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微型药物递送装置及其制备方法

阅读：19发布：2020-05-12

专利汇可以提供微型药物递送装置及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种微型药物递送装置，所述微型药物递送装置包括：微管，和位于所述微管内的干化学推进剂和活性分子，其中，所述化学推进剂遇水发生反应释放出气体；所述活性分子在所述干化学推进剂释放出的气体的作用下能被发射出所述微管。本发明的微型药物递送装置具有生物相容性好，制备简单，方向可控，操作简单等优点，在药物递送领域具有良好的应用前景。，下面是微型药物递送装置及其制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种微型药物递送装置，其特征在于，所述微型药物递送装置包括：微管，和位于所述微管内的干化学推进剂和活性分子，其中，
所述干化学推进剂为固体分散体的形式，由有机酸和碱性碳酸盐构成，遇水发生反应释放出气体；
所述活性分子能在所释放出的气体的作用下被发射出所述微管。
2.根据权利要求1所述的微型药物递送装置，其特征在于，
所述有机酸是选自由柠檬酸、酒石酸、富马酸、己二酸、苹果酸或它们的混合物组成的组中的一种或多种，
所述碱性碳酸盐是选自由碳酸钙、碳酸镁、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铁、碳酸铜、碳酸锌、碳酸锰、碳酸铝、碳酸氢钙、碳酸氢镁、碳酸氢钠、碳酸氢钾或它们的混合物组成的组中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的微型药物递送装置，其特征在于，所述固体分散体的载体是选自由聚乙二醇、聚乙烯醇共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、聚乙烯醇或它们的混合物组成的组中的一种或多种。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的微型药物递送装置，其特征在于，所述微管的直径为0.1～20μm。
5.根据权利要求4所述的微型药物递送装置，其特征在于，所述微管的直径为0.1～
12.0μm。
6.根据权利要求4所述的微型药物递送装置，其特征在于，所述微管的直径为0.1～
10.0μm。
7.根据权利要求4所述的微型药物递送装置，其特征在于，所述微管通过层层自组装技术、电化学沉积法或化学镀法来构建。
8.根据权利要求1～3中任一项所述的微型药物递送装置，其特征在于，所述微管具有磁性粒子。
9.根据权利要求1～3中任一项所述的微型药物递送装置，其特征在于，所述活性分子包括药物或造影剂。
10.根据权利要求9所述的微型药物递送装置，其特征在于，所述活性分子被制成纳米微粒的形式。
11.一种制备如权利要求1～10中任一项所述的微型药物递送装置的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)构建微管；
2)装载活性分子；和
3)装载干化学推进剂，其中所述干化学推进剂为固体分散体的形式。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤1)中通过层层自组装技术、电化学沉积法或化学镀法来构建微管。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述微管的直径为0.1～20μm。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述微管的直径为0.1～12.0μm。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述微管的直径为0.1～10.0μm。
16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤3)包括在高温水浴中装载熔融状的干化学推进剂，装载完成后，立即置于冰水中冷却以形成固体分散体形式的干化学推进剂。

说明书全文

微型药物递送装置及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于药物递送领域。具体地，本发明涉及一种微型药物递送装置及其制备方法。

背景技术

[0002] 为了克服体内天然屏障，人们一直梦想着能有一种装置可以将装载的药物穿过屏障直接靶向递送到靶组织。微米或纳米球在尺寸上具有优势，可以高效地穿过组织或者屏障，尽可能地减少仪器或导管装置对身体造成的伤害，因此常常将药物包裹在微尺寸球中进行递送。

[0003] 为了进一步提高药物递送装置的效率和靶向性，人们为微尺寸球提供了递送药物的动力。目前，为微尺寸球提供动力的燃料可分为三大类：生物燃料、化学燃料、物理燃料。

[0004] 生物燃料指在真核生物内部含有多种具有特异性、高效性以及高能性的生物分子及其例如生物泵和分子马达等。纳米尺寸的分子马达是指由生物大分子构成，利用化学能进行机械做功的纳米系统，其动力来源于高能生物分子的自发性反应，例如三磷酸腺苷(ATP)的分解。通过分解ATP获得的能量可以使分子马达进行构象变化，从而实现线性或旋转运动，但缺点是它们在体外环境中寿命过短并且对于工作环境要求较高。

[0005] 物理燃料指利用外界能量源，如光、磁场、超声等释放能量进行机械做功。目前物理燃料的使用大都会涉及到金属材料的使用。Ibele等提出紫外线的照射下，氯化银粒子相互之间会发生反应，共同地向大微粒区域运动(Ibele M,Mallouk T E,Sen A.Schooling Behavior of Light-Powered Autonomous Micromotors in Water[J].Angewandte Chemie International Edition,2009,48(18):3308-3312.)。Gao等提出由金、银和镍组成纳米线，银经过过氧化氢处理使纳米线变得柔软，而金作为纳米线的头和镍作为纳米线的尾部可以在外源磁场操控下向前或向后运动(Gao W,Sattayasamitsathit S,Manesh K M,et al.Magnetically powered flexible metal nanowire motors[J].Journal of the American Chemical Society,2010,132(41):14403-14405.)。但物理材料存在制备过程复杂，可操控性不高等问题。

