4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸的结晶形式及其制备方法
阅读：1030发布：2020-07-05
专利汇可以提供4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸的结晶形式及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 总体上涉及 治疗 化合物的领域，且更具体地涉及4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯 甲酸 (本文称为“BHBA-001”)的结晶形式，所述化合物特别地是一种(选择性的)视黄酸受体β(RARβ)(例如RARβ2)激动剂。本发明还涉及包含此类结晶形式的药物组合物，以及此类结晶形式和组合物在体外和体内(选择性地)活化RARβ(例如RARβ2)以引起或促进神经突发育、神经突生长和/或神经突再生的用途，以及此类结晶形式和组合物在治疗由RARβ(例如RARβ2)介导的 疾病 和病症、通过活化RARβ(例如RARβ2)得以改善的疾病和病症等，包括例如神经系统损伤诸如脊髓损伤中的用途。，下面是4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸的结晶形式及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸的结晶形式，其中所述结晶形式是形式4。
2.根据权利要求1所述的结晶形式，其具有X射线粉末衍射，所述X射线粉末衍射显示出至少在14.8°±0.2°的特征散射角(2θ)。
3.根据权利要求1所述的结晶形式，其具有X射线粉末衍射，所述X射线粉末衍射显示出至少在14.8°±0.2°和20.7°±0.2°的特征散射角(2θ)。
4.根据权利要求1所述的结晶形式，其具有X射线粉末衍射，所述X射线粉末衍射显示出至少在14.8°±0.2°、20.7°±0.2°和9.5°±0.2°的特征散射角(2θ)。
5.根据权利要求1所述的结晶形式，其具有X射线粉末衍射，所述X射线粉末衍射显示出至少在14.8°±0.2°、20.7°±0.2°、9.5°±0.2°和16.4°±0.2°的特征散射角(2θ)。
6.根据权利要求1所述的结晶形式，其具有X射线粉末衍射，所述X射线粉末衍射显示出至少在14.8°±0.2°、20.7°±0.2°、9.5°±0.2°、16.4°±0.2°、13.1°±0.2°、24.6°±0.2°、
26.7°±0.2°和21.0°±0.2°的特征散射角(2θ)。
7.根据权利要求1所述的结晶形式，其具有X射线粉末衍射，所述X射线粉末衍射显示出至少在14.8°±0.2°、20.7°±0.2°、9.5°±0.2°、16.4°±0.2°、13.1°±0.2°、24.6°±0.2°、
26.7°±0.2°、21.0°±0.2°、14.4°±0.2°、12.4°±0.2°、12.7°±0.2°和28.1°±0.2°的特征散射角(2θ)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的结晶形式，其具有X射线粉末衍射，其中在17.0°±0.2°和20.0°±0.2°之间的特征散射角(2θ)处的任何峰的峰强度小于最强峰的约2％。
9.根据权利要求1所述的结晶形式，其具有基本上如图9中所示的X射线粉末衍射。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的结晶形式，其具有差示扫描量热法热谱图，所述差示扫描量热法热谱图包括在约268±4℃处发生的吸热。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的结晶形式，其具有基本上如图10中所示的差示扫描量热法热谱图。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的结晶形式，其具有热重分析热谱图，所述热重分析热谱图显示在40±4℃和100±4℃之间重量损失小于约0.5％。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的结晶形式，其具有基本上如图11中所示的热重分析热谱图。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的结晶形式，其具有基本上如图12中所示的动态蒸汽吸附吸附-解吸曲线。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的结晶形式，其具有基本上如图13中所示的动态蒸汽吸附质量吸收曲线。
16.一种组合物，其包含根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
17.根据权利要求16所述的组合物，其基本上不含4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-
1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸的其他结晶形式。
18.根据权利要求16所述的组合物，其中在所述整体组合物中(a)4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸的其他结晶形式(例如，形式1、2和3)的总重量与(b)4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸的结晶形式4的重量的比率小于约1:10。
19.一种制备组合物的方法，所述方法包括将根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。
20.一种制备根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式的方法，所述方法依序包括以下步骤：
(a)加热4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸和乙醇的混合物；
(b)冷却所述混合物；以及
(c)从所述混合物中分离所述结晶形式。
21.根据权利要求20所述的方法，其中4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸和乙醇的所述混合物是固体4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸和乙醇的混合物(例如，浆液)。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述加热在约40℃至所述混合物的回流温度(例如，约78℃)的温度下进行。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述加热持续约30分钟至约24小时(例如，约2小时)的时间。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述冷却是冷却至约5℃至约30℃(例如，约20℃)的温度。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其中在所述冷却之后进行(b’)老化所述冷却的混合物的步骤。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述老化持续约30分钟至约24小时(例如，约1小时)的时间。
27.一种在体外或体内活化视黄酸受体β(RARβ)的方法，所述方法包括使RARβ与有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式或从根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式获得的4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸接触。
28.一种在体外或体内相对于RARα和/或RARγ选择性地活化视黄酸受体β(RARβ)的方法，所述方法包括使RARβ与有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式或从根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式获得的4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,
2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸接触。
29.一种在体外或体内在神经元细胞中活化视黄酸受体β(RARβ)的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式或从根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式获得的4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-
3-基)苯甲酸接触。
30.一种在体外或体内在神经元细胞中选择性地活化视黄酸受体β(RARβ)的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式或从根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式获得的4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸接触。
31.一种引起或促进神经突发育、神经突生长和/或神经突再生的方法，所述方法包括在体外或体内使神经元与有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式或从根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式获得的4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,
4-噁二唑-3-基)苯甲酸接触。
32.根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式，其用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中。
33.根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式，其用于治疗以下的方法中：
神经系统损伤；
中枢神经系统(CNS)损伤；
周围神经系统(PNS)损伤；
神经损伤；
PNS神经损伤；
CNS神经损伤；
脊髓损伤；
由创伤引起的脊髓损伤；
视神经损伤；
由青光眼引起的视神经损伤；
神经病变；
PNS神经病变；
CNS神经病变；
脊髓神经病变；
视神经病变；
糖尿病性神经病变；
AIDS性神经病变；
麻风性神经病变；
周围神经病变；
多发性神经病变、单发性神经病变、多发性单神经炎或自主神经病变；
神经退化性病症；
认知障碍、记忆损害、记忆缺失、老年性痴呆、阿尔茨海默病、早期阿尔茨海默病、中期阿尔茨海默病、晚期阿尔茨海默病、认知损害或轻度认知损害；
亨廷顿氏病；
帕金森氏病；
运动神经元疾病；
局部麻痹；
贝耳氏麻痹；
神经性阳痿；
由根治性前列腺切除术后神经创伤引起的神经性阳痿；
麻痹；
单瘫、四肢瘫或截瘫；
由神经系统损伤引起的神经系统病症；
由神经病变引起的神经系统病症；或
神经病变引起的神经系统损伤。
34.根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式在制造用于治疗以下的药物中的用途：
神经系统损伤；
中枢神经系统(CNS)损伤；
周围神经系统(PNS)损伤；
神经损伤；
PNS神经损伤；
CNS神经损伤；
脊髓损伤；
由创伤引起的脊髓损伤；
视神经损伤；
由青光眼引起的视神经损伤；
神经病变；
PNS神经病变；
CNS神经病变；
脊髓神经病变；
视神经病变；
糖尿病性神经病变；
AIDS性神经病变；
麻风性神经病变；
周围神经病变；
多发性神经病变、单发性神经病变、多发性单神经炎或自主神经病变；
神经退化性病症；
认知障碍、记忆损害、记忆缺失、老年性痴呆、阿尔茨海默病、早期阿尔茨海默病、中期阿尔茨海默病、晚期阿尔茨海默病、认知损害或轻度认知损害；
亨廷顿氏病；
帕金森氏病；
运动神经元疾病；
局部麻痹；
贝耳氏麻痹；
神经性阳痿；
由根治性前列腺切除术后神经创伤引起的神经性阳痿；
麻痹；
单瘫、四肢瘫或截瘫；
由神经系统损伤引起的神经系统病症；
由神经病变引起的神经系统病症；或
由神经病变引起的神经系统损伤。
35.一种治疗以下的方法：
神经系统损伤；
中枢神经系统(CNS)损伤；
周围神经系统(PNS)损伤；
神经损伤；
PNS神经损伤；
CNS神经损伤；
脊髓损伤；
由创伤引起的脊髓损伤；
视神经损伤；
由青光眼引起的视神经损伤；
神经病变；
PNS神经病变；
CNS神经病变；
脊髓神经病变；
视神经病变；
糖尿病性神经病变；
AIDS性神经病变；
麻风性神经病变；
周围神经病变；
多发性神经病变、单发性神经病变、多发性单神经炎或自主神经病变；
神经退化性病症；
认知障碍、记忆损害、记忆缺失、老年性痴呆、阿尔茨海默病、早期阿尔茨海默病、中期阿尔茨海默病、晚期阿尔茨海默病、认知损害或轻度认知损害；
亨廷顿氏病；
帕金森氏病；
运动神经元疾病；
局部麻痹；
贝耳氏麻痹；
神经性阳痿；
由根治性前列腺切除术后神经创伤引起的神经性阳痿；
麻痹；
单瘫、四肢瘫或截瘫；
由神经系统损伤引起的神经系统病症；
由神经病变引起的神经系统病症；或
由神经病引起的神经损伤；
所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式或从根据权利要求1至15中任一项所述的结晶形式获得的4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸。
4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯
甲酸的结晶形式及其制备方法
[0001] 相关申请
技术领域
[0003] 本发明总体上涉及治疗化合物的领域，且更具体地涉及4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸(本文称为“BHBA-001”)的结晶形式，所述化合物特别地是一种(选择性的)视黄酸受体β(RARβ)(例如RARβ2)激动剂。本发明还涉及包含此类结晶形式的药物组合物，以及此类结晶形式和组合物在体外和体内(选择性地)活化RARβ(例如RARβ2)以引起或促进神经突发育、神经突生长和/或神经突再生的用途，以及此类结晶形式和组合物在治疗由RARβ(例如RARβ2)介导的疾病和病症、通过活化RARβ(例如RARβ2)得以改善的疾病和病症等，包括例如神经系统损伤诸如脊髓损伤中的用途。技术背景
[0004] 本文引用了许多专利和出版物，以便更全面地描述和公开本发明以及本发明所属领域的现有技术。这些参考文献中的每一篇均以引用方式整体并入本公开，其程度如同每个单独的参考文献被具体和单独地指出以引用方式并入。
[0005] 在整个说明书，包括随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变化将被理解为意指包括所述整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。
[0006] 必须指出，除非上下文另外明确地规定，否则如在说明书和所附权利要求书中使用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提到“药物载体”包括两种或更多种此类载体的混合物等。
[0007] 在本文中，范围可以表示为从“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。当表示这种范围时，另一个实施方案包括从一个具体值和/或至另一个具体值。类似地，在通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解具体值形成另一个实施方案。
[0008] 本公开包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术，或与目前要求保护的发明有关，或并不承认明确地或隐含地引用的任何公布是现有技术。
[0009] 神经损伤
[0010] 到目前为止尚无有效的用于治疗神经损伤，包括脊髓损伤(SCI)、中风和周围神经损伤的方法。本发明人已鉴定出一种新的信号传导机制-类视色素信号传导通路-该通路可以在神经损伤模型中被刺激，从而引起轴突生长和功能恢复。参见，例如，Maden and Corcoran，2000。该通路通过视黄酸(RA)与视黄酸受体(RAR)结合而活化，视黄酸受体在细胞核中起作用驱动RNA的合成，并因此产生用于轴突生长的蛋白质。本发明人已证实了RARβ2亚型特异性地参与此过程。
[0011] 类视色素信号传导和神经突生长
[0012] 至少有三个原因可以解释脊髓损伤后中枢神经系统(CNS)神经元轴突生长缺乏。第一：存在生长抑制分子，包括Nogo-A、髓鞘相关糖蛋白(MAG)和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(Omgp)(参见，例如，He和Koprivica，2004)。第二：促生长因子不足，促生长因子以能够在体外促进神经突生长以及在施用于受损神经索时诱导一些轴突生长而著称(参见，例如，Schnell等人，1994；Lu等人，2004)。第三：受损神经元缺乏适当的“生长计划”(参见，例如，Kwon和Tetzlaff，2001)。可以诱导这种生长计划的一种因素是RA信号传导(参见，例如，Quinn和De Boni，1991)。RA信号传导由RAR和类视色素X受体(RXR)介导，这两者都具有三种亚型(α、β和γ以及各种同种型)(参见，例如，Bastien和Rochette-Egly，2004)。当RA结合RAR/RXR异源二聚体时发生转录，然后RAR/RXR异源二聚体结合位于靶基因调控区中的视黄酸反应元件(RARE)(参见，例如，Bastien和Rochette-Egly，2004)。
[0013] RARβ2信号传导介导神经突生长
[0014] 类视色素信号传导对于胚胎的发育很重要。当神经系统在发育期间失去RA时，在例如缺乏RA的胚胎中无法实现神经突生长(参见，例如，Maden等人，1996；White等人，1998)。通过使用一组RAR激动剂，本发明人已证实了RARβ信号传导是神经元的类视色素介导的神经元生长所必需的，而RARα或RARγ信号传导没有作用(参见，例如，Corcoran等人，
2000)。更具体地说，是RARβ2的活化介导了这种作用(参见，例如，Corcoran等人，2000)，并且这是由其配体自动调控的(参见，例如，Leid等人，1992)。类视色素活化RARβ2使得培养的胚胎背根神经节(DRG)、脊髓和成体DRG的神经突生长(参见，例如，Corcoran等人，2000；
