一个实施方式中，能够产生生物素、硫辛酸或硫胺素的本发明的经遗传修饰的细菌细胞还包含选自以下组的一个或多个基因：编码黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白-NADP还原酶(EC 1.18.1.2和EC 1.19.1.1)的基因；编码丙酮酸-黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白氧化还原酶(EC 1.2.7)的基因；编码黄素氧还蛋白的基因；编码铁氧还蛋白的基因；编码黄素氧还蛋白和铁氧还蛋白-NADP还原酶的基因。与所述一种或多种基因的每一个可操作地连接的启动子能够增强所述一种或多种基因在所述细菌中的表达；其中所述一种或多种基因的每一个可以是天然基因或转基因。优选地，可操作地连接的启动子将所述一种或多种基因在所述细菌中的表达增强至比本发明的经遗传修饰细菌所源自的亲本细菌中更高的水平。优选地，本发明的经遗传修饰的细菌细胞包含编码黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白-NADP还原酶(EC:1.18.1.2和EC 1.19.1.1)的基因和编码黄素氧还蛋白的基因；或包含单一基因，其包含黄素氧还蛋白和铁氧还蛋白-NADP还原酶二者的编码序列。另外，所述经遗传修饰的细菌细胞可以进一步包含编码铁氧还蛋白的基因。

[0178] 在本发明的经遗传修饰的细菌细胞中表达电子传递途径的成分的基因的过表达增强了它们的SAM-自由基铁硫簇酶的细胞活性(如实施例4中对本发明的产生生物素的细胞所示)。

[0179] 优选地，当由本发明的经遗传修饰的细菌细胞中的天然基因或转基因编码的多肽具有黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白还原酶活性(EC:1.18.1.2和EC 1.19.1.1)时，其氨基酸序列与选自以下任何一个的序列具有80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性：SEQ ID No:241(来源：来自大肠杆菌的fpr基因)；SEQ ID No:243(来源：来自枯草芽孢杆菌168的yumC基因)；SEQ ID No:245(来源：来自恶臭假单胞菌KT2440的fpr-I基因)；SEQ ID No:247(来源：来自委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)ATCC 10712的SVEN_0113基因)；SEQ ID No:249(来源：来自谷氨酸棒状杆菌ATTCC 13032的Cgl2384基因)和SEQ ID No:251(来源：来自鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)JB170的SJN 15614.1基因)。

[0180] 优选地，当由本发明的经遗传修饰的细菌细胞中的天然基因或转基因编码的多肽具有丙酮酸-黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白氧化还原酶活性(EC 1.2.7)时，其氨基酸序列与选自以下任何一个的序列具有80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性：SEQ ID No:253(来源：来自大肠杆菌K12 MG1655的YdbK基因)；SEQ ID No:255(来源：来自硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)AM-1的por基因)；SEQ ID No:257(来源：来自深海来源链霉菌(Streptomyces pratensis)ATCC 33331的Sfla_2592基因)；SEQ ID No:259(来源：源自来自弗氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)DSM20271的RM25_0186基因)；SEQ ID No:261(来源：来自集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803的nifJ基因)。

[0181] 优选地，当由本发明的经遗传修饰的细菌细胞中的天然基因或转基因编码的多肽是黄素氧还蛋白时，其氨基酸序列与选自以下任何一个的序列具有80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性：SEQ ID No:263(来源：来自大肠杆菌K12 MG1655的fldA基因)；SEQ ID No:265(来源：来自大肠杆菌K12 MG1655的fldB基因)；SEQ ID No:267(来源：来自枯草芽孢杆菌168的ykuN基因)；SEQ ID No:269(来源：来自集胞藻PCC 6803的isiB基因；SEQ ID No:271(来源：来自委内瑞拉链霉菌ATCC 10712的wrbA基因)；SEQ ID No:273(起源：来自杂色甲烷球菌(Methanococcus aeolicus)Nankai-3的PRK06242基因)。