[0006] 化学燃料指通过化学反应释放能量进行机械做功。利用银催化剂(Mei Y,Huang G,Solovev A A,et al.Versatile approach for integrative and functionalized tubes by train engineering of nanomembranes on polymers[J].Advanced
Materials,2008,20(21):4085-4090.)、铂催化剂(Ismagilov R F,Schwartz A,Bowden N,et al.Autonomous movement and self-assembly[J].Angewandte Chemie
International Edition,2002,41(4):652-654.)，等将过氧化氢分解为水和氧气，产生的氧气气泡从催化剂表面喷出时所产生的反作用力可以推动整个装置的运动。Gao等提出了可以在强酸环境下进行自发运动的由聚苯胺(polyaniline，PANI)和锌组成的管状“纳米马达”(Gao W,Uygun A,Wang J.Hydrogen-Bubble-Propelled Zinc-Based Microrockets in Strongly Acidic Media[J].Journal of the American Chemical Society,2012,134
(2):897-900.)。以上化学燃料的驱动力都来源于气泡的反作用力且需要金属作为催化剂。
虽然产生气体作为动力不会产生有毒物质，但需要使用银铂等重金属，因此长期使用会沉积在体内造成损害，还会对生物环境造成一定影响。

[0007] 因此，为了解决上述问题，本发明构建了一种新型的药物递送装置，该药物递送装置使用层层自组装法制备的微管为管壁，制备成固体分散体的干化学分散剂为燃料，通过遇水产生气体的作用力，实现药物的靶向递送。

发明内容

[0008] 本发明的目的之一是提供一种新的微型药物递送装置。

[0009] 本发明的另一目的是提供制备本发明的微型药物递送装置的方法。

[0010] 在本发明的一个方面中，提供了一种微型药物递送装置，该微型药物递送装置可以包括：微管，和位于所述微管内的干化学推进剂和活性分子；其中，所述干化学推进剂遇水发生反应释放出气体；所述活性分子可以在所释放出的气体的作用下被发射出所述微管。

[0011] 在本文中，药物递送装置指在空间、时间及剂量上全面调控药物在生物体内分布的技术体系。其目标是在恰当的时机将适量的药物递送到正确的位置，从而增加药物的利用效率，提高疗效，降低成本，减少毒副作用。微型药物递送装置指直径小于100μm，优选小于90、80、70、60、50、40、30或20μm的药物递送装置。

[0012] 在本发明的微型药物递送装置中，所述微管可以通过现有技术中已知的技术来构建，例如可以通过层层自组装技术、电化学沉积法、化学镀法等，优选通过层层自组装技术来构建。

[0013] 在本文中，层层自组装技术(LbL)是基于静电作用依次吸附上带正负电荷聚电解质的分子自组装技术，通过静电相互作用在表面荷电的基材表面依次交替吸附上带正负电荷的聚电解质阴阳离子，以形成多种功能的超薄膜。在本发明的一个实施方式中，可以将模板，例如聚碳酸酯膜或聚氨酯膜交替浸入带正电和带负电的电解质溶液中，来实现层层自组装。例如，带正电的电解质溶液可以为壳聚糖溶液等；带负电的电解质溶液可以为海藻酸盐溶液等，例如为海藻酸钠。利用层层自组装技术来构建微管经一层层组装，可以控制管壁厚度以及内外直径，而且还可以通过组装相应的成分实现马达内外表面的功能化。

[0014] 本发明的微管具有两个端口，优选地，这两个端口直径存在差异，根据直径大小分别被称为小端口和大端口。

[0015] 本发明的微管的直径可以为0.1～20.0μm，例如可以为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、
15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0μm。优选地，本发明的微管的直径为0.1～12.0μm，更优选为0.1～10.0μm，最优选为5.0μm。

[0016] 在本发明的一个实施方式中，在微管的构建过程中，可以将磁性粒子通过静电吸引力组装到微管中，以实现外源磁场对于本发明的微型药物递送装置的运动方向的控制，使微型药物递送装置快速地指向靶向区域。进一步的，在本发明的微型药物递送装置的微管中，包括一层或多层磁性粒子。所述磁性粒子可以为带负电荷的磁性粒子或带正电荷的磁性粒子。所述磁性粒子的粒径可以为1～100nm，优选为1～50nm，最优选为20nm。所述磁性粒子优选为磁性纳米粒子。

[0017] 在本发明的微型药物递送装置中，所述干化学推进剂可以由有机酸和碱性碳酸盐构成。优选地，所述有机酸可以是选自由柠檬酸、酒石酸、富马酸、己二酸、苹果酸或它们的混合物组成的组中的一种或多种，最优选为柠檬酸。优选地，所述碱性碳酸盐可以是选自由碳酸钙、碳酸镁、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铁、碳酸铜、碳酸锌、碳酸锰、碳酸铝、碳酸氢钙、碳酸氢镁、碳酸氢钠、碳酸氢钾或它们的混合物组成的组中的一种或多种。

[0018] 在所述干化学推进剂中，有机酸与碱性碳酸盐的摩尔比可以为4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，或1:4，最优选为1:1。

[0019] 在本发明的另一实施方式中，所述干化学推进剂可以为固体分散体的形式。具体地，所述固体分散体的载体可以是选自由聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇共聚物、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、聚乙烯醇(PVA)或它们的混合物组成的组中的一种或多种。

[0020] 进一步地，所述固体分散体的载体与干化学推进剂的质量比可以为1.0～30.0，例如可以为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、24.0、25.0、26.0、27.0、28.0、29.0或30.0。
优选地，所述固体分散体的载体与干化学推进剂的质量比可以为3.0～7.0，最优选为5.0。