Corcoran和Maden，1999；So等人，2006；Corcoran等人，2002)。当RARβ2被转导到培养的成年啮齿动物脊髓外植体(其通常不表达此受体)中时，发生神经突生长(参见，例如，Corcoran等人，2002)。
2000)。更具体地说，是RARβ2的活化介导了这种作用(参见，例如，Corcoran等人，2000)，并且这是由其配体自动调控的(参见，例如，Leid等人，1992)。类视色素活化RARβ2使得培养的胚胎背根神经节(DRG)、脊髓和成体DRG的神经突生长(参见，例如，Corcoran等人，2000；
Corcoran和Maden，1999；So等人，2006；Corcoran等人，2002)。当RARβ2被转导到培养的成年啮齿动物脊髓外植体(其通常不表达此受体)中时，发生神经突生长(参见，例如，Corcoran等人，2002)。
[0015] RARβ2信号传导介导轴突生长
[0016] RARβ信号传导在轴突生长中的重要性的测试是在基因缺失的RARβ缺陷型小鼠中进行的。与在DRG神经元中表达RARβ2的正常小鼠相比，在周围神经压迫模型中轴突生长被阻碍(参见，例如，Corcoran和Maden，1999；So等人，2006)。
[0017] 此外，通过在脊髓损伤模型中过表达RARβ2可以证明RARβ2表达对于体内轴突生长是必需的。在啮齿动物撕脱模型(其中周围感觉轴突的轴突受损导致前肢麻痹)中，RARβ2过表达到受损DRG的神经元中使得轴突生长穿过背根入髓区(DREZ)并返回到脊髓中，引起功能恢复(参见，例如，Wong等人，2006)。
[0018] 另一种脊髓损害模型是切断皮质脊髓束(CST)的模型。这些CST神经元的细胞体位于大脑中。CST形成脊髓背柱中的主要下行通路，它们受伤害导致某些运动任务的功能损害。可以通过压迫啮齿动物的C4位脊髓来实现CST损害。这致使前肢功能丧失。近来，已证明在成体CST神经元中通过慢病毒载体过表达RARβ2引起CST轴突生长和前肢功能恢复(参见，例如，Yip等人，2006)。
[0019] 本发明人现已证实，RARβ激动剂可能可用于治疗神经损伤。RARβ激动剂在神经损伤模型中引发轴突生长，因此功能得以恢复。在以下实例中更详细地描述了表明这些发现的研究。
[0021] Kikuchi等人，2000描述了某些据称具有RARα激动剂活性的四氢-四甲基-2-喹喔啉化合物。
[0022] Yoshimura等人，2000描述了某些据称具有RARα激动剂活性的苯并呋喃基-吡咯和苯并噻吩基-吡咯化合物。
[0024] Tagami等人，2000a；Tagami等人，2000b和Tagami等人，2002都描述了某些据称表现出视黄酸受体激动作用的化合物。
[0025] Kikuchi等人，2001描述了某些据称具有视黄酸活性的化合物。
[0026] Tsuda等人，1999描述了某些据称可用于治疗尿频和尿失禁的化合物。
[0027] Cai等人，2003和Cai等人，2005描述了某些据称是半胱天冬酶活化剂和凋亡诱导剂的化合物。
[0028] Olsson等人，2009描述了某些据称对RARβ2受体具有活性的化合物。
[0029] BHBA-001
[0030] Borthwick等人，2016描述了某些双环杂芳基-杂芳基-苯甲酸(BHBA)化合物，它们(选择性地)活化RARβ2(例如RARβ2)的活性，以及它们在治疗由RARβ(例如RARβ2)介导的疾病和病症包括例如神经系统损伤诸如脊髓损伤中的用途。
[0031] Borthwick等人，2016描述了在其中的合成1中BHBA-001的制备。在最后一步中，通过用LiOH水溶液进行处理使甲酯脱保护。将所得混合物冷却至室温，用HCl酸化，并通过过滤收集所得固体。将固体溶解在MeOH中并蒸发至干，得到呈“白色固体”的BHBA-001。
发明内容
[0032] 本发明涉及4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸(如下所示，且在本文中称为“BHBA-001”)的结晶形式。
[0033]
[0034] 如本文所述，已鉴定出BHBA-001的四种不同的结晶形式(即，形式1、2、3和4)。
[0035] 本发明的一个方面是如本文所述的BHBA-001的结晶形式。
[0036] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式是如本文所述的形式1。
[0037] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式是如本文所述的形式2。
[0038] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式是如本文所述的形式3。
[0039] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式是如本文所述的形式4。
[0041] 本发明的另一方面涉及一种组合物(例如药物组合物)，所述组合物包含如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0042] 本发明的另一方面涉及一种制备组合物(例如药物组合物)的方法，所述方法包括将如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)和药学上可接受的载体或稀释剂混合的步骤。
[0043] 本发明的另一方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)在于体外或体内活化视黄酸受体β(RARβ)(例如RARβ2)的方法中，例如在包括使RARβ(例如RARβ2)与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触的方法中的用途。
[0044] 本发明的另一方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)在于体外或体内(例如相对于RARα和/或RARγ)选择性地活化视黄酸受体β(RARβ)(例如RARβ2)的方法中，例如在包括使RARβ(例如RARβ2)与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触的方法中的用途。
[0045] 本发明的另一方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式在于体外或体内在神经元细胞中活化视黄酸受体β(RARβ)(例如RARβ2)的方法中，例如在包括使所述细胞与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触的方法中的用途。
[0046] 本发明的另一方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式在于体外或体内在神经元细胞中选择性地活化视黄酸受体β(RARβ)(例如RARβ2)的方法中，例如在包括使所述细胞与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触的方法中的用途。
[0047] 本发明的另一方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)在引起或促进神经突发育、神经突生长和/或神经突再生的方法中，例如在包括在体外或体内使神经元与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触的方法中的用途。
[0048] 本发明的另一方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)在通过疗法治疗人体或动物体的方法中的用途。
[0049] 本发明的另一方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)在制造用于治疗的药物中的用途。
[0050] 本发明的另一方面涉及一种治疗方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001，所述化合物优选呈药物组合物的形式。
[0051] 在一个实施方案中，所述治疗是对例如以下的治疗：
[0052] 神经系统损伤；
[0053] 中枢神经系统(CNS)损伤；
[0054] 周围神经系统(PNS)损伤；
[0055] 神经损伤；
[0056] PNS神经损伤；
[0057] CNS神经损伤；
[0058] 脊髓损伤；
[0059] 由创伤引起的脊髓损伤；
[0060] 视神经损伤；
[0061] 由青光眼引起的视神经损伤；
[0062] 神经病变；
[0063] PNS神经病变；
[0064] CNS神经病变；
[0065] 脊髓神经病变；
[0066] 视神经病变；
[0067] 糖尿病性神经病变(即与糖尿病相关的神经病变)；
[0068] AIDS性神经病变(即与AIDS相关的神经病变)；
[0069] 麻风性神经病变(即与麻风病相关的神经病变)；
[0070] 周围神经病变(例如，多发性神经病变、单发性神经病变、多发性单神经炎或自主神经病变)；
[0071] 神经退化性病症；
[0072] 认知障碍、记忆损害、记忆缺失、老年性痴呆、阿尔茨海默病、早期阿尔茨海默病、中期阿尔茨海默病、晚期阿尔茨海默病、认知损害或轻度认知损害；
[0073] 亨廷顿氏病；
[0074] 帕金森氏病；
[0075] 运动神经元疾病；
[0076] 局部麻痹；
[0077] 贝耳氏麻痹；
[0078] 神经性阳痿；
[0079] 由根治性前列腺切除术后神经创伤引起的神经性阳痿；
[0080] 麻痹，例如单瘫、四肢瘫或截瘫；
[0081] 由神经系统损伤引起的神经系统病症；
[0082] 由神经病变引起的神经系统病症；或
[0083] 由神经病变引起的神经系统损伤。
[0084] 本发明的另一方面涉及一种药盒，所述药盒包括(a)如本文所述的BHBA-001的结晶形式，其优选作为药物组合物提供并且提供于合适的容器中和/或具有合适的包装；(b)使用说明书，例如关于如何施用所述化合物的书面说明书。
[0085] 本发明的另一方面涉及一种制备如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)的方法。
[0086] 本发明的另一方面涉及一种如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)，其可通过如本文所述的制备BHBA-001的结晶形式(例如形式4)的方法获得。
[0087] 本发明的另一方面涉及一种如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)，其通过如本文所述的制备BHBA-001的结晶形式(例如形式4)的方法获得。
[0089] 图1示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的X射线粉末衍射(XRPD)图。
[0090] 图2示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的差示扫描量热法(DSC)热谱图。
[0091] 图3示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的热重分析(TGA)热谱图和差示扫描量热法(DSC)热谱图。
[0093] 图5示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的动态蒸汽吸附(DVS)质量吸收曲线图。
[0094] 图6示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的偏振光显微镜(PLM)显微照片。
[0095] 图7示出了含有BHBA-001的结晶形式2的样品的X射线粉末衍射(XRPD)图。
[0096] 图8示出了含有BHBA-001的结晶形式3的样品的X射线粉末衍射(XRPD)图。
[0097] 图9示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的X射线粉末衍射(XRPD)图。
[0098] 图10示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的差示扫描量热法(DSC)热谱图。
[0099] 图11示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的热重分析(TGA)热谱图和差示扫描量热法(DSC)热谱图。
[0100] 图12示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的动态蒸汽吸附(DVS)吸附-解吸曲线图。
[0101] 图13示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的动态蒸汽吸附(DVS)质量吸收曲线图。
[0102] 图14示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的偏振光显微术(PLM)显微照片。
[0103] 图15示出了含有BHBA-001的结晶形式1、2、3和4的样品的X射线粉末衍射(XRPD)图的叠加。
具体实施方式
[0104] BHBA-001的结晶形式
[0105] 结晶BHBA-001，包括BHBA-001的特定结晶形式(例如，多结晶形式)(例如，如本文所述的形式1、2、3和4)可具有关于以下方面的有利特性，例如稳定性和/或溶解性和/或生物利用度和/或杂质分布和/或过滤特征和/或干燥特征和/或吸湿性，和/或易于处理和/或易于微粉化和/或易于配制成片剂和/或胶囊剂。
[0106] 因此，本发明的一个方面涉及4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸(如下所示，且在本文中称为“BHBA-001”)的结晶形式。
[0107]
[0108] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式是如本文所述的形式1。
[0109] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式是如本文所述的形式2。
[0110] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式是如本文所述的形式3。
[0111] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式是如本文所述的形式4。
[0112] BHBA-001的各种结晶形式可以利用例如X射线粉末衍射(XRPD)、差示扫描量热法(DSC)和其他固态方法通过其独特的固态特征来鉴定。关于结晶形式的水含量或溶剂含量的进一步表征可以通过各种常规方法中任一种来测量，所述方法有诸如热重分析(TGA)、差示扫描量热法(DSC)、动态蒸汽吸附(DSV)和其他技术。
[0113] 值得注意的是，相比其他形式，BHBA-001的结晶形式4具有(基本上)更好的物理化学特性(例如，无水的、低溶剂保留、低吸湿性、长期稳定性、合适的粒度等)。
[0114] 结晶形式1
[0115] 本发明的一个方面涉及BHBA-001的结晶形式1。
[0116] 图1示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的X射线粉末衍射(XRPD)图。
[0117] 图2示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的差示扫描量热法(DSC)热谱图。
[0118] 图3示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的热重分析(TGA)热谱图和差示扫描量热法(DSC)热谱图。
[0119] 图4示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的动态蒸汽吸附(DVS)吸附-解吸曲线图。
[0120] 图5示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的动态蒸汽吸附(DVS)质量吸收曲线图。
[0121] 图6示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的偏振光显微术(PLM)显微照片。
[0122] BHBA-001的结晶形式1的物理特性总结在下表中。
[0123]
[0124] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有X射线粉末衍射，其显示出至少在13.1°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0125] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有X射线粉末衍射，其显示出至少在13.1°±0.2°、27.0°±0.2°和17.5°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0126] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有X射线粉末衍射，其显示出至少在13.1°±0.2°、27.0°±0.2°、17.5°±0.2°和24.0°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0127] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有X射线粉末衍射，其显示出至少在13.1°±0.2°、27.0°±0.2°、17.5°±0.2°、24.0°±0.2°、8.8°±0.2°、18.0°±0.2°和16.3°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0128] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有X射线粉末衍射，其显示出至少在13.1°±0.2°、27.0°±0.2°、17.5°±0.2°、24.0°±0.2°、8.8°±0.2°、18.0°±0.2°、16.3°±0.2°、10.9°±0.2°、8.2°±0.2°和21.6°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0129] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有X射线粉末衍射，其显示出至少在13.1°±0.2°、27.0°±0.2°、17.5°±0.2°、24.0°±0.2°、8.8°±0.2°、18.0°±0.2°、16.3°±0.2°、10.9°±0.2°、8.2°±0.2°、21.6°±0.2°、12.2°±0.2°、16.6°±0.2°和17.2°±
0.2°的特征散射角(2θ)。
0.2°的特征散射角(2θ)。