[0182] 优选地，当由本发明的经遗传修饰的细菌细胞中的天然基因或转基因编码的多肽是铁氧还蛋白时，其氨基酸序列与选自以下任何一个的序列具有80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性：SEQ ID No:275(来源：来自大肠杆菌的fdx基因)；SEQ ID No:277(来源：来自枯草芽孢杆菌168的fer基因)；SEQ ID No:279(来源：来自谷氨酸棒状杆菌ATTCC
13032的fdxB基因)；SEQ ID No:281(来源：来自集胞藻PCC6803的fdx基因)；SEQ ID No:283(来源：委内瑞拉链霉菌ATCC 10712的SVEN_7039基因)；SEQ ID No:285(来源：来自杂色甲烷球菌Nankai-3的fdx基因)。

[0183] 当与编码所述细菌中电子传递途径的多肽的天然基因或转基因可操作地连接时能够增强基因表达的启动子优选是非天然启动子。所述启动子可以是组成型apFAB309启动子家族的成员[SEQ ID No:230-232]。优选地，当与所述天然基因或转基因可操作地连接时，所述非天然启动子将所述编码的多肽在所述经遗传修饰的细菌中的表达增强至高于其所源自的亲本细菌的水平。可以与所述天然基因或转基因可操作地连接的合适的终止子包括apFAB378终止子家族[SEQ ID No:235-237]。

[0184] 实施例

[0185] 实施例1：鉴定和表征能够增强生物素生产的经遗传修饰的大肠杆菌菌株

[0186] 1.方法

[0187] 1.1实施例中使用的以下大肠杆菌菌株如下所示。

[0188] 表1：菌株

[0189]

[0190] 1缺失前的ΔbioB基因的核苷酸序列为SEQ ID No:21

[0191] 1.2实施例中使用的以下质粒如下所示。

[0192] 表2：质粒

[0193]

[0194] 1 bioB移码基因的核苷酸序列具有SEQ ID No：23。

[0195] 1.3 培养基和添加剂：

[0196] 每个实施例中使用的生长培养基(mMOPS)具有以下组成：1.32mM K2HPO4；2g/lD-葡萄糖；0.0476mg/l泛酸钙；0.0138mg/l对氨基苯甲酸；0.0138mg/l对羟基苯甲酸；0.0154mg/l2，3-二羟基苯甲酸；和1x改良的MOPS缓冲液。

[0197] 10x改良的MOPS包含：0.4M MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)；0.04M三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)；0.1mM FeSO4·7H2O；95mM NH4Cl；2.76mM K2SO4；5μM CaCl2·2H2O；5.25mM MgCl2；0.5M NaCl；微量营养素储备溶液的5000x稀释液。

[0198] 微量营养素储备液：

[0199] 组分化学式 FW g/50mL钼酸铵 (NH4)6Mo7O24·4H2O 1235.9 0.009
硼酸 H3BO3 61.83 0.062
氯化钴 CoCl2 237.9 0.018
硫酸铜 CuSO4 249.7 0.006
氯化锰 MnCl2 197.9 0.040
硫酸锌 ZnSO4 287.5 0.007

[0200] 使用了以下抗生素储备液：氨苄青霉素(amp，100mg/mL)，卡那霉素(kan，50mg/mL)，博来霉素(zeo，40mg/mL)；如所示将其加入生长培养基中以获得1000x稀释度。

[0201] 1.4 建立大肠杆菌菌株文库：

[0202] 通过将细胞在补充有kan的mMOPS培养基(MOPS-kan)中静置过夜培养，制备MOPS-kan中的100倍稀释的所得培养物，并重复过夜培养和稀释的连续步骤5次，从而从包含质粒pBS412的大肠杆菌菌株BS1011的细胞衍生出具有进化的基因组多样性的大肠杆菌文库。这个程序通过允许累积由不完善的纠错聚合酶产生的背景突变，从而产生了遗传多样性。在每轮培养和稀释后，将细胞培养物样品平板接种在具有IPTG的mMOPS平板上(见下文)，以检测适合耐受增强的BioB表达的细胞的出现。然后用BioB过表达质粒pBS412转化每个文库的细胞。

[0203] 1.5 突变株的选择

[0204] 通过将来自包含pBS412的BS1011在mMOPS-kan中的o/n培养物的104、105、106和107个细胞各自平板接种在包含IPTG浓度为0、0.0001、0.001、0.01、0.1和1mM的mMOPS的一系列1.5％琼脂平板上，从而建立选择测定。然后将这些平板在37℃下温育至多36小
时，并且每隔一段时间评估细胞生长。在这些条件下，在平板接种在单个培养皿上时，发现用0.1mM IPTG诱导pBS412的BioB表达能够阻止至多105个细胞的生长，而用1mM IPTG诱导则阻止了至少107个细胞的生长。发现针对105个细胞的细胞群的包括用1mM IPTG进行诱导的选择压力最适合鉴定在BioB表达下更强健的菌株；并且该选择压力相应地如下实施：

