一种芽胞@Fe3+微球用于高效选择富集磷酸化蛋白的方法
阅读：192发布：2024-01-15
专利汇可以提供一种芽胞@Fe3+微球用于高效选择富集磷酸化蛋白的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 材料 制备领域，涉及一种芽胞@Fe3+微球用于高效选择富集磷 酸化 蛋白的方法。芽胞微球表面固有的各种官能团能与 金属离子 发生螯合反应，使Fe3+离子固定在芽胞微球表面。以α- 酪蛋白 和β-酪蛋白作为模式 磷酸 化蛋白评估芽胞@Fe3+微球的选择性富集磷酸化蛋白的能 力 。本发明提供一种制备芽胞@Fe3+微球的方法，所述的芽胞@Fe3+微球对磷酸化蛋白有高效选择 吸附 能力，对α-casein、β-casein的吸附容量分别为1983mg g-1、1818mg g-1，对β-casein的富集因子达到170，高于文献报道。所述微球还可用于富集人工合成蛋白混合样品、 牛 奶样品、大肠杆菌中的磷酸化蛋白等。，下面是一种芽胞@Fe3+微球用于高效选择富集磷酸化蛋白的方法专利的具体信息内容。
1.一种利用芽胞杆菌芽胞制备芽胞@Fe3+微球的方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)芽胞杆菌培养及芽胞收集：取在–20℃下用50％甘油保存的巨大芽胞杆菌菌种200μL，加入已灭菌的5mL LB液体培养基中，置于37℃控温摇床中180r min-1培养过夜，将菌种活化；将活化好的菌液吸取200μL加入到已冷却的LB固体培养基平板上，用玻璃棒涂布均匀后，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养7d，使巨大芽胞杆菌转变为芽胞；收集平板上长出的巨大芽胞杆菌芽胞，用双蒸水清洗芽胞3次，重悬，保存在4℃冰箱中备用；
(2)芽胞处理：将收集到的巨大芽胞杆菌的芽胞用双蒸水重悬后，冰浴条件下超声处理
5次，每次3min，每次超声间隔6min，超声输出强度为7–8，频率为20％–30％，超声后离心，用双蒸水清洗3次后，收集沉淀下来的芽胞，用15–20mL的1％胰蛋白酶溶液重悬，在37℃摇床中80r min-1振荡过夜；离心去除胰蛋白酶溶液，加入15–20mL的去衣被剂(Decoating Buffer)，在70℃的条件下磁力搅拌反应2h；将处理好的芽胞离心去除上清液，用双蒸水清洗芽胞5次，将芽胞重悬后，在121℃高压蒸汽下灭活30min，使芽胞失去活性，在4℃冰箱保存备用，即为芽胞储备液；
(3)芽胞吸附Fe3+离子：取0.5mL，即为芽胞干重为0.5mg的处理好的芽胞储备液置于EP管中，12000rpm离心2min，弃掉上清，加入1mL的0.05mol L-1的Fe3+离子溶液将芽胞重悬，吹打均匀使芽胞充分分散；将EP管放入摇床中140r min-1振荡40min，离心去上清，用MOPS缓冲液清洗后离心，去除上清中未吸附的Fe3+离子，即为巨大芽胞杆菌@Fe3+微球；
其中：
步骤(2)中所述的去衣被剂(Decoating Buffer)按照如下方法配制：分别称取0.40g氢氧化钠，5.84×10-1g氯化钠，1.00g十二烷基硫酸钠，1.54g二硫代苏糖醇，加超纯水定容至
100mL；
步骤(3)中所述的1％胰蛋白酶溶液的配制：称取1g胰蛋白酶，溶于100mL pH7.4的PBS缓冲液中；
步骤(3)中所述的0.05mol L-1的Fe3+溶液配制：称取0.0108g六水合三氯化铁溶于50mL去离子水中；
步骤(3)中MOPS缓冲液的配制：准确称取2.09g MOPS和11.17g氯化钠溶于双蒸水中；调pH至6.0后定容至1000mL，用0.45μm滤膜过滤，室温下避光保存。
2.如权利要求1所述的一种利用芽胞杆菌芽胞制备芽胞@Fe3+功能微球的方法，其特征在于：所述的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)的保藏编号为CCTCC AB 92052。
3.如权利要求1所述的一种利用芽胞杆菌芽胞制备芽胞@Fe3+功能微球的方法，其特征在于：所述的Fe3+离子来源于六水合三氯化铁(FeCl3.6H2O)，其分子量为270.29。
4.一种利用芽胞杆菌芽胞制备的芽胞@Fe3+微球，其特征在于，所述的芽胞@Fe3+微球通过下列步骤制备得到：
(1)芽胞杆菌培养及芽胞收集：取在–20℃下用50％甘油保存的巨大芽胞杆菌菌种200μL，加入已灭菌的5mL LB液体培养基中，置于37℃控温摇床中180r min-1培养过夜，将菌种活化；将活化好的菌液吸取200μL加入到已冷却的LB固体培养基平板上，用玻璃棒涂布均匀后，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养7d，使巨大芽胞杆菌转变为芽胞；收集平板上长出的巨大芽胞杆菌芽胞，用双蒸水清洗芽胞3次，重悬，保存在4℃冰箱中备用；