[0130] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有基本上如图1中所示的X射线粉末衍射。
[0131] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有差示扫描量热法热谱图，其包括在277±4℃处发生的吸热。
[0132] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有基本上如图2中所示的差示扫描量热法热谱图。
[0133] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有热重分析热谱图，其显示在40±4℃和100±4℃之间重量损失为约2.4±2％。
[0134] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有热重分析热谱图，其显示在219±4℃的起始温度下重量损失为约2.7±2％。
[0135] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有热重分析热谱图，其显示在256±4℃的起始温度下重量损失为约1.1±2％。
[0136] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有基本上如图3中所示的热重分析热谱图。
[0137] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有基本上如图4中所示的动态蒸汽吸附吸附-解吸曲线。
[0138] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式1具有基本上如图5中所示的动态蒸汽吸附质量吸收曲线。
[0139] 结晶形式2
[0140] 本发明的一个方面涉及BHBA-001的结晶形式2。
[0141] 图7示出了含有BHBA-001的结晶形式2的样品的X射线粉末衍射(XRPD)图。
[0142] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式2具有X射线粉末衍射，其显示出至少在15.6°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0143] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式2具有X射线粉末衍射，其显示出至少在15.6°±0.2°、10.4°±0.2°、12.7°±0.2°和17.4°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0144] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式2具有X射线粉末衍射，其显示出至少在15.6°±0.2°、10.4°±0.2°、12.7°±0.2°、17.4°±0.2°和8.7°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0145] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式2具有X射线粉末衍射，其显示出至少在15.6°±0.2°、10.4°±0.2°、12.7°±0.2°、17.4°±0.2°、8.7°±0.2°、11.9°±0.2°、21.3°±0.2°和26.7°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0146] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式2具有基本上如图7中所示的X射线粉末衍射。
[0147] 结晶形式3
[0148] 本发明的一个方面涉及BHBA-001的结晶形式3。
[0149] 图8示出了含有BHBA-001的结晶形式3的样品的X射线粉末衍射(XRPD)图。
[0150] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式3具有X射线粉末衍射，其显示出至少在14.2°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0151] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式3具有X射线粉末衍射，其显示出至少在14.2°±0.2°和11.1°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0152] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式3具有X射线粉末衍射，其显示出至少在14.2°±0.2°、11.1°±0.2°和16.1°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0153] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式3具有X射线粉末衍射，其显示出至少在14.2°±0.2°、11.1°±0.2°、16.1°±0.2°和16.8°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0154] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式3具有X射线粉末衍射，其显示出至少在14.2°±0.2°、11.1°±0.2°、16.1°±0.2°、16.8°±0.2°、9.5°±0.2°、18.9°±0.2°和7.1°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0155] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式3具有X射线粉末衍射，其显示出至少在14.2°±0.2°、11.1°±0.2°、16.1°±0.2°、16.8°±0.2°、9.5°±0.2°、18.9°±0.2°、7.1°±
0.2°、12.4°±0.2°、21.5°±0.2°和12.1°±0.2°的特征散射角(2θ)。
0.2°、12.4°±0.2°、21.5°±0.2°和12.1°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0156] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式3具有基本上如图8中所示的X射线粉末衍射。
[0157] 结晶形式4
[0158] 本发明的一个方面涉及BHBA-001的结晶形式4。
[0159] 图9示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的X射线粉末衍射(XRPD)图。
[0160] 图10示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的差示扫描量热法(DSC)热谱图。
[0161] 图11示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的热重分析(TGA)热谱图和差示扫描量热法(DSC)热谱图。
[0162] 图12示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的动态蒸汽吸附(DVS)吸附-解吸曲线图。
[0163] 图13示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的动态蒸汽吸附(DVS)质量吸收曲线图。
[0164] 图14示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的偏振光显微术(PLM)显微照片。
[0165] BHBA-001的结晶形式4的物理特性总结在下表中。
[0166]
[0167] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有X射线粉末衍射，其显示出至少在14.8°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0168] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有X射线粉末衍射，其显示出至少在14.8°±0.2°和20.7°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0169] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有X射线粉末衍射，其显示出至少在14.8°±0.2°、20.7°±0.2°和9.5°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0170] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有X射线粉末衍射，其显示出至少在14.8°±0.2°、20.7°±0.2°、9.5°±0.2°和16.4°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0171] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有X射线粉末衍射，其显示出至少在14.8°±0.2°、20.7°±0.2°、9.5°±0.2°、16.4°±0.2°、13.1°±0.2°、24.6°±0.2°、26.7°±0.2°和21.0°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0172] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有X射线粉末衍射，其显示出至少在14.8°±0.2°、20.7°±0.2°、9.5°±0.2°、16.4°±0.2°、13.1°±0.2°、24.6°±0.2°、26.7°±0.2°、21.0°±0.2°、14.4°±0.2°、12.4°±0.2°、12.7°±0.2°和28.1°±0.2°的特征散射角(2θ)。
[0173] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有X射线粉末衍射，其未显示出在17.0°±0.2°和20.0°±0.2°之间的特征散射角(2θ)(例如，其中峰强度小于最强峰的约
3％)。
3％)。
[0174] 如下表所示，形式1、2和3中的每一个都在16.8°至20.2°的范围内具有大峰。相比之下，形式4在该范围内没有强度为3％或更大的峰。还可参见，例如，图15。
[0175]
[0176] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有X射线粉末衍射，其中在17.0°±0.2°和20.0°±0.2°之间的特征散射角(2θ)处的任何峰的峰强度小于最强峰的约3％、优选小于最强峰的约2％、更优选小于最强峰的约1.5％。
[0177] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有X射线粉末衍射，其未显示出在10.0°±0.2°和12.0°±0.2°之间的特征散射角(2θ)(例如，其中峰强度小于最强峰的约
3％)。
3％)。
[0178] 如下表所示，形式1、2和3中的每一个都在9.8°至12.2°的范围内具有大峰。相比之下，形式4在该范围内没有强度为3.0％或更大的峰。还可参见，例如，图15。
[0179]
[0180] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有X射线粉末衍射，其中在10.0°±0.2°和12.0°±0.2°之间的特征散射角(2θ)处的任何峰的峰强度小于最强峰的约3％、优选小于最强峰的约2％、更优选小于最强峰的约1％。
[0181] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有基本上如图9中所示的X射线粉末衍射。
[0182] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有差示扫描量热法热谱图，其包括在约268±4℃处发生的吸热。
[0183] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有基本上如图10中所示的差示扫描量热法热谱图。
[0184] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有热重分析热谱图，其显示在40±4℃和100±4℃之间重量损失为小于约0.5％。
[0185] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有基本上如图11中所示的热重分析热谱图。
[0186] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有基本上如图12中所示的动态蒸汽吸附吸附-解吸曲线。
[0187] 在一个实施方案中，BHBA-001的结晶形式4具有基本上如图13中所示的动态蒸汽吸附质量吸收曲线。
[0188] 结晶形式的比较
[0189] 结晶形式1、2、3和4各自具有XRPD图，这些图显示出不同的特征散射角。参见，例如，图15。
[0190] BHBA-001的结晶形式1含有2.4％(w/w)的残留溶剂，是吸湿性的，在0％和95％相对湿度(RH)之间具有8.7％(w/w)吸收，并且固体和固体由小(较小)的颗粒组成。
[0191] 发现BHBA-001的结晶形式2(从乙醇获得)含有乙醇，并被表征为乙醇溶剂合物。
[0192] 发现BHBA-001的结晶形式3(从乙酸获得)含有乙酸，并被表征为乙酸溶剂合物。
[0193] BHBA-001的结晶形式4是无水的，几乎不含有残余溶剂，具有低吸湿性，在环境条件下稳定数月，并且固体由大(较大)的颗粒组成。
[0194] 在250℃以上，形式4熔化并重结晶，得到形式1。
[0195] 基于(基本上)更好的物理化学特性(例如，无水的、低溶剂保留、低吸湿性、长期稳定性、合适的粒度等)，BHBA-001的结晶形式4最适合作为制剂候选物来开发。
[0196] BHBA-001的化学合成
[0197] Borthwick等人，2016描述了一种制备BHBA-001的合成路线，该合成路线在下面的方案1中示出。
[0198] 方案1
[0199]
[0200] 在这种方法中，使2,5-二甲基苯酚(1)与多聚甲醛反应得到2-羟基-3,6-二甲基苯甲醛(2)，然后使之与2-溴乙酸叔丁酯反应得到4,7-二甲基苯并呋喃-2-羧酸叔丁酯(3)，脱保护得到4,7-二甲基苯并呋喃-2-羧酸(4)。然后使此酸与4-(N'-羟基甲脒基)苯甲酸甲酯(5)反应得到4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸甲酯(6)，然后将其脱保护，得到目标化合物4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸(BHBA-001)。
[0201] 下面描述此合成路线的一个实例。
[0202] 步骤1：2-羟基-3,6-二甲基苯甲醛(2)
[0203]
[0204] 将2,5-二甲基苯酚(1)(20g，160mmol)、多聚甲醛(34g，1.1mol)、MgCl2(23.4g，246mmol)和Et3N(86mL，610mmol)在无水MeCN(550mL)中的悬浮液在回流下搅拌2小时。将反应混合物真空浓缩至一半体积，然后在Et2O(200mL)和1M HCl(200mL)之间分配。将水相用Et2O(400mL)进一步萃取，然后将合并的有机萃取物用MgSO4干燥并过滤。将溶液真空浓缩并通过硅胶色谱法(330g，0-20％Et2O的异己烷溶液)纯化残余物得到呈黄色固体的标题化合物(2)(8.6g，35％)：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.12(1H,s),10.29(1H,s),7.25(1H,d),
6.61(1H,d),2.56(3H,s),2.20(3H,s)。
6.61(1H,d),2.56(3H,s),2.20(3H,s)。
[0205] 步骤2：4,7-二甲基苯并呋喃-2-羧酸叔丁酯(3)
[0206]
[0207] 将2-溴乙酸叔丁酯(10.6mL，71.5mmol)滴加到搅拌的2-羟基-3,6-二甲基苯甲醛(2)(8.6g，57mmol)和碳酸钾(19.8g，143mmol)在无水DMF(40mL)中的悬浮液中。将反应混合物在回流下搅拌20小时。将混合物在EtOAc(100mL)和水(100mL)之间分配，并将水相用EtOAc(100mL)进一步萃取。将合并的有机物用盐水(5 x 100mL)洗涤并真空浓缩。通过硅胶色谱法(330g，20％MeOH的二氯甲烷溶液(DCM))纯化残余物，得到呈红色油状物的标题化合物(3)(12.3g，87％收率)：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.42(1H,s),7.04(2H,dd),8.33(1H,d),2.52(3H,s),2.50(3H,s),1.63(9H,s)。
[0208] 步骤3：4,7-二甲基苯并呋喃-2-羧酸(4)
[0209]
[0210] 在0℃下，将三氟乙酸(TFA)(19.2mL，249mmol)滴加到4,7-二甲基苯并呋喃-2-羧酸叔丁酯(3)(12.3g，49.8mmol)在DCM(100mL)中的溶液中。加完后，使混合物温热至室温并搅拌20小时。真空去除溶剂并将残余物在EtOAc(100mL)和1M HCl(100mL)之间分配。将水相用EtOAc(100mL)进一步萃取，并将合并的有机相用盐水(300mL)洗涤，然后真空浓缩。将残余物溶解于EtOAc(100mL)中，然后用饱和NaHCO3溶液(200mL)萃取。通过加入浓HCl来酸化水溶液，并用EtOAc(200mL)萃取。将有机溶液真空浓缩并与甲苯共蒸发，得到呈浅棕色固体的标题化合物(4)(7.7g，81％收率)：m/z 190[M+H]+(ES+)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:13.48(1H,s),7.72(1H,s),7.11(2H,dd),2.47(3H,s),2.44(3H,s)。
[0211] 步骤4：4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸甲酯(6)[0212]
[0213] 在0℃下，将2-丙烷膦酸酐(T3P)的EtOAc(50％)(23.2mL，39.4mmol)溶液滴加到4,7-二甲基苯并呋喃-2-羧酸(4)(3.0g，16mmol)、4-(N'-羟基甲脒基)苯甲酸甲酯(5)(3.1g，