[0205] 1)在每个mMOPS-kan-1mM IPTG琼脂平板上接种来自1.4节所述的每个文库的约105个细胞，并在37℃下温育最多24小时。

[0206] 2)将单个菌落在mMOPS-kan液体培养基中生长以产生预培养物，然后通过在补充有0.00、0.01或0.1mM IPTG的mMOPS-kan中进行的生物素生物测定(如下文1.6节所述)，从而评估所述预培养物的生物素产生。每种预培养物的细胞均保存在20％甘油中作为甘油储备样。

[0207] 3)将产生超过1.5mg生物素/l(检测细胞外生物素)的菌落重新划线接种在mMOPS-kan琼脂平板上，在37℃下温育至多24小时，然后在生物重复样品中再次进行生物测定以获得生物素产量(如下文1.6节所述)。

[0208] 4)所选的生物素高产菌株的细胞如下评估：

[0209] a)对从所选的菌株的细胞中分离出的DNA如下进行全基因组测序，以鉴定与亲本菌株BS1011的基因组相比所选的菌株的细胞的基因组中的遗传突变：使所选的细胞在5-10mL mMOPS-kan中生长，随后收获细胞；使用Invitrogen Purelink基因组DNA提取试剂盒(https://www.thermofisher.com/order/cataloq/product/K182001)从收获的细胞中分离出基因组DNA；对提取的DNA进行全基因组测序。

[0210] b)消除(curing)所选菌株的细胞的pBS412质粒；然后用pBS412质粒重新转化经消除的菌株的细胞；最后，对转化的菌株细胞的培养物重新进行生物测定，以获得生物素产量。消除细胞的pBS412质粒的步骤如下进行：在37℃下，在无抗生素的含1mM IPTG的富Luria Broth(LB)培养基中使细胞过夜生长，将所得培养物的细胞划线接种在LB琼脂平板上，并在37℃下温育过夜。将来自琼脂平板的单个菌落稀释在50μl LB培养基中，并用5μl在LB和LB-amp琼脂平板上点样，在37℃下温育过夜。将那些在LB平板上生长但不在LB-amp平板上生长的单个菌落重新划线接种在LB平板上，以获得单个菌落，将其用作用于再次转化的经消除的菌株。

[0211] 在生物重复样品中测量经转化的菌株的细胞的生物素产量(如以下1.6节所述)。简言之，在补充有0.00、0.01或0.1mM IPTG的mMOPS-kan中重新评估了生物重复样品中的生物素产量。平行地，在Multiskan FC中，在“快速摇动”以进行有氧生长的情况下，于37℃在用透明的透气密封件密封的微量滴定板中的200μL mMOPS-kan培养基中测量每种转化的菌株的细胞的生长速率，为期24小时。细胞生长通过每30分钟测量OD620来监测。

[0212] 1.6 用于定量生物素生产的生物测定

[0213] 在96孔深孔板中的400μl mMOPS-kan中，从所选的单个细胞菌落制备每种预培养物，在37℃下以275rpm摇动温育16-18小时。通过用足以提供约0.03的初始OD600值的4μL预培养物接种到96孔深孔板中的400μl mMOPS-kan(其补充有0.1g/L脱硫生物素(DTB)，且可选地包含最终浓度至多为1mM的IPTG)中，由此制得生产培养物。然后使培养物在37℃、275rpm摇动下生长24小时。在测量培养物的OD600之后，通过在4000G下离心8分钟来使96孔深孔板中的细胞沉淀。用超纯(Milli-Q)水将来自每种培养物上清液的上清液稀释至
0.05nM至0.50nM生物素的浓度范围。平行地，在Milli-Q水中制备浓度范围为0.1nM(0.024μg生物素/L)至1nM(0.24μg生物素/L)的多于5个生物素标准品。然后将15μL的每个稀释的上清液和每个生物素标准品加入微量滴定板的孔中；其中每个孔包含135μL的包含质粒
pBS451的BS1011的生物素饥饿型过夜培养物；其中过夜培养物在补充有zeocin的mMOPS中被稀释至初始OD620为0.01。用透气密封件密封平板，并在37℃下以275rpm摇动温育20小时，然后测量OD600。使用一系列生物素标准品通过该生物测定获得的生物素生物测定校准曲线如图5所示。

