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一种三荧光发射分子印迹 传感器及其制备和应用

阅读：2发布：2022-03-07

专利汇可以提供一种三荧光发射分子印迹传感器及其制备和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于分析化学以及快速检测领域，具体涉及一种基于后印迹混合法的红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器及其制备和在精确可视化检测牛血红蛋白中的应用。传感器为通过后印迹混合法将红色荧光牛血红蛋白印迹微球、绿色荧光牛血红蛋白印迹微球和蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球混合，即获得红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器。本发明方法制备得到的传感器能够高灵敏、高选择、自校正地检测牛血红蛋白，且提供的荧光颜色变化范围较传统双荧光发射分子印迹传感器更宽、更丰富，可对目标物进行更精确的可视化检测。，下面是一种三荧光发射分子印迹传感器及其制备和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种三荧光发射分子印迹传感器，其特征在于：传感器为通过后印迹混合法将红色荧光牛血红蛋白印迹微球、绿色荧光牛血红蛋白印迹微球和蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球混合，即获得红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器。
2.按权利要求1所述的三荧光发射分子印迹传感器，其特征在于：所述传感器为将通过溶胶-凝胶聚合法分别合成的红色、绿色和蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球由后印迹混合法混合于pH为中性的缓冲液中；其中，按体积百分比计，红色荧光牛血红蛋白印迹微球4-6%、绿色荧光牛血红蛋白印迹微球10-12%、蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球5-7%，余量为缓冲液。
3.按权利要求1或2所述的三荧光发射分子印迹传感器，其特征在于：所述荧光牛血红蛋白印迹微球为通过溶胶-凝胶聚合法在二氧化硅纳米粒子表面进行牛血红蛋白印迹，印迹层内分别包埋不同荧光物质，洗脱牛血红蛋白后的空穴为识别位点，即分别得到具有核壳结构的荧光牛血红蛋白印迹微球；其中，红色印迹微球包埋CdTe/ZnS量子点、绿色印迹微球包埋CdTe量子点、蓝色印迹微球包埋7-羟基香豆素。
4.一种权利要求1所述的三荧光发射分子印迹传感器的制备方法，其特征在于：向pH为中性的缓冲液中加入红色、绿色、蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球，混匀，得到红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器。
5.按权利要求4所述的三荧光发射分子印迹传感器的制备方法，其特征在于：通过溶胶-凝胶聚合法分别合成红色、绿色和蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球，而后将所得微球由后印迹混合法混合于pH为中性的缓冲液中；其中，按体积百分比计，红色荧光牛血红蛋白印迹微球4-6%、绿色荧光牛血红蛋白印迹微球10-12%、蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球5-7%，余量为缓冲液。
6.按权利要求4所述的三荧光发射分子印迹传感器的制备方法，其特征在于：所述荧光牛血红蛋白印迹微球为通过溶胶-凝胶聚合法在二氧化硅纳米粒子表面进行牛血红蛋白印迹，印迹层内分别包埋不同荧光物质，洗脱牛血红蛋白后的空穴为识别位点，即分别得到具有核壳结构的荧光牛血红蛋白印迹微球，而后将上述获得微球分别分散于所述pH为中性的缓冲液中；其中，红色印迹微球包埋CdTe/ZnS量子点、绿色印迹微球包埋CdTe量子点、蓝色印迹微球包埋7-羟基香豆素。
7.按权利要求6所述的三荧光发射分子印迹传感器的制备方法，其特征在于：所述荧光牛血红蛋白印迹微球为向含有二氧化硅微球的pH为中性的缓冲液中加入牛血红蛋白和3-氨基丙基三乙氧基硅烷，搅拌1-2小时后，再分别加入不同荧光物质，混匀后继续加入正硅酸乙酯和氨水在黑暗环境下进行溶胶-凝胶聚合反应10-12小时，反应后将产物用离心法沉淀，弃上清液，洗涤沉淀，得到具有核壳结构的荧光牛血红蛋白印迹微球，而后再将微球重新分散在pH为中性的缓冲液中。
8.按权利要求4-7任意一项所述的三荧光发射分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，所述pH为中性的缓冲液为0.01 M, pH 为7.0的磷酸缓冲液。
9.一种按权利要求1所述的三荧光发射分子印迹传感器在定量或可视化定性检测牛血红蛋白中的应用。