16mmol)和Et3N(11mL，79mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(25mL)中的混合物中。将混合物在0℃下搅拌10分钟，然后温热至90℃并搅拌18小时。将反应混合物冷却至室温并倾入冰水(150mL)中。收集固体，用冷EtOAc洗涤并抽吸干燥。将该物质通过用MeOH研磨来纯化并真空干燥，得到呈粉红色固体的标题化合物(6)(3.6g，65％收率)：m/z 349[M+H]+(ES+)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.29-8.26(3H,m),8.19(2H,d),7.29(1H,d),7.13(1H,d),3.92(3H,s),2.56(3H,s),2.54(3H,s)。
16mmol)和Et3N(11mL，79mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(25mL)中的混合物中。将混合物在0℃下搅拌10分钟，然后温热至90℃并搅拌18小时。将反应混合物冷却至室温并倾入冰水(150mL)中。收集固体，用冷EtOAc洗涤并抽吸干燥。将该物质通过用MeOH研磨来纯化并真空干燥，得到呈粉红色固体的标题化合物(6)(3.6g，65％收率)：m/z 349[M+H]+(ES+)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.29-8.26(3H,m),8.19(2H,d),7.29(1H,d),7.13(1H,d),3.92(3H,s),2.56(3H,s),2.54(3H,s)。
[0214] 步骤5：4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸(BHBA-001)
[0215]
[0216] 将4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸甲酯(6)(100mg，0.287mmol)在四氢呋喃(THF)(1mL)中的悬浮液用LiOH(2M，水溶液，720μL，1.4mmol)处理，并将混合物在40℃下搅拌20小时。将反应混合物冷却至室温，然后通过滴加
1M HCl来酸化。过滤收集所得固体，然后溶于MeOH中并蒸发至干，得到呈白色固体的标题化合物(BHBA-001)(95mg，99％收率)：m/z 335[M+H]+(ES+),333[M-H]-(ES)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:13.34(1H,br.s),8.25-8.23(3H,m),8.16(2H,d),7.29(1H,d),7.12(1H,d),
2.56(3H,s),2.53(3H,s)。
1M HCl来酸化。过滤收集所得固体，然后溶于MeOH中并蒸发至干，得到呈白色固体的标题化合物(BHBA-001)(95mg，99％收率)：m/z 335[M+H]+(ES+),333[M-H]-(ES)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:13.34(1H,br.s),8.25-8.23(3H,m),8.16(2H,d),7.29(1H,d),7.12(1H,d),
2.56(3H,s),2.53(3H,s)。
[0217] 另一种用于制备BHBA-001的方法在下面的方案2中示出。
[0218] 方案2
[0219]
[0220] 在此方法中，使用羟胺的甲醇水溶液作为溶剂来处理4-氰基苯甲酸甲酯(III)。反应完成后，加入甲基叔丁基醚(MTBE)，冷却混合物，老化过夜后，分离出呈固体的产物4-(N’-羟基甲脒基)苯甲酸甲酯(IV)。
[0221] 将4,7-二甲基苯并呋喃-2-羧酸(I在催化性N,N-二甲基甲酰胺存在下，用二氯甲烷中的草酰氯处理。反应完成后，将含有产物4,7-二甲基苯并呋喃-2-碳酰氯(II)的溶液延伸到下一阶段。
[0222] 在有三乙胺作为碱和2-丁酮作为溶剂存在下，将4,7-二甲基苯并呋喃-2-碳酰氯(II)用4-(N’-羟基甲脒基)苯甲酸甲酯(IV)处理。去除溶剂后，将倒数第二个中间体4-[5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基]苯甲酸甲酯(VI)从甲醇中结晶并通过过滤分离。
[0223] 将4-[5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基]苯甲酸甲酯(VI)通过在60-65℃下在四氢呋喃(THF)中用氢氧化钾处理来水解，然后用水和乙醇稀释。加入浓盐酸后，目标化合物4-[5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基]苯甲酸(BHBA-001)沉淀，然后通过过滤分离。
[0224] 下面描述此合成路线的一个实例。
[0225] 步骤1：4-(N’-羟基甲脒基)苯甲酸甲酯(IV)
[0226]
[0227] 将4-氰基苯甲酸甲酯(III)(2.50kg，1重量)在甲醇(7.5L，3体积)中的溶液用甲基叔丁基醚(9.3kg，3.7重量)溶液稀释。在20-25℃下在约0.5小时内加入羟胺水溶液(50％溶液；1.23kg，0.5重量，1.2当量)。用甲醇(1kg，0.4重量)冲洗加料管线，并使反应在20-25℃下进行约12小时。将批料冷却至5±5℃并在5±5℃下老化3小时。将产物4-(N’-羟基甲脒基)苯甲酸甲酯(IV)通过过滤分离，用甲基叔丁基醚(2 x 5.5kg，2 x 2.2重量)洗涤，并在氮气流下在环境温度下干燥大约4小时(2.38kg，93％)。
[0228] 步骤2：4,7-二甲基苯并呋喃-2-碳酰氯(II)
[0229]
[0230] 向反应器中装入4,7-二甲基苯并呋喃-2-羧酸(I)(1.96kg，1重量)、N,N-二甲基甲酰胺(8g，0.004重量)和二氯甲烷(6.85kg，3.5重量)，并将批料加热至25-30℃。在约15分钟的时间内，向混合物中加入草酰氯(1.47kg，0.75重量，1.1当量)，并用二氯甲烷(1.3kg，0.66重量)冲洗加料管线。将批料在30-35℃下搅拌大约1.5小时，所得产物4,7-二甲基苯并呋喃-2-碳酰氯(II)不经任何进一步纯化直接用于下一步骤。
[0231] 步骤3：4-[5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基]苯甲酸甲酯(VI)[0232]
[0233] 向反应器中装入4-(N’-羟基甲脒基)苯甲酸甲酯(IV)(1.97千克，1重量，0.97当量(基于(I)而言))、三乙胺(2.34kg，1.2重量，2.2当量)和甲基异丁基酮(23.9kg，12重量)。将批料加热至30-35℃并加入4,7-二甲基苯并呋喃-2-碳酰氯(II)溶液(在步骤2中制备)，确保温度不超过60℃。用二氯甲烷(0.66重量)冲洗加料管线，并将溶剂首先蒸馏去除一些溶剂，然后在大气压下在110-115℃下加热大约3小时。将批料冷却至60-70℃，加入甲醇(8kg，4重量)，并将批料在此温度下再加热30分钟。将批料冷却至20±3℃并在此温度下老化大约
1小时。将固体产物过滤，用甲醇(2 x 6.2kg，2 x 3.1重量)洗涤，并在氮气流下在环境温度下干燥16小时(3.3kg，93％)。
1小时。将固体产物过滤，用甲醇(2 x 6.2kg，2 x 3.1重量)洗涤，并在氮气流下在环境温度下干燥16小时(3.3kg，93％)。
[0234] 步骤4：4-[5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基]苯甲酸(BHBA-001)
[0235]
[0236] 向反应器中装入4-[5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基]苯甲酸甲酯(VI)(3.0kg，1重量)、四氢呋喃(THF)(22kg，7.1重量)和氢氧化钾水溶液(由在软化水(DEMI水，7.5kg，2.5重量)中的固体KOH(0.69kg，0.23重量)制得)。将批料加热至65±5℃并在65±5℃下搅拌大约3小时。将批料冷却至30-35℃，并排出反应混合物。经由串联过滤器将此溶液装入反应器中(即，澄清步骤)。经由串联过滤器向反应器中装入DEMI水(6kg，2.0重量)和无水乙醇(9.6kg，3.2重量)。将批料加热至55±5℃。经由串联过滤器向反应器中加入浓缩的(30重量％)盐酸(1.35kg，0.45重量)，并将批料在55±5℃下搅拌大约15分钟。将批料冷却至20±3℃并在此温度下老化2小时。过滤产物，滤饼用DEMI水(1.5kg，0.5重量)和无水乙醇(8.4kg，2.8重量)的混合物洗涤两次。将批料在环境温度下在过滤器上干燥大约1小时，得到目标化合物BHBA-001。
[0237] 筛选研究
[0238] 研究1：溶解度研究
[0239] 在15种溶剂中确定BHBA-001(通过XRPD表征为形式1)的溶解度以研究初始多晶型行为。应用振荡烧瓶法，将固体逐步(例如，每次10mg)添加到已知量的溶剂(例如，3mL)中。目测确认溶解度。添加后，将悬浮液/溶液在20℃下保持24小时，以检查缓慢溶解或重结晶。
如果固体没有完全溶解，则将悬浮液加热至50℃以促进溶解。然后在一些情况下，借助于抗溶剂通过蒸发去除溶剂。使用XRPD分析所得固体。
如果固体没有完全溶解，则将悬浮液加热至50℃以促进溶解。然后在一些情况下，借助于抗溶剂通过蒸发去除溶剂。使用XRPD分析所得固体。
[0240] 结果总结在下表中。该化合物在大多数溶剂中仅能微溶。然而，鉴定出两种新的结晶形式：形式2和形式3。
[0241]
[0242] (*)在50℃下的溶解度。
[0243] 研究2：浆化研究
[0244] 由于其低溶解度，使用以下三种不同的温度曲线将BHBA-001(形式1)用各种溶剂浆化以观察重结晶效果：(a)在20℃下持续5天；(b)在50℃下持续2天；以及(c)加热至60℃，然后以5℃/小时从60℃缓慢冷却至5℃。浆化后，倾析出液体，将剩余的固体在氮气流下干燥并使用XRPD进行分析。
[0245] 结果总结在下表中。几乎在所有情况下，浆化研究都产生了形式1。然而，鉴定出一种新的结晶形式(形式4)。
[0246] 在缓慢冷却研究中，所有这些都产生了形式1，颗粒惯态变为5-10μm的细长颗粒。
[0247]
[0248]
[0249]
[0250]
[0251] 研究3：浆化研究(针对水合物)
[0252] 使用几种水-甲醇混合物进行另外的浆化研究以确定是否将形成水合物。
[0253] 结果总结在下表中。没有鉴定出新的结晶形式(因此没有水合物)。
[0254]
[0255] 研究4：竞争性浆化研究
[0256] 在多种不同溶剂中进行竞争性浆化实验(数据未示出)。将形式1、2、3和4的混合物用各溶剂浆化，并通过XRPD分析所得固体。竞争性浆化研究表明，是溶剂(而不是温度)决定了形成哪种多晶型体。
[0257] 在筛选研究中鉴定的结晶形式的表征
[0258] 表征方法
[0259] BHBA-001的各种结晶形式可以利用例如X射线粉末衍射(XRPD)、差示扫描量热法(DSC)和其他固态方法通过其独特的固态特征来鉴定。
[0260] 关于结晶形式的水含量或溶剂含量的进一步表征可以通过各种常规方法中任一种来测量，所述方法有诸如热重分析(TGA)、差示扫描量热法(DSC)、动态蒸汽吸附(DVS)和其他技术。
[0261] X射线粉末衍射(XRPD)：
[0262] 使用处于Bragg-Brentano配置的Bruker AXS D2相位器(Bruker AXS D2PHASER)(设备#1549)利用Cu-Kα辐射进行XRPD研究。实验参数为：Cu阳极，30kV，10mA；样品台标准旋转；通过Kβ滤波器(0.5％Ni)进行单色化；狭缝：固定发散狭缝1.0mm(＝0.61°)，主轴向Soller狭缝2.5°，次级轴向Soller狭缝2.5°；检测器：线性检测器LYNXEYE，接收狭缝5°检测器打开。标准样品架(0.1mm空腔，(510)硅圆片)对背景信号的影响极小。
[0263] 测量条件为：扫描范围：5-45°2θ；样品旋转：5rpm，0.5s/步，0.010°/步，3.0mm检测器狭缝。为了确认系统适用性，每天测量刚玉样品A26-B26-S(NIST标准)。
[0264] 用于数据收集的软件是Diffrac.Commander v3.3.35。使用Diffrac.Eva V3.0进行数据分析。未对衍射图进行背景校正或平滑化。使用Diffrac.Eva软件脱除Cu-Kα2的影响。
[0265] 对于XRPD，峰的相对强度可以是变化的，这取决于样品制备技术、样品安装程序和所用的特定仪器。此外，仪器变化和其他因素可影响2θ值。因此，衍射图的峰分配通常可以在正或负约0.2°(例如，±0.2°)内变化。
[0266] 热重分析/差示扫描量热法(TGA/DSC)：
[0267] 使用具有34位自动取样器的Mettler Toledo TGA/DSCl STARe系统(设备#1547)进行TGA/DSC研究。
[0268] 使用铝坩埚(40μL；穿孔的)制备样品。通常，将5-10mg样品装入预先称重的铝坩埚中并在30℃下保持5分钟，之后将其以10℃/min从30℃加热至300℃。在样品上保持40mL/min的氮气吹扫。为确认系统适用性，使用铟和锌作为参考。
[0269] 用于数据收集和评估的软件是STARe Software v10.00 build 2480。未对热谱图进行校正。
[0270] 对于DSC，已知观察到的温度将取决于温度变化的速率以及样品制备技术和所用的特定仪器。因此，本文报道的有关DSC热谱图的值可以在正或负约4℃内变化。
[0271] 差示扫描量热法(DSC)：
[0272] 使用Mettler Toledo DSCl STARe系统(设备#1564)进行DSC研究。
[0273] 使用铝坩埚(40μL；穿孔的)制备样品。通常，将1-8mg样品装到预先称重的铝坩埚上并在30℃下保持5分钟，之后将其以10℃/min从30℃加热至350℃并再次保持在350℃下。在样品上保持40mL/min的氮气吹扫。为确认系统适用性，使用铟和锌作为参考。
[0274] 用于数据收集和评估的软件是STARe Software v10.00 build 2480。未对热谱图进行校正。
[0275] 对于DSC，已知观察到的温度将取决于温度变化的速率以及样品制备技术和所用的特定仪器。因此，本文报道的有关DSC热谱图的值可以在正或负约4℃内变化。
[0276] 动态蒸汽吸附(DVS)：
[0277] 使用Surface Measurement Systems Ltd.DVS-1 No Video(设备#2126)进行DVS研究。
[0278] 将样品在玻璃盘中称重，通常为20-30mg，并在0％RH下平衡。在材料干了后，以10％/步增加相对湿度(RH)，每步增加持续1小时，增加到95％RH为止。
[0279] 用于数据收集的软件是DVSWin v3.01 No Video。使用DVS Standard Analysis Suite v6.3.0(标准版)进行数据分析。
[0280] 偏振光显微术(PLM)：
[0281] 使用配备有AxioCamERc 5s的AxioVert 35M(设备#1612)进行显微术研究。
[0282] 显微镜配备有四个透镜：Zeiss A-Plan Sx/0.12；Zeiss A-plan lOx/0.25；LD A-Plan 20x/0.30；和Achros TIGMAT 32x/0.40。
[0283] 使用Carl Zeiss Zen AxioVision Blue Edition Lite 2011 v1.0.0.0软件进行数据收集和评估。将少量样品装到物镜上并铺展直至获得薄层。
[0284] 稳定性研究：
[0285] 如下进行稳定性研究。将样品封装在双低密度聚乙烯袋中，用塑料扣密封，并置于高密度聚乙烯(HDPE)桶中。将样品在以下储存条件下储存：25℃/60％RH(模拟“实时”)和40℃/75％RH(“加速”)。
[0286] 定期测试样品的视觉外观、药物含量(通过HPLC)、水含量(通过Karl Fischer滴定)和药物相关杂质(通过HPLC)。
[0287] 根据以下等式计算药物含量(校正至无水和无溶剂基准)：含量(％)＝100-(水+溶剂+灼烧残渣+相关杂质)。
[0288] 使用反相梯度HPLC方法，在254nm处进行UV检测，使用150mm x 4.6mm，3μm Waters Atlantis T3柱，利用以下参数测定药物相关杂质：
[0289]
[0290]
[0291] 结晶形式1
[0292] 图1示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的X射线粉末衍射(XRPD)图。
[0293] XRPD图中最强的25个峰列于下表中。
[0294]
[0295]
[0296] 图2示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的差示扫描量热法(DSC)热谱图。
[0297] DSC热谱图的特征在于40-100℃之间的广泛去溶剂化事件(起始温度：36.36℃；峰值温度：65.72℃；热流：-59.70J/g)，随后是吸热事件(熔点)，峰值温度为约277℃(起始温度：273.21℃；峰值温度：277.23℃；热流：-114.90J/g)。在200-250℃处还出现小的广泛事件(起始温度：207.01℃；峰值温度：235.94℃；热流：-144.44J/g)。
[0298] 图3示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的热重分析(TGA)热谱图和差示扫描量热法(DSC)热谱图。
[0299] DSC热谱图的特征在于40-100℃之间的广泛吸热事件(起始温度：77.78℃；峰值温度：94.83℃；热流：-27.26J/g)，该事件与由TGA测得的2.35％的重量损失相关联。观察到两个玻璃化转变吸热事件：第一个事件起始温度为219℃(起始温度：219.63℃；中点温度：237.19℃)，其与由TGA测得的2.7％w/w的重量损失相关联；第二个事件起始温度为256℃(起始温度：256.33℃；中点温度：258.04℃)，其与由TGA测得的1.13％w/w的重量损失相关联。观察到形式1吸热熔体的起始温度为273℃(起始温度：272.98℃；峰值温度：277.33℃；
热流：-155.35J/g)。
热流：-155.35J/g)。
[0300] 图4示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的动态蒸汽吸附(DVS)吸附-解吸曲线图。
[0301] 为了确定形式1的吸湿性，在25℃下以两个吸附-解吸循环测量DVS曲线图。在0％和95％RH之间的总质量吸收为8.7％w/w，这将形式1表征为吸湿形式。吸收是可逆的且可再现的。
[0302] 图5示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的动态蒸汽吸附(DVS)质量吸收曲线图。