[0021] 在本发明的微型药物递送装置中，通过将干化学推进剂制备成固体分散体，有利于干化学推进剂在固体分散体中的装载，同时起到固定作用，而且产生速释效果。

[0022] 在本发明的微型药物递送装置中，所述活性分子可以包括药物或造影剂。优选地，所述活性分子可以包括蛋白质、糖类、核酸、脂质等。

[0023] 在本发明的一个实施方式中，所述活性分子可以被制成纳米粒的形式。

[0024] 优选地，所述活性分子可以被装载到凝胶中，以起到固定作用，方便装载于微管中。凝胶被递送至体内后，在正常体温下，逐渐变为溶胶态，这可以减小活性分子或纳米粒之间的摩擦力，便于干化学推进剂释放出气体后将活性分子发射出所述微管。

[0025] 图1中示出了根据本发明一个实施方式的微型药物递送装置的示意图，其中干化学推进剂被制成了固体分散体的形式。具体地，微型药物递送装置1包括微管111、固体分散体112和活性分子113。微管111中包括磁性纳米粒114，用于在磁场下控制药物递送装置的方向。固体分散体112内装载了干化学推进剂115。遇水后，固体分散体中的干化学推进剂115立即发生反应释放气体，利用作用力(例如反作用力)，将活性分子113发射出微管111。

[0026] 在本发明的另一方面中，提供了一种制备上述微型药物递送装置的方法，所述方法可以包括以下步骤：

[0027] 1)构建微管；

[0028] 2)装载活性分子；和

[0029] 3)装载干化学推进剂。

[0030] 在本发明的一个实施方式中，上述步骤1)中通过层层自组装技术、电化学沉积法、化学镀法来构建微管。所述微管的直径可以为0.1～20μm，优选为0.1～12.0μm，更优选为0.1～10.0μm。

[0031] 进一步地，上述步骤1)包括在微管内组装一层或多层磁性粒子。

[0032] 在本发明的又一实施方式中，在上述步骤3)中，所述干化学推进剂先被制备成固体分散体的形式，再被装载在所述微管中。

[0033] 所述固体分散体通过以下过程来制备：将碱性碳酸盐(例如碳酸氢钠)溶于水中，并与熔融的固体分散体的载体(例如PEG)混合，然后蒸干水份；将有机酸(例如柠檬酸)溶于无水乙醇中，将有机酸的乙醇溶液滴加到上述混合物中，然后挥干乙醇，即得到固体分散体形式的化学推进剂。

[0034] 之后，将固体分散体形式的化学推进剂置于高温水浴中，以熔融状态装载到所述微管中。装载完成后，立即置于冰水中冷却以在所述微管内形成固体分散体形式的干化学推进剂。

[0035] 通过以上制备过程，确保了有机酸与碱性碳酸盐在整个制备过程中不会在介质水中彼此接触，从而避免了有机酸与碱性碳酸盐过早地遇水发生反应释放出气体。

[0036] 如上文所述，本发明的微型药物递送装置基于气体动力的构想，利用有机酸和碱式碳酸(氢)盐遇水发生反应，生成并释放大量的二氧化碳气体，通过所产生的二氧化碳气体的作用力，将微型药物递送装置的微管中的活性分子发射出去。因此，本发明的微型药物递送装置不需要金属催化剂，只需遇水即能触发反应释放出气体，将活性分子发射出去，从而没有毒性，具有很好的生物相容性。更形象来讲，本发明的微型药物递送装置以活性分子为“子弹”，干化学推进剂为“燃料”，微管为“炮筒”，以水为天然无毒的“点火器”，实现了靶向发射。

[0037] 另外，本发明的微型药物递送装置的微管内含有磁性粒子，这样可以在外加磁场的引导下，控制微型药物递送装置的微管朝向，更好地实现了方向可控的靶向发射。

[0038] 综上，本发明的微型药物递送装置具有生物相容性好，制备简单，方向可控，操作简单等优点。附图说明

[0039] 图1示出了根据本发明一个实施方式的微型药物递送装置的示意图。

[0040] 图2示出了分别在扫描电镜和光学显微镜下观察到的根据本发明实施方式的微管的图像。A为微管的扫描电镜图；B为微管的扫描电镜的放大图；C为未装载磁性粒子的微管的光学显微镜图；D为装载有磁性粒子的微管的光学显微镜图。

[0041] 图3示出了装载有磁性粒子的微管在有磁场或无磁场情况下的图像。A：无磁场；B：微管处于磁感线向上；C：磁感线垂直于微管所处平面。

[0042] 图4示出了根据本发明实施方式的固体分散体的X射线衍射(XRD)图谱。A：柠檬酸；B：碳酸氢钠；C：PEG4000；D：柠檬酸、碳酸氢钠和PEG4000三者物理混合粉末；E：固体分散体形式的化学推进剂。

[0043] 图5示出了装载不同深度纳米粒的微管的激光共聚焦显微镜图像。A～C：干化学推进剂的装载时间为0s；D～F：干化学推进剂的装载时间为10s；G～I：干化学推进剂的装载时间为15s。

[0044] 图6示出了装载有干化学推进剂的微管和纳米粒混悬剂(NPs)在凝胶表面发射纳米粒的激光共聚焦显微镜图像。其中，在红通道(尼罗红)中的深灰色显示的是含尼罗红纳米粒。

[0045] 图7示出了装载有纳米粒和固体分散体的微管组、纳米粒混悬剂组和空白对照组在鼓膜中的纳米粒分布的激光共聚焦显微镜图像。

[0046] 图8示出了装载有纳米粒和固体分散体的微管组在鼓膜上发射纳米粒后，对鼓膜进行逐层扫描激光共聚焦显微镜图像。A～B为鼓膜的外上皮层；C～D为鼓膜的中间纤维组织；E～F为鼓膜的内皮层。