说明书全文

一种三荧光发射分子印迹 传感器及其制备和应用

技术领域

[0001] 本发明属于分析化学以及快速检测领域，具体涉及一种基于后印迹混合法的红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器及其制备和在精确可视化检测牛血红蛋白中的应用。

背景技术

[0002] 现如今，快速可视化检测在环境检测、食品安全、临床诊断等领域都发挥着重要作用。对大量待测样品的快速可视化检测，结合对可疑样品的大型仪器（如高效液相色谱）精确检测往往构成一个完整的检测流程，既节约检测的金钱和时间花费又保证检测结果的可靠性。因此，往往要求快速可视化检测方法具有高灵敏性与高选择性。

[0003] 比率荧光检测方法具有高灵敏性的优势，有利于痕量物质浓度的检测；具有自校正功能，可避免受到各种目标物不相关的因素干扰而导致数据失真，例如背景荧光、仪器波动等；同时可随目标物浓度不同展现不同荧光颜色，提供可视化检测结果。分子印迹技术可用于制备具有高选择性识别位点的分子印迹聚合物，分子印迹聚合物的物理、化学稳定性以及价格廉价性远远优于抗体类同样具有特异性识别功能的物质。

[0004] 随着比率荧光检测方法以及分子印迹技术近年来的快速发展，更期望制备比率荧光分子印迹传感器，结合二者的高灵敏性、自校正功能、荧光演变功能、以及高选择性，将其应用于复杂基质中蛋白质的快速可视化检测。目前，比率荧光分子印迹传感器中主要存在两点不足：（1）传统比率荧光分子印迹传感器只具有两个发射峰，检测目标物时提供的荧光颜色变化范围狭窄，不能够精确可视化检测目标物的含量；（2）比率荧光分子印迹传感器制备往往需要对不同发射峰的荧光强度进行优化，选择合适的发射峰强度比值，以达到最优的可视化检测效果，但传统比率荧光分子印迹传感器的发射峰强度比值优化过程复杂且繁琐。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种基于后印迹混合法的红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器及其制备和在精确可视化检测牛血红蛋白中的应用。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种三荧光发射分子印迹传感器，传感器为通过后印迹混合法将红色荧光牛血红蛋白印迹微球、绿色荧光牛血红蛋白印迹微球和蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球混合，即获得红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器。

[0007] 所述传感器为将通过溶胶-凝胶聚合法分别合成的红色、绿色和蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球由后印迹混合法混合于pH为中性的缓冲液中；其中，按体积百分比计，红色荧光牛血红蛋白印迹微球4-6%、绿色荧光牛血红蛋白印迹微球10-12%、蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球5-7%，余量为缓冲液；所述获得微球可混合后再加入于缓冲液中，或，依次加入至缓冲液中。

[0008] 所述荧光牛血红蛋白印迹微球为通过溶胶-凝胶聚合法在二氧化硅纳米粒子表面进行牛血红蛋白印迹，印迹层内分别包埋不同荧光物质，洗脱牛血红蛋白后的空穴为识别位点，即分别得到具有核壳结构的荧光牛血红蛋白印迹微球；其中，红色印迹微球包埋红色荧光碲化镉/硫化锌（CdTe/ZnS）量子点、绿色印迹微球包埋绿色荧光碲化镉（CdTe）量子点、蓝色印迹微球包埋蓝色荧光7-羟基香豆素。

[0009] 一种三荧光发射分子印迹传感器的制备方法，向pH为中性的缓冲液中加入红色、绿色、蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球，混匀，得到红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器。

