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一株富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019及其分离筛选方法和应用

阅读：1035发布：2020-09-12

专利汇可以提供一株富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019及其分离筛选方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一株富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019及其分离筛选方法和应用，该菌株于2018年07月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏序号为：CCTCC M No:2018459。所述富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019采用光密度法和红硒法进行筛选，对种鸭饲料来源益生菌进行逐级耐无机硒筛选，筛选出耐硒能力强的菌株，通过形态观察和16S rDNA分子生物学鉴定方法，鉴定出D1-019菌为短小芽孢杆菌。所述菌株有机硒转化率达100％，并在一定时间内增加饲料与食品中的有机硒含量。作为一种新型有机硒源，能够应用于饲料、饲料发酵剂、食品和保健品领域。，下面是一株富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019及其分离筛选方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一株富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019，其特征在于：该菌株于2018年07月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏序号为：CCTCC M No：2018459。
2.权利要求1所述富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019的16S rDNA基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
3.权利要求1所述富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019的富硒培养方法，其特征在于，培养基中亚硒酸钠浓度为0-1730μg/mL、5-500μg/mL、5-20μg/mL、20μg/mL或为15μg/mL。
4.权利要求1所述富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019的分离和筛选方法，其特征在于，根据菌体颜色和红硒现象，对种鸭饲料来源菌株的耐硒能力进行初筛、复筛、鉴定，分离出高有机硒转化率的菌株，具体步骤为：
所述初筛是将菌种库中菌种在一级培养基中活化，一级培养基为大豆胨5g/L，蛋白胨
2.5g/L，酪蛋白胨2.5g/L，酵母浸粉2.5g/L，牛肉粉5g/L，抗坏血酸钠0.5g/L，β-甘油磷酸钠
19g/L，硫酸镁0.25g/L，0.5％乳糖，pH 7.0-7.4，30℃培养36h，测定OD600值后，以1:39体积比例加入二级培养液中，二级培养基是在一级培养基的基础上加入0,25,50μg/mL梯度浓度的亚硒酸钠，30℃静置培养36h，根据菌液颜色变化及红硒现象，筛选出耐硒菌株，所述复筛是将初筛菌株在浓度范围为50-1730μg/mL的Na2SeO3条件下，根据菌液颜色变化及红硒现象重复上述筛选步骤，选出耐硒菌株，
所述鉴定是将耐硒的菌株进行形态观察、革兰氏染色、16S rDNA基因序列分析，并构建系统发育树鉴定菌株，
所述有机硒转化能力是将样品进行湿法消化处理后，采用ICP-MS方法检测其中质量数为78的Se元素含量，计算出无机硒含量，然后根据菌株培养前后培养液中无机硒利用率表示菌株对有机硒的转化能力，
富硒转化率计算公式为：
5.权利要求1所述富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019作为有机硒源的应用。
6.根据权利要求4所述富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019在生物饲料中应用，其特征在于，饲料中含有富有机硒的短小芽孢杆菌菌剂，所述菌剂中芽孢杆菌的含量为1.0×106～1.0×1012CFU/mL、1.0×108～1.0×1011CFU/mL或是1.0×109～1.0×1010CFU/mL。
7.根据权利要求4所述富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019在食品中应用，其特征在于，食品中含有富有机硒的短小芽孢杆菌菌剂和/或富有机硒短小芽孢杆菌有机硒组分的提取物，所述菌剂含有所述芽孢杆菌含量为1.0×106～1.0×1012CFU/mL、1.0×108～1.0×1011CFU/mL或是1.0×109～1.0×1010CFU/mL。
8.根据权利要求1所述富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019作为生物饲料发酵剂的应用，其特征在于，含有所述富硒短小芽孢杆菌菌剂和无机硒，在所述菌剂中芽孢杆菌的含量为1.0×106～1.0×1012CFU/g、1.0×108～1.0×1011CFU/g或是1.0×109～1.0×1010CFU/g，所述无机硒为亚硒酸钠终浓度为0.001～500μg/mL、5～20μg/mL或是15μg/mL。

