技术领域
[0001] 本
发明涉及
土壤修复领域，具体地涉及一种植物微生物联修复重金属污染土壤的方法。
背景技术
[0002] 土壤重金属污染具有污染物在土壤中移动性差、滞留时间长、自然降解慢的特点，并可经
水、植物等介质最终影响人类健康。历史上发生的“骨痛病”和“水俣病”就是由于重金属污染而致病的典型案例。镍污染是由镍或其化合物所引起的环境污染，镍元素可以在土壤中富集，土壤中的镍主要来源于大气降尘、含镍
废水、农田
施肥、植物和动物残体的腐烂等。含镍化合物有潜在致癌
风险，并对
农作物生长有一定抑制作用。
[0003] 日前针对土壤重金属污染的修复方法主要有物理修复、
化学修复、农业生态修复等。物理修复主要包括
电动修复以及电热修复，化学修复主要为土壤热淋，由于物理修复及化学修复方法均有一定
缺陷，
植物修复及植物-微生物联合修复成为重金属污染土壤修复方法的研究热点。
[0004] 植物根分泌物包括溢泌物、分泌物、粘胶质、分解物和脱落物，从组分上包括各种糖类、
有机酸和
氨基酸等。根分泌物主要通过改变
根际环境pH值和
氧化还原电位以及重金属的化学性质，改变污染土壤中金属元素的形态和活性或者鳌合、
吸附、包埋根际中某些游离重
金属离子，降低重金属污染物在土壤中的流动性。
[0005] 本发明提供一种植物与微生物联合修复系统，通过所选植物与微生物复合菌剂的相互配合，组成稳定的生态修复系统，利用牧草及其根际环境微生物体系的吸收、转化的作用，能够有效降解或富集污染土壤中的镍，实现对土壤的有效修复。
发明内容
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种植物微生物联修复重金属污染土壤的方法。
[0007] 本发明是以如下技术方案实现的：
[0008] 为实现上述目的，本发明提供一种植物微生物联合修复
土壤污染的方法，所述方法包括在镍污染土壤上种植牧草，像牧草根部注射复合微生物菌剂。
[0009] 进一步地，所述方法包括：
[0010] 步骤1、在镍污染土壤上种植牧草，所述牧草优选地为黑麦草；
[0011] 步骤2、向黑麦草根部均匀注射所述复合微生物菌剂，待黑麦草生长的平均株高距地面5～8cm后，再次向黑麦草土壤际根注射复合微生物菌剂；
[0012] 步骤3、所述复合微生物菌剂中各菌种的接种量以百分比计为：球形红细菌4.5％，类黄氢噬胞菌10％，中华屈挠杆菌6.7％，
脱硫弧菌9％，小单孢菌2％、木薯菌1.5％、假单胞菌3.2％。
[0013] 步骤4、所述复合微生物菌剂的制备步骤为：将球形红细菌、类黄氢噬胞菌、中华屈挠杆菌、脱硫弧菌、小单孢菌、木薯菌、假单胞菌分别进行振荡培养，将上述菌株接种到液体培养基中，28℃振荡培养对数生长期，将菌液转移至无菌离心瓶中离心，收集菌体，并用去离子水反复清洗，最终将离心出的菌体用无菌去离子水洗净后稀释至OD600≈1.0，将菌体按照微生物复合菌的配比方式进行混合，得到复合微生物菌剂。
[0014] 更进一步地，所述复合微生物菌剂中各菌种的接种量以百分比计为：球形红细菌15.5％、类黄氢噬胞菌9％、中华屈挠杆菌3.1％、脱硫弧菌5％、小单孢菌1.5％、木薯菌
8.5％、假单胞菌2.5％。
[0015] 进一步地，所述菌种按照以下方法活化：
[0016] 步骤1、安瓿管开封：用浸过70％酒精的
脱脂棉擦净安瓿管；用火焰将安瓿管顶端加热；滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂；用锉刀或
镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。
[0017] 步骤2、菌株恢复培养：用无菌吸管，吸取0.3-0.4ml适宜的液体培养基，滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状；取约0.2ml菌体悬浮液，移植于
指定的琼脂斜面培养基上，剩余的菌液，注入指定的液体培养基内(3-4ml)，然后在建议的
温度下培养。
[0018] 步骤3、注意事项：菌种活化前，请将安瓿管保存在5-10℃的环境下；厌氧菌的培养，如无特别说明，自开封至接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态；某些菌种经过
冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。
[0019] 优选地，所述牧草选自麦草、冬牧、黑麦草、苦荬菜、白三叶、鸡脚草、菊苣、鲁梅克斯、紫花苜蓿、芜菁甘蓝。
[0020] 本发明的有益效果是：
[0021] 本发明提供一种植物-微生物联修复重金属污染土壤的方法，通过所选植物与复合微生物菌剂的相互配合，组成稳定的生态修复系统，利用牧草及其根际环境微生物体系的吸收、转化的作用，有效降解和富集污染土壤中的镍，以实现对土壤的有效修复。
附图说明
[0022] 图1是黑麦草与复合微生物菌剂降解土壤镍污染示意图。
具体实施方式
[0023] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
[0024]
实施例1：具有降解功能的微生物的选取