[0047] 图9示出了装载有纳米粒和固体分散体的微管组、纳米粒混悬剂组和空白对照组在圆窗膜中的纳米粒分布的激光共聚焦显微镜图像。

[0048] 图10示出了鼓膜和圆窗膜在经本发明的药物递送装置发射后的扫描电镜图(标尺：20μm)。A、C分别是鼓膜和圆窗膜的空白对照组；B、D分别是经装载有纳米粒和干化学推进剂(固体分散体形式)的微管组处理的鼓膜和圆窗膜。

[0049] 图11示出了本发明的药物递送装置和纳米粒混悬剂的跨圆窗膜的药代动力学差异。n＝6；***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05。

[0050] 图12示出了本发明的药物递送装置和纳米粒混悬剂的纳米粒在接收液中的药代动力学差异(n＝6；**P<0.01；*P<0.05)。

具体实施方式

[0051] 以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域技术人员来说，在不脱离本发明基本原理的前提下，可以做出若干改进，这些改进也视为在本发明的范围内。下面分通过具体实施方式对本发明进行详细说明。但是，应当理解，本发明并不限定于以下的具体实施方式。本发明的保护范围由权利要求书来定义，在其范围内，可以对本发明下述实施方式进行任意改变和组合。

[0052] 下面将结合具体实施例，进一步解释本发明。

[0053] 材料和方法

[0054] 1.微管的制备

[0055] 称取海藻酸钠0.1g和氯化钠0.59g于烧杯中，加入适量蒸馏水，溶胀30min，磁力搅拌加热至溶解，容量瓶定容至100mL，配置成浓度为1mg/mL的海藻酸钠溶液。将溶液存放于4℃环境，使用前先通过0.45μm孔径过滤膜过滤。

[0056] 称取壳聚糖0.1g于10mL EP管中，加入10mL 0.1％的醋酸溶液，溶胀30min，磁力搅拌至溶解，容量瓶定容至100mL，配置成1mg/mL的壳聚糖溶液。将溶液存放于4℃环境，使用前先通过0.45μm孔径过滤膜过滤。

[0057] 将5μm聚碳酸酯过滤膜模板分步交替浸入于带正电的壳聚糖溶液以及带负电的海藻酸钠溶液中各30min，以此作为一个双层。组装结束后，用二氯甲烷溶解模板，通过在3000rpm离心5min来收集微管，清洗10次后，相继分散于乙醇和水中后便可以得到最终的装载四氧化三铁纳米粒子的聚合物多层膜微管。

[0058] 2.带磁性粒子的微管的制备

[0059] 如上所述制备带正电的壳聚糖溶液以及带负电的海藻酸钠溶液，然后将5μm聚碳酸酯过滤膜模板分步交替浸入其中各30min，以此作为一个双层。在沉积10个双层后，组装四氧化三铁纳米粒子，然后再组装10个双层，最后以海藻酸钠作为最内层。组装结束后，用二氯甲烷溶解模板，用磁铁收集微管，清洗10次后，相继分散于乙醇和水中后便可以得到最终的装载四氧化三铁纳米粒子的聚合物多层膜微管。

[0060] 进一步地，可以在微管中组装两层四氧化三铁纳米粒子。即，在组装第一层四氧化三铁纳米粒子后，组装10个双层，再组装第二次四氧化三铁纳米粒子，最后以海藻酸钠作为最内层。这样制得装载两层四氧化三铁纳米粒子的聚合物多层膜微管。

[0061] 3.固体分散体形式的化学推进剂的制备

[0062] 为了提高干化学推进剂的溶出速率，并使其更快地发生酸碱中和反应，将干化学推进剂高度分散在高分子中作为固体分散体。具体制备方法如下。

[0063] 称取PEG4000 5g，加热熔融。称取一定量的碳酸氢钠，溶解于水中，与熔融了的PEG4000混合均匀，并蒸干水分。称取一定量柠檬酸，溶于无水乙醇，将无水乙醇缓慢逐滴加入到上述熔融物中，挥干无水乙醇，制成固体分散剂，并立即置于-20℃保存。为了考察不同质量比的碳酸氢钠与柠檬酸对释放气体速率的影响，分别称取不同量的碳酸氢钠(0.05g，0.105g，0.21g，0.42g)和不同量的柠檬酸(0.12g，0.24g，0.48g，0.96g)，将其依照上述方法制备成固体分散体。

[0064] 4.壳聚糖纳米粒的制备

[0065] 采取离子交联法制备壳聚糖纳米粒。

[0066] 将62.5mg壳聚糖溶解于25mL 1％的醋酸溶液中形成2.5mg/mL的壳聚糖溶液；电动器搅拌0.5h；用1mol/L氢氧化钠溶液调pH到5.3～5.5。将10mg多聚磷酸钠(TPP)溶解在10mL蒸馏水中形成1mg/mL的TPP溶液，同时将2mg尼罗红溶解于50μL吐温-80中，将两种溶液混合均匀。在搅拌的条件下，将得到的混合液逐滴滴加到壳聚糖溶液中，反应0.5h形成混悬剂。3000rpm离心10min，去除游离壳聚糖，即得壳聚糖纳米粒混悬剂。

[0067] 5.壳聚糖纳米粒和固体分散体形式的干化学推进剂在微管中的装载

[0068] 将如上制备的微管的聚碳酸酯膜模板适当剪裁后，将其置于可更换滤膜的过滤器中(直径13mm)。加载50℃呈溶胶状的壳聚糖纳米粒溶液，当滤头上下都有溶液时，即表明纳米粒充满整个微管内。然后，将装载有壳聚糖纳米粒的微管与固体分散体形式的干化学推进剂一起置于99℃水浴(干化学推进剂在该水浴中呈熔融状态)中，持续一定时间，进行干化学推进剂的装载。装载完成后，将其立即置于0℃冰水中冷却以使熔融状态的干化学推进剂形成固体分散体形式，从而制得装载有干化学推进剂和壳聚糖纳米粒的微管。将其置于4℃环境中保存备用。

