一种高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的构建方法及其表达
应用
一、技术领域
[0002] 右旋糖酐(dextran)，又称葡聚糖，是蔗糖经肠膜状明串珠菌
发酵后生成的高分子
葡萄糖聚合物，主要由α(1-6)糖苷键连接，伴有少量α(1-3)和α(1-4)糖苷键，也可以通过工程菌生产的右旋糖酐蔗糖酶制备。因其具有安全、无毒、
生物相容性、结构特异性等多种优点，在食品、医学、色谱分析、材料等多个领域都有了广泛的应用。不同结构的右旋糖酐其物理化学性质都有较大的差异，根据其功能都有其特定的用途，例如由明串珠菌发酵的95％α(1-6)糖苷键的右旋糖酐70是目前公认的优良
血浆替代品，由面包
酵母发酵的右旋糖酐可作为
食品添加剂改善食品的口感。右旋糖酐由于其超高的分子量，和链上的一些活性官能团，可以
吸附分散体系中微粒，形成架桥作用，将分散体系中的微粒絮凝沉降下来，右旋糖酐或者改性右旋糖酐(接枝不同的官能团)在絮凝剂方面有很大的应用价值。
[0003] 目前国内制糖工业采用的传统澄清手段主要是采用石灰和二
氧化硫为主要清净剂。混合汁经预灰、一次加热、硫熏中和、二次加热后入沉降器，分离出清净汁和泥汁，泥汁经过滤得滤清汁，它与清净汁混合再经加热、多效
蒸发成糖浆，再经糖浆硫熏得清糖浆作结晶原料。或者以石灰和二氧化
碳为主要清净剂的蔗汁清净法。其工艺流程为：混合汁经一次加热、预灰，然后在加入过量的石灰乳的同时通入二氧化碳进行一次碳酸饱充，使产生大量
钙盐沉淀，随即加热、过滤得一碳清汁，再经第二次碳酸饱充，然后加热、过滤，得二碳清汁，又经硫熏、加热、蒸发成糖浆。然后进行硫漂使pH降至5.8～6.4，供结晶之用。大量的二氧化硫和石灰石的使用，不仅需要投入大量资金，同时对环境和人体也会有很大的影响和危害。而使用蔗糖为底物合成的右旋糖酐作为
澄清剂，将会使澄清步骤绿色，无污染，更加节约资源。
[0004] 分析发现，要完善右旋糖酐作为絮凝剂的生产工艺，有2个关键性问题尚待解决：①因为右旋糖酐结构多样性，其功能也是多样性的，首先要选择分子量和支链化程度适宜的右旋糖酐用作絮凝剂或其絮凝剂前提的研究。②通过基因手段理性设计右旋糖酐技术，要想得到不同结构的右旋糖酐，就要从其上游，右旋糖酐蔗糖酶基因的改造来获得结构特异的右旋糖酐。通过对右旋糖酐基因序列和其表达蛋白三维结构分析，设计合理的基因序列，获得所需结构的右旋糖酐。
[0005] 迄今为止，有关于改造右旋糖酐蔗糖酶基因生产右旋糖酐应用于絮凝剂的研究在国内外文献未见报道。目前右旋糖酐主要应用于血浆替代品，文献中大多是对右旋糖酐蔗糖酶催化机理，以及蛋白结构分析等
基础研究报道，应用方面大多是对原始菌株表达的右旋糖酐应用研究。通过分子生物学手段特异性的改造右旋糖酐，国内外均为见报道。基因改造手段制备目的右旋糖酐工业将是以后国际研究热点和解决问题的关键。三、发明内容
[0006] 本发明旨在提供一种高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的构建方法及其表达应用，通过该酶从而改良右旋糖酐性质，使其更适合絮凝剂或絮凝剂前提的研究。
[0007] 本发明高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌是以右旋糖酐蔗糖酶基因(Genbank No.DQ345760)为模板，去除3’端的1584bp
碱基、保留上游3000bp碱基dex-YG-bMU01后重组转化到BL21(DE3)大肠杆菌中获得的BL21(DE3)/dex-YG-bMU01基因工程菌。
[0008] 本发明涉及保藏菌株为高枝化型重组右旋糖酐蔗糖酶工程菌dex-YG-bMU01基因工程菌，分类命名为高枝化型重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)，保藏于中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏日期2016年05月12日，保藏编号CGMCC No.12437。
[0009] 本发明高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的构建方法，包括引物设计、重组质粒构建和宿主菌转化各单元过程：
[0010] 所述引物设计是根据右旋糖酐蔗糖酶基因(dex-YG)序列和载体pET-28a-(+)的序列，借助Primer Primer 5
软件设计引物如下：
[0011] 上游引物选择BamH I作为酶切位点：
[0012] 5’-----CGCGGATCCATGCCATTTACAGAAAAAGT-----3’
[0013] 下游引物选择Hind III作为酶切位点：
[0014] 5’---CCCAAGCTTTTATTCTGTCGGTGTGCCA---3’；
[0015] 所述重组质粒构建是以右旋糖酐蔗糖酶基因(dex-YG)为模板，利用PCR扩增技术，得到含BamH I和Hind III酶切位点截短后的基因克隆
片段dex-YG-bMU01；将上述的基因克隆片段用BamH I和Hind III双酶切，酶切产物连接到载体pET-28a-(+)的双酶切位点上，得到重组表达质粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01；
[0016] 所述宿主菌转化是将重组表达质粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(购自全式金生物公司)中，经过卡那霉素抗性筛选、酶切、菌液PCR和DNA测序验证后，获得右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/dex-YG-bMU01。