(2)芽胞处理：将收集到的巨大芽胞杆菌的芽胞用双蒸水重悬后，冰浴条件下超声处理
5次，每次3min，每次超声间隔6min，超声输出强度为7–8，频率为20％–30％，超声后离心，用双蒸水清洗3次后，收集沉淀下来的芽胞，用15–20mL的1％胰蛋白酶溶液重悬，在37℃摇床中80r min-1振荡过夜；离心去除胰蛋白酶溶液，加入15–20mL的去衣被剂(Decoating Buffer)，在70℃的条件下磁力搅拌反应2h；将处理好的芽胞离心去除上清液，用双蒸水清洗芽胞5次，将芽胞重悬后，在121℃高压蒸汽下灭活30min，使芽胞失去活性，在4℃冰箱保存备用，即为芽胞储备液；
(3)芽胞吸附Fe3+离子：取0.5mL，即为芽胞干重为0.5mg的处理好的芽胞储备液置于EP-1 3+
管中，12000rpm离心2min，弃掉上清，加入1mL的0.05mol L 的Fe 离子溶液将芽胞重悬，吹打均匀使芽胞充分分散；将EP管放入摇床中140r min-1振荡40min，离心去上清，用MOPS缓冲液清洗后离心，去除上清中未吸附的Fe3+离子，即为巨大芽胞杆菌@Fe3+微球；
其中：
步骤(2)中所述的去衣被剂(Decoating Buffer)按照如下方法配制：分别称取0.40g氢氧化钠，5.84×10-1g氯化钠，1.00g十二烷基硫酸钠，1.54g二硫代苏糖醇，加超纯水定容至
100mL；
步骤(3)中所述的1％胰蛋白酶溶液的配制：称取1g胰蛋白酶，溶于100mL pH7.4的PBS缓冲液中；
步骤(3)中所述的0.05mol L-1的Fe3+溶液配制：称取0.0108g六水合三氯化铁溶于50mL去离子水中；
步骤(3)中MOPS缓冲液的配制：准确称取2.09g MOPS和11.17g氯化钠溶于双蒸水中；调pH至6.0后定容至1000mL，用0.45μm滤膜过滤，室温下避光保存。
5.如权利要求4所述的一种利用芽胞杆菌芽胞制备的芽胞@Fe3+功能微球，其特征在于：
所述的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)的保藏编号为CCTCC AB 92052。
6.如权利要求4所述的一种利用芽胞杆菌芽胞制备的芽胞@Fe3+功能微球，其特征在于：
所述的Fe3+离子来源于六水合三氯化铁(FeCl3.6H2O)，其分子量为270.29。
7.权利要求4所述的一种利用芽胞杆菌芽胞制备的芽胞@Fe3+微球在在磷酸化蛋白选择富集中的应用。
3+
一种芽胞@Fe 微球用于高效选择富集磷酸化蛋白的方法
技术领域
背景技术
[0002] 蛋白质磷酸化是复杂、高度动态的生命进程，涉及到众多的生物学事件。在真核生物中大约有三分之一的蛋白质被磷酸化，蛋白质磷酸化和去磷酸化过程是调节功能属性中重要的信号机制，涉及到基因表达、细胞周期、细胞增殖和分化[1]。特定磷酸化位点的鉴定和绝对量化，对阐明蛋白质功能信号通路有很大的帮助，也可以促进开发新型的个性化诊断治疗工具。异常的蛋白质磷酸化已经被证明与疾病的发生密切相关。此外，磷酸化蛋白是重要的药物发现目标可以用于疾病治疗干预[2-4]。因此，开发有效的方法从大量非磷酸化蛋白的干扰中选择富集磷酸化蛋白、实现识别和检测微量的磷酸化蛋白质，对于理解磷酸化蛋白发挥的作用是至关重要[5-7]。
[0003] 目前，用于选择分离富集复杂混合物中的磷酸化蛋白方法主要包括：离子交换色谱[8]，层析聚焦[9]，抗体固定亲和色谱法[10]，固定化金属离子亲和色谱法[11-13]，金属氧化物亲和色谱[14,15]等。其中，基于磷酸基团与金属离子(如：Fe3+Al3+,Ga3+,Zr4+,和Ti4+等)之间高亲和力的固定化金属离子亲和色谱法被证明是最方便的富集分离磷酸化蛋白方法之一。但是，金属离子螯合基团(如：次氮基三乙酸、亚氨基二乙酸、三-羧甲基乙二胺配体等)通常需要采用复杂的程序修饰到固相载体(如：硅胶，琼脂颗粒等)表面[16]，且不可避免使用有毒的化学试剂[17]。因此，开发简单、环境友好型新方法用于高效、选择分离磷酸化蛋白具有十分重要的意义。
[0004] 申请人的前期研究表明：芽胞微球[18-21]具有良好的物理、化学稳定性，均匀的粒径分布等优点；此外，芽胞微球表面含有大量的天然金属螯合基团(包括：羧基、氨基、羟基等)可以直接用于螯合金属离子。基于芽胞微球的优良特性，本发明首次采用芽胞微球作为固定化金属离子亲和色谱法的固相载体，并成功实现从复杂样品中分离富集磷酸化蛋白。其优点包括：无需复杂的官能团修饰过程，成本低，环境友好，效率高等。展示出了其在基础研究和实际应用中的良好前景。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种芽胞@Fe3+微球用于高效选择富集磷酸化蛋白的方法与应用，本发明在于以一种新型材料作为载体，制备高分散性的功能微球，然后将金属离子固定在处理后的芽胞表面，将其应用于磷酸化蛋白的选择富集。本发明克服了传统方法用于蛋白吸附时操作复杂、成本高、蛋白吸附量低等缺点。本发明将所合成的新型复合材料成功用于富集人工合成蛋白混合样品、牛奶样品、大肠杆菌中的磷酸化蛋白，展示了其在磷酸化蛋白质组学研究中的巨大应用前景。