[0303] 在25℃下记录形式1的样品的DVS曲线图并在0％RH下平衡。在材料干了后，以10％/步增加RH，每步增加持续1小时，增加到95％RH为止，最终质量吸收为8.7％w/w。以
10％/步降低RH，每步增加持续1小时，回到0％RH。形式1被表征为吸湿形式。吸收是可逆的且可再现的。
10％/步降低RH，每步增加持续1小时，回到0％RH。形式1被表征为吸湿形式。吸收是可逆的且可再现的。
[0304] 图6示出了含有BHBA-001的结晶形式1的样品的偏振光显微术(PLM)显微照片。
[0305] 形式1被表征为具有极小颗粒的附聚物。
[0306] BHBA-001的结晶形式1的物理特性总结在下表中。
[0307]
[0308] BHBA-001的结晶形式1含有2.4％(按质量计)的残余溶剂(包括水)。
[0309] BHBA-001的结晶形式1是吸湿性的，在0％和95％RH之间具有8.7％w/w的水吸收。
[0310] 结晶形式2
[0311] 图7示出了含有BHBA-001的结晶形式2的样品的X射线粉末衍射(XRPD)图。
[0312] XRPD图中最强的12个峰列于下表中。
[0313]
[0314] 发现形式2(从乙醇获得)含有乙醇(通过溶液1H NMR确定；数据未示出)，并基于XRPD和1H NMR数据被表征为乙醇溶剂合物。
[0315] 结晶形式3
[0316] 图8示出了含有BHBA-001的结晶形式3的样品的X射线粉末衍射(XRPD)图。
[0317] XRPD图中最强的12个峰列于下表中。
[0318]
[0319] 发现形式3(从乙酸获得)含有乙酸(通过溶液1H NMR确定；数据未示出)，并基于XRPD和1H NMR数据被表征为乙酸溶剂合物。
[0320] 结晶形式4
[0321] 图9示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的X射线粉末衍射(XRPD)图。
[0322] XRPD图中最强的32个峰列于下表中。
[0323]
[0324]
[0325] 图10示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的差示扫描量热法(DSC)热谱图。
[0326] DSC热谱图的特征在于两个吸热事件：第一个事件峰值温度为268℃(起始温度：263.36℃；峰值温度：268.07℃；热流：-16.65J/g)，其对应于形式4的熔化，结合放热事件(重结晶)，放热事件峰值温度为270℃(起始温度：269.80℃；峰值温度：270.69℃；热流：+
2.61J/g)；然后是在279℃峰值温度下形式1的熔化(起始温度：277.54℃；峰值温度：279.19℃；热流：-51.95J/g)。
2.61J/g)；然后是在279℃峰值温度下形式1的熔化(起始温度：277.54℃；峰值温度：279.19℃；热流：-51.95J/g)。
[0327] 图11示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的热重分析(TGA)热谱图和差示扫描量热法(DSC)热谱图。
[0328] TGA热谱图显示在40-80℃之间的重量损失非常小，为0.2％。DSC热谱图的特征在于两个吸热事件：第一个事件起始温度为256℃(起始温度：256.09℃；峰值温度：264.60℃；热流：-16.34J/g)，其对应于形式4的熔化；结合在278℃起始温度下形式1的重结晶和融化(起始温度：278.10℃；峰值温度：279.77℃；热流：-166.01J/g)。
[0329] 图12示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的动态蒸汽吸附(DVS)吸附-解吸曲线图。
[0330] 为了确定形式4的吸湿性，在25℃下以两个吸附-解吸循环测量DVS曲线图。在0％和95％RH之间的总质量吸收为0.1％，这将形式4表征为非吸湿形式。
[0331] 图13示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的动态蒸汽吸附(DVS)质量吸收曲线图。
[0332] 在25℃下记录形式4的样品的DVS曲线图并在0％RH下平衡。在材料干了后，以10％/步增加RH，每步增加持续1小时，增加到95％RH为止，最终质量吸收为0.1％。以10％/步降低RH，每步增加持续1小时，回到0％RH。形式4被表征为吸湿形式。
[0333] 图14示出了含有BHBA-001的结晶形式4的样品的偏振光显微术(PLM)显微照片。
[0334] 形式4被表征为具有这样的颗粒惯态：优选的形状为大约50-100μm的针状颗粒。
[0335] BHBA-001的结晶形式4的物理特性总结在下表中。
[0336]
[0337]
[0338] 对BHBA-001的结晶形式4进行稳定性研究(如上所述)。结果总结在下表中。
[0339]
[0340] 在25℃/60％RH下储存24个月和在40℃/75％RH下储存6个月后，样品的外观基本保持不变。
[0341] 在25℃/60％RH下储存24个月和在40℃/75％RH下储存6个月后，水含量基本保持不变。
[0342] 在25℃/60％RH下储存24个月和在40℃/75％RH下储存6个月后，药物含量基本保持不变。
[0343] 在25℃/60％RH下储存24个月和在40℃/75％RH下储存6个月后，药物相关杂质水平基本保持不变。
[0344] 概括地说，BHBA-001的结晶形式4显示在25℃/60％RH下储存至少24个月和在40℃/75％RH下储存6个月后稳定。
[0345] 结晶形式4的制备
[0346] 开发了以下方案用于制备结晶形式4。已证明该方案可成功用于大规模批次，包括至少一个2.5kg批次。
[0347] 在第1部分(脱保护)中，由对应的甲酯制备BHBA-001的溶液。
[0348] 在第2部分(沉淀)中，将BHBA-001从溶液中沉淀出来(呈形式1)。
[0349] 在第3部分(形成形式4)中，将BHBA-001(形式1)在升高的温度下在无水乙醇中浆化(得到形式4)。
[0350] 第1部分：制备含BHBA-001的溶液
[0351] ·向反应器中装入4-(5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基)苯甲酸甲酯(1重量)和四氢呋喃(7.1重量)。
[0352] ·向反应器中装入氢氧化钾水溶液，其由在软化水(2.5重量)中的固体KOH(0.23重量)制得。
[0353] ·将批料加热至65±5℃。
[0354] ·将批料在65±5℃下搅拌至少3小时。
[0355] ·将批料冷却至30±5℃。
[0356] ·排出反应混合物。
[0357] ·经由串联过滤器向第二反应器中装入所述反应混合物。
[0358] ·经由串联过滤器向第二反应器中装入软化水(2.0重量)和无水乙醇(3.2重量)。
[0359] ·将批料加热至55±5℃。
[0360] 第2部分：沉淀BHBA-001(形式1)
[0361] ·经由串联过滤器向第二反应器中加入浓缩的(30重量％)盐酸(0.45重量)。
[0362] ·将批料在55±5℃下搅拌至少15分钟。
[0363] ·将批料冷却至20±3℃。
[0364] ·将批料在20±3℃下老化至少2小时。
[0365] ·过滤批料。
[0366] ·洗涤批料：经由串联过滤器向反应器中加入软化水(0.5重量)和无水乙醇(2.8重量)的混合物，并使用此溶剂混合物洗涤滤饼。
[0367] ·洗涤批料：经由串联过滤器向反应器中加入无水乙醇(3.2重量)，并使用此溶剂洗涤滤饼。
[0368] ·干燥批料：将过滤器上的批料在环境温度(约20℃)下干燥至少1小时(得到BHBA-001的结晶形式1)。
[0369] 第3部分：再浆化以将BHBA-001(形式1)转化为BHBA-001(形式4)
[0370] ·向反应器中装入滤饼。
[0371] ·经由串联过滤器向反应器中加入无水乙醇(12.6重量)。
[0372] ·将混合物加热至回流温度(约78℃)，并在此温度下搅拌至少2小时。
[0373] ·将批料冷却至20±3℃。
[0374] ·将批料在20±3℃下老化至少1小时。
[0375] ·过滤批料。
[0376] ·洗涤批料：经由串联过滤器向反应器中加入甲基叔丁基醚(2x3.7重量)，并使用此溶剂混合物洗涤滤饼。
[0377] ·干燥批料：将过滤器上的批料在环境温度(约20℃)下干燥至少1小时(得到BHBA-001的结晶形式4)。
[0378] 因此，本发明的另一方面是一种制备BHBA-001的结晶形式4的方法，所述方法依序包括以下步骤：
[0379] (a)加热BHBA-001和乙醇的混合物；
[0380] (b)冷却所述混合物；以及
[0381] (c)从所述混合物中分离所述结晶形式。
[0382] 在一个实施方案中，所述BHBA-001和乙醇的混合物是固体BHBA-001和乙醇的混合物(例如浆液)。
[0383] 在一个实施方案中，所述固体BHBA-001是BHBA-001的结晶形式1。
[0384] 在一个实施方案中，所述加热在约40℃至所述混合物的回流温度(例如，约78℃)的温度下进行。
[0385] 在一个实施方案中，所述加热在约50℃至所述混合物的回流温度(例如，约78℃)的温度下进行。
[0386] 在一个实施方案中，所述加热在约60℃至所述混合物的回流温度(例如，约78℃)的温度下进行。
[0387] 在一个实施方案中，所述加热在所述混合物的回流温度(例如，约78℃)下进行(例如，所述加热是回流加热)。
[0388] 在一个实施方案中，所述加热持续约30分钟至约24小时的时间。
[0389] 在一个实施方案中，所述加热持续约30分钟至约12小时的时间。
[0390] 在一个实施方案中，所述加热持续约30分钟至约6小时的时间。
[0391] 在一个实施方案中，所述加热持续约30分钟至约3小时的时间。
[0392] 在一个实施方案中，所述加热持续约2小时的时间。
[0393] 在一个实施方案中，所述冷却是冷却至约5℃至约30℃的温度。
[0394] 在一个实施方案中，所述冷却是冷却至约5℃至约25℃的温度。
[0395] 在一个实施方案中，所述冷却是冷却至约20℃的温度。
[0396] 在一个实施方案中，在所述冷却之后进行(b’)老化所述冷却的混合物的步骤。
[0397] 在一个实施方案中，所述老化持续约30分钟至约24小时的时间。
[0398] 在一个实施方案中，所述老化持续约30分钟至约12小时的时间。
[0399] 在一个实施方案中，所述老化持续约30分钟至约6小时的时间。
[0400] 在一个实施方案中，所述老化持续约30分钟至约3小时的时间。
[0401] 在一个实施方案中，所述老化持续约1小时的时间。
[0402] 在一个实施方案中，所述分离是通过过滤进行的。
[0403] 实施例
[0404] 第1部分：脱保护
[0405] 向反应器中装入4-[5-(4,7-二甲基苯并呋喃-2-基)-1,2,4-噁二唑-3-基]苯甲酸甲酯(3.0kg，1重量)、四氢呋喃(22kg，7.1重量)和氢氧化钾水溶液(由在软化水(DEMI水，7.5kg，2.5重量)中的固体KOH(0.69kg，0.23重量)制得)。将批料加热至65±5℃并在65±5℃下搅拌大约3小时。将批料冷却至30-35℃，并排出反应混合物。经由串联过滤器将此溶液装入反应器中(即，澄清步骤)。经由串联过滤器向反应器中装入DEMI水(6kg，2.0重量)和无水乙醇(9.6kg，3.2重量)。将批料加热至55±5℃。
[0406] 第2部分：沉淀
[0407] 经由串联过滤器向反应器中加入浓缩的(30重量％)盐酸(1.35kg，0.45重量)，并将批料在55±5℃下搅拌大约15分钟。将批料冷却至20±3℃并在此温度下老化2小时。过滤产物，滤饼用DEMI水(1.5kg，0.5重量)和无水乙醇(8.4kg，2.8重量)的混合物洗涤两次。将批料在环境温度下在过滤器上干燥大约1小时，得到目标化合物BHBA-001。
[0408] 第3部分：形成结晶形式4
[0409] 经由串联过滤器将滤饼装入反应器中，并加入无水乙醇(37.8kg，12.6重量)。将混合物加热至回流，并将悬浮液在此温度下搅拌大约2小时。将批料冷却至20±3℃并在此温度下在20±3℃下老化大约1小时。过滤固体，用甲基叔丁基醚(2 x 11kg，2 x 3.7重量)洗涤，并在氮气流下在环境温度下干燥20小时，得到目标化合物即呈结晶形式4的BHBA-001(2.52kg，80％)。
[0410] 组合物、制剂和医疗用途
[0411] 组合物
[0412] 本发明的一个方面涉及一种组合物(例如药物组合物)，所述组合物包含如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0413] 在一个实施方案中，所述组合物是包含BHBA-001的结晶形式4的组合物(例如药物组合物)，其基本上不含BHBA-001的其他结晶形式(例如，形式1、2和3)。
[0414] 如在此上下文中所用的“基本上不含BHBA-001的其他结晶形式”是指在整体组合物中(a)BHBA-001的其他结晶形式(例如，形式1、2和3)的总重量与(b)BHBA-001的结晶形式4的重量的比率小于约1:10，优选小于约1:20，更优选小于约1:50。
[0415] 本发明的另一方面涉及一种制备组合物(例如药物组合物)的方法，所述方法包括将如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。
[0416] 用途
[0417] BHBA-001(包括如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4))可用于例如治疗通过(选择性)活化RARβ(例如RARβ2)得以改善的疾病和病症，例如像神经系统损伤诸如脊髓损伤。
[0418] 在活化视黄酸受体β(RARβ)的方法中的用途：
[0419] 本发明的一个方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)在于体外或体内活化视黄酸受体β(RARβ)(例如RARβ2)的方法中，例如在包括使RARβ(例如RARβ2)与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触的方法中的用途。
[0420] 本发明的一个方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)在于体外或体内(例如相对于RARα和/或RARγ)选择性地活化视黄酸受体β(RARβ)(例如RARβ2)的方法中，例如在包括使RARβ(例如RARβ2)与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触的方法中的用途。
[0421] 本发明的一个方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式在于体外或体内在神经元细胞中活化视黄酸受体β(RARβ)(例如RARβ2)的方法中，例如在包括使所述细胞与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触的方法中的用途。
[0422] 本发明的一个方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式在于体外或体内在神经元细胞中选择性地活化视黄酸受体β(RARβ)(例如RARβ2)的方法中，例如在包括使所述细胞与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触的方法中的用途。
[0423] 本发明的一个方面涉及一种在体外或体内活化视黄酸受体β(RARβ)(例如RARβ2)的方法，所述方法包括使RARβ(例如RARβ2)与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触。
[0424] 本发明的一个方面涉及一种在体外或体内(例如相对于RARα和/或RARγ)选择性地活化视黄酸受体β(RARβ)(例如RARβ2)的方法，所述方法包括使RARβ(例如RARβ2)与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触。
[0425] 本发明的一个方面涉及一种在体外或体内在神经元细胞中活化视黄酸受体β(RARβ)(例如RARβ2)的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触。
[0426] 本发明的一个方面涉及一种在体外或体内在神经元细胞中选择性地活化视黄酸受体β(RARβ)(例如RARβ2)的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触。
[0427] 在一个实施方案中，所述方法在体外执行。
[0428] 在一个实施方案中，所述方法在体内执行。
[0429] 在一个实施方案中，BHBA-001以药学上可接受的组合物(例如，如从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的)的形式提供。
[0430] 用于确定RARβ活化(例如RARβ2活化)的合适测定在本文中加以描述和/或在本领域中是已知的。
[0431] 在引起或促进神经突发育的方法等中的用途：
[0432] BHBA-001(包括如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4))可用于引起或促进神经突发育、神经突生长和/或神经突再生。
[0433] 如本文所用的术语“神经突”是指自神经元细胞体的突出，并且包括例如轴突和树突。
[0434] 本发明的一个方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)在引起或促进神经突发育、神经突生长和/或神经突再生的方法中，例如在包括在体外或体内使神经元与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触的方法中的用途。
[0435] 本发明的一个方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)在引起或促进神经突发育的方法中，例如在包括在体外或体内使神经元与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触的方法中的用途。
[0436] 本发明的一个方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)在引起或促进神经突生长的方法中，例如在包括在体外或体内使神经元与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触的方法中的用途。
[0437] 本发明的一个方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)在引起或促进神经突再生的方法中，例如在包括在体外或体内使神经元与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触的方法中的用途。