说明书全文

一株富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019及其分离筛选方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及食品生物技术领域，具体是一株富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019及其分离筛选方法和应用。

背景技术

[0002] 硒是生物体必需的一种重要微量元素，与机体正常生理功能的维持以及多种疾病的发生发展密切相关。一旦缺硒，就会引发许多症状，同时会影响基因的表达和正常生理代谢的紊乱；缺硒会使幼畜出现白肌病。归纳起来，硒的生物学功能有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、保肝解毒、提高机体免疫力、调节机体代谢、影响繁殖功能等。现如今，部分地区的补硒主要手段仍是利用无机硒化合物制成补充剂，但是其毒副作用和利用率的弊端越来越被放大，需要改变补硒方式。有机硒补硒被认为是最安全也是最有效的手段。自上世纪八九十年代起，国内外对生物补硒的关注和研究持续至今，对硒的转化机理的了解越来越深入。

[0003] 益生菌作为一种无毒、无抗药性、无副作用、无残留且无污染的饲料添加剂而受人们重视。目前《，饲料添加剂品种目录》2013版中允许添加的微生物菌种共35种。其中，芽孢杆菌是最理想的微生物添加剂之一，它具有较高的蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶活性，对植物性碳水化合物有较强的降解能力，且物理性质十分稳定，因而在饲料中的应用研究也非常多。大量研究表明，在日粮中添加适量的富硒益生菌可以提高幼畜的生产性能，显著提高免疫功能、抗氧化水平和基因表达水平。富硒益生菌也可以拮抗致病菌在动物肠道定植；可以抗诱变及抗癌；调节肠道菌群。

[0004] 富硒微生物中，研究最为成熟的是富硒酵母和富硒乳酸菌，现已进入工业化生产阶段，但是对芽孢杆菌的富硒条件研究极少。目前，饲用富硒益生菌的研究呈现出以下问题：高富硒转化率的益生菌种类开发少；富硒益生菌菌株在饲料中的活力和适应性需经过研究和安全性评价才可添加进入饲料等。因此，有必要开发新型高效合成有机硒的益生菌，特别是适用于生物饲料领域的富硒芽孢杆菌。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一株富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019及其分离筛选方法和应用。

[0006] 本发明的技术方案是：一种富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019，该菌株于2018年07月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏序号为：CCTCC M No:2018459。

[0007] 所述富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019的16s rDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

[0008] 所述富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019的富硒培养方法，培养基中亚硒酸钠浓度为0-1730μg/mL、5-500μg/mL、5-20μg/mL、20μg/mL或为15μg/mL。

[0009] 所述富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019的分离和筛选方法，根据菌体颜色和红硒现象，对种鸭饲料来源菌株的耐硒能力进行初筛、复筛、鉴定，分离出高有机硒转化率的菌株，具体步骤为：

[0010] 所述初筛是将菌种库中菌种在一级培养基中活化，一级培养基为大豆胨5g/L，蛋白胨2.5g/L，酪蛋白胨2.5g/L，酵母浸粉2.5g/L，牛肉粉5g/L，抗坏血酸钠0.5g/L，β-甘油磷酸钠19g/L，硫酸镁0.25g/L，0.5％乳糖，pH 7.0-7.4，30℃培养3 6h，测定OD600值后，以1:39体积比例加入二级培养液中，二级培养基是在一级培养基的基础上加入0,25,50μg/mL梯度浓度的亚硒酸钠，30℃静置培养36h，根据菌液颜色变化及红硒现象，筛选出耐硒菌株，[0011] 所述复筛是将初筛菌株在浓度范围为50-1730μg/mL的Na2SeO3条件下，根据菌液颜色变化及红硒现象重复上述筛选步骤，选出耐硒菌株，