[0010] 通过溶胶-凝胶聚合法分别合成红色、绿色和蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球，而后将所得微球由后印迹混合法混合于pH为中性的缓冲液中；其中，按体积百分比计，红色荧光牛血红蛋白印迹微球4-6%、绿色荧光牛血红蛋白印迹微球10-12%、蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球5-7%，余量为缓冲液。

[0011] 所述荧光牛血红蛋白印迹微球为通过溶胶-凝胶聚合法在二氧化硅纳米粒子表面进行牛血红蛋白印迹，印迹层内分别包埋不同荧光物质，洗脱牛血红蛋白后的空穴为识别位点，即分别得到具有核壳结构的荧光牛血红蛋白印迹微球，而后将上述获得微球分别分散于所述pH为中性的缓冲液中；其中，红色印迹微球包埋CdTe/ZnS量子点、绿色印迹微球包埋CdTe量子点、蓝色印迹微球包埋7-羟基香豆素。

[0012] 进一步地，所述荧光牛血红蛋白印迹微球为向含有二氧化硅微球的pH为中性的缓冲液中加入牛血红蛋白和3-氨基丙基三乙氧基硅烷，搅拌1-2小时后，再分别加入不同荧光物质，混匀后继续加入正硅酸乙酯和氨水在黑暗环境下进行溶胶-凝胶聚合反应10-12小时，反应后将产物用离心法沉淀，弃上清液，洗涤沉淀，得到具有核壳结构的荧光牛血红蛋白印迹微球，而后再将微球重新分散在pH为中性的缓冲液中。

[0013] 进一步地，所述溶胶凝胶聚合反应体系总体积控制在18-22mL；其中，二氧化硅、牛血红蛋白、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、红色荧光CdTe/ZnS量子点、绿色荧光CdTe量子点、蓝色荧光7-羟基香豆素、正硅酸乙酯和氨水用量分别为8-12 mg，8-12 mg，20-40 μL，10-15 mL，2-5 mL，15-25 mg，40-70 μL和40-70 μL。

[0014] 所述pH为中性的缓冲液为磷酸缓冲液（0.01 M, pH 7.0）。

[0015] 一种三荧光发射分子印迹传感器的应用，所述传感器在定量/可视化定性检测牛血红蛋白中的应用。

[0016] 所述传感器于待测液中，传感器内的红色荧光CdTe/ZnS量子点、绿色荧光CdTe量子点和蓝色荧光7-羟基香豆素都作为荧光响应信号，其荧光强度随目标物浓度增加而分别降低、降低和增强，通过三处发射峰强度不同程度的变化，产生红-绿-蓝范围内的丰富的荧光颜色变化实现对待检测液中牛血红蛋白的可视化检测。

[0017] 而后通过荧光分光光度计测定溶液的荧光光谱，读取三个发射峰峰强，计算三个峰强比值的变化与牛血红蛋白浓度存在的计量关系，进而进行牛血红蛋白的定量检测；检测原理：本发明传感器可视化检测牛血红蛋白的机理在于，通过光致激发电子转移猝灭红色和绿色荧光；而通过改变7-羟基香豆素的水环境使其荧光强度增强。所采用的红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器，能够通过三处发射峰强度不同程度的变化，产生红-绿-蓝范围内的荧光颜色变化，实现对待检测液中牛血红蛋白的精确可视化检测。