[0025] 球形红细菌Rhodobacter sphaeroides属于光合细菌紫色非硫菌群的红细菌属，球形红细菌是具有原始光能合成体系的原核微生物，兼性厌氧细菌，可以随着生存环境灵活地改变代谢类型，中国普通微生物菌种保藏管理中心可以提供，购买号CGMCC.14736。
[0026] 类黄氢噬胞菌Hydrogenophaga flava产生非
水溶性黄色素，好氧，兼性嗜氢自养菌，以氧为末端
电子受体的氧化型的糖代谢，具有厌氧
硝酸盐呼吸，具反
硝化作用。能在含有机酸、氨基酸或蛋白胨的培养基上良好生长，但很少利用
碳水化合物，中国普通微生物菌种保藏管理中心可以提供，购买号CGMCC.58473。
[0027] 中华屈挠杆菌Flexibacter chinenses，细胞有时聚集成团，兼性厌氧，革兰氏阴性，无内生芽孢及其它形式的休眠细胞，
滑行运动，能利用多种糖类作为碳源但不分解琼脂、几丁质和
纤维素。对固氮蓝藻营养细胞有溶解能
力。对
四环素以外的多种抗菌素均具有相当强的耐受性，模式株FCA中国科学院水生生物研究所可提供，购买号CGMCC.75673。
[0028] 脱硫弧菌Desulfovibrio desulfuricans，革兰氏阴性，专性厌氧，不产芽孢，弯曲或螺旋杆状。存在于土壤中，可还原态硫化物进行厌氧呼吸。中国普通微生物菌种保藏管理中心可以提供，购买号CGMCC.36984。
[0029] 除上述细菌外，还添加小单孢菌、木薯菌、假单胞菌(市售菌株)。
[0030] 实施例2：微生物复合菌剂的制备
[0031] 用下列方法恢复培养CGMCC冷冻干燥的菌种：
[0032] a.安瓿管开封：用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管；用火焰将安瓿管顶端加热；滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂；用锉刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。
[0033] b.菌株恢复培养：用无菌吸管，吸取0.3-0.4ml适宜的液体培养基，滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状；取约0.2ml菌体悬浮液，移植于指定的琼脂斜面培养基上，剩余的菌液，注入指定的液体培养基内(3-4ml)，然后在建议的温度下培养。
[0034] c.注意事项：菌种活化前，请将安瓿管保存在5-10℃的环境下；厌氧菌的培养，如无特别说明，自开封至接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态；某些菌种经
过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。
[0035] 所述微生物复合菌剂中各菌种的接种量以百分比计为：球形红细菌4.5％，类黄氢噬胞菌10％、中华屈挠杆菌6.7％、脱硫弧菌9％、小单孢菌2％、木薯菌1.5％、假单胞菌3.2％，余量由生理盐水或LB液体培养基补足。或所述微生物复合菌中各菌种的接种量以百分比计为：球形红细菌15.5％、类黄氢噬胞菌9％、中华屈挠杆菌3.1％、脱硫弧菌5％、小单孢菌1.5％、木薯菌8.5％、假单胞菌2.5％，余量由生理盐水或LB液体培养基补足。
[0036] 将上述菌种分别进行振荡培养，菌株接种到液体培养基中，28℃振荡培养对数生长期，将菌液转移至无菌离心瓶中离心，收集菌体，并用去离子水反复清洗，最终将离心出的菌体用无菌去离子水洗净后稀释至OD600≈1.0，将菌体按照复合微生物菌的配比方式进行混合，得到复合微生物菌剂。
[0037] 实施例3：植物-微
生物降解系统的构建
[0038] 在镍污染土壤中
播种黑麦草，待黑麦草出苗后，向黑麦草根部均匀注射实施例1所述复合菌微生物菌剂，待牧草生长的平均株高距地面5～8cm后，再次向土壤际根均匀注射复合微生物菌剂(采用五点法分孔注射微生物复合菌)。通过牧草与微生物复合菌的联合作用，实现对镍污染土壤的修复工作。微
生物群落可以加强牧草对
环境胁迫的抗性，提高黑麦草的生物量，同时还能通过生理代谢产生小分子物质来活化土壤中重金属，提高重金属的生物有效性，而黑麦草可以分泌营养物质或小分子物质促进微生物生长，从而使得植物-微生物系统联合修复土壤重金属污染效果显著提升。
[0039] 实施例4：植物-微生物降解系统的降解效果检测
[0040] 取放置有镍污染土壤1000g的花盆10个，编号为Q1-Q9号，剩余一个为CK，检测初始镍浓度并记录，向花盆中分别接种黑麦草5株，Q1-Q9号盆按实施例2所述方法注射复合微生物菌剂，培养90天，第30天检测Q1-Q3号盆的镍浓度，取平均值；第60检测Q4-Q6号盆的镍浓度，取平均值；第90检测Q7-Q9号盆的镍浓度，取平均值；检测结果如表1及图1所示，检测结果表明，黑麦草与复合微生物菌剂的联合使用可以有效降解或富集土壤中的镍元素。
[0041] 表1黑麦草与复合微生物菌剂降解效果测试结果
[0042]
[0043] 以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明
权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