[0012] 所述鉴定是将耐硒的菌株进行形态观察、革兰氏染色、16s rDNA序列分析，并构建系统发育树鉴定菌株，

[0013] 所述有机硒转化能力是将样品进行湿法消化处理后，采用ICP-MS方法检测其中质量数为78的Se元素含量，计算出无机硒含量，然后根据菌株培养前后培养液中无机硒利用率表示菌株对有机硒的转化能力，

[0014] 富硒转化率计算公式为：

[0015]

[0016] 所述富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019作为有机硒源的应用。

[0017] 所述富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019在生物饲料中应用，其特征在于，饲料中含有富有机硒的短小芽孢杆菌菌剂，所述菌剂中芽孢杆菌的含量为1.0×106～1.0×1012CFU/mL、1.0×108～1.0×1011CFU/mL或是1.0×109～1.0×1010CFU/mL。

[0018] 所述富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019在食品中应用，其特征在于，食品中含有富有机硒的短小芽孢杆菌菌剂和/或富有机硒短小芽孢杆菌有机硒组分的提取物，所述菌剂含有所述芽孢杆菌含量为1.0×106～1.0×1012CFU/mL、1.0×108～1.0×1011CFU/mL或是1.0×109～1.0×1010CFU/mL。

[0019] 所述富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019作为生物饲料发酵剂的应用，含有所述富硒短小芽孢杆菌菌剂和无机硒，在所述菌剂中芽孢杆菌的含量为1.0×106～1.0×1012CFU/g、1.0×108～1.0×1011CFU/g或是1.0×109～1.0×1010CFU/g，所述无机硒为亚硒酸钠终浓度为0.001～500μg/mL、5～20μg/mL或是15μg/mL。

[0020] 本发明的突出优点在于：

[0021] 1、所述富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019筛选自种鸭饲料的益生菌，有利于回归应用于饲料领域。

[0022] 2、所述富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019有机硒转化率达到100％，为具有迄今为止报道的最高值，作为高有机硒源的益生菌，在发挥益生菌功效的同时，可用做有效补充有机硒的食品、饲料添加剂，并可用作新型生物饲料发酵剂。

[0023] 3、所述富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019筛选方法，为首次结合耐受无机硒能力和红硒现象，对种鸭饲料来源菌株进行初筛、复筛、鉴定，分离出高有机硒转化率的菌株，具有推广应用于其他来源饲用富有机硒益生菌的价值。附图说明

[0024] 图1为富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019的筛选。(A)光密度法初筛结果二维散点图；(B)光密度法初筛结果三维散点图；(C)光密度法复筛结果柱状图；(D)红硒法复筛结果柱状图。

[0025] 图2为富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019的菌落形态图(A)和革兰氏染色结果图(B)。

[0026] 图3为富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019总DNA提取结果(A)和PCR扩增结果琼脂凝胶电泳图(B)。

[0027] 图4为富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019系统发育树。

[0028] 图5为富硒短小芽孢杆菌菌株Bacillus pumilus D1-019生长曲线。

[0029] 图6为硒含量测定标准曲线。

具体实施方式

[0030] 下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

[0031] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0032] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0033] 实施例1