[0018] 本发明的有益效果为：本发明三荧光发射分子印迹传感器可在同一波长激发下发射三个不同波长的荧光，与目标物作用后三发射峰发生不同的变化，或荧光增强或荧光猝灭，通过测量三个不同发射波长处的荧光强度，以其比值为信号参量可测定目标物的含量。同时，通过三处发射峰不同的变化，能够产生丰富的荧光颜色变化，进而拓宽分子印迹技术在快速可视化检测蛋白质中的应用；具体为：
1）本发明首次将三种荧光（红、绿、蓝）运用于分子印迹传感器中，其中红色、绿色荧光随牛血红蛋白浓度增强而荧光强度降低，蓝色荧光反而增强，进而提供丰富的荧光颜色变化以及更高的灵敏度和更大的印迹因子，进而将获得的传感器用于牛血红蛋白的精确可视化检测；
2）本发明通过后印迹混合法，首先合成三种不同荧光发射的牛血红蛋白印迹微球，然后按照适合比例混匀，简化了三种荧光峰发射强度比例的优化过程，避免多次合成分子印迹聚合物，大大缩短了实验周期，减少了实验花费；
3）本发明不同荧光发射的牛血红蛋白印迹微球的制备通过溶胶-凝胶法在缓冲溶液中表面印迹制备红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器，在温和条件下对蛋白质进行过夜反应即可得到产物，进而得到具有结构预定性、识别选择性以及广谱实用性的分子印迹传感器；
4）本发明传感器通过印迹位点对牛血红蛋白的特异性识别可以高选择性地识别、重结合牛血红蛋白，进而同时猝灭红色、绿色荧光，提高蓝色荧光；即在检测中红色CdTe/ZnS、绿色CdTe量子点和目标物牛血红蛋白之间发生光致电子转移，随着牛血红蛋白浓度的增大，红色和绿色荧光逐渐猝灭,而蓝色7-羟基香豆素所处空穴的水环境因结合牛血红蛋白而改变，随着牛血红蛋白浓度增大，蓝色荧光逐渐增强，从而使荧光颜色发生黄绿色-黄色-粉橙色-紫红色-紫色-蓝色的宽范围变化，实现牛血红蛋白的精确可视化检测；
5）本发明传感器充分发挥了分子印迹聚合物高选择性以及三发射荧光检测技术高灵敏性、自校正抗干扰、颜色演变丰富等优势，建立了一种方便快捷且可靠的定量方法用于复杂样品中牛血红蛋白的检测，且提供丰富的颜色变化能用于定性检测，本发明传感器能检测0.025–3 μM的牛血红蛋白，检测限低达9.8 nM，印迹因子高达15.2；本发明克服了传统的比率荧光分子印迹传感器颜色演变范围窄、制备复杂等缺点，在生物大分子的诊断与控制中具有重要应用价值。
附图说明

[0019] 图1为本发明实施例提供的蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球的制备过程示意图。

[0020] 图2为本发明实施例提供的牛血红蛋白印迹微球与非印迹微球形貌图；其中，A-C分别为红色、绿色和蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球（分别标记为r-MIPs、g-MIPs和b-MIPs），D-F分别为红色、绿色和蓝色荧光非印迹微球（分别标记为r-NIPs、g-NIPs和b-NIPs）。

[0021] 图3为本发明实施例提供的传感器中含有不同绿色牛血红蛋白印迹微球条件下检测牛血红蛋白的荧光光谱图与荧光颜色演变图；其中，A-H分别为绿色牛血红蛋白印迹微球（r-MIPs和b-MIPs）用量：0%，3%，5%，7%，9%，11%，13%和15%；A-H中箭头表示牛血红蛋白浓度增加；且A-H中红色牛血红蛋白印迹微球（r-MIPs）用量固定为5%（体积分数），蓝色牛血红蛋白印迹微球（b-MIPs）用量固定为6%（体积分数）。

[0022] 图4为本发明实施例提供的不同传感器检测牛血红蛋白的荧光光谱图与三荧光发射分子印迹传感器荧光颜色演变图；其中，A为红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器，B为红-绿-蓝三荧光发射非印迹传感器，C为红-绿双荧光发射分子印迹传感器，D为红-蓝双荧光发射分子印迹传感器，E为绿-蓝双荧光发射分子印迹传感器检测牛血红蛋白的荧光光谱图与荧光颜色演变；A-E中箭头表示牛血红蛋白浓度增加；F为三个荧光强度的比值变化与牛血红蛋白浓度的线性关系图。