[0069] 6.本发明的药物递送装置在凝胶中的发射实验

[0070] 配制40mg/mL的明胶溶液(天津市科密欧化学试剂有限公司)，在凝胶为溶液状态时将其滴于激光共聚焦皿底部，且尽可能的薄，然后置于4℃使凝胶凝固。之后，将装载含尼罗红的纳米粒和干化学推进剂的微管置于凝胶上。将37℃的水滴于微管表面，保持1min后去除微管，将凝胶保存于4℃备用。使用纳米粒混悬剂作为对照组，将其直接滴于凝胶表面。

[0071] 用激光共聚焦显微镜观察含尼罗红的纳米粒在凝胶中的发射情况。

[0072] 7.实验动物的处理

[0073] 使用购自南方医科大学实验动物中心的纯白红目豚鼠，品系FMMU，普通级，体重300～350g，鼓膜正常，耳廓反应灵敏。向豚鼠腹腔注射致死量的乌拉坦溶液(2.5g/kg)，断头取听泡，小心清理骨壁，暴露鼓膜。

[0074] 8.对鼓膜的处理

[0075] 将纳米粒混悬剂、装载有纳米粒和干化学推进剂(固体分散体形式)的微管置于鼓膜上，将37℃的水滴于微管表面，保持1min后去除微管。将鼓膜放于4％的多聚甲醛中固定2小时后，取出，放于PBS溶液中漂洗10min。之后，将鼓膜置于0.1％的Triton X-100溶液中通透20min；再置于含3％BSA(牛血清白蛋白)的0.1％Triton X-100溶液(其中含1％FITC-鬼笔环肽)中，染色50min。之后，再置于0.1％Triton X-100溶液中20min，随后置于PBS溶液中漂洗10min，洗去Triton X-100溶液。接下来置于DAPI中，染色20min，最后置于PBS中漂洗10min，洗去表面DAPI。在载玻片上滴加抗荧光猝灭剂进行铺片，封片后用激光共聚焦显微镜考察纳米粒在鼓膜中的发射情况。

[0076] 9.对圆窗膜的处理

[0077] 除使用圆窗膜进行纳米粒发射实验之外，其他实验步骤同“对鼓膜的处理”。

[0078] 10.对含尼罗红纳米粒跨圆窗膜的离体药代动力学测定

[0079] 豚鼠(FMMU)腹腔注射致死量乌拉坦溶液(2.5g/kg)，断头取听泡，小心清理骨壁，留下耳蜗，暴露圆窗膜。之后将装载有纳米粒(含尼罗红)和干化学推进剂(固体分散体形式)的微管置于圆窗膜上，将37℃水滴于模板表面，分别给药1、3、5、7、9、15、30min(n＝6)。同时以含尼罗红纳米粒组作为对照，给药剂量为2μL，给药时间同上。给药一定时间后，用毛细管刺破圆窗膜，抽取7μL的内耳外淋巴液(PL)。使用HPLC对所得PL进行分析。具体地，将所得的PL用50μL的乙腈稀释，5000rpm离心10min，取上清进样，进样量20μL(Ex＝543nm；Em＝
610nm；流动相为纯乙腈，流速为1mL/min)。

[0080] 11.对含尼罗红纳米粒跨鼓膜的离体药代动力学测定

[0081] 豚鼠(FMMU)腹腔注射致死量的乌拉坦溶液(2.5g/kg)，断头取听泡，小心清理骨壁，将鼓膜完整取出(仍与骨壁连接)，置于搭建的扩散池装置中，接收液为蒸馏水，温度37℃，转速500rpm。之后将装载好纳米粒和固体分散体的微管置于鼓膜上，滴加37℃水于模板表面，分别给药5、15、30min(n＝6)。在给药同时，将扩散池置于磁铁上，使鼓膜置于磁场中，同时以纳米粒混悬剂组作为对照，给药剂量为5μL，给药时间同上。给药一定时间后，将扩散池液体全部收集，于旋转蒸发仪上旋干，用300μL乙腈复溶，涡旋1min，5000rpm离心10min，0.2μm的有机膜过滤。HPLC测定样品中尼罗红含量(Ex＝543nm；Em＝610nm；流动相为纯乙腈，流速为1mL/min)。

[0082] 实施例

[0083] 实施例1.根据本发明的药物递送装置的表征

[0084] 1-1.对本发明的微管的形态检测

[0085] 使用扫描电镜Quanta 400F，在工作电压为20KeV的条件下，检测微管的形态。将一滴根据“1.微管的制备”所述制备的微管样品溶液滴于锡箔纸表面并在室温下避光晾干。将晾干的锡箔纸通过双面胶贴于样品台上，随后在减压条件下喷金。最后，在扫描电镜下对样品进行拍照。

[0086] 图2为分别在扫描电镜(图2A和2B)和光学显微镜(图2C和2D)下观察到的微管的形态。从中可以看出，微管具有明显的管状结构。长度在15μm左右，微管的直径约为5μm。从扫描电镜照片(图2A和2B)可以明显看出，微管两端管口直径存在差异，分为小口端和大口端。从光学显微镜的照片(图2C和2D)来看，微管的分散性良好。