[0034] 富硒芽孢杆菌的分离筛选方法

[0035] 根据菌体颜色和红硒现象，对种鸭饲料来源菌株的耐硒能力进行初筛、复筛分离出耐硒和富硒菌株。

[0036] (1)初筛：将种鸭饲料来源的119个菌株，在一级培养基中活化，30℃培养36h，测定OD600值后，以1:39体积比例加入二级培养液中。一级培养基为：大豆胨5g/L，蛋白胨2.5g/L，酪蛋白胨2.5g/L，酵母浸粉2.5g/L，牛肉粉5g/L，抗坏血酸钠0.5g/L，β-甘油磷酸钠19g/L，硫酸镁0.25g/L，0.5％乳糖，pH 7.0-7.4。二级培养基为：在一级培养基的基础上添加不同浓度梯度的Na2SeO3。30℃静置培养36h，观察菌液颜色变化及红硒现象。初筛时Na2SeO3浓度梯度为0,25,50μg/mL，以OD600(25μg/mL)/OD600(0μg/mL)和OD600(50μg/mL)/OD600(0μg/mL)的值做二维散点图，以OD600(0μg/mL)、OD600(25μg/mL)、OD600(50μg/mL)做三维散点图筛选出生长快速的菌株，同时记录出现红硒沉淀的菌株及其现红硒沉淀的浓度条件。

[0037] 初筛结果图1A所示，以比值大于等于0.9为筛选标准，共从119株出发菌株中筛选出33株菌；如图1B所示，除所筛选的33株菌外，又筛选出可以同时在含有50μg/mL和25μg/mL Na2SeO3的快速生长的4株菌。

[0038] (2)复筛：以初筛的37株菌为出发菌株，采用与初筛相同的培养方法，在上述(1)中一级培养基，分别添加0，50，200，500μg/mL Na2SeO3浓度梯度，30℃静置培养36h，观察菌液颜色变化及红硒现象。以菌株的OD600(50μg/mL)/OD600(0μg/mL)、OD600(200μg/mL)/OD600(0μg/mL)和OD600(500μg/mL)/OD600(0μg/mL)值作建立柱形图，筛选耐受性更高的菌株。

[0039] 复筛结果如图1C所示，37株耐硒菌株中，三个比值均大于1的菌株有12，选取其中在初筛和复筛中的比值均明显高于其他菌株的4株菌；以及在4种无机硒浓度条件下均表现较高生长活力的菌株有5种菌株。9种菌株作为再次筛选的出发菌株，分别为：D7，D12，F1，F3，G4，H5，H10，H12和B’2。

[0040] (3)再次复筛：以复筛的9株菌为出发菌株，采用与复筛相同的培养方法，在上述(1)中一级培养基，分别添加0，500μg/mL，865μg/mL，1730μg/mL Na2SeO3浓度梯度，30℃静置培养36h，观察菌液颜色变化及红硒现象。从图1D可以看出，当Na2SeO3浓度上升到865μg/mL及以上时，9株菌生长量都明显降低，受到不同程度的抑制，其中，D12、G4和H12三种益生菌相比于其他菌株生长量更高，耐受性更强。

[0041] (4)红硒法复筛：对复筛获取的4株菌A’9，B’4，E12和B9进行红硒筛选，分别在上述(1)中一级培养基，添加0，20，40，60和80μg/mL Na2SeO3浓度梯度，30℃静置培养36h，通过观察深孔培养板底部红色沉淀硒的颜色，对菌株进行筛选。实验结果如下表1所示，A’9和B’4在20μg/mL Na2SeO3条件下能够耐硒，最终确定其为红硒筛选法中的结果菌。

[0042] 表1红硒法筛选实验结果

[0043]

[0044]

[0045] 注：“－”-透明、无明显红色沉淀；“+”-少量红色沉淀；“++”-明显红色沉淀；“+++”-大量红色沉淀。

[0046] (5)富硒条件筛选，综合上述筛选结果，共选择5株D12、G4、H12、A’9和B’4，在菌种库中对应的原始编号分别为D1-014，D1-019，M3-013，M4-013和F4-001，进行富硒实验。采用上述(1)中一级培养基，分别添加0，10，20，30，40和50μg/mL的Na2SeO3浓度梯度，30℃静置培养36h。实验结果如表2所示，根据实验结果可以确定D1-014，D1-019，M3-013，F4-001在无机硒的浓度为20μg/mL，M4-013菌为10μg/mL时，可以避免出现红硒现象，而最大程度地富集有机硒。