[0438] 本发明的一个方面涉及一种引起或促进神经突发育、神经突生长和/或神经突再生的方法，所述方法包括在体外或体内使神经元与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触。
[0439] 本发明的一个方面涉及一种引起或促进神经突发育的方法，所述方法包括在体外或体内使神经元与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触。
[0440] 本发明的一个方面涉及一种引起或促进神经突生长的方法，所述方法包括在体外或体内使神经元与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触。
[0441] 本发明的一个方面涉及一种引起或促进神经突再生的方法，所述方法包括在体外或体内使神经元与有效量的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001接触。
[0442] 在一个实施方案中，所述方法在体外执行。
[0443] 在一个实施方案中，所述方法在体内执行。
[0444] 在一个实施方案中，BHBA-001以药学上可接受的组合物(例如，如从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的)的形式提供。
[0445] 用于确定或测量神经突发育、神经突生长和神经突再生的合适测定在本文中加以描述和/或在本领域中是已知的。
[0446] 在治疗方法中的用途：
[0447] 本发明的另一方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)在通过疗法治疗人体或动物体的方法中的用途。
[0448] 在药物制造中的用途：
[0449] 本发明的另一方面涉及如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)在用于治疗的药物的制造中的用途。
[0450] 在一个实施方案中，所述药物包含BHBA-001的结晶形式(例如形式4)。
[0451] 治疗方法
[0452] 本发明的另一方面涉及一种治疗方法，所述方法包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或从BHBA-001的结晶形式(例如形式4)获得的BHBA-001，所述化合物优选呈药物组合物的形式。
[0453] 治疗的疾患
[0454] RARβ介导的疾患：
[0455] 在一个实施方案(例如，在治疗方法中的用途的实施方案、在药物制造中的用途的实施方案、治疗方法的实施方案)中，治疗是对由RARβ(例如RARβ2)介导的疾病或疾患的治疗。
[0456] 通过活化RARβ得以改善的疾患：
[0457] 在一个实施方案(例如，在治疗方法中的用途的实施方案、在药物制造中的用途的实施方案、治疗方法的实施方案)中，治疗是对通过活化RARβ(例如RARβ2)得以改善的疾病或疾患的治疗。
[0458] 在一个实施方案(例如，在治疗方法中的用途的实施方案、在药物制造中的用途的实施方案、治疗方法的实施方案)中，治疗是对通过(例如，相对于RARα和/或RARγ)选择性活化RARβ(例如RARβ2)得以改善的疾病或疾患的治疗。
[0459] 神经系统损伤：
[0460] 在一个实施方案(例如，结晶形式在治疗方法中的用途的实施方案、在药物制造中的用途的实施方案、治疗方法的实施方案)中，治疗是对神经系统损伤的治疗。
[0461] 如本文所用的术语“神经系统损伤”是指神经系统的任何损伤或伤害，包括例如机械诱导的(例如，由创伤引起的)神经系统的损伤或伤害；化学诱导的(例如，由神经毒素引起的；或由具有免疫抑制作用(无论是设计引起还是作为副作用)的治疗方案引起的)神经系统的损伤或伤害；或与疾病有关的(例如，由微生物、细菌、真菌或病毒感染引起的；由神经退化性病症引起的；或由任何其他神经组织相关病症引起的)神经系统的损伤或伤害。
[0462] 在一个实施方案中，治疗是对中枢神经系统(CNS)损伤的治疗。
[0463] 在一个实施方案中，治疗是对周围神经系统(PNS)损伤的治疗。
[0464] 如本文所用的术语“中枢神经系统”(CNS)是指脑和脊髓。如本文所用的术语“周围神经系统”(PNS)是指脑和脊髓外的神经元、神经和神经节。如本文所用的术语“神经系统”是指CNS和PNS两者。
[0465] 在一个实施方案中，治疗是对神经损伤的治疗。
[0466] 在一个实施方案中，治疗是对PNS神经损伤的治疗。
[0467] 在一个实施方案中，治疗是对CNS神经损伤的治疗。
[0468] 在一个实施方案中，治疗是对脊髓损伤的治疗。
[0469] 在一个实施方案中，治疗是对由创伤引起的脊髓损伤的治疗。
[0470] 在一个实施方案中，治疗是对视神经损伤的治疗。
[0471] 在一个实施方案中，治疗是对由青光眼引起的视神经损伤的治疗。
[0472] 在一个实施方案中，治疗是对神经病变的治疗。
[0473] 在一个实施方案中，治疗是对PNS神经病变的治疗。
[0474] 在一个实施方案中，治疗是对CNS神经病变的治疗。
[0475] 在一个实施方案中，治疗是对脊髓神经病变的治疗。
[0476] 在一个实施方案中，治疗是对视神经病变的治疗。
[0477] 在一个实施方案中，治疗是对糖尿病性神经病变(即与糖尿病相关的神经病变)的治疗。
[0478] 在一个实施方案中，治疗是对AIDS性神经病变(即与AIDS相关的神经病变)的治疗。
[0479] 在一个实施方案中，治疗是对麻风性神经病变(即与麻风病相关的神经病变)治疗。
[0480] 在一个实施方案中，治疗是对周围神经病变(例如，多发性神经病变、单发性神经病变、多发性单神经炎或自主神经病变)的治疗。
[0481] 在一个实施方案中，治疗是对神经退化性病症的治疗。
[0482] 在一个实施方案中，治疗是对认知障碍、记忆损害、记忆缺失、老年性痴呆、阿尔茨海默病、早期阿尔茨海默病、中期阿尔茨海默病、晚期阿尔茨海默病、认知损害或轻度认知损害的治疗；
[0483] 在一个实施方案中，治疗是对亨廷顿氏病的治疗。
[0484] 在一个实施方案中，治疗是对帕金森氏病的治疗。
[0485] 在一个实施方案中，治疗是对运动神经元疾病的治疗。
[0486] 在一个实施方案中，治疗是对局部麻痹的治疗。
[0487] 在一个实施方案中，治疗是对贝耳氏麻痹的治疗。
[0488] 在一个实施方案中，治疗是对神经性阳痿的治疗。
[0489] 在一个实施方案中，治疗是对由根治性前列腺切除术后神经创伤引起的神经性阳痿的治疗。
[0490] 在一个实施方案中，治疗是对麻痹，例如单瘫、四肢瘫或截瘫的治疗。
[0491] 在一个实施方案中，治疗是对由神经系统损伤引起的神经系统病症的治疗。
[0492] 在一个实施方案中，治疗是对由例如如上所述的神经病变引起的神经系统病症的治疗。
[0493] 在一个实施方案中，治疗是对由例如如上所述的神经病变引起的神经系统损伤的治疗。
[0494] 治疗
[0495] 如本文在治疗疾患的上下文中所用的术语“治疗”总体上涉及这样的治疗和疗法，不论是对人还是对动物(例如在兽医应用中)：其中获得了一些所需的治疗效果，例如，抑制疾患的进展，并且包括降低进展速率、终止进展速率、减轻疾患症状、改善疾患和治愈疾患。还包括作为预防性措施的治疗(即预防)。例如，用于尚未发展疾患但有发展疾患风险的患者，涵盖在术语“治疗”中(即，治疗疾患涵盖降低该疾患的风险)。
[0496] 例如，治疗包括预防局部麻痹，降低局部麻痹的风险，减轻局部麻痹的症状等。
[0497] 如本文所用的术语“治疗有效量”涉及当根据所需的治疗方案施用时，有效产生与合理的益处/风险比相称的一些所需治疗效果的化合物，或包含化合物的材料、组合物或剂型的量。
[0498] 组合疗法：
[0499] 术语“治疗”包括组合治疗和疗法，其中两种或更多种治疗或疗法例如顺序地或同时地组合。例如，本文所述的化合物还可以用于组合疗法，例如与其他剂联合使用。治疗和疗法的实例包括但不限于化学疗法(施用活性剂，包括例如药物、抗体(例如，如同免疫疗法)、前药(例如，如同光动力疗法、GDEPT、ADEPT等)；手术；放射疗法；光动力疗法；基因疗法；和控制饮食。
[0500] 例如，将利用如本文所述的化合物的治疗与一种或多种其他(例如，1种、2种、3种、4种)剂或疗法(例如治疗神经系统损伤的剂或疗法)组合可能是有益的。
[0501] 本发明的一个方面涉及如本文所述的化合物与如下所述的一种或多种另外的治疗剂的组合。
[0502] 特定的组合将由医师酌定，医师将使用熟练的从业者已知的公知常识和给药方案来选择剂量。
[0503] 剂(即，本文所述的化合物，加上一种或多种其他剂)可以同时地或顺序地施用，并且可以以单独变化的剂量方案且通过不同的途径施用。例如，当顺序地施用时，可以以紧密时间间隔(例如，在5-10分钟时间内)或以更长的间隔(例如，相隔1小时、2小时、3小时、4小时或更多个小时，或甚至在需要时相隔更长时间)施用剂，精确的剂量方案与治疗剂的特性相称。
[0504] 剂(即，本文所述的化合物，加上一种或多种其他剂)可以以单一剂型配制在一起，或者，可以将各剂分开配制并以药盒的形式一起提供，任选地与它们的使用说明书一起提供。
[0505] 其他用途
[0506] BHBA-001(包括如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4))还可以用作细胞培养添加剂来活化RARβ(例如RARβ2)，例如以引起或促进神经突发育、神经突生长和/或神经突再生。
[0507] BHBA-001(包括如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4))还可以用作例如体外测定的一部分，例如以便确定候选宿主是否可能受益于所考虑化合物的治疗。
[0508] BHBA-001(包括如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4))还可以例如在测定中用作标准品，以便鉴定其他化合物、其他RARβ(例如RARβ2)激动剂等。
[0509] 药盒
[0510] 本发明的一个方面涉及一种药盒，所述药盒包含(a)如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)，或包含如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)的组合物，例如优选地提供于合适的容器中和/或具有合适的包装；以及(b)使用说明书，例如关于如何施用所述化合物或组合物的书面说明书。
[0511] 书面说明书还可以包括活性成分对其而言是合适治疗的适应症清单。
[0512] 施用途径
[0513] BHBA-001的结晶形式(例如形式4)或包含BHBA-001的结晶形式(例如形式4)的药物组合物可以通过任何方便的施用途径施用于受试者，无论是以全身方式/周围方式还是以局部方式(即，在所需的作用部位)都可。
[0514] 施用途径包括但不限于口服(例如通过摄入)；颊面；舌下；透皮(包括例如通过贴片、膏药等)；透粘膜(包括例如通过贴片、膏药等)；鼻内(例如通过鼻喷剂)；眼部(例如通过滴眼剂)；肺部(例如通过使用例如气溶胶，例如经过口或鼻的吸入或吹入疗法)；直肠(例如通过栓剂或灌肠剂)；阴道(例如通过阴道栓剂)；肠胃外，例如通过注射，包括皮下、皮内、肌肉内、静脉内、动脉内、心内、鞘内、脊柱内、囊内、包膜下、眶内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内注射；通过例如皮下或肌内植入贮库或贮器。
[0515] 受试者/患者
[0516] 受试者/患者可以是脊索动物、脊椎动物、哺乳动物、胎盘哺乳动物、有袋类动物(例如，袋鼠、袋熊)、啮齿目动物(例如，豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠类(例如，小鼠)、兔类动物(例如，兔)、禽类(例如，鸟)、犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、马科动物(例如，马)、猪(porcine)(例如，猪(pig))、羊(例如，绵羊)、牛科动物(例如，奶牛)、灵长类动物、类人猿(例如，猴或猿猴)、猴(例如，狨猴、狒狒)、猿(例如，大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人。
[0517] 此外，受试者/患者可以是它的任何发育形式，例如胎儿。
[0518] 在一个优选的实施方案中，受试者/患者是人。
[0519] 制剂
[0520] 虽然可以单独施用BHBA-001的结晶形式(例如形式4)，但优选将其作为包含如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)的药物制剂(例如，组合物、制剂、药物)提供，再加上本领域技术人员熟知的一种或多种其他药学上可接受的成分，包括但不限于药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、调味剂和甜味剂。制剂还可包含其他活性剂，例如其他治疗剂或预防剂。
[0521] 因此，本发明还提供如上所定义的药物组合物，以及制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4)，以及本领域技术人员熟知的一种或多种其他药学上可接受的成分，例如载体、稀释剂、赋形剂等。如果配制成离散单位(例如片剂、胶囊剂等)，则每个单位含有预定量(剂量)的化合物。
[0522] 如本文所用的术语“药学上可接受的”涉及在合理医学判断范围内适用于与所考虑的受试者(例如，人)的组织接触地使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的化合物、成分、材料、组合物、剂型等。每种载体、稀释剂、赋形剂等在与制剂的其他成分相容的含义上也必须为“可接受的”。
[0523] 合适的载体、稀释剂、赋形剂等可以在标准药学著作，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1990；和Handbook of Pharmaceutical Excipients,第5版,2005中找到。
[0524] 制剂可通过药学领域中熟知的任何方法来制备。此类方法包括使BHBA-001(包括例如其结晶形式)与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。一般来讲，通过以下方式来制备制剂：使BHBA-001(包括例如其结晶形式，例如形式4)与载体(例如，液体载体、细分固体载体等)均匀且紧密地结合在一起，然后将产品成形(如果需要的话)。
[0525] 可以制备这样的制剂：用于提供快速或缓慢释放；立即、延迟、定时或持续释放；或它们的组合。
[0526] 制剂可以适当地为以下形式：液体、溶液(例如，水性的、非水性的)、悬浮液(例如，水性的、非水性的)、乳液(例如，水包油、油包水)、酏剂、糖浆、糖饵剂、漱口水、滴剂、片剂(包括例如包衣片剂)、颗粒剂、粉剂、锭剂(losenge)、软锭剂(pastille)、胶囊剂(包括例如硬明胶胶囊剂和软明胶胶囊剂)、扁囊剂、丸剂、安瓿、大丸剂、栓剂、阴道栓剂、酊剂、凝胶、糊剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂、油、泡沫、喷雾剂、雾或气溶胶。
[0527] 制剂可以适当地作为贴剂、橡皮膏、绷带、敷料等提供，这些材料浸渍有BHBA-001(包括例如其结晶形式，例如形式4)和任选的一种或多种其他药学上可接受的成分，包括例如渗透增强剂、浸透增强剂和吸收增强剂。制剂还可以适当地以贮库或贮器的形式提供。
[0528] BHBA-001(包括例如其结晶形式，例如形式4)可以溶解于、悬浮于一种或多种其他药学上可接受的成分中或与这些成分混合。化合物可以提供在设计用于将化合物靶向例如血液成分或一种或多种器官的脂质体或其他微粒中。
[0529] 适于口服施用(例如，通过摄取)的制剂包括液体、溶液(例如，水性的、非水性的)、悬浮液(例如，水性的、非水性的)、乳液(例如，水包油、油包水)、酏剂、糖浆、糖饵剂、片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、扁囊剂、丸剂、安瓿、大丸剂。
[0530] 适于颊面施用的制剂包括漱口水、锭剂、软锭剂，以及贴剂、橡皮膏、贮库和贮器。锭剂通常将化合物包含在调味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中。软锭剂通常将化合物包含在惰性基质，诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶中。漱口剂通常将化合物包含在合适的液体载体中。
[0531] 适于舌下施用的制剂包括片剂、锭剂、软锭剂、胶囊剂和丸剂。
[0533] 适于非口腔透粘膜施用的制剂包括液体、溶液(例如，水性的、非水性的)、悬浮液(例如，水性的、非水性的)、乳液(例如，水包油、油包水)、栓剂、阴道栓剂、凝胶、糊剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂、油，以及贴剂、橡皮膏、贮库和贮器。
[0534] 适于透皮施用的制剂包括凝胶、糊剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂和油，以及贴剂、橡皮膏、绷带、敷料、贮库和贮器。
[0535] 可以任选地与一种或多种辅助成分通过常规方法例如压制或模制来制备片剂。可通过在合适机器中压制任选地与一种或多种以下物质混合的呈自由流动形式诸如粉末或颗粒剂的BHBA-001(包括例如其结晶形式，例如形式4)来制备压制片剂：粘合剂(例如，聚维酮、明胶、阿拉伯胶、山梨糖醇、黄蓍胶、羟丙基甲基纤维素)；填充剂或稀释剂(例如，乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、二氧化硅)；崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)；表面活性剂或分散剂或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)；防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸)；调味剂、增味剂和甜味剂。可通过在合适机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备模制片剂。片剂可任选地包衣或刻痕并且可使用例如提供所需释放特征的不同比例的羟丙基甲基纤维素来配制以便提供其中化合物的缓慢释放或控制释放。片剂可任选地提供有例如以影响释放的包衣例如肠溶包衣以在肠的部分而不是胃内提供释放。
[0536] 软膏剂通常由BHBA-001(包括例如其结晶形式，例如形式4)和石蜡或水混溶性软膏基质制备。