[0023] 图5为本发明实施例提供的三荧光分子印迹传感器（MIPs）与非印迹传感器（NIPs）识别不同蛋白质后荧光强度比值以及荧光颜色的变化图；其中，各蛋白质浓度均为1μM。

具体实施方式

[0024] 以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

[0025] 本发明传感器中红色、绿色、蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球分别提供红色、绿色和蓝色荧光，发射波长分别为637nm、537nm和453nm，各自因牛血红蛋白产生不同的荧光信号强度变化，即荧光猝灭、荧光猝灭和荧光增强，进而用于牛血红蛋白的可视化检测。而后通过荧光分光光度计测定溶液的荧光光谱，读取三个发射峰峰强，计算三个峰强比值的变化与牛血红蛋白浓度存在的计量关系，进而进行牛血红蛋白的定量检测；同时，当该传感器检测牛血红蛋白时，红色和绿色荧光逐渐猝灭，而蓝色荧光逐渐增强，从而使荧光颜色发生丰富的演变：从最初的黄绿色到黄色到粉橙色到紫红色到紫色到最后的蓝色，可用于精确可视化检测牛血红蛋白。

[0026] 本发明方法制备得到的传感器能够高选择、高灵敏地检测牛血红蛋白，且提供颜色演变与自校正功能；且该后印迹混合构建传感器的方法，可有效简化三种荧光峰发射强度比例的优化过程，大大缩短实验周期，减少实验花费，可更广泛地应用于各种生物大分子的精确可视化检测，为生物大分子的诊断与控制提供重要应用价值。

[0027] 实施例1三荧光发射分子印迹传感器的制备：
（1）制备牛血红蛋白印迹微球，以蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球为例参见图1：
向20 mL磷酸缓冲液（0.01 M, pH 7.0）中加入10mg粒径约为79nm 的二氧化硅微球、
10mg牛血红蛋白和35 μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），搅拌1小时后，加入20mg 蓝色荧光7-羟基香豆素，混匀后继续加入56 μL正硅酸乙酯（TEOS）和56 μL氨水（NH3·H2O），在黑暗环境下进行溶胶-凝胶聚合反应10-12小时。反应完成后，将产物用离心法沉淀（8000rpm，
5分钟），弃上清液，用0.5% Triton X-100洗脱沉淀物中的牛血红蛋白，得到具有核壳结构的蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球（b-MIPs），而后将获得b-MIPs分散在20mL 缓冲溶液（0.01 M, pH 7.0）中备用。

[0028] 同时，采用上述相同的方法制备，制备过程中仅在印迹过程中不加模板分子牛血红蛋白，获得蓝色荧光非印迹微球（b-NIPs）作为对照。

[0029] 按照上述制备方式分别获得红色荧光牛血红蛋白印迹微球（r-MIPs）和和绿色荧光牛血红蛋白印迹微球（g-MIPs），制备过程中分别用12mL 红色荧光CdTe/ZnS量子点和3mL 绿色荧光CdTe量子点替代7-羟基香豆素，所获得的r-MIPs和g-MIPs分别分散在20mL 缓冲溶液（0.01 M, pH 7.0）中备用；并且，以未添加模板分子牛血红蛋白获得的红色荧光牛血红蛋白印迹微球（r-NIPs）和绿色荧光牛血红蛋白印迹微球（r-NIPs）作为对照。

[0030] （2）将50μL红色荧光牛血红蛋白印迹微球分散液、110μL 绿色荧光牛血红蛋白印迹微球分散液、60μL 蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球分散液，依次均匀分散在780μL 磷酸缓冲溶液（0.01 M, pH 7.0）中，得到红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器。

[0031] 取上述实施例制备获得红色、绿色、蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球（r-MIPs，g-MIPs和b-MIPs）溶液、和红色、绿色、蓝色荧光非印迹微球（r-NIPs，g-NIPs和b-NIPs）溶液各100μL，而后分别经超纯水分别进行稀释1000倍，稀释后分别分散在经过乙醇清洗的铜网上，干燥之后，将载有上述各稀释后物质的铜网用透射电镜进行观察（参见图2A-F）。