[0214] 1.7 基因组突变的鉴定

[0215] 对于所有下一代测序(NGS)数据，使用CLC基因组工作台9.5.3版(由Qiagen提供)来鉴定所选菌株的细胞基因组中与亲本菌株基因组相比的突变(通过Variant Detection得到的单个或几个置换、缺失或插入，以及通过InDels和Structrual Variants得到的更大的插入/缺失)。使用85％的截止值来定义“重大突变”，这意味着从给定细菌菌株的细胞中分离出的DNA分子(基因组)在数量上超过85％应当具有突变，由此将基因组突变与测序程序所引入的错误核苷酸区分开。

[0216] 使用NCBI的基因组登录号CP009273作为参照序列，并考虑到经测序证实了序列的Keio ΔbioB疤痕突变。

[0217] 1.8 表征iscR突变体的蛋白质组学谱

[0218] 通过最近开发的结合LC-MS和高效蛋白提取的方法(Schmidt等，2015)，确定了0.025mM IPTG诱导水平下的BS1013+pBS430、BS1011+pBS412和BS1353+pBS412的蛋白含量，以及1mM IPTG诱导下的BS1353+pBS412的蛋白含量。选择3种肽作为用于分析的已鉴定肽的最小数量，并使用2.0％FDR的肽阈值。基于使用ScaffoldViewer 4.7.5进行的多重检验用Benjamini-Hochberg校正下的方差分析(ANOVA)，以0.5％的置信区间报告了蛋白表达的显著变化。

[0219] 使菌株在具有IPTG诱导的mMOPS中生长约10代，直到OD600为0.5(指数期)。通过在4℃下以最大速度离心而收集108个细胞；在冰冷的PBS缓冲液中洗涤一次；通过在4℃以最大速度离心来再次沉淀，并在除去PBS缓冲液后在液氮中速冻。

[0220] 2.结果

[0221] 2.1 BioB的过表达具有毒性

[0222] 保留了其天然生物素合酶基因(bioB)但还表达来自低拷贝质粒(Sc101复制起点)的IPTG诱导性移码大肠杆菌bioB基因(由于提前终止密码子，其编码非功能性生物素合酶)的大肠杆菌能够在有或没有IPTG的mMOPS-kan培养基中有氧生长。这在图4(左图)中示出，其显示了大肠杆菌BW25113 BioB移码突变体的指数生长曲线。相比之下，在大肠杆菌敲除菌株ΔbioB中，功能性生物素合酶基因(bioB)的过表达对生长有毒性，导致停滞期非常明显的延长。这在图4(右图)中示出，其显示了表达低拷贝质粒(Sc101复制起点)上的位于IPTG诱导性T5启动子下的大肠杆菌bioB基因的大肠杆菌敲除菌株ΔbioB的生长。如图4所示，响应于增加水平的IPTG，对增加的BioB表达的诱导(灰色暗)显著影响了停滞期，但生长速率则受到轻微影响(黑框)。

[0223] 2.2 分离具有增强的生物素生产效价的iscR突变株

[0224] 在具有进化的基因组多样性的大肠杆菌文库(见1.4和1.5节)中进行筛选，以获得对bioB基因表达的耐受性提高且生物素产量提高的菌株。对所选菌株的全基因组测序鉴定出了三个独特的突变体，每个均包含编码具有氨基酸置换L15F、C92Y和H107Y之一的iscR多肽的铁硫簇调节因子(iscR)基因，其中所编码的调节因子的氨基酸序列分别为SEQ ID No:16、18和20。如1.6节(和图5)所述，使用生物测定法测量生物素的生产水平。每个iscR突变菌株以及大肠杆菌BW25113 ΔbioB参照菌株的生物素生产效价示于图6中，其显示了在没有IPTG或具有两种不同的IPTG浓度水平(随着灰色变深，IPTC递增)下、在补充有0.1g/l DTB的mMOPS中生长的4个生物学重复样品(黑点)。IPTG高于0.01mM时，参照菌株中的生物素产生受到抑制，这与对参照菌株的生长有毒性的IPTG水平相对应(见图4)，而iscR突变菌株在0.01至0.1mMIPTG的IPTG水平下均生长并产生生物素。在0.01mM的IPTG浓度下，所有三种iscR突变株产生的生物素均为参照菌株的(断点虚线)约1.5倍。在IPTG浓度为0.1mM时，iscR突变株的产量是参照菌株的最高生产效价(约1.5mg生物素/l)的至多2倍(约3.2mg生物素/l)。