[0006] 本发明通过以下技术方案实现：
[0007] 首先将培养3～10天的细菌芽胞(浓度在108～1011cfu)收集起来，经过离心洗涤后再进行超声处理，然后用胰蛋白酶液处理和去芽胞衣缓冲液(Decoating buffer)[11]处理，最后得到除去孢外壁和芽胞衣的表面光滑的细菌芽胞微球，然后用此微球负载Fe3+离子用于高效选择富集磷酸化蛋白。
[0008] 本发明的具体技术方案如下所述
[0009] 一种利用芽胞杆菌芽胞制备芽胞@Fe3+微球的方法，包括下列步骤：
[0010] (1)芽胞杆菌培养及芽胞收集：取在–20℃下用50％甘油保存的巨大芽胞杆菌菌种200μL，加入已灭菌的5mL LB液体培养基中，置于37℃控温摇床中180r min-1培养过夜，将菌种活化；将活化好的菌液吸取200μL加入到已冷却的LB固体培养基平板上，用玻璃棒涂布均匀后，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养7d，使巨大芽胞杆菌转变为芽胞；收集平板上长出的巨大芽胞杆菌芽胞，用双蒸水清洗芽胞3次，重悬，保存在4℃冰箱中备用；
[0011] (2)芽胞处理：将收集到的巨大芽胞杆菌的芽胞用双蒸水重悬后，冰浴条件下超声处理5次，每次3min，每次超声间隔6min，超声输出强度为7–8，频率为20％–30％，超声后离心，用双蒸水清洗3次后，收集沉淀下来的芽胞，用15–20mL的1％胰蛋白酶溶液重悬，在37℃摇床中80r min-1振荡过夜；离心去除胰蛋白酶溶液，加入15–20mL的去衣被剂(Decoating Buffer)，在70℃的条件下磁力搅拌反应2h；将处理好的芽胞离心去除上清液，用双蒸水清洗芽胞5次，将芽胞重悬后，在121℃高压蒸汽下灭活30min，使芽胞失去活性，在4℃冰箱保存备用，即为芽胞储备液；
[0012] (3)芽胞吸附Fe3+离子：取0.5mL，即为芽胞干重为0.5mg的处理好的芽胞储备液置于EP管中，12000rpm离心2min，弃掉上清，加入1mL的0.05mol L-1的Fe3+离子溶液将芽胞重悬，吹打均匀使芽胞充分分散；将EP管放入摇床中140r min-1振荡40min，离心去上清，用MOPS缓冲液清洗后离心，去除上清中未吸附的Fe3+离子，即为巨大芽胞杆菌@Fe3+微球；其中：
[0013] 步骤(2)中所述的去衣被剂(Decoating Buffer)按照如下方法配制：分别称取0.40g氢氧化钠，5.84×10-1g氯化钠，1.00g十二烷基硫酸钠，1.54g二硫代苏糖醇，加超纯水定容至100mL；
[0014] 步骤(3)中所述的1％胰蛋白酶溶液的配制：称取1g胰蛋白酶，溶于100mL pH7.4的PBS缓冲液中；
[0016] 步骤(3)中MOPS缓冲液的配制：准确称取2.09g MOPS和11.17g氯化钠溶于双蒸水中；调pH至6.0后定容至1000mL，用0.45μm滤膜过滤，室温下避光保存。
[0017] 所述的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)的保藏编号为CCTCC AB 92052。
[0018] 所述的Fe3+离子来源于六水合三氯化铁(FeCl3.6H2O)，其分子量为270.29。
[0019] 一种利用芽胞杆菌芽胞制备的芽胞@Fe3+微球，所述的芽胞@Fe3+微球通过下列步骤制备得到：
[0020] (1)芽胞杆菌培养及芽胞收集：取在–20℃下用50％甘油保存的巨大芽胞杆菌菌种200μL，加入已灭菌的5mL LB液体培养基中，置于37℃控温摇床中180r min-1培养过夜，将菌种活化；将活化好的菌液吸取200μL加入到已冷却的LB固体培养基平板上，用玻璃棒涂布均匀后，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养7d，使巨大芽胞杆菌转变为芽胞；收集平板上长出的巨大芽胞杆菌芽胞，用双蒸水清洗芽胞3次，重悬，保存在4℃冰箱中备用；
[0021] (2)芽胞处理：将收集到的巨大芽胞杆菌的芽胞用双蒸水重悬后，冰浴条件下超声处理5次，每次3min，每次超声间隔6min，超声输出强度为7–8，频率为20％–30％，超声后离心，用双蒸水清洗3次后，收集沉淀下来的芽胞，用15–20mL的1％胰蛋白酶溶液重悬，在37℃摇床中80r min-1振荡过夜；离心去除胰蛋白酶溶液，加入15–20mL的去衣被剂(Decoating Buffer)，在70℃的条件下磁力搅拌反应2h；将处理好的芽胞离心去除上清液，用双蒸水清洗芽胞5次，将芽胞重悬后，在121℃高压蒸汽下灭活30min，使芽胞失去活性，在4℃冰箱保存备用，即为芽胞储备液；