[0087] 另外，装载四氧化三铁纳米粒的微管和未装载四氧化三铁纳米粒的微管(如根据“2.带磁性粒子的微管的制备”制备)在形态上无明显差异。

[0088] 1-2.根据本发明的带磁性粒子的药物递送装置在磁场中的方向控制

[0089] 将根据“2.带磁性粒子的微管的制备”所述制备的微管样品溶液滴于载玻片上，将磁铁放置于载玻片旁，并不断变化磁铁方位，利用装有摄像头的显微镜观察和记录微管的运动。

[0090] 图3为摄像机拍摄的微管在磁场中的方向控制。同针头一样，没有磁场时，微管为无序散乱状态(图3A)；将磁铁放置于载玻片一侧时，微管顺着磁感线统一排列(图3B)；将磁铁放置于载玻片上方，且磁感线垂直平面向外时，微管顺着磁感线方向全都站立起来(图3C)。

[0091] 从视频中可以看到，当磁铁置于载玻片上方时，实现方向控制的时间远远小于将磁铁置于侧面。推测原因可能是因为当磁铁置于侧面时，微管需要克服与载玻片的摩擦力，而置于上方时，微管要克服的是自身的重力，而需要克服的重力小于要克服的摩擦力。

[0092] 总之，通过上述结果，可以得出带有磁性粒子的微管在磁场控制下能够实现方向的统一控制。

[0093] 实施例2.对固体分散体形式的化学推进剂的表征

[0094] 使用X射线衍射法，分析PEG4000、柠檬酸、碳酸氢钠、三者物理混合物，以及如“3.固体分散体形式的化学推进剂的制备”所述制备的化学推进剂。

[0095] 将PEG4000、柠檬酸、碳酸氢钠、三者物理混合物以及如上所述制备的化学推进剂装入到Cu Kα管中进行测定。主要测定条件为：扫描速度为2θ/min；角度范围为3度到80度。通过X射线在样品中产生衍射，根据XRD图谱中的相关衍射特征峰的峰位有效鉴别样品的晶型。

[0096] 如图4所示，柠檬酸(图4A)与碳酸氢钠(图4B)谱图出现多个独立、尖锐的强衍射特征峰，说明柠檬酸与碳酸氢钠均为晶体形态，这可能是由于存在羧基使得分子链内或分子间存在氢键作用而具有结晶能力。PEG4000(图4C)谱图有两个尖而强的衍射特征峰，说明PEG4000有一定的结晶度。由于多相物质的衍射图谱是单相物质衍射图谱的简单叠加，而不会改变其它物质的衍射特征。如图4D所示，可以看出柠檬酸、碳酸氢钠和PEG4000三者物理混合之后，XRD图谱是之前图4A、4B、4C图谱的简单叠加，说明三者物理混合之后各晶型并没有发生变化，也没有发生化学键的结合或断裂。

[0097] 当柠檬酸与碳酸氢钠与PEG4000按照“3.固体分散体形式的化学推进剂的制备”所述的方法制备成固体分散体时，XRD图谱与PEG4000的XRD图谱一致。如图4D所示，可以看出在相同位置具有与PEG4000相同的两个强而尖锐的衍射特征峰，说明固体分散体中只有PEG4000还保留着晶型结构；而柠檬酸与碳酸氢钠的衍射特征峰消失，说明它们的分子结构已经从晶型转变为无定型。

[0098] 与晶型物质相比，无定型状态的物质分子排列杂乱无序，具有较大的表面能，表现出较大的溶解度。在物质从晶体状态转变为无定型状态的过程中，晶态物质的结晶颗粒从肉眼可见水平逐渐减小至原子水平(1～100nm)，因此柠檬酸和碳酸氢钠在制成固体分散体后粒径大大缩小。同时，制成固体分散体后，提高了柠檬酸和碳酸氢钠的溶出速率，使其更快地发生酸碱中和反应。

[0099] 实施例3.固体分散体的装载时间与在微管中的装载深度之间的关系

[0100] 按照“5.壳聚糖纳米粒和固体分散体形式的干化学推进剂在微管中的装载”所述装载壳聚糖纳米粒和干化学推进剂，其中干化学推进剂的装载持续时间不同(0、10、15s)。然后，通过激光共聚焦显微镜，检测了不同持续时间时，干化学推进剂在微管中的装载深度。

[0101] 结果示于图5中，因壳聚糖纳米粒含有尼龙红，图中深灰色显示的是含尼罗红的壳聚糖纳米粒。

[0102] 具体地，图5A～C示出干化学推进剂的装载时间持续0s，即未装载干化学推进剂；图5D～F示出干化学推进剂的装载时间持续10s；图5G～I示出干化学推进剂的装载时间持续15s。

[0103] 另外，图5A、D、G为微管的整体3D图；图5B、E、H为整体3D图的局部放大图；图C、F、I为激光共聚焦显微镜的15μm逐层扫描图，其中15张图所示的深度以1μm量逐层递增。

[0104] 从图5A、D、G所示的整体3D图可以看出，不装载干化学推进剂时(图5A)，纳米粒充满整个微管，纳米粒装载的深度为15μm；干化学推进剂的装载时间为10s时(图5D)，纳米粒装载的深度大部分在10μm左右；干化学推进剂的装载时间为15s时(图5G)，纳米粒装载的深度大部分在5μm左右。

[0105] 图5B、E、H可以更清晰地看到纳米粒装载的深度，同时图E和H可以看出含尼罗红的纳米粒集中于微管的上部，而干化学推进剂集中于微管的下部。

[0106] 这一结果也得到了逐层扫描图5C、F、I的证明。从图5C可以看出从上到下微管的直径逐渐增大，含尼罗红的纳米粒充满整个微管。与此相比，图5F和I可以看出，含尼罗红的纳米粒集中于微管的上部，随着深度逐渐增大，含尼罗红的纳米粒量逐渐减少，表明微管的下部装载有干化学推进剂。