[0225] 2.3 IscR H107Y突变株中的生物素生产和生长

[0226] 在250mL摇瓶实验中，在两种不同的IPTG诱导水平下(图7A中为0.01mM；图7B中为0.5mM)，在补充有0.1g/l DTB的50mL mMOPS中表征了iscR(H107Y)突变株的生长曲线和生物素生产效价。在低IPTG水平下(图7A)，IscR突变株(深灰色)和参照菌株(浅灰色)在生长和生物素生产效价方面相似，最终效价约为1.1mg生物素/l。但是，在高IPTG诱导水平下(图
7B中的0.5mM)，参照菌株(浅灰色)的生长受到严重抑制，而IscR突变株保持了与低IPTG诱导水平时相同的生长曲线。此外，IscR突变株的生物素生产效价在生长25小时后增加至约2倍，至多约2.2mg生物素/l。

[0227] 2.4 IscR突变的作用机理

[0228] 如图6所示，所有三种已鉴定的IscR突变株均清楚地展示了增强的生物素耐受表型。C92突变(C92Y)的增强生物素耐受性的能力据认为是由于C92在IscR的[Fe-S]簇结合性质中的作用。C92Y突变所导致的[Fe-S]团簇结合性质的丧失据认为使IscR的Isc操纵子抑制行为失活。同时提出，C92Y突变IscR中的IscR的启动子功能仍保持完整，从而使其保留了其在激活对多个细胞过程必不可少的其他途径中的功能。在提供IscR的[Fe-S]簇结合性质方面，一种类似的重要作用源于H107，其中H107Y突变能够类似地增强大肠杆菌的生物素耐受性。还提出IscR中的L15F破坏铁硫簇结合，并由此部分克服铁硫簇的消耗。图9显示了当与DNA结合时IscR中L15和H107的位置(hya的结合位点，PDB代码4HF1)，可以看出L15位于每个IscR亚基的内部。苯丙氨酸是比亮氨酸大得多的氨基酸，可以干扰蛋白质的三维折叠。

[0229] 2.5 仅在大肠杆菌菌株中过表达isc操纵子或suf操纵子不足以增强生物素的产生

[0230] 为了确定过表达isc操纵子(iscSUA-hscBA-fdx，对应于去掉iscR基因的天然大肠杆菌操纵子结构)或suf操纵子(sufABCDSE，对应于天然大肠杆菌操纵子结构)对大肠杆菌中生物素生产的直接作用，将每种操纵子克隆到中等拷贝数质粒(p15A ori)中，并位于强RBS和IPTG诱导型T5启动子的控制下。使用包含编码超折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)的基因(代替isc或suf操纵子)的质粒作为对照。将各质粒转化到包含IPTG诱导性bioB表达质粒的大肠杆菌菌株的细胞中。除了IPTG诱导性bioB表达质粒外，一式三份的生物学菌落还包含以下之一：1)IPTG诱导性isc操纵子，2)IPTG诱导性suf操纵子，或3)IPTG诱导性GFP(对照)，在低诱导(0.01mM IPTG)和高诱导(0.1mMIPTG)下，在具有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL大观霉素的400μL mMOPS中培养这些菌落，之后测定它们的生物素产生(如1.5节所述)。

[0231] 从图中(图10)可以看出，尽管在所有菌株中生物素的产生都是IPTG可诱导的，但与图6中所示的参照菌株和突变iscR菌株相比，达到可检测的生物素生产水平所需的IPTG浓度从0.01mM IPTG增加到0.1mM IPTG。此外，与图10中的sfGFP菌株相比，isc或suf操纵子的过表达使生物素生产效价显著降低。另外，isc操纵子的过表达比suf操纵子的过表达对生物素产量的抑制更多。结合在iscR中具有单点突变的突变株中观察到的生物素产量增加(图6)，在这些菌株中产生的isc操纵子的去抑制不太可能是提高这些菌株中的生物素产量的唯一/主要原因。