[0022] (3)芽胞吸附Fe3+离子：取0.5mL，即为芽胞干重为0.5mg的处理好的芽胞储备液置于EP管中，12000rpm离心2min，弃掉上清，加入1mL的0.05mol L-1的Fe3+离子溶液将芽胞重悬，吹打均匀使芽胞充分分散；将EP管放入摇床中140r min-1振荡40min，离心去上清，用MOPS缓冲液清洗后离心，去除上清中未吸附的Fe3+离子，即为巨大芽胞杆菌@Fe3+微球；
[0023] 其中：
[0024] 步骤(2)中所述的去衣被剂(Decoating Buffer)按照如下方法配制：分别称取0.40g氢氧化钠，5.84×10-1g氯化钠，1.00g十二烷基硫酸钠，1.54g二硫代苏糖醇，加超纯水定容至100mL；
[0025] 步骤(3)中所述的1％胰蛋白酶溶液的配制：称取1g胰蛋白酶，溶于100mL pH7.4的PBS缓冲液中；
[0026] 步骤(3)中所述的0.05mol L-1的Fe3+溶液配制：称取0.0108g六水合三氯化铁溶于50mL去离子水中；
[0027] 步骤(3)中MOPS缓冲液的配制：准确称取2.09g MOPS和11.17g氯化钠溶于双蒸水中；调pH至6.0后定容至1000mL，用0.45μm滤膜过滤，室温下避光保存。
[0028] 所述的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)的保藏编号为CCTCC AB 92052。
[0029] 所述的Fe3+离子来源于六水合三氯化铁(FeCl3.6H2O)，其分子量为270.29。
[0030] 本发明利用芽胞杆菌芽胞制备的芽胞@Fe3+微球可在在磷酸化蛋白选择富集中的应用。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0032] 相对于未处理的芽胞，本发明处理后的芽胞的机械刚性结构更加稳定，负载的金属材料也不易脱落，作为载体的性能更加稳定可靠。
[0033] 芽胞作为天然的生物材料，表面含有丰富的功能基团，不需要复杂的活化程序即可与金属离子稳定结合，这个过程不需要复杂的化学修饰过程。具有安全、快速等优点。
[0035] 图1：芽胞@Fe3+微球特异吸附磷酸化蛋白技术路线图。
[0036] 图2：芽胞及芽胞@Fe3+微球表征图。附图标记说明：图2中的A图和图2中的B图分别是处理前后巨大芽胞杆菌的透射电镜图；图2中的C图是芽胞吸附Fe3+离子前后的FTIR光谱图，红线是处理后芽胞的FTIR光谱图，黑线是芽胞吸附Fe3+离子后的FTIR光谱图；图2中的D图是处理后芽胞的XPS能谱图；图2中的E图是芽胞吸附Fe3+的XPS能谱图；图2中的F图为E图中Fe3+元素的XPS分峰图。。
[0037] 图3：芽胞@Fe3+微球吸附蛋白的等温吸附曲线图。
[0038] 图4：芽胞@Fe3+微球吸附蛋白的吸附动力学曲线图。
[0039] 图5：芽胞@Fe3+微球的非特异性吸附图。
[0040] 图6：芽胞@Fe3+微球磷酸化蛋白和去磷酸化蛋白的吸附图。
[0041] 图7：芽胞@Fe3+微球磷酸化蛋白和去磷酸化蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。附图标记说明：
[0042] 图7中的A图是芽胞@Fe3+微球吸附β-casein的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图7中的B图是芽胞@Fe3+微球吸附去磷酸化的β-casein的聚丙烯酰氨凝胶电泳图。
[0043] 图8：芽胞@Fe3+微球从复杂蛋白混合物中选择吸附蛋白高效液相色谱图。
[0044] 图9：BSA和β-casein不同质量比混合时的高效液相色谱图。附图标记说明：图9中的A图是BSA和β-casein以质量比1:1混合时的高效液相色谱图；图9中的B图是BSA和β-casein以质量比10:1混合时的高效液相色谱图；图9中的C图是BSA和β-casein以质量比20:1混合时的高效液相色谱图；图9中的D图是BSA和β-casein以不同质量比混合时的吸附效率图。
[0045] 图10：BSA和β-casein不同质量比混合时的蛋白回收率图。
[0046] 图11：BSA和β-casein不同质量比混合时的蛋白富集因子图。
[0047] 图12：芽胞@Fe3+微球选择吸附BSA/β-casein聚丙烯酰氨凝胶电泳图。
[0048] 图13：芽胞@Fe3+微球吸附牛奶蛋白聚丙烯酰氨凝胶电泳图。
[0049] 图14：芽胞@Fe3+微球吸附大肠杆菌蛋白聚丙烯酰氨凝胶电泳图。
具体实施方式
[0050] 实施例1(制备实施例)
[0051] 本实施例以巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)作为起始材料。具体处理步骤如下所述：