[0107] 从上述结果可以得出，随着装载持续时间延长，含尼罗红的纳米粒的量变少，而干化学推进剂的量变多。从而证明了干化学推进剂的装载持续时间与装载深度呈正相关。

[0108] 实施例4.根据本发明的药物递送装置的发射穿膜实验

[0109] 4-1.评估根据本发明的药物递送装置在凝胶中的纳米粒的发射

[0110] 图6A示出了含尼罗红的纳米粒混悬剂(NPs)直接滴于凝胶表面后的分布情况。图6B示出了装载含尼罗红的纳米粒和干化学推进剂的微管，在凝胶中发射含尼罗红的纳米粒的结果。

[0111] 如图6A所示，在红通道(尼罗红)下纳米粒在凝胶表面分散均匀分布，从白通道看到凝胶表面是平整的。如图6B所示，从红通道(尼罗红)观察到纳米粒的分布是呈圆状聚集的，从白通道可以看到在对应纳米粒的地方，存在对应的圆形小坑。

[0112] 从这些结果，可以得出微管内干化学推进剂遇水后产生的气体能够提供动力，推动纳米粒发射到凝胶中。

[0113] 另外，碳酸氢钠和柠檬酸以不同质量比制备的固体分散体，对纳米粒的发射效果是类似的(数据未示出)。

[0114] 4-2.根据本发明的药物递送装置在鼓膜中发射纳米粒的情况

[0115] 1)使用激光共聚焦显微镜进行评估

[0116] 在装载有纳米粒和干化学推进剂的微管在鼓膜上发射纳米粒之后，用激光共聚焦显微镜观察纳米粒在鼓膜表面分布的情况。使用纳米粒混悬剂、未经处理的组作为空白对照。结果示于图7中。

[0117] 从图7的“微管”组可以看出，鼓膜上出现了类似之前凝胶上出现的现象，从白通道可以看到鼓膜上有被纳米粒冲击出的小坑；从红色通道(尼罗红)可以看出对应于小坑处存在荧光(红色)，这表明这些小坑是由于干化学推进剂遇水后，产生气泡，通过力的相互作用，推动含尼罗红的纳米粒在鼓膜上留下的“痕迹”；绿色通道(FITC)可以更加明显的看出一个个小洞(如图中箭头所示)，表明干化学推进剂确实推进了纳米粒在鼓膜上的运动。从小坑的厚度和大小来看，鼓膜上小坑的直径基本在5μm左右，与微管的直径相符，厚度为4μm左右，刚能够穿过上皮层，从而不会不对纤维层造成危害。

[0118] 与“微管”组相比，“纳米粒混悬剂(NPs)”组从白通道可以看出没有出现如“微管”组那样的小坑，从红通道看到荧光分散均匀分布。

[0119] 对于“空白”组，从白通道可以看出也没有出现如“微管”组那样的小坑，且从红通道未看到荧光。

[0120] 从这些结果，可以得出装载有纳米粒和固体分散体形式的干化学推进剂的微管中，干化学推进剂遇水反应释放出气体，将纳米粒发射出微管，在鼓膜表面造成孔洞。以这样的方式，完成纳米粒在鼓膜上的跨膜靶向给药。

[0121] 2)使用扫描激光共聚焦显微镜来评估

[0122] 使用扫描激光共聚焦显微镜，对上述经装载有纳米粒和干化学推进剂的微管处理的鼓膜进行逐层扫描，结果如图8所示。

[0123] 图8A～B示出了鼓膜的外上皮层。其中可以观察到含尼罗红的纳米粒(如箭头所示)。这说明微管在鼓膜上发射纳米粒后，存在于鼓膜的外上皮层，在上面造成直径约为5微米的孔洞。

[0124] 图8C～F示出了鼓膜的中间纤维组织，其中看不到类似上皮层孔洞的痕迹，也看不到含尼罗红的纳米粒。

[0125] 这些结果表明从微管发射出的纳米粒仅在鼓膜的外上皮层上造成直径约5微米的孔洞，但不会对中间纤维组织层造成伤害。

[0126] 4-3.根据本发明的药物递送装置在圆窗膜中发射纳米粒的情况

[0127] 本实验检测了装载有纳米粒和干化学推进剂(固体分散体形式)的微管组在圆窗膜中发射纳米粒的情况。结果示于图9中。

[0128] 在“微管”组中，从白色通道可以看到圆窗膜上也出现了被纳米粒冲击出的小坑；从红色通道(尼罗红)可以看出与小坑相对应的地方有含尼罗红的纳米粒(如箭头所示)出现。

[0129] 在“纳米粒混悬剂(NPs)”组中，可以明显看到由于给药时间非常短暂，纳米粒大部分滞留在圆窗膜表面。

[0130] 由此可以得出，经微管发射出纳米粒能够穿过圆窗膜进行给药，从而在跨膜靶向给药上具有明显优势。

[0131] 4-4.对上述经装载有纳米粒和干化学推进剂的微管处理之后的鼓膜和圆窗膜的结构的检测

[0132] 在本实验中，我们使用扫描电镜(SEM)对鼓膜和圆窗膜表面进行了观测，以进一步观察在经装载有纳米粒和干化学推进剂的微管发射纳米粒后，鼓膜和圆窗膜表面结构的变化。结果示于图10中。