[0232] 2.6 BioB蛋白含量与生物素产生相关

[0233] 为了研究野生型和突变背景菌株中BioB过表达的分子效应，对以下菌株进行了蛋白组学测量：野生型背景菌株：具有pBS430的BS1013；具有bioB生产质粒的野生型iscR菌株：具有pBS412的BS1011；以及具有bioB生产质粒的突变iscR菌株：具有pBS412的BS1353。所有菌株均在具有0.1g/L DTB和0.025mM IPTG的mMOPS中生长。最后一种菌株在1mM IPTG诱导下另外生长。收获指数期的细胞用于蛋白组学分析，而剩余的细胞培养物总共温育24小时，然后使用其他地方描述的生物测定法测量生物素的产生。

[0234] 见图(图11)，所测得的BioB蛋白水平与生物素产量强相关(R2值为0.96)。线性相关性表明促进BioB表达的增强是提高IscR突变细胞工厂中生物素产量的关键。对蛋白组学数据的ANOVA分析显示，另外29种蛋白的表达显著增加(95％置信区间，p值为0.00166)。其中有isc操纵子(IscA和IscS)和suf操纵子(SufB和SufS)的成员。

[0235] 2.7 iscR敲除突变体中的生物素产量未增加

[0236] 通过将iscR的22位的谷氨酸的编码密码子(E,GAA)转换成终止密码子(*,TGA)，利用MAGE将iscR基因的翻译敲除引入BW25113 ΔbioB菌株。对该区域进行PCR扩增，然后进行Sanger测序，验证了密码子的成功转化。用IPTG诱导性bioB质粒pBS412转化具有编码野生型iscR、iscR敲除(E22*)和突变iscR(C92Y)的基因的菌株，并如上所述在三种不同的IPTG诱导水平(0、0.01和0.1mM)下、在补充有0.1g/l DTB和50μg/l卡那霉素的mMOPS中生长生物复制样品(n＝3)，并测试其生物素产生。

[0237] 当通过IPTG诱导来诱导bioB表达时，在iscR敲除(iscRKO)菌株和野生型iscR(iscR WT)菌株之间未观察到生物素产生的显著差异。这提供了敲除iscR不会提高生物素生产的证据。与iscR WT和iscR KO菌株相比，在编码iscR C92Y置换的突变iscR中再次观察到了生物素生产的显著提高。

[0238] 2.8 在本发明的iscR突变菌株中增强了生物素的从新生产

[0239] 用四环素抗性质粒转化已删除了bioA基因和整个生物素操纵子(ΔbioB-bioD)且包含iscR WT、iscR H107Y突变基因或iscR C92Y突变基因的BW25113大肠杆菌菌株，所述质粒组成型地过表达天然大肠杆菌bioA和生物素操纵子，且在bioO操纵基因位点处有一个单点突变(9型突变，Ifuku等，1993)。如上所述，在添加和不添加0.1g/l DTB的具有10μg/ml四环素的mMOPS(2g葡萄糖/1)中，以生物重复样品(n＝4)评估了三种不同菌株的生物素产量(图13)。

[0240] 当将底物DTB添加到生长培养基中时，所有三种菌株都观察到生物素效价显著增加，表明在这些菌株中，将DTB转化为生物素的bioB酶反应本身不再是生物素生产的瓶颈(图13)。此外，与iscR WT菌株相比，两种iscR突变菌株均观察到了从葡萄糖从新产生生物素的显著增加。鉴于这些结果，可以推断出本发明的突变iscR菌株均支持从直接前体DTB和从葡萄糖的增强的生物素生产。

[0241] 实施例2：能够增强硫辛酸生产的经遗传修饰的大肠杆菌菌株的工程化和表征

[0242] 实施例中使用的以下大肠杆菌菌株如下所示。

[0243] 表3：菌株

[0244]名称描述
BS1912 源自大肠杆菌K-12BW25113的ΔlipA
BS2114 在iscR中包含H107Y突变的BS1912衍生物

[0245] 实施例中使用的以下质粒如下所示。

[0246] 表4：质粒

[0247]