[0052] (1)配制LB液体培养基和LB固体培养基，将所述的培养基在121℃灭菌30min，取用50％甘油保存在-20℃的巨大芽胞杆菌菌种(巨大芽胞杆菌是中国典型培养物保藏中心公开发放和索取的常规菌株，其保藏编号为CCTCC AB 92052)200μL，加入已灭菌的5mL LB液体培养基中，置于37℃控温摇床中180rpm培养过夜，将菌种活化。将活化好的菌液吸取200μL加入到已冷却的LB固体培养基平板上，然后在37℃培养箱中培养，收集培养5-7d的芽胞，用去离子清洗芽胞3次，重悬，即可保存在4℃冰箱中备用。
[0054] (3)将上步处理的芽胞用去离子水反复离心洗涤，之后将所得的芽胞在pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液即PBS溶液配制的含1％的胰蛋白酶溶液中，胰蛋白酶溶液处理完成后，离心去除酶液，并反复洗涤3～5次；
[0055] (4)配制与芽胞悬液等体积的去芽胞衣处理液(Decoating Buffer)将芽胞重悬，在70℃水浴中搅拌处理0.5-4h，将处理后的芽胞用适量的去离子水重悬，得到芽胞微球，即为芽胞储备液。
[0056] 实施例2(应用实施例1)
[0057] 制备芽胞微球的方法参见实施例1。在实施例1的基础上，对所得生物芽胞微球做进一步处理，具体步骤如下所述：
[0058] (1)取0.5mL(0.5mg)处理好的芽胞储备液置于EP管中，12000rpm离心2min，弃掉上3+
清，加入1mL 0.05M的Fe 离子溶液将芽胞重悬，吹打均匀使芽胞充分分散，将EP管放入摇床中140rpm振荡30min，离心去上清，用去离子水清洗后离心，去除上清中未吸附的Fe3+离子。
巨大芽胞杆菌@Fe3+微球即制备完成，具体流程见图1所述的技术路线图。
清，加入1mL 0.05M的Fe 离子溶液将芽胞重悬，吹打均匀使芽胞充分分散，将EP管放入摇床中140rpm振荡30min，离心去上清，用去离子水清洗后离心，去除上清中未吸附的Fe3+离子。
巨大芽胞杆菌@Fe3+微球即制备完成，具体流程见图1所述的技术路线图。
[0059] (2)将实施例1所述的天然芽胞(例如巨大芽胞杆菌菌种，包含但不限于)、处理后3+
的芽胞、芽胞@Fe 复合微球分别用透射电子显微镜(TEM)，傅里叶红外光谱(FTIR)和X射线光电子能谱(XPS)进行表征，观察复合微球的制备情况(上述仪器设备为通用商购产品)。
的芽胞、芽胞@Fe 复合微球分别用透射电子显微镜(TEM)，傅里叶红外光谱(FTIR)和X射线光电子能谱(XPS)进行表征，观察复合微球的制备情况(上述仪器设备为通用商购产品)。
[0060] 本实施例的结果如图2所示：图2的附图标记中：图2中的A图和B图分别为天然芽胞、处理后的芽胞的TEM照片。图2中的C图为处理后芽胞和芽胞@Fe3+微球的FTIR照片。图2中3+
的D图、E图和F图分别为芽胞、芽胞@Fe 微球和Fe元素的XPS图片。以上结果表明本实施例制备的Fe3+离子能很好的结合在处理好的芽胞微球表面，形成芽胞@Fe3+复合微球。
的D图、E图和F图分别为芽胞、芽胞@Fe 微球和Fe元素的XPS图片。以上结果表明本实施例制备的Fe3+离子能很好的结合在处理好的芽胞微球表面，形成芽胞@Fe3+复合微球。
[0061] 实施例3(应用实施例2)
[0062] 将实施例2制备的芽胞@Fe3+微球作为载体用于高效选择富集磷酸化蛋白的检测。具体应用步骤如下：
[0063] (1)配制pH 6.0的10mmol/L的3-(N-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲溶液：准确称取2.09g MOPS和11.17g氯化钠溶于双蒸水中。用氢氧化钠调节pH至6.0后定容到1000mL。0.45μm滤膜过滤，室温避光保存。
[0064] (2)将蛋白用MOPS缓冲液溶解，与吸附好的芽胞@Fe3+微球于140r min-1的摇床37℃条件下吸附40min。
[0066] (4)沉淀用MOPS缓冲液清洗两次，记作清洗液。再用10％氨水在140r min-1的摇床37℃条件下洗脱30min。离心，留上清，记作洗脱液。将其用作后续实验的高效液相色谱测定，和SDS-PAGE分析。
[0067] (5)吸附实验在离心管中常温下进行。所有蛋白样品均用吸附缓冲液(pH 6.0，10mmol L-1的MOPS缓冲液包含0.20mol L-1的NaCl)溶解。等温吸附实验中，芽胞@Fe3+微球(0.50mg)用来吸附磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白，涡旋吸附500μL不同种类和不同浓度的蛋白2h，浓度从0.1到2.0mg mL-1。在动力学吸附实验中，芽胞@Fe3+微球(0.50mg)分别用来吸附500μL磷酸化蛋白(2mg mL-1)和非磷酸化蛋白(1mg mL-1)。吸附时间从5min到240min。然后将蛋白和芽胞@Fe3+微球的混合物在12000r min-1条件下离心2min，上清中蛋白的浓度用酶标仪进行测量。