[0133] 图10A、C分别是鼓膜和圆窗膜的空白对照组，图10B、D分别是经装载有纳米粒和干化学推进剂的微管组处理的鼓膜和圆窗膜。

[0134] 从图10A、C可以看出，未使用微管处理的鼓膜和圆窗膜表面均十分光滑，圆窗膜表面还可看到微绒毛的存在，且细胞间间隔较鼓膜清晰。从图10B、D可以看出，使用装载有纳米粒和干化学推进剂的微管处理之后，鼓膜和圆窗膜表面都可见到直径为5微米左右的小坑或孔洞，这证实了纳米粒发射成功，并在膜表面造成孔洞，从而实现纳米粒的跨膜给药。

[0135] 4-5.对纳米粒混悬剂和装载于微管中的纳米粒跨膜后在内耳外淋巴和接收液中的含量测定

[0136] 本实验分为两大组，分别为纳米粒混悬剂(NPs)组和装载有纳米粒和干化学推进剂的微管组，其中纳米粒均含游离尼罗红，且保证游离尼罗红的含量在两组之间是相同的。实验结果见下表1。

[0137] 对于纳米粒混悬剂(NPs)组，从表中可以看出，圆窗膜组和鼓膜组在内耳外淋巴或接收液中的含量都是极低的，甚至圆窗膜组的游离尼罗红溶液跨膜后其含量未能定量检测(在出峰时间处达到定性线，未达到定量线)。此结果表明纳米粒混悬剂组中，游离尼罗红纳米粒本身能穿过膜到达内耳外淋巴或接收液，但是量非常低。

[0138] 对于微管组，我们观察到游离尼罗红在内耳外淋巴或接收液中的含量普遍高于纳米粒混悬剂(NPs)组。这一结果再一次证明了干化学推进剂对于装载于微管上端的含尼罗红纳米粒具有推动作用，促进含尼罗红纳米粒跨膜进入内耳淋巴液或接收液。

[0139] 另一方面，从表中数据可以看出，装载于微管中的游离尼罗红在开始时穿过量较大，之后随着时间，穿过速度逐渐变慢。这说明微管的发射作用是快速而有效的。与此相比，NPs组中的游离尼罗红随时间始终以一定速率跨膜，推测其扩散方式应为被动扩散。

[0140] 表1.对内耳外淋巴和接收液中的游离尼罗红的含量测定

[0141]

[0142] 实施例5.对根据本发明的药物递送装置的离体药代动力学研究

[0143] 5-1.本发明的药物递送装置和纳米粒混悬剂的跨圆窗膜的药代动力学

[0144] 通过HPLC考察装载有纳米粒和干化学推进剂的微管在发射纳米粒后的跨圆窗膜的药代动力学特性。结果示于图11中。

[0145] 从图11可以看出，分别使用纳米粒混悬剂(NPs)组和装载有纳米粒和干化学推进剂的微管组对圆窗膜处理后，纳米粒在内耳外淋巴中的含量有显著性差异。微管组的纳米粒浓度明显高于NPs组。

[0146] 具体来讲，在短时间时，NPs组进入量非常低，而微管组的优势在于快速进入。从两组的数据可以看出，在刚开始的1min、3min、5min时，两组的差异性最大。随着时间的延长，差异性逐渐变小，说明了微管组与NPs组相比较，其最大的优势在于快速跨膜。同时，从纳米粒浓度上，可以看出微管组的进入量明显优于NPs组，

[0147] 从这些结果可以得出微管组在跨膜给药上具有明显的优势，大大提高了活性物质(纳米粒)在内耳外淋巴中的生物利用度。

[0148] 5-2.本发明的药物递送装置或纳米粒混悬剂在双驱动力作用下跨鼓膜的药代动力学

[0149] 鼓膜结构不同于圆窗膜。鼓膜的内皮层是紧密连接的，而圆窗膜下皮组织有一定空隙。本发明的药物递送装置经设计能够打穿上皮层，但在鼓膜中要打穿紧密连接的内皮层仍有一定困难。为了克服这一问题，发明人使用了带有磁性粒子的微管来装载纳米粒和固体分散体形式的干化学推进剂，同时增加了磁场，以为微管中的纳米粒进行二次加速，帮助纳米粒跨膜。

[0150] 在本实施例中，为了研究本发明的药物递送装置在干化学推进剂和磁场的双重驱动力作用下发射纳米粒穿过鼓膜的优势，采用了5种给药方式：1)纳米粒混悬剂(NPs)加磁；2)纳米粒混悬剂(NPs)不加磁；3)微管不加磁；4)微管加磁；和，5)微管加双磁，其中在刚开始给药时，就有磁场存在，以探究干化学推进剂和磁场是否具有协同作用。使用HPLC对含尼罗红纳米粒跨鼓膜的药代动力学进行了测定，分别检测了在这5种给药方式下，接收液中的纳米粒的浓度。结果示于图12中。

[0151] 从图12中可以看出，对于1)NPs不加磁组和2)NPs加磁组，两组相比接收液中的纳米粒浓度无显著性差异。与1)NPs不加磁组和2)NPs加磁组相比，3)微管不加磁组和4)微管加磁组在5、15和30min时均有显著性差异，这说明微管内的干化学推进剂推动了纳米粒跨鼓膜转运。此外，3)微管不加磁组与4)微管加磁组之间在15min时有显著性差异，在5min和30min时，这两组之间虽无显著性差异，但数值差别较大，这表明在干化学推进剂和磁场双重递进作用力下，进一步提高了纳米粒跨鼓膜转运。另外，4)微管加磁组和5)微管加双磁组相比，两者无明显差异，说明磁场作用力在干化学推进剂打通鼓膜上表皮时的作用不明显，分析其主要原因可能是干化学推进剂发挥作用的时间短暂，大约为1min左右，故磁场发挥的作用力不大。

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