[0537] 乳膏剂通常由BHBA-001(包括例如其结晶形式，例如形式4)和水包油乳膏基质制备。如果需要，乳膏基质的水相可包括例如至少约30％w/w的多元醇，即具有两个或更多个羟基的醇，诸如丙二醇、1,3-丁二醇、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇以及它们的混合物。局部制剂可理想地包括增强化合物穿过皮肤或其他患病区域的吸收或渗透的化合物。这种皮肤渗透促进剂的实例包括二甲基亚砜和相关的类似物。
[0538] 乳液通常由BHBA-001(包括例如其结晶形式，例如形式4)和油相制备，所述油相可任选地仅包含乳化剂(emulsifier)(也称为乳化剂(emulgent))，或者它可包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油两者的混合物。优选地，亲水性乳化剂可以与亲脂性乳化剂(充当稳定剂)一起被包含在内。还优选包含油和脂肪两者。同时，含有或不含稳定剂的乳化剂组成所谓的乳化蜡，且所述蜡连同油和脂肪一起组成形成乳膏制剂的油性分散相的所谓乳化软膏基质。
[0539] 合适的乳化剂和乳液稳定剂包括Tween 60、Span 80、十八十六醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯和月桂基硫酸钠。用于制剂的合适的油或脂肪的选择基于期望获得的化妆品特性，因为化合物在可能用于药物乳液制剂的大多数油中的溶解度可能非常低。因此，乳膏剂应优选为不油腻、无污染且可洗涤的产品，具有合适的稠度以避免从管或其他容器中渗漏。可以使用直链或支链的一元或二元烷基酯，例如二异己二酸酯、硬脂酸异十六烷基酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己酯或称为Crodamol CAP的支链酯的共混物，后三种是优选的酯。这些可以单独使用或组合使用，这取决于所需的特性。另选地，可以使用高熔点脂质，诸如白色软石蜡和/或液体石蜡或其他矿物油。
[0540] 适于鼻内施用的制剂(其中载体是液体)包括例如鼻喷剂、滴鼻剂；或者(通过喷雾器通过气溶胶施用)包括BHBA-001(包括例如其结晶形式，例如形式4)的水性或油性溶液。
[0541] 适于鼻内施用的制剂(其中载体是固体)可以包括例如呈现为具有在例如约20至约500微米范围内的粒度的粗糙粉末的那些，所述粗糙粉末以其中采用鼻吸的方式来施用，即，通过鼻道从靠近鼻子的粉末的容器中快速吸入。
[0542] 适于肺部施用的制剂(例如，通过吸入或吹入疗法)包括呈现为来自加压包装的气溶胶喷雾的那些，所述气溶胶喷雾借助于合适的推进剂，诸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。
[0543] 适于眼部施用的制剂包括滴眼剂，其中BHBA-001(包括例如其结晶形式，例如形式4)溶解或悬浮在合适的载体中，尤其是化合物的水性溶剂中。
[0544] 适于直肠施用的制剂可以呈现为具有合适基质的栓剂，所述基质包括例如天然或硬化油、蜡、脂肪、半液体或液体多元醇，例如可可油或水杨酸盐；或呈现为用于通过灌肠剂进行的治疗的溶液或悬浮液。
[0545] 适于阴道施用的制剂可呈现为除化合物外还含有如本领域中已知为适当的载体的阴道栓剂、棉塞、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。
[0546] 适于胃肠外施用(例如，通过注射)的制剂包括水性或非水性的、等渗的、无热原的、无菌液体(例如，溶液、悬浮液)，其中溶解、悬浮或以其他方式(例如，在脂质体或其他微粒中)提供了BHBA-001(包括例如其结晶形式，例如形式4)。这样的液体可以另外包含其他药学上可接受的成分，诸如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂以及溶质，所述药学上可接受的成分使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗。赋形剂的实例包括，例如，水、醇、多元醇、甘油、植物油等。用于在所述制剂中使用的合适的等渗载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸化林格氏注射液。通常，在液体中化合物的浓度是约1ng/mL至约10μg/mL，例如约10ng/ml至约1μg/mL。制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器，例如，安瓿和小瓶中，并且可存储于冷冻干燥(冻干)条件下，只需要在使用前即时添加无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。
[0547] 剂量
[0548] 本领域技术人员将理解，适当剂量的BHBA-001(包括例如如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4))以及包含BHBA-001(包括例如如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4))的组合物可以因患者而异。
[0549] 确定最优剂量总体上将涉及在治疗益处的水平和任何风险或有害副作用之间进行平衡。所选剂量水平将取决于各种因素，包括但不限于BHBA-001的活性、如本文所述的特定BHBA-001的结晶形式(例如形式4)的活性、施用途径、施用时间、BHBA-001的排泄速率、治疗持续时间；组合使用的其他药物、化合物和/或材料；疾患的严重性以及患者的种类、性别、年龄、体重、状态、一般健康状况和以前病史。BHBA-001(包括例如如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4))的量和施用途径将最终由医师、兽医或临床医生酌定，但是总体上将剂量选择成在作用部位获得局部浓度，其实现所需效果而不导致实质上有害或有毒的副作用。
[0550] 施用可在整个治疗过程中以一次剂量、连续或间歇地(例如在适当的时间间隔下，以分剂量)实现。确定最有效施用方式和剂量的方法为本领域技术人员熟知并且将随着用于治疗的制剂、治疗目的、所治疗的靶细胞和所治疗的受试者而变化。单次或多次施用可根据由治疗医师、兽医或临床医生选择的剂量水平和模式来执行。
[0551] 通常，BHBA-001(包括例如如本文所述的BHBA-001的结晶形式(例如形式4))的合适剂量在约10μg至约250mg的范围内(更典型地为约每天每千克受试者体重100μg至约25mg。
[0552] RARβ激动剂的生物建模
[0553] 用于治疗神经损伤的RARβ激动剂的生物建模-1
[0554] 一种在体内上调RARβ2表达的简单方法是使用RARβ激动剂，因为此受体的基因含有RARE，可引起自身调控(参见，例如Leid等人，1992)。此外，这是比基因疗法更有效的治疗CNS损伤的解决方案，因为类视色素是小的亲脂性分子，它可以潜在地到达所有受损的神经元，并且剂量可以容易地得到控制。
[0555] 在大鼠的C4位压迫大鼠的皮质脊髓束(CST)，并将RARβ激动剂(CD2019，6-(4-甲氧基-3-(1-甲基环己基)苯基)-2-萘甲酸，一种选择性RARβ激动剂)体内施加于侧脑室，持续2周。结果表明CD2019使CST神经元细胞体中的RARβ2上调。5周后，CST轴突的BDA标记显示，在损害的对照动物中，未发现标记的轴突穿过损害部位，但激动剂治疗的大鼠显示大量轴突穿过损害部位并延伸至损害部位几毫米之外。具体地说，在媒介物治疗的动物中，轴突(白色)未生长穿过SCI，但在CD2019治疗的动物中，观察到许多轴突穿过损伤部位。
[0556] 在5周后的行为测试中，CD2019治疗的大鼠表现出与未损害的动物一样的行为。
[0557] 结果在Borthwick等人，2016中示出。其中的图1示出了对于网格任务(A)和梁木任务(B)，大鼠脚步滑脱数量作为损害后周数的函数的两个图表。图1中的数据表明CD2019诱导损害动物的前肢的功能恢复。在损害之时，以180ng/kg/天通过侧脑室内(i.c.v.)施用CD2019治疗大鼠，持续14天。CD2019治疗的损害大鼠在网格任务(A)中在损害后4周表现出功能恢复，在梁木任务(B)中在损害后2周表现出功能恢复，而在媒介物治疗的损害动物中未出现显著恢复。误差线显示SEM。星号表示损害的治疗组(CD2019或媒介物)和未损害的媒介物治疗组之间的显著差异。*P<0.05，学生t检验，每个治疗组n＝6只大鼠。
[0558] 当培养来自这些RARβ激动剂治疗的动物的皮质切片时，观察到神经突生长，这与对照损害动物的皮质形成对照。具体地说，轴突未从成体媒介物治疗的皮层生长，但是却从成体CD2019治疗的皮层生长。
[0559] 用于治疗神经损伤的RARβ激动剂的生物建模-2
[0560] 在神经损伤的另一个实施例中，将左前肢位的四个DRG中的每一个DRG的四个感觉根切断并重新植入脊髓中。用许多具有不同选择性特征(如下表所示；所有人数据)的不同类视色素以及RARβ激动剂(CD2019和BHBA-001)治疗大鼠。
[0561]
[0562]
[0563] 在5周后的行为测试中，仅CD2019(已知的RARβ激动剂)和BHBA-001治疗的大鼠表现出与未损害的动物一样的行为。
[0564] 结果在Borthwick等人，2016中示出。其中的图2示出了大鼠感觉到胶带所需的时间(图A)和去除放置在大鼠受损前爪上的胶带所需的时间(图B)作为损伤后周数的函数的两个图表。在损害后两天用1mg/kg的受试化合物或媒介物治疗大鼠，然后在实验期间每周三次进行治疗。误差线显示SEM。***P<0.001，学生t检验，每个治疗组n＝3-4只大鼠。在第3周、第4周和第5周，相比于用其他类视色素激动剂和媒介物治疗的大鼠，用RARβ激动剂治疗的大鼠之间存在显著差异。
[0565] 图2中的数据进一步表明RARβ选择性是前肢功能恢复所必需的。如胶带感应(图A)和胶带去除(图B)所指示的，用RARβ激动剂治疗的损害大鼠表现出功能恢复。在用任何其他类视色素激动剂或媒介物治疗的损害大鼠中未出现恢复。
[0566] RARβ2信号传导与参与神经突生长的其他通路的相互作用：
[0567] 通过说明RARβ信号传导通路与已知参与轴突/神经突生长过程的其他通路的相互作用，也证明了RARβ信号传导通路在此过程中的重要性。
[0568] 磷酸肌醇3-激酶通路：
[0569] 已知刺激神经突生长的通路包括环AMP(cAMP)依赖性蛋白激酶A(PKA)和磷酸肌醇3-激酶(PI3K)，并且这些通路能够克服髓鞘抑制(参见，例如，Williams等人，2005)。
Borthwick等人，2016的作者还研究了RARβ信号传导通路如何与这些通路中的任一种相关联。
Borthwick等人，2016的作者还研究了RARβ信号传导通路如何与这些通路中的任一种相关联。
[0570] 在于髓鞘存在下生长的小脑神经元培养物中，证明了RARβ激动剂CD2019引起神经突生长，并且在存在阻止cAMP信号传导的PKA抑制剂(KT5720)的情况下，RARβ激动剂介导的神经突生长几乎未受到影响。
[0571] 然而，当在RARβ激动剂(CD2019)和PI3K抑制剂(LY295002)存在下培养小脑神经元时，神经突生长受到严重阻碍。具体地说，PI3K抑制剂(LY295002)在MAG存在下阻止RARβ激动剂(CD2019)介导的神经突生长，而cAMP抑制剂(KT5720)不影响RARβ激动剂(CD2019)介导的生长。此外，与对照培养物相比，用1μM RARβ激动剂CD2019治疗的小脑培养物的蛋白质印记显示神经元磷酸-Akt(phospho-Akt)(非PI3K的靶标，总Akt)显著增加4倍。这表明RARβ激动剂经由PI3K通路通过增加AKT的磷酸化而非AKT总库来刺激神经突生长。也证明了，在体内CD2019在受损的CST神经元中诱导磷酸化AKT(phosphor AKT)，这表明激动剂通过与体外相同的机制发挥作用(参见，例如，Agudo等人，2010)。
[0572] 虽然有兴趣将PI3K通路作为CNS再生的靶标，但是难以为激酶本身制备特异性靶标，然而可以制备可调节此通路的特异性RARβ激动剂。
[0573] 生物建模-方法细节
[0574] 动物手术
[0575] 所有动物实验均依照英国内政部法规进行。如前所述对成年雄性大鼠进行背柱损害(参见，例如，Bradbury等人，2002)。向流速为0.5μL/小时持续14天的微型渗透泵(AlzetTM)填充10μM RARβ激动剂(CD2019，购自CIRD Galderma,Sophia-Antipolis,France)或媒介物(10％DMSO的PBS溶液)。CD2019对RARβ的选择性是对RARα的选择性的5倍，且是对RARγ的选择性的12倍(参见，例如，Bernard等人，1992；Delescluse等人，1991)。将泵置于皮下并连接至脑输注导管(AlzetTM)，所述脑输注导管插入侧脑室(前囟坐标：喙尾侧(rostrocaudal)：-0.8mm，中外侧：-1.5mm，背腹侧：-4.5mm)。这提供了180ng/kg/天的CD2019剂量。所述剂量是基于先前对成年大鼠脑中RARα和RARβ信号传导的活化的体内研究(参见，例如，Goncalves等人，2009)。将经历行为研究和后续追踪的动物(每个治疗组n＝6)保持六周，然后通过致命性注射戊巴比妥来处死并经心脏灌注4％PFA。处理解剖的组织(颈脊髓和腰脊髓)用于免疫荧光。
[0576] 蛋白质印迹
[0577] 在手术后14天从成年大鼠的皮质中提取蛋白质(每组n＝3)。使用二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(Pierce)测定蛋白质的量。将蛋白质(10μg)上样到10％或6％的SDS-PAGE凝胶上。进行半干印迹，并用兔抗RARβ(Santa Cruz，稀释度1:500)、兔抗磷酸-Akt、兔抗Akt(均来自Cell Signalling Technology，稀释度1:1000)和小鼠抗GFAP(Sigma，稀释度1:1000)探测印迹。然后将膜与HRP缀合的二抗(抗小鼠IgM+A，1:5000，来自Abcam；和抗小鼠和抗兔，来自Amersham Pharmacia Biotech，1:5000)一起孵育，并通过应用化学发光底物(ECL；Amersham Pharmacia Biotech)显现HRP活性，接着将膜暴露于X射线胶片。对于上样对照，用小鼠抗βIII微管蛋白(Promega，稀释度1:1000)探测印迹并如上所述进行显影。通过Gene ToolsTM程序(Syngene)分析暴露胶片。将信号密度计算为信号强度与β-III微管蛋白的比率。
[0578] RT-PCR
[0579] 分离RNA并如前所述进行cDNA合成(参见，例如，Corcoran等人，2000)。对于大鼠RARβ2(登录号AJ002942)的PCR，使用以下引物：正向引物(ttcgtggacttttctgtgc)和反向引物(tgtagaaatccaggatctgcc)；得到134bp的产物。这些引物是大鼠RARβ2特异性的，因此不能检测其他RAR/RXR同种型。使用以下条件进行30个循环：94℃，30秒；56℃，30秒和72℃，30秒。
[0580] 神经突生长测定
[0581] 将从出生后3天的大鼠幼仔分离的小脑神经元在对照培养基、或补充有最终浓度为20μg/mL MAG-Fc的重组MAG-Fc嵌合体(R&DSystems)的培养基中的亲本3T3细胞单层上培养。在加入神经元之前将单层确立24小时，并将共培养物维持大约21小时。用4％多聚甲醛小心固定后，用GAP-43抗体(来自Graham Wilkin,Imperial College)以1:500稀释度免疫染色神经元，并如前所述针对大约120-150个神经元测量每个细胞最长神经突的平均长度(参见，例如，Williams等人，2005)。从成年大鼠获得DRG和皮质外植体，如前所述将它们在cellogen中培养(参见，例如，Corcoran和Maden，1999)。每个治疗组使用三个外植体。3天后通过用NF200(Sigma，稀释度1:200)进行免疫组织化学评估神经突生长。使用image pro plus软件测量神经突的平均长度。培养基由补充有葡萄糖(33mM)和谷氨酰胺(2mM)的含有N2(Invitrogen)的DMEM-F12(Invitrogen)组成。
[0582] CST神经元/束的标记和免疫组织化学
[0583] 如前所述，通过将BDA(10％的PBS溶液，Mw10K，来自Molecular Probes)注射到运动皮质中进行背柱压迫后，对下行皮质脊髓束轴突进行顺行追踪(参见，例如，Yip等人，2006)。在右侧皮质中进行六次注射(0.5μL BDA/注射点)。灌注动物(每个治疗组n＝6)，并将脊髓转移至PBS(加0.1％叠氮化钠)并嵌入明胶中(10％，300bloom；Sigma,Poole,UK)。将明胶块在4％多聚甲醛中硬化，并在振动切片机(Leica,Nussloch,Germany)上切割40μm的自由漂浮的连续横向切片并将这些切片收集在含有PBS(加0.1％叠氮化钠)的24孔板中。
[0584] 使用与外抗生物素蛋白-FITC(Amersham Pharmacia Biotech,UK，1:500)偶联的酪酰胺扩增试剂盒(Perkin-Elmer)检测BDA。由对治疗不知情的实验者，在距离损害部位以上5mm至以下5mm的测量间隔内对在1mm正方网格内观察到的所有BDA标记的纤维进行计数。在距中点相同的中外侧距离处(如中央管所见)，在每第三个切片中计数BDA阳性轴突(每只动物每个分析点5个切片，每只动物总共40个切片)。
[0585] 以0.5μL/分钟的速率将2μL的5％Fluorogold(FG，MolecularProbes)注射到颈脊髓中2mm深处(C3-C4)，通过逆行追踪标记CST神经元(每组n＝3只大鼠)。在假动物中，将FG注射到脊髓内侧线两侧0.5mm处(每侧1μL)，并且在损害动物中将FG(2μL)注射到损伤中。14天后，将皮质在4％多聚甲醛(PFA)中固定2小时，包埋在OCT化合物中并冷冻保存。切割矢状切片(12μm)并取含有来自外侧3.4-3.9mm处的2个切片的4个连续载玻片用于分析(参见，例如，Paxinos和Watson，2002)。
[0586] 使用抗兔磷酸-Akt(Cell Signalling technology，稀释度1:100)进行免疫组织化学。所用的二抗是缀合的抗兔Cy3(Jackson，以1:1000使用)。使用Roperscientific数字相机以100x放大率捕获图像。
[0587] 行为测试
[0588] 如前所述进行行为测试(参见，例如，Bradbury等人，2002)。在手术前首先训练大鼠(每个治疗组n＝6)走网格和走梁木，持续两周；然后，在损害后由对试验治疗不知情的观察者对大鼠进行测试，每周一次，持续五周。
[0589] 图表和统计值
[0590] 使用Sigma plot绘制图表。数据表示为平均值±S.E.M，并使用学生t检验使用Sigma Stat软件(SPSS Software Ltd,Birmingham UK)进行统计分析。均值、SEM、SD和P值作为汇总统计值提供。
[0591] BHBA-001的生物活性
[0592] RARα、RARβ和RARγ受体的反式活化测定