[0248] 将克隆在质粒pBS1037上的编码LipA[SEQ ID No:103]的IPTG诱导性转基因引入包含天然iscR基因的大肠杆菌宿主菌株，或引入实施例1所述的已将天然iscR基因置换为突变iscR基因的大肠杆菌宿主菌株中，所述突变iscR基因编码具有C92Y或H107Y置换的IscR蛋白；这两个菌株还包含bioB或lipA的敲除。在补充有0.1mM生物素(对于ΔbioB菌株)、用于诱导lipA表达的IPTG和0.6g/l作为底物的辛酸的mMOPS培养基中培养菌株(如1.3节所述)，在37℃下培养24小时，然后测量上清液中的游离硫辛酸。对于ΔlipA菌株(BS1912和BS2114，表3)，在37℃下生长24小时。

[0249] 通过1.6节中所述类似的生物测定，使用包含pBS451的BS1912，从上清液中测量由所述菌株的培养细胞产生的硫辛酸。使用不能合成硫辛酸的营养缺陷型大肠杆菌单一ΔlipA突变株(Herbert和Guest，1975)(包含pBS451的BS1912)，进行用于定量硫辛酸的基于生长的生物测定。上清液中的游离硫辛酸浓度通过测量硫辛酸营养缺陷型菌株在最低限度培养基中的生长来确定，所述最低限度培养基具有50nN琥珀酸钠作为碳源，且补充有从生产菌株中回收的硫辛酸作为硫辛酸的唯一来源。平行地制作硫辛酸生物测定校准曲线，其中使营养缺陷型菌株在补充有已知浓度范围的硫辛酸标准品的最低限度培养基上生长。

[0250] 这些测试表明，与在包含编码天然形式的IscR蛋白的基因的亲本大肠杆菌菌株中过表达lipA基因时相比，在包含编码突变形式的IscR蛋白(具有C92Y或H107Y置换的IscR蛋白)的基因的大肠杆菌菌株中过表达lipA基因既导致更稳定的生产，又使硫辛酸效价提高80％(图14)。因此，iscR WT菌株(具有pBS993的BS1011)的生产效价的标准偏差为2.73，而iscR C92Y(具有pBS993的BS1375)的为1.42，而iscRH107Y(具有pBS993的BS1353)的则低至
0.11(菌株信息见表1)。基于各个菌株的平均生产效价，与WT菌株相比，突变菌株中的硫辛酸产量提高至1.79倍(见图14)。

[0251] 对于WT iscR菌株(三角形，包含pBS1037的BS1912)和iscR突变菌株(方形，包含pBS1037的BS2114)，响应于IPTG对LipA的诱导的增加(灰色阴影变深)，LipA的过表达显示出降低生长速率的明显趋势。但是，对于在0.01mM和0.03mM之间测试的所有IPTG诱导水平，与突变iscR菌株相比，WT iscR菌株的生长速率降低得更加严重(见图15)。

[0252] 实施例3：能够增强硫胺素生产的经遗传修饰的大肠杆菌菌株的工程化和表征

[0253] 实施例中使用的以下大肠杆菌菌株如下所示。

[0254] 表5：菌株

[0255]

[0256] 实施例中使用的以下质粒如下所示。

[0257] 表2：质粒

[0258]

[0259]

[0260] 将克隆在质粒pBS140上的硫胺素途径基因thiCEFSGHMD导入包含天然iscR基因的大肠杆菌宿主菌株(BS750)(作为参照菌株)中，以及导入实施例1所述的已将天然iscR基因置换为突变iscR基因的上述参照菌株的衍生物中，所述突变iscR基因编码分别具有C92Y或H107Y置换的IscR蛋白(BS2019和BS2020)。在深孔培养板的各个孔中，在37℃下在mMOPS培养基中培养菌株(如1.3节所述)24小时。

[0261] 如下回收和提取由所述菌株的培养细胞产生的细胞外和细胞内硫胺素、TMP和TPP：通过在培养板中以4000×g离心5分钟，从而在4℃收获0.4mL的每种培养物。其余所有步骤均在冰上执行。轻轻去除40μL上清液以分析细胞外TPP、TMP和硫胺素。倾析出剩余的上清液后，将培养板倒置以除去残留的培养基，然后涡旋。将100μL冰冷的HPLC级甲醇添加至培养板的每个孔，然后将细胞再次涡旋。在冰上温育至少20分钟后，通过以4000x g离心5分钟使细胞碎片沉淀。上清液用作细胞内提取物以用于进一步分析。