[0068] 本实施例的结果如图3所示，为蛋白的吸附特性曲线，由图3可知当蛋白的浓度增加时，磷酸化蛋白吸附量几乎成线性增加，在2mg mL-1时蛋白的吸附量达到最大值。与此同时非磷酸化蛋白的吸附量增加非常缓慢，在蛋白浓度为0.50mg mL-1时，蛋白吸附量就已经达到平衡。非磷蛋白的吸附量仅仅是磷酸化蛋白吸附量的十分之一，显示出芽胞@Fe3+微球对磷酸化蛋白出色的吸附能力。这种高效的选择吸附能力主要是通过金属离子与磷酸基团间强的特异螯合作用力实现的。
[0069] 表1芽胞@Fe3+微球吸附蛋白等温吸附曲线拟合参数总结
[0070]
[0071]
[0072] 将蛋白的吸附特性曲线进行Langmuir线性拟合，参数如表1所示，四种蛋白的R2值均可达到0.99以上。高度符合Langmuir模型，可以证明芽胞@Fe3+微球对标准蛋白的吸附为一种单分子层吸附行为。
[0073] 表2不同材料对蛋白的吸附量对比
[0074]
[0075] 如表2所示拟合得到微球最大吸附量远远高于先前文献所述，表明芽胞@Fe3+微球具有较高的吸附特性。
[0076] 图4为蛋白吸附动力学图，由图4可知随着吸附时间的增加，在前60min内，磷酸化蛋白的吸附量显著增加对比非磷酸化蛋白并没有明显的变化。这主要是因为，刚开始磷酸化蛋白中的磷酸基团极易与Fe3+离子发生螯合反应，当吸附位点饱和时，磷酸化蛋白开始非特定的扩散到芽胞@Fe3+微球表面，类似于非磷酸化蛋白吸附的行为方式。
[0077] 以上结果表明，芽胞@Fe3+微球对磷酸化蛋白具有较高的吸附量，且吸附过程很快。说明本发明的芽胞@Fe3+微球作为作为新型生物载体在磷蛋白吸附上有良好的应用前景，为构建新型的载体提供了新思路。
[0078] 实施例4(应用实施例3)
[0079] 申请人选择几种非磷酸化蛋白来验证芽胞@Fe3+微球的非特异性吸附能力。具体步骤为：
[0080] (1)芽胞微球(0.50mg)吸附Fe3+离子后，吸附2mg mL-1的BSA，LYZ，HRP，TRY蛋白120min，达到吸附平衡，然后将上清蛋白进行合适倍数稀释后，测A595nm处的吸光值，代入标准曲线，计算各蛋白的吸附量。
[0081] 芽胞@Fe3+微球对磷酸化蛋白虽然有非常出色的吸附效果，但是非特异吸附也是我们验证材料的一个重要因素。四种不同等电点和分子大小的非磷酸化蛋白(LTZ，BSA，HRP，TRY)用来验证芽胞@Fe3+微球非特异吸附能力。本实施例结果如图5所示，结果表明了芽胞@3+ -1 -1
Fe 微球对α-casein(1760mg g )，β-casein(1670mg g )具有相当高的特异识别能力。然而我们的微球对非磷酸化蛋白的吸附量仅从174mg g-1到278mg g-1。虽然BSA(4.7)的等电点和磷酸化蛋白α-casein，β-casein(4.6-5.1)非常相似，但是芽胞@Fe3+微球对BSA的吸附能力远低于磷酸化蛋白。其他三种非磷酸化蛋白的吸附量也仅仅是磷酸化蛋白吸附量的十
3+
分之一左右，结果表明我们的芽胞@Fe 微球对磷酸化的蛋白具有高效特异的识别能力。
Fe 微球对α-casein(1760mg g )，β-casein(1670mg g )具有相当高的特异识别能力。然而我们的微球对非磷酸化蛋白的吸附量仅从174mg g-1到278mg g-1。虽然BSA(4.7)的等电点和磷酸化蛋白α-casein，β-casein(4.6-5.1)非常相似，但是芽胞@Fe3+微球对BSA的吸附能力远低于磷酸化蛋白。其他三种非磷酸化蛋白的吸附量也仅仅是磷酸化蛋白吸附量的十
3+
分之一左右，结果表明我们的芽胞@Fe 微球对磷酸化的蛋白具有高效特异的识别能力。
[0082] 实施例5(应用实施例4)
[0083] 将制备好的芽胞@Fe3+微球用于吸附去磷酸化的蛋白，计算其吸附量，验证微球对磷酸化蛋白吸附的特异性。具体步骤如下：
[0084] (1)α和β酪蛋白溶解在浓度为2mg mL-1的Tris-HCl(1mmol L-1MgCl2，pH6.0，100mmol L-1Tris-HCl)溶液中。在2mL的蛋白混合物中加入2μL酶活为2U的碱性磷酸酶，于37℃水浴条件下酶解2h。然后将所有的去磷酸化的蛋白质转移到75℃水浴5min。用芽胞@Fe3+微球(0.50mg)吸附去磷酸化的蛋白40min，离心取上清，进行合适倍数的稀释后，测定OD595，代入标曲，计算蛋白吸附量。
[0085] (2)芽胞@Fe3+微球吸附磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白后的初始蛋白混合物、上清液、洗脱液被用来进行SDS-PAGE分析。