[0047] 表2复筛菌株在不同浓度无机硒条件下培养结果

[0048]

[0049] 注：“－”-透明、无明显红色沉淀；“+”-少量红色沉淀；“++”-明显红色沉淀；“+++”-大量红色沉淀。

[0050] 实施例2

[0051] 富硒短小芽孢杆菌D1-019的鉴定

[0052] 本发明所提供的富硒短小芽孢杆菌Bacillus pumilus D1-019菌株于2018年07月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏序号为：CCTCC M No:2018459，分类命名为：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

[0053] 2.1短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)D1-019菌株特性

[0054] 根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，对D1-019的菌落形态观察结果为：菌落生长相对缓慢，菌落形态不规则、光滑湿润、半透明、有部分菌落连成线，经过革兰氏染色后判断其为革兰氏阳性菌。菌落形态见附图2A，革兰氏染色见附图2B。提取总DNA，总DNA提取结果如附图3A，大小为23.1kb。

[0055] 2.2D1-019分子生物学技术鉴定

[0056] (1)PCR扩增

[0057] PCR反应体系构建如下表3所列，引物27F和1492R具体序列分别为序列表SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，PCR反应条件如下表4。PCR产物电泳结果如图3B，目标产物大小为1.6kb。PCR产物纯化后委托华大公司进行DNA测序，具体序列如序列表SEQ ID No.1所示。

[0058] 表3 PCR反应体系

[0059]

[0060] 表4 PCR反应条件

[0061]

[0062] (2)16S rDNA序列分析

[0063] 借助于NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)和RDP数据库(http://rdp.cme.msu.edu/)对16s rDNA序列进行比对分析，鉴定菌株信息。结果如表5所示，与D1-
019亲缘关系最近的菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus B147)。16s rDNA序列系统发育树结果如图4所示，同样表明D1-019为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。因此，结合上述《伯杰氏细菌鉴定手册》分析结果，可将D1-019菌株鉴定为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus。

[0064] 表5 D1-019 16s rDNA序列同源性比对分析

[0065]

[0066] 实施例3

[0067] 富硒短小芽孢杆菌D1-019的富硒条件优化

[0068] 采用正交实验方法对短小芽孢杆菌D1-019的富硒条件进行优化，选取培养温度、初始pH、无机硒浓度和加硒时间作为研究因素，因素的水平设置见表6。其余条件控制一定：50mL锥形瓶中装液量为20mL，同批菌液接种量为5％，静置培养48h，培养基和不同浓度亚硒酸钠混合比例为99:1。

[0069] (1)在pH为5、6、7的一级培养基中，分别配制终浓度为10，15，20μg/mL Na2SeO3的无机硒培养基。按照正交组别的变量水平要求，各取20mL相应培养基分组装入50mL锥形瓶中，接入1mL D1-019菌液，分别于30，37和42℃下，静置培养48h。每个实验组平行重复一次。

[0070] (2)培养结束后，测定各组OD600值大小。将各组培养液以5000r/min的转速离心30min，分别取上清液数毫升，备用。

[0071] (3)湿法消化。取50μL上清液加入到装有5mL超纯水的锥形瓶中，加10mL硝酸-高氯酸混合酸(9+1)及几粒玻璃珠，冷消化2h后于电热板上加热，并及时补加硝酸。当溶液变为清亮无色或淡黄色且有白烟产生时，再继续加热至剩余2mL左右。溶液冷却后加入6mol/L盐酸溶液5mL，继续加热至溶液产生白烟，在剩余2mL左右时冷却，用25mL比色管定容。同时做试剂空白。

[0072] 测量无机硒：将菌体干燥后，取100mg于烧杯中，加入10mL 15％盐酸(分析纯)。在电热板上加热煮沸，及时补加15％盐酸直至澄清，冷却后，以4500r/min转速离心10min后取上清定容至10mL。