[0017]
实施例中提供了利用该基因工程菌株发酵表达右旋糖酐蔗糖酶，利用该酶生产右旋糖酐以及右旋糖酐的絮凝效果考量的具体方法。
[0018] 通过本发明高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，包括如下步骤：
[0019] 将基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG-bMU01按0.5％的接种量(体积)接种到含有40～60μg/ml卡那霉素的LB培养基中，转速250r/min，35～40℃培养16～18小时；从上述培养液中吸取2mL加入至200mL的A培养基中，放置于37℃下，220～240r/min(往复式)或者260～
280r/min(回转式)摇床培养，当富集培养的菌液用蒸馏
水稀释10倍后的OD600在0.20～0.24时(约3.5h之后)即可加入500μL IPTG开始诱导产酶，保持25℃，220～230r/min(往复式)或者250～260r/min(回转式)摇床诱导发酵4-6小时，将诱导发酵后的菌悬液在0℃下，6000r/min离心12～15min，一支离心管对应一瓶菌悬液，然后加入蒸馏水振荡清洗，再次离心；向每支离心管中加入20mL pH值5.4的
醋酸-醋酸钙缓冲液震荡摇匀，外加
冰水浴，超声
破碎15min，离心分离，上清液即为粗酶液，酶活80-100U/mL。
[0020] 所述A培养基中各组分及浓度为：甘油5g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，
硝酸钾10g/L，Na2HPO4 12H2O 17.105g/L，KH2PO4 3g/L，NH4Cl 1g/L，MgSO4 7H2O 0.1mM/L。
[0021] 利用获得的右旋糖酐蔗糖酶粗酶液
水解合成右旋糖酐，包括如下步骤：
[0022] 按100g蔗糖/800ml缓冲液(pH值5.4的醋酸-醋酸钙)的比例配置反应液，酶用量按酶活2U/ml比例加入，将
混合液在25℃下搅拌反应24-28小时，将反应液过滤，以2-3倍体积的
乙醇醇沉，洗涤，干燥后得到右旋糖酐。
[0023] 本发明构建的BL21(DE3)/dex-YG-bMU01右旋糖酐蔗糖酶基因工程菌，合成的右旋糖酐支链化程度提高，其中的α(1-3)比例从原来的5％提高到了17％，其水溶液黏度增加，絮凝效果方面得到明显改良，其产酶仍然保持了较高的活性。四、
附图说明
[0024] 图1是本发明蔗糖酶工程菌的构建示意图。
[0025] 图2是本发明右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐催化原理。
[0026] 图3是野生型与突变株右旋糖酐核磁检测对比图。其中a为基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG发酵生产右旋糖酐核磁图；b为基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG-bMU01发酵生产右旋糖酐核磁图。从5.2ppm左右处的质子峰可以看出分子改造的右旋糖酐蔗糖酶合成的右旋糖酐α(1-3)比例从原有的5％提高到了17％。五、具体实施方式
[0027] 实施例1：重组表达质粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01的构建
[0028] 1、根据右旋糖酐蔗糖酶基因(dex-YG)序列和载体pET-28a-(+)的序列，借助Primer Primer5软件设计引物如下：
[0029] 上游引物选择BamH I作为酶切位点：
[0030] 5’-----CGCGGATCCATGCCATTTACAGAAAAAGT-----3’
[0031] 下游引物选择Hind III作为酶切位点：
[0032] 5’---CCCAAGCTTTTATTCTGTCGGTGTGCCA---3’；
[0033] 2、以右旋糖酐蔗糖酶基因(dex-YG)为模板，利用PCR扩增技术，得到含BamH I和Hind III酶切位点截短后的基因克隆片段；将上述的基因克隆片段用BamH I和Hind III酶切，酶切产品连接到载体pET-28a-(+)的双酶切位点上，得到重组表达质粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01：
[0034] ①利用PCR技术获得截短的基因片段：50μL的PCR反应体系分别加入10μL的Buffer、4μL的dNTP mixture、两种引物Primer各2.5μL、DNA模板2μL、28μL的ddH2O，最后加入1μL的polymerase。
[0035] ②利用PCR仪进行扩增，反应条件：变性
温度98℃，10s；
退火温度60℃，15s；延伸温度68℃，90s；以变性、退火、延伸过程为一个循环重复反应35个循环。
[0036] ③利用takara的胶回收
试剂盒对PCR扩增后截短片段进行纯化回收，将纯化回收后基因片段和空载pET-28a-(+)质粒载体分别用BamHI和HindIII在37℃条件下水浴2小时进行双酶切，混合后加入T4DNA连接酶16℃过夜进行酶连，构建重组表达质粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01。