[0032] 由图2可知，牛血红蛋白印迹微球和非印迹微球都具有粗糙表面，平均粒径大约都为95nm，计算可知具有8nm 厚的聚合物层，可见模板分子对传感器的形貌没有很大影响，且印迹微球与非印迹微球在形貌、尺寸上没有明显区别，微球对牛血红蛋白可能存在的不同的识别效果并非源于形貌和尺寸。

[0033] 实施例2将上述获得红色荧光牛血红蛋白印迹微球（r-MIPs）分散液、蓝色荧光牛血红蛋白印迹微球（b-MIPs）分散液和绿色荧光牛血红蛋白印迹微球（g-MIPs）分散液按一定比例混合于磷酸缓冲液（0.01 M, pH 7.0）中即获得传感器；其中，磷酸缓冲液（0.01 M, pH 7.0）总体积控制在1 mL，红色牛血红蛋白印迹微球（r-MIPs）用量固定为5%（体积分数），蓝色牛血红蛋白印迹微球（b-MIPs）用量固定为6%（体积分数），绿色牛血红蛋白印迹微球（g-MIPs）用量分别为0%，3%，5%，7%，9%，11%，13%和15%；而后向上述传感器中加入不同量的牛血红蛋白，使其终浓度达到0，0.025，0.05，0.075， 0.1，0.25，0.5，0.75，1，2和3μM；加入牛血红蛋白后混匀，反应8分钟，然后用荧光分光光度计测定每个样品的荧光光谱（激发波长：365nm，狭缝宽度5/5nm）（参见图3）。

[0034] 由图3所示，随着牛血红蛋白浓度的增加，红色和绿色荧光猝灭，而蓝色荧光增强，其中如图3A所示，绿色荧光牛血红蛋白印迹微球（g-MIPs）用量为0%，红色荧光猝灭而蓝色荧光猝灭导致荧光颜色从紫红色变为蓝色。如图3B-H所示，随着绿色荧光牛血红蛋白印迹微球（g-MIPs）用量从3%增加到15%，样品初始荧光颜色从紫红色变为橙色变为黄色再变为草绿色；随着牛血红蛋白浓度的增加，含有过低绿色荧光牛血红蛋白印迹微球（g-MIPs）的样品荧光颜色演变缺失黄色荧光区间，颜色演变主要呈现红色调和紫色调；而过量添加的绿色荧光牛血红蛋白印迹微球（g-MIPs）会掩盖红色荧光，使得样品荧光颜色从绿色变为蓝色；两种情况都会缩小荧光颜色变化范围。对比各个荧光颜色演变图可知，当绿色荧光牛血红蛋白印迹微球（g-MIPs）用量为11%，随牛血红蛋白浓度从0增加到250nM, 样品荧光颜色变化为黄绿色-黄色-粉橙色-紫红色，随牛血红蛋白浓度继续增加到3μM, 样品荧光颜色会继续变为紫色再变为蓝色，荧光颜色变化最丰富，范围最宽。该结果表明，可视化检测牛血红蛋白的红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器中微球的最佳配比为：r-MIPs: g-MIPs: b-MIPs=5%:11%:6%。

[0035] 实施例3根据上述记载的传感器制备方法制备不同传感器，具体将上述获得的不同微球按一定比例混合于缓冲液中，即获得不同选择和不同比例的不同传感器；其中红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器中r-MIPs: g-MIPs: b-MIPs=5%:11%:6%（体积百分比）、红-绿-蓝三荧光发射非印迹传感器中r-NIPs: g-NIPs: b-NIPs=5%:11%:6%（体积百分比）、红-绿双荧光发射分子印迹传感器中r-MIPs: g-MIPs =5%:11%（体积百分比）、红-蓝双荧光发射分子印迹传感器中r-MIPs: b-MIPs=5%:6%（体积百分比）、绿-蓝双荧光发射分子印迹传感器中g-MIPs: b-MIPs=11%:6%（体积百分比）；且，上述各传感器中磷酸缓冲液（0.01 M, pH 7.0）总体积控制在1 mL。