[0262] 为了使用荧光检测器检测TPP、TMP和硫胺素，将每种培养物所产生的硫胺素化合物衍生化为强荧光的硫胺荧。所有步骤均在室温下进行。将40μl体积的细胞外和细胞内提取物添加到80μl 4M乙酸钾中，并吹吸混合。添加40μl新鲜制备的在7M NaOH中的3.8mM铁氰化钾，并混合。通过添加40μl新鲜制备的在饱和KH2PO4中的0.06％H2O2来淬灭反应。通过添加47μL 6M HCl来中和提取物，然后通过HPLC或使用Multiskan的直接荧光测量来进行分析。与所分析的提取物平行，使用新鲜制备的TPP、TMP和硫胺素(衍生化为硫胺荧)标准品的荧光标准曲线，对所有衍生化的化合物进行定量。

[0263] 这些测试表明，与在包含编码天然形式的IscR蛋白的基因的宿主大肠杆菌菌株(BS750)中过表达时相比，在包含编码突变形式的IscR蛋白(具有C92Y或H107Y置换的IscR蛋白)的基因的宿主大肠杆菌菌株(BS2019和BS2020)中，硫胺素途径基因(包括thiC基因和thiH基因以及TMP磷酸酶基因(At5g32470))的过表达导致了硫胺素、TMP和TPP(特别是硫胺素)的生物合成增强。

[0264] 更具体而言，这些测试显示，在使用pBS140时，在具有WT iscR的菌株(BS750)和编码iscR突变体的菌株(BS2020,H107Y或BS2019,C92Y)之间，OD标准化的硫胺素(硫胺素、TMP和TPP)的细胞外产量增加至1.43倍(图16)。

[0265] 实施例4：过表达黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白还原酶(Fpr)和黄素氧还蛋白(FldA)还原系统以增加能够产生生物素的经遗传修饰的大肠杆菌菌株的生产力

[0266] 1 方法

[0267] 1.1 实施例中使用的以下大肠杆菌菌株如下所示。

[0268] 表7：菌株

[0269]

[0270] 实施例中使用的以下质粒如下所示。

[0271] 表8：质粒

[0272]

[0273] 将编码BioB的IPTG诱导性转基因克隆到质粒pBS679上；将编码GFP的组成型调节转基因克隆到质粒pBS1054上；并将包含编码FldA-Fpr的合成操纵子的组成型调节转基因克隆到质粒pBS1112上。如实施例1中所述，将pBS679导入已将天然iscR基因置换为突变iscR基因的大肠杆菌宿主菌株(BS1615)中，其中突变iscR基因编码具有H107Y置换的IscR蛋白，并进一步包含bioAFCD基因的敲除，从而产生了菌株BS1937。然后用质粒pBS1054或pBS1112进一步转化菌株BS1937，分别得到菌株BS2707(对照菌株)和BS2185。

[0274] 将菌株在mMOPS培养基(如实施例1.3中所述)中培养，所述培养基含有合适的抗生素、作为用于BioB介导的催化的底物的0.1g/L DTB，并补充有0、0.01、0.025、0.05、0.075或0.1mM IPTG以用于诱导BioB基因的表达。将细胞在深孔培养板的各个孔中于37℃温育24小时。估计终点OD值，离心收集上清液，并如实施例1.6中通过生物素生物测定法从上清液中定量生物素。

[0275] 如图12和图17所示，对于菌株BS1937，当用浓度递增的IPTG诱导包含经遗传修饰的内源iscR基因的大肠杆菌细胞中的BioB基因表达时，细胞显示出生物素产量的相应的逐步增加。与其亲本菌株BS1937相比，以及与表达编码GFP而不是FldA-Fpr的转基因的对照菌株相比，这些经遗传修饰的细胞中的生物素产量通过过表达编码FldA-Fpr的转基因而得到进一步增强(菌株BS2185)。

[0276] 与对照菌株BS1937(没有FldA-Fpr基因的过表达)相比，包含编码突变形式的IscR蛋白(具有H107Y置换的IscR蛋白)的基因以及用于BioB(pBS679)和FldA-Fpr基因过表达(pBS1112)的质粒的菌株BS2185的生物素产量提高至2.12倍(图18)。

[0277] 参考文献

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