[0086] α/β-酪蛋白是两种模式磷酸化蛋白，用碱性磷酸酶处理之后，磷酸化蛋白表面含有少量或者几乎没有磷酸基团。本实施例结果如图6所示，芽胞@Fe3+微球对Dep-α-casein，Dep-β-casein的最大吸附量只有648mg g-1，500mg g-1，仅为α/β-casein吸附量的三分之一，本结果可以证明该新型微球对磷酸化蛋白有特异的吸附能力。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图7所示，图7中的a图泳道3(吸附后上清液)中未看到条带，可知磷酸化蛋白几乎完全被吸附，上清中几乎没有蛋白残留。泳道4洗脱液中可以看到大量蛋白条带，可知磷酸化蛋白近乎完全被吸附洗脱。相反的，图7中的b图泳道3(吸附后上清)中看到大量蛋白条带，泳道4洗脱液中只有少量蛋白被洗脱。可能是由于磷酸化蛋白去磷酸化后，大量的磷酸基团丢失，降低了微球的特异吸附能力。这个结果进一步证明，芽胞@Fe3+微球对磷酸化蛋白具有高效选择吸附能力。
[0087] 实施例6(应用实施例5)
[0088] 将芽胞@Fe3+微球用于吸附混合标准蛋白，验证微球的选择吸附能力，具体步骤如下：
[0089] (1)将β-casein，BSA，LYZ以3：5：1的质量比进行混合，然后用芽胞@Fe3+微球(0.50mg)吸附蛋白混合物，最后用10％的氨水洗脱吸附的蛋白，用1mol L–1的盐酸将pH调至7.0。将蛋白初始混合液，吸附后上清，清洗液，洗脱液，用来进行液相色谱分析。
[0090] (2)将BSA和β-casein分别以1：1，10：1，20：1，40：1，100：1的质量比进行混合，然后用芽胞@Fe3+微球(0.50mg)吸附蛋白混合物，最后用10％的氨水洗脱吸附的蛋白，用1mol L-1的盐酸将pH调至7.0。将蛋白初始混合液，吸附后上清，清洗液，洗脱液，用来进行液相色谱分析(HPLC)。不同比例的蛋白吸附效率＝(1-吸附后上清中蛋白量/初始蛋白混合物中的蛋白量)×100％。蛋白回收率＝蛋白的回收率＝(洗脱液蛋白量/初始蛋白混合物中的蛋白量)×100％。富集因子可以用富集后磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白的比率除以富集前磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白的比率来计算。蛋白回收率用洗脱液蛋白量与初始蛋白混合物蛋白量比值的百分比计算。
[0091] 实施例具体结果如图8所示，在初始混合物中，由于非磷酸化蛋白的含量较高，β-casein的信号被淹没峰比较小。在吸附后的上清中就可以看到几乎所有的非磷酸化蛋白都已经被洗脱，磷酸化蛋白近乎完全吸附未被洗脱下来。而在洗脱液中，可以看到磷酸化蛋白的信号非常强，而非磷酸化蛋白的信号很弱，这一结果表明芽胞@Fe3+微球对磷酸化蛋白的选择吸附能力。将β-casein和BSA以不同质量比混合，验证微球的选择性。如图9所示，在两种蛋白以1：1混合时，我们可以看到洗脱液中的磷酸化蛋白的信号非常强，几乎看不到BSA的峰。在两种蛋白以质量比为10：1和20：1时，初始混合物中，β-casein信号几乎被淹没，只能看到很小的峰。但是在洗脱液中，可以看到β-casein的信号峰有明显的增强，BSA的洗脱峰较小，表明非特异性干扰下本发明制备的芽胞@Fe3+微球对磷酸化蛋白有一定的富集作用。
[0092] 蛋白的吸附效率＝(1-吸附后上清中蛋白量/初始蛋白混合物中的蛋白量)×100％，计算不同比例下，两种蛋白的吸附效率。如图9中D图所示，可以看出在BSA浓度增加时，β-casein吸附率只有少量降低，在以20：1混合时，蛋白的吸附率仍可高达74％，而BSA的吸附率一直在下降，在浓度20：1时，吸附率已经降到5.4％。该结果表明，芽胞@Fe3+微球对磷酸化蛋白显示出了较高的选择吸附能力。
[0093] 蛋白的回收率＝(洗脱液蛋白量/初始蛋白混合物中的蛋白量)×100％。根据图10的结果表明，磷酸化蛋白的回收率可高达70％，而非磷酸化蛋白的回收率均在5％以下。即使在1：100的质量比下，大量的非磷酸化蛋白并未对磷酸化蛋白的回收率造成很大影响，磷酸化蛋白回收率大约是非磷酸化蛋白回收率的15倍。表明本材料对磷酸化蛋白具有高效选择回收能力。
[0094] 蛋白的富集因子被用来研究材料对磷酸化蛋白的富集能力强弱，富集因子可以用富集后磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白的浓度比/富集前磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白的浓度比来计算。如图11所示，我们可以看到随着BSA与β-casein质量比的增加，蛋白富集因子逐渐升高，当两种蛋白质量比增加到100：1时，富集因子增加到170以上。此结果高于相关文献所述，这种富集过程类似于一种蛋白纯化的过程。
[0095] 实施例7(应用实施例6)
[0096] 将芽胞@Fe3+微球用于吸附实际样品中的磷蛋白，验证微球的实际应用能力，具体步骤如下：
[0097] (1)芽胞(0.50mg)吸附Fe3+离子后，吸附质量比为1：1的BSA和β-casein蛋白混合物(0.50mg mL-1)。将初始蛋白混合物记为I，吸附后上清记为S，清洗液记为W，洗脱液记为E，上述样品留作SDS-PAGE分析。