[0036] 向上述获得的不同传感器中加入不同量的牛血红蛋白，使其终浓度达到0，0.025，0.05，0.075， 0.1，0.25，0.5，0.75，1，2和3μM；混匀，反应8分钟，然后用荧光分光光度计测定每个样品的荧光光谱（激发波长：365nm，狭缝宽度5/5nm）（参见图4）。

[0037] 如图4A所示，在365nm波长激发下，红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器发射三个荧光峰分别在637nm、537nm和453nm。随着牛血红蛋白浓度的增强，红色和绿色荧光强度逐渐降低，而蓝色荧光强度逐渐增强；因为同时发生的猝灭与增强作用，荧光强度的变化可造成明显而丰富的荧光颜色变化：黄绿色-黄色-粉橙色-紫红色-紫色-蓝色，进而可视化检测牛血红蛋白含量。如图4F所示，三个荧光强度比值的变化与牛血红蛋白浓度（0.025-3μM）呈线性关系，线性相关系数（r2）为0.9941，检测限为9.8nM。而如图4B所示，随着牛血红蛋白浓度的增加，红-绿-蓝三荧光发射非印迹传感器的红色、绿色和蓝色荧光强度的变化都不明显，造成的荧光颜色变化范围也大大缩小。进一步可见牛血红蛋白印迹传感器（MIPs）中存在特异性结合牛血红蛋白的识别位点，而非印迹传感器（NIPs）中没有。

[0038] 同时观察双荧光发射分子印迹传感器，即红-绿（图4C）、红-蓝（图4D）和绿-蓝（图4E）双荧光发射分子印迹传感器，同样地，红色和绿色荧光会因为牛血红蛋白而猝灭，蓝色荧光会增强，导致响应的荧光颜色变化分别为：草绿色-黄色-粉橙色，紫红色-紫色-蓝色，绿色-蓝色。与三荧光发射分子印迹传感器对比，双荧光发射分子印迹传感器的荧光颜色变化范围更窄。此外，如图4F所示，双荧光发射分子印迹传感器荧光强度比值的变化也明显不如三荧光发射分子印迹传感器，可见三荧光发射分子印迹传感器具有更低的灵敏度。该结果表明，三荧光发射分子印迹传感器在灵敏度和颜色变化范围都优于双荧光发射分子印迹传感器。

[0039] 实施例4将上述实施例获得的不同传感器，即红-绿-蓝三荧光发射分子印迹传感器（r-MIPs: g-MIPs: b-MIPs=5%:11%:6%）（又称牛血红蛋白分子印迹传感器）和红-绿-蓝三荧光发射非印迹传感器（r-NIPs: g-NIPs: b-NIPs=5%:11%:6%）（又称非印迹传感器）加入磷酸缓冲液（0.01 M, pH 7.0），而后加入不同的蛋白质，且蛋白质最终浓度都为1μM。混匀，反应8分钟，然后用荧光分光光度计测定每个样品的荧光光谱（激发波长：365nm，狭缝宽度5/5nm）（参见图5）；其中，不同的蛋白质种类包括：牛血红蛋白、牛血清蛋白、卵清蛋白和溶菌酶。

[0040] 如图5所示，牛血红蛋白对分子印迹传感器的荧光强度比值变化影响最大，由于分子印迹传感器含有大量对牛血红蛋白特定的识别位点，其他蛋白质因构型、尺寸等与识别位点不匹配，因而很难进入印迹空穴，使得荧光强度变化不大。同时各种蛋白质对非印迹传感器的荧光强度比值变化影响相当，非印迹传感器没有特异性的识别位点，其对蛋白质的识别仅为非特异性识别。

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