[0593] 用gal4融合受体构建体进行转录反式活化测定，所述构建体使用小鼠或人的在COS-7细胞中与pFR-luc(Stratagene)报告构建体共转染的每个RAR配体结合结构域产生。因此，转染的细胞将组成型表达gal4-RAR融合蛋白，所述gal4-RAR融合蛋白继而可被所有反式视黄酸(atRA)反式活化以诱导由gal4UAS驱动的荧光素酶的表达。
[0594] 简言之，在第1天，将96孔板每孔接种8000个细胞，然后放置过夜恢复。在第2天，使用脂质转染胺(lipofectamine)(Invitrogen)，以每孔100ng报告质粒和10ng适当受体质粒共转染细胞。在第3天，将含有脂质转染胺的培养基替换为不含酚红的DMEM，然后向每个孔的100μL总体积中加入溶于1μL DMSO中的受试化合物。最后，在第4天，裂解细胞并通过BrightGloTM试剂(Promega)提供其荧光素酶底物，然后在MicroBeta TriLuxTM(Perkin Elmer)上读板。
[0595] 在每个板上，一式两份地运行atRA的8点剂量-反应曲线，并且还一式两份地生成受试化合物的剂量-反应曲线。
[0596] 通过使用GraphPad PrismTM拟合剂量-反应曲线生成受试化合物和atRA两者的EC50数据。将受试化合物的数据引用为EC50值。在已生成重复数据的情况下，将数据引用为来自单独实验的平均EC50。
[0597] 数据总结在下表中。EC50值报告为三次或更多次测定的平均值。
[0598]
[0599]
[0600] (*)“RARα活性”与“RARβ活性”的比率称为“RARα/RARβ比”，反映了相比RARα对RARβ的倍数选择性。大于1的值表示对RARβ的选择性。
[0601] (**)“RARγ活性”与“RARβ活性”的比率称为“RARγ/RARβ比”，反映了相比RARγ对RARβ的倍数选择性。大于1的值表示对RARβ的选择性。
[0602] BHBA-001是RARβ的激动剂，RARβ活性小于2nM。
[0603] 相比RARα，BHBA-001对RARβ也具有选择性：相比RARα，对RARβ的选择性约为13.4倍。
[0604] 相比RARγ，BHBA-001对RARβ也具有选择性：相比RARγ，对RARβ的选择性约为5.6倍。
[0605] 两种优选化合物的其他小鼠和人数据总结在下表中。
[0606]
[0607] 前面已经描述了本发明的原理、优选实施方案和操作模式。然而，本发明不应当被解释为限制于所讨论的特定实施方案。相反，上述实施方案应被视为说明性的而非限制性的，并且应当理解，本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围的情况下对那些实施方案做出改变。
[0608] 参考文献
[0609] 本文引用了许多专利和出版物，以便更全面地描述和公开本发明以及本发明所属领域的现有技术。下面提供这些参考文献的完整引用。
[0610] 这些参考文献中的每一篇均以引用方式整体并入本公开，其程度如同每个单独的参考文献被具体和单独地指出以引用方式并入。
[0611] Agudo M，Yip P，Davies M，Bradbury E，Doherty P，McMahon S，Maden M，Corcoran JP(2010)A retinoic acid receptor beta agonist(CD2019)overcomes inhibition of axonal outgrowth via phosphoinositide 3-kinase signalling in the injured adult spinal cord.Neurobiol Dis 37：147-155.
[0612] Bastien J，Rochette-Egly C(2004)Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes.Gene 328：1-16.
[0613] Bernard et al.，1992，“Identification of synthetic retinoids with selectivity for human nuclear retinoic acid receptor gamma”，Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.186，pp.977-983.
[0614] Borthwick et al.，2016，“Bicycloheteroaryl-heteroaryl-benzoic acid compounds as retinoic acid receptor beta(RARβ)agonists”，international patent application number PCT/EP2015/080029 filed 16 December 2015，published as WO 2016/097004 A1 on 23 June 2016.
[0615] Bradbury EJ，Moon LD，Popat RJ，King VR，Bennett GS，Patel PN，Fawcett JW，McMahon SB(2002)Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury.Nature 416：636-640.
[0616] Cai et al.，2003，“Substituted 3-aryl-5-aryl-[1，2，4]-oxadiazoles and analogs as activators of caspases and inducers of apoptosis and the use thereof”，US Patent Publication No2003/0045546 A1 published 06 March 2003.[0617] Cai et al.，2005，“Substituted 3-aryl-5-aryl-[1，2，4]-oxadiazoles and analogs as activators of caspases and inducers of apoptosis and the use thereof”，US Patent Publication No.2005/0154012 A1 published 14 July 2005.[0618] Corcoran J，Maden M(1999)Nerve growth factor acts via retinoic acid synthesis to stimulate neurite outgrowth[letter].Nat Neurosci 2：307-308.[0619] Corcoran J，Shroot B，Pizzey J，Maden M(2000)The role of retinoic acid receptors in neurite outgrowth from different populations of embryonic mouse dorsal root ganglia[In Process Citation].J Cell Sci 113(Pt 14)：2567-2574.[0620] Corcoran J，So PL，Barber RD，Vincent KJ，Mazarakis ND，Mitrophanous KA，Kingsman SM，Maden M(2002)Retinoic acid receptor beta2 and neurite outgrowth in the adult mouse spinal cord in vitro.J Cell Sci 115：3779-3786.
[0621] Delescluse et al.，1991，“Selective high affinity retinoic acid receptor alpha or beta-gamma ligands，”Mol.Pharmacol.，Vol.40，pp.556-562.[0622] Goncalves et al.，2009，“Sequential RARbeta and alpha signalling in vivo can induce adult forebrain neural progenitor cells to differentiate into neurons through Shh and FGF signalling pathways”，Dev.Biol.，Vol.326，pp.305-313.
[0623] He Z，Koprivica V(2004)The nogo signaling pathway for regeneration block.Annu Rev Neurosci 27：341-368.
[0624] Kikuchi et al.，2000，“Synthesis and structure-activity relationships of 5，6，7，8-tetrahydro-5，5，8，8-tetramethyl-2-quinoxaline derivatives with retinoic acid receptor α activity”，J.Med.Chem.，Vol.43，pp.409-419.
[0625] Kikuchi et al.，2001，“Heterocycle-containing carboxylic acid derivative and drug containing the same”，US Patent No 6,329,402 granted 11 December 2001.
[0626] Kwon BK，Tetzlaff W(2001)Spinal cord regeneration：from gene to transplants.Spine 26：S13-S22.
[0627] Leid M，Kastner P，Chambon P(1992)Multiplicity generates diversity in the retinoic acid signalling pathways.Trends Biochem Sci 17：427-433.
[0628] Lund et al.，2005，“Discovery of a potent，orally available，and isoform-selected retinoica acid β2 receptor agonist”，J.Med.Chem.，Vol.48，pp.7517-7519.[0629] Maden and Corcoran，2000，“Factor”，international patent(PCT)publication number WO 00/57900 A2，published 05 October 2000.
[0630] Maden et al.，1996，“Vitamin A-deficient quail embryos have half a hindbrain and other neural defects”，Curr.Biol.，Vol.6，pp.417-426.
[0631] Olsson et al.，2009，“Compounds with activity at retinoic acid receptors”，US Patent Publication No.2009/0176837 A1 published 09 July 2009.[0632] Paxinos and Watson，2002，“The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates”，2nd edition，Academic Press，London.
[0633] Quinn SD，De Boni U(1991)Enhanced neuronal regeneration by retinoic acid of murine dorsal root ganglia and of fetal murine and human spinal cord in vitro.In Vitro Cell Dev Biol 27：55-62.
[0634] Schnell L，Schneider R，Kolbeck R，Barde YA，Schwab ME(1994)Neurotrophin-3 enhances sprouting of corticospinal tract during development and after adult spinal cord lesion[see comments].Nature 367：170-173.
[0635] Seino et al.，2004，“Prevention of acute and chronic allograft rejection by a novel retinoic acid receiptor-α-selective agonist”，Inter.Immunology，Vol.16，No.5，pp.665-673.
[0636] So PL，Yip PK，Bunting S，Wong LF，Mazarakis ND，Hall S，McMahon S，Maden M，Corcoran JP(2006)Interactions between retinoic acid，nerve growth factor and sonic hedgehog signalling pathways in neurite outgrowth.Dev Biol 298：167-175.[0637] Tagami et al.，1997，“Fused-ring carboxylic acid derivatives”，European patent publication number EP 0889032 A1，published 07 January 1999.
[0638] Tagami et al.，2000a，“Fused-ring carboxylic acid derivatives”，US Patent No 6,121,309 granted 19 September 2000.
[0639] Tagami et al.，2000b，“Carboxylic acid derivatives having fused rings”，US Patent No 6,110,959 granted 29 August 2000.
[0640] Tagami et al.，2002，“Carboxylic acid derivatives having fused rings，”US Patent No 6,358,995 granted 19 March 2002.
[0641] Tsuda et al.，1999，“Pyrrole derivatives and medicinal composition”，US Patent No 5,998,459 granted 07 December 1999.
[0642] White et al.，1998，“，Defects in embryonic hindbrain development and fetal resorption resulting from vitamin A deficiency in the rat are prevented by feeding pharmacological levels of all-trans-retinoic acid”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.95，pp.13459-12364.
[0643] Williams G，Eickholt BJ，Maison P，Prinjha R，Walsh FS，Doherty P(2005)A complementary peptide approach applied to the design of novel semaphorin/neuropilin antagonists.J Neurochem 92：1180-1190.
[0644] Wong LF，Yip PK，Battaglia A，Grist J，Corcoran J，Maden M，Azzouz M，Kingsman SM，Kingsman AJ，Mazarakis ND，McMahon SB(2006)Retinoic acid receptor beta2 promotes functional regeneration of sensory axons in the spinal cord.Nat Neurosci 9：243-250.
[0645] Yip PK，Wong LF，Pattinson D，Battaglia A，Grist J，Bradbury EJ，Maden M，McMahon SB，Mazarakis ND(2006)Lentiviral vector expressing retinoic acid receptor beta2 promotes recovery of function after corticospinal tract injury in the adult rat spinal cord.Hum Mol Genet 15：3107-3118.
[0646] Yoshimura et al.，2000，“Discovery of novel and potent retinoic acid receptor a agonists：synthesis and evaluation of benzofuranyl-pyrrole and benzothiophenyl-pyrrole derivatives”，J.Med.Chem.，Vol.43，pp.2929-2937.
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种快凝充填胶凝材料 | 2020-05-08 | 575 |
| 一种防水卷材用水泥基胶黏剂水剂及其制备方法 | 2020-05-11 | 584 |
| 一种水泥基渗透结晶型建筑防水材料及制备方法 | 2020-05-11 | 81 |
| 一种高强轻集料混凝土制备方法及泵送工艺 | 2020-05-11 | 183 |
| 提高甜菜产量和糖度的结合物联网的种植方法和灌溉装置 | 2020-05-14 | 253 |
| 一种具有抗低温性能的胶凝材料及制备方法 | 2020-05-11 | 766 |
| 一种高性能环保软土固化剂及其制备方法 | 2020-05-12 | 584 |
| 一种纳米凝胶聚合铝型液体无碱速凝剂及其制备方法 | 2020-05-12 | 996 |
| 透水沥青外加剂、透水沥青及透水沥青路面 | 2020-05-11 | 359 |
| 一种利用磷肥副产硅胶制备的纳米晶核早强剂及其制备方法 | 2020-05-12 | 788 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
早期强度热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