[0037] 实施例2：右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/dex-YG-bMU01的构建
[0038] 1、从-70℃
冰箱中取200μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自北京全式金生物公司)悬液，置于冰上解冻。
[0039] 2、加入实施例1制备的重组表达质粒的溶液，每100ul感受态细胞加入20ng质粒DNA，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。
[0040] 3、42℃水浴中热激90秒，热激后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
[0041] 4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)混匀后，37℃培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗性基因。
[0042] 5、将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含抗生素的筛选平板上，
正面向上放置半小时，当菌液完全被培养基吸收后倒置培养基，37℃培养16-24小时。挑选阳性菌落，菌液PCR进行验证后，获得右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/dex-YG-bMU01。
[0043] 实施例3：右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/dex-YG-bMU01的表达
[0044] 将工程菌株BL21(DE3)/dex-YG按0.5％的接种量接种到含50μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中37℃培养16-18小时，转接到优化后的A培养基中37℃培养，当OD值达到2.0时加入1mmol/ml的IPTG进行诱导，4-5小时后，进行破碎离心，对所取样品做SDS-PAGE
电泳分析，所表达出的右旋糖酐蔗糖酶的蛋白分子量约为130KDa与预测值一致。
[0045] 所述A培养基中各组分及浓度为：甘油5g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，硝酸钾10g/L，Na2HPO4 12H2O 17.105g/L，KH2PO4 3g/L，NH4Cl 1g/L，MgSO4 7H2O 0.1mM/L。
[0046] 实施例4：基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG-bMU01发酵产酶
[0047] 将基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG-bMU01按0.5％的接种量接种到含有40～60μg/ml卡那霉素的LB培养基中，转速250r/min，35～40℃培养，培养16～18小时，从上述
种子培养液中吸取2mL菌液加入至200ml的A培养基中，放置于37℃下，220～240r/min(往复式)或者260～280r/min(回转式)摇床培养。当富集培养的菌液用蒸馏水稀释10倍后的OD600在0.20～0.24时(约3.5h之后)即可加入500μL IPTG开始诱导产酶，保持25℃，220～230r/min(往复式)或者250～260r/min(回转式)摇床诱导发酵4～6小时，将诱导发酵后的菌悬液在0℃下，6000r/min离心12～15min，一支离心管对应一瓶菌悬液，然后加入适量的蒸馏水振荡清洗，再次离心。向每支离心管中加入20mL的pH值5.4的醋酸-醋酸钙缓冲液震荡摇匀，外加冰水浴，超声破碎15min，离心分离，上清液即为粗酶液，酶活80-100U/mL。
[0048] 所述A培养基中各组分及浓度为：甘油5g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，硝酸钾10g/L，Na2HPO4 12H2O 17.105g/L，KH2PO4 3g/L，NH4Cl 1g/L，MgSO4 7H2O 0.1mM/L。
[0049] 实施例5：产品转化
[0050] 利用实施例4获得的右旋糖酐蔗糖酶粗酶液水解合成右旋糖酐，具体步骤为：
[0051] 1、酶反应体系配制：蔗糖100g，缓冲液800ml(pH5.4，5mmol/L的乙酸-乙酸钙缓冲液)。
[0052] 2、按2U/ml的比例加入右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。
[0053] 3、将上述混合液在25℃下搅拌反应24-28小时，催化获得右旋糖酐。
[0054] 4、将催化后的反应液进行过滤、醇沉洗涤、
真空干燥即可得到大分子右旋糖酐，该右旋糖酐的α(1-3)比例明显提升，溶解后的
粘度明显增加，絮凝效果得到改善。
[0055] 实施例6：絮凝效果
[0056] 1、称取1g的
高岭土溶于250ml的水中，搅拌使其呈浑浊状态。
[0057] 2、加入200μL的1mmol/ml的Al2(SO4)3和200μL的1mmol/ml的右旋糖酐溶液，快速搅拌1min，然后缓慢搅拌3min，静置10min。
[0058] 3、吸取一定量的上清液使用紫外分光光度计在550nm测量吸光值。
[0059] 絮凝率的计算公式F＝(A0-A)/A0×100％
[0060] 式中A0为高岭土混悬液吸光值，A为处理后上清液吸光值。絮凝率均达到90％以上。