[0073] 有机硒含量则为总硒含量减去无机硒含量。

[0074] (4)处理后的样品通过ICP-MS方法，测定质量数为78的Se元素含量，换算出各培养液中的无机硒含量，结果列于表6。

[0075] 表6富硒条件优化正交设计表及实验结果

[0076]

[0077] 正交实验结果表明，影响富硒效率的因素排序为：培养温度>初始pH>加硒时间>无机硒浓度。最优富硒条件组合为：培养温度30℃、初始pH＝5，在第6h时加入终浓度为20μg/mL的Na2SeO3溶液。

[0078] (5)最优富硒条件再验证。根据正交结果得出的最优富硒条件进行D1-019菌的富硒培养。经过测定，在30℃、pH＝5，第6h时加入终浓度为20μg/mL的亚硒酸钠溶液的条件下，培养48h后其富硒转化率高达100％，且未出现红硒现象，说明无机硒全部转化为有机硒。国内外研究中尚未见到100％富硒转化率的报道，表明本发明提供的D1-019菌具有应用于富硒产业的潜在优势。

[0079] 实施例4

[0080] 富硒短小芽孢杆菌D1-019生长曲线测定

[0081] 以上述实施例3中确定的最优富硒条件培养D1-019菌株，测定生长曲线。在pH为5的一级种子培养基中接入4mL的D1-19菌液，摇匀，同时以不含菌液的一级种子培养基作为空白，平行移取3次，测定OD600值大小，取平均值。将培养液置于30℃环境下培养，48h内每间隔2h取样，测定其OD600值。其中，在测定6h的OD600值后，立即加入终浓度为2g/L的Na2SeO3溶液，空白则加入同体积的超纯水，混匀后30℃培养。以OD600值数据为纵坐标，以时间为横坐标，分别绘制两个实验组中菌液的生长曲线。

[0082] 测得生长曲线如图5所示，从中可以看出最优富硒条件下，D1-019菌加硒生长与正常生长的曲线大体重合，仅对数生长期的生长速度略不同。D1-019菌在加入亚硒酸钠后，生长速率略低于未加亚硒酸钠的对照组，对照组更快地到达稳定期。实验组和对照组在稳定期的OD600都在0.4左右，说明该条件下无机硒对于D1-019菌的生长影响不明显。在加入亚硒酸钠后的第4h，开始出现明显变红的现象，说明亚硒酸钠有部分被芽孢杆菌转化为了单质硒。

[0083] 实施例5

[0084] 富硒短小芽孢杆菌菌剂

[0085] 将冻存的D1-019菌进行平板划线，培养过夜后挑取单菌落于培养液中，培养液为：大豆胨5g/L，蛋白胨2.5g/L，酪蛋白胨2.5g/L，酵母浸粉2.5g/L，牛肉粉5g/L，抗坏血酸钠
0.5g/L，β-甘油磷酸钠19g/L，硫酸镁0.25g/L，0.5％乳糖，pH 7.0-7.4。待OD600值为0.05后加入终浓度为20μg/mL的Na2SeO3，继续在30℃静置培养48h后，得到富硒短小芽孢杆菌杆菌菌剂，菌液浓度为1.0×108CFU/mL，经过适当的浓缩和稀释可以调配到1.0×106～1.0×
1012CFU/mL。

[0086] 实施例6

[0087] 富硒短小芽孢杆菌制剂应用于饲料

[0088] 根据实施例5所述的富硒后的短小芽孢杆菌菌剂中芽孢杆菌的含量为1.0×106-1.0×1012CFU/mL，优选的是1.0×108-1.0×1011CFU/mL，更优选的是1.0×109-1.0×
1010CFU/mL。以重量份为单位，富硒菌剂2份；D1中药种鸭饲料8份，在摇瓶中混匀培养，培养温度为30℃，转速为200rpm。分别培养0h、12h、24h、36h、48h，在烘箱中60℃低温烘干至恒重，分别测定其有机硒含量。