[0098] (2)芽胞(0.50mg)吸附Fe3+离子后，吸附30倍稀释后牛奶中的磷酸化蛋白。将初始蛋白混合物记为I，吸附后上清记为S，清洗液记为W，洗脱液记为E，上述样品留作SDS-PAGE分析。
[0099] (3)芽胞(0.50mg)吸附Fe3+离子后，吸附破碎后大肠杆菌DH5α细胞中的磷酸化蛋白。将初始蛋白混合物记为I，吸附后上清记为S，清洗液记为W，洗脱液记为E，上述样品留作SDS-PAGE分析。
[0100] BSA和β-casein混合物被用来验证芽胞@Fe3+微球的选择吸附能力，实施例具体结果如图12所示，条带2中可以清楚看到初始混合物BSA和β-casein的两条条带，条带3中是芽3+
胞@Fe 微球吸附蛋白混合物之后的上清，可以看到BSA几乎被洗脱下来，而β-casein未看见明显的条带。在洗脱液中，可以看见较深的β-casein条带(泳道5)，而BSA的条带非常浅，可能是由于非特异性吸附所导致。结果显示芽胞@Fe3+微球对磷酸化蛋白有高效选择吸附能力。
胞@Fe 微球吸附蛋白混合物之后的上清，可以看到BSA几乎被洗脱下来，而β-casein未看见明显的条带。在洗脱液中，可以看见较深的β-casein条带(泳道5)，而BSA的条带非常浅，可能是由于非特异性吸附所导致。结果显示芽胞@Fe3+微球对磷酸化蛋白有高效选择吸附能力。
[0101] 饮用的牛奶被用来进一步验证芽胞@Fe3+微球对含有复杂蛋白组分的样品中磷酸化蛋白的选择吸附能力，包括α-casein和β-casein。饮用的牛奶经过30倍稀释，然后与芽胞@Fe3+微球混合吸附。实施例具体结果如图13所示，全牛奶蛋白中有许多的条带(泳道2)，对应19kDa到33kDa的蛋白包括α-casein，β-casein andκ-casein，50kDa至100kDa的蛋白碎片包括BSA和其他非磷酸化蛋白碎片。经过芽胞@Fe3+微球吸附处理后，在洗脱液(泳道5)只看到两条磷酸化蛋白条带(Docena et al 1996,Sicherer and Sampson 1999)，证明此材料对复杂实际样品中的磷酸化蛋白有较高的选择吸附能力。
[0102] 将大肠杆菌破碎之后的蛋白用来进一步验证芽胞@Fe3+微球的实际应用能力，实施例具体结果如图14所示，在泳道1中可以看到较多的蛋白条带，芽胞@Fe3+微球吸附之后的上清液中可以看到绝大部分的非蛋白被洗脱下来，但是在洗脱液中却只能看见一条较为清晰的磷酸化蛋白的条带。该结果表明，芽胞@Fe3+微球在实际样品中有较好的选择吸附磷酸化蛋白的能力。
[0103] 附录：
[0104] 实施例中所用到实验材料、试剂和仪器的相关信息：
[0105] 细菌芽胞：来自于培养3～10天的芽胞杆菌，包括取自：巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)AB92052，菌株均保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，属于公开发放的生物材料，但是实施本发明不限于此生物材料。
[0106] 试剂相关信息：
[0107] 大肠杆菌(Escherichia coli DH5-α)购买自北京康为世纪生物科技有限公司，α-casein，β-casein，TPCK处理的胰蛋白酶均在sigma公司购买，考马斯亮蓝G250于天津威一化工科技有限公司购买，牛血清蛋白购买自德国罗氏公司。溶菌酶，辣根过氧化物酶购买自合肥宝生物。碱性磷酸酶购买自碧云天试剂公司，蛋白Marke购买自北京全式金生物技术有限公司。氢氧化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，氯化钠，三氟乙酸购买自国药化学试剂有限公司，蒙牛牌纯牛奶于普通超市购买。
[0108] 胰蛋白酶购买于美国Sigma-Aldrich公司；
[0109] 超声波破碎仪：450D，美国Branson公司；
[0110] LB液体培养基配方为常用培养基:称取10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母浸粉，10.0g氯化钠，
[0111] 溶于双蒸水中后，用1mol L-1NaOH溶液调节pH值到7.2～7.4，定容到1L，分装至500mL
[0112] 的锥形瓶中，121℃高压灭菌30min，室温保存；
[0113] 去衣被剂(Decoating Buffer)的配方：分别称取0.40g氢氧化钠，5.84×10-1g氯化[0114] 钠，1.00g十二烷基硫酸钠，1.54g二硫代苏糖醇，加超纯水定容至100mL。
[0115] 1％胰蛋白酶溶液的配方：称取1g胰蛋白酶，溶于100mL pH7.4的PBS缓冲液中。
[0116] 0.05mol L-1的Fe3+溶液配制：称取0.0108g六水合三氯化铁溶于50mL去离子水中。
[0117] 主要参考文献：
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