[0089] 湿法消化。取50μL上清液加入到装有5mL超纯水的锥形瓶中，加10mL硝酸-高氯酸混合酸(9+1)及几粒玻璃珠，冷消化2h后于电热板上加热，并及时补加硝酸。当溶液变为清亮无色或淡黄色且有白烟产生时，再继续加热至剩余2mL左右。溶液冷却后加入6mol/L盐酸溶液5mL，继续加热至溶液产生白烟，在剩余2mL左右时冷却，用25mL比色管定容。同时做试剂空白。

[0090] 测量无机硒：将菌体干燥后，取100mg于烧杯中，加入10mL分析纯浓度的15％盐酸。在电热板上加热煮沸，及时补加15％盐酸直至澄清，冷却后，以4500rpm转速离心10min后取上清定容至10mL。

[0091] 有机硒含量则为总硒含量减去无机硒含量。

[0092] 采用如图6所示标准曲线，标准曲线方程为y＝28342.7870*x+13.0533，对各样品中无机硒、总硒和有机硒进行测定。结果如表7所示，从中可以看出，添加富硒短小芽孢杆菌制剂明显补充了中草药种鸭饲料中有机硒含量，并在48h内维持稳定。

[0093] 表7富硒短小芽孢杆菌制剂应用于中草药种鸭饲料效果

[0094]

[0095]

[0096] 实施例7

[0097] 富硒短小芽孢杆菌制剂应用于食品

[0098] 取100mL富硒短小芽孢杆菌，于4℃、8000r/min离心10min，重悬于10mL蒸馏水中后超声破胞，超声条件为：5min，功率30％，超声1s，间隙2s，取上清即为富硒蛋白抽提液。将按照质量比牛奶70％，富硒蛋白30％进行添加，于温度为30℃，分别放置0h、12h、24h。测定不同放置时间后有机硒含量变化。硒测定方法与标准曲线同实施例6。加入富硒蛋白的牛奶在24h之后乳白色中带有浅青绿色，并伴有轻微特殊气味。实验表明，富硒短小芽孢杆菌粗蛋白抽液添加入牛奶中，总硒和有机硒含量基本稳定，有机硒含量及比例不但不减少而且有所增加。

[0099] 图8含富硒短小芽孢杆菌粗蛋白抽液牛奶中硒含量随时间变化表

[0100]

[0101] 实施例8

[0102] 富硒短小芽孢杆菌作为生物饲料发酵剂的应用，

[0103] 取20mL富硒短小芽孢杆菌D1-019培养液，加入2g生物饲料，加入终浓度为20μg/mL亚硒酸钠，200μl芽孢杆菌D1-019菌液。培养液成分为：大豆胨5g/L，蛋白胨2.5g/L，酪蛋白胨2.5g/L，酵母浸粉2.5g/L，牛肉粉5g/L，抗坏血酸钠0.5g/L，β-甘油磷酸钠19g/L，硫酸镁0.25g/L，0.5％乳糖，pH 7.0-7.4。分别培养0h、12h、24h、36h、48h，55-65℃烘干后得应用产物，分别测定不同发酵时间后菌体浓度有机硒含量变化。测硒方法与标准曲线同实例7。随着时间的增加，有机硒的含量总体呈上升趋势。

[0104] 表9富硒短小芽孢杆菌作为生物饲料发酵剂的硒含量随时间变化表

[0105]

[0106] 以上实例证明了该菌株在饲料、食品方面的应用，将该菌株应用于饲料方面可在一段时间里快速有效的增加饲料与食品中的有机硒含量。

[0107] 本发明不限于上述技术方案，本发明的任何改进，包括对该技术方案进行多种简单变型，均落在本发明的保护范围内。

[0108] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

[0109] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可任何进行组合，只要不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

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一株富硒短小芽孢杆菌菌株D1-019及其分离筛选方法和应用

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