一种组织工程皮肤构建新方法
专利汇可以提供一种组织工程皮肤构建新方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种组织工程 皮肤 构建方法，该方法采用人表皮干细胞、真皮 成 纤维 细胞 作为 种子 细胞，以经过人胎盘IV型胶原修饰的同种无细胞真皮基质作为 支架 ，利用气液界面分离培养法复合构建为一种有活性的双层组织工程皮肤。该方法构建的组织工程皮肤更接近天然皮肤的结构，组织形态学显示该组织工程皮肤具有表皮和真皮双层结构，其中真皮胶原支架结构完整，表皮层中具有多层不同分化程度的细胞，达到组织工程皮肤的形态学要求。，下面是一种组织工程皮肤构建新方法专利的具体信息内容。
1.一种组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：采用人表皮干细胞、真皮成纤维细胞作为种子细胞，以经过人胎盘IV型胶原修饰的同种无细胞真皮基质作为支架，利用气液界面分离法复合构建为一种有活性的双层组织工程皮肤。
2.如权利要求1所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
(1)表皮干细胞的分离和培养
取同种皮肤组织小块，含双抗的PBS反复冲洗，置Dispase Ⅱ中浸泡过夜，冷消化分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，胰酶热消化，分离表皮干细胞，过滤并接种于IV型胶原包被的培养瓶中，通过差速粘附筛选表皮干细胞，加专用培养基培养；
(2)成纤维细胞的分离和培养
取步骤(1)中分离的真皮，PBS缓冲液冲洗，剪碎，真皮面向下散在接种于培养瓶，倒置一段时间后，加入成纤维细胞专用培养基培养；
(3)同种无细胞真皮的制备
采用高渗盐溶液-SDS-胰蛋白酶法制备同种无细胞真皮：取同种刃厚皮片，使其浸于Nacl溶液中恒温震荡，脱去表皮；在十二烷基硫酸钠-磷酸盐溶液中超声处理，破碎细胞；
以胰蛋白酶消化，清除细胞残骸；最后以生理盐水清洗备用；
(4)IV型胶原修饰真皮支架
取步骤(3)所得的同种无细胞真皮，将IV型胶原铺于真皮支架的乳头层面上，并放置于培养箱中过夜；
(5)接种成纤维细胞
用丝裂霉素C处理步骤(2)所得第3或第4代成纤维细胞，接种于步骤(4)所得真皮支架上，加入含FBS的DMEM培养基，置培养箱中培养1～3天；
(6)接种表皮干细胞
将步骤(1)所得第2或第3代表皮干细胞接种于步骤(5)所得的真皮支架上，添加足量培养基使真皮支架完全浸没，置培养箱中培养1周，形成初期复合物；
(7)气液分离培养构建组织工程皮肤
以Transwell培养小室作为气液分离支架，将步骤(6)所得复合物转移至该气液分离支架上，添加培养基，培养基液面须与复合物最底部平齐，置培养箱中培养1周，即完成组织工程皮肤的制备过程。
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3.如权利要求2所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：步骤(1)中取2～4cm同种皮肤小块；所述的Dispase Ⅱ的浓度为2.4U/ml；所述的表皮干细胞专用培养基为含
5％胎牛血清的KSFM培养基。
4.如权利要求2所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：步骤(2)中所述的倒置时间为5小时；所述的专用培养基为含10％胎牛血清的L-DMEM培养液。
5.如权利要求2所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：步骤(3)中所述的十二烷基硫酸钠-磷酸盐溶液的浓度为5g/L；所述的胰蛋白酶的浓度为0.25％。
6.如权利要求2所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：步骤(4)中所述的IV型胶原的浓度为100μg/ml。
7.如权利要求2所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：步骤(5)中所述的丝裂霉素C的浓度为10μg/ml～40μg/ml；所述的FBS在DMEM培养基中的含量为10％；培养箱中的培养条件为37℃，5％CO2饱和湿度。
8.如权利要求2所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：步骤(6)中的表皮干细胞专用培养基为含5％胎牛血清的KSFM培养基；培养箱中的培养条件为37℃，5％CO2饱和湿度。
9.如权利要求2所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：步骤(7)中培养箱的培养条件为37℃，5％CO2饱和湿度；复合皮肤专用培养基为含10％胎牛血清的KSFM培养基。
10.如权利要求2所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：所述的同种皮肤组织源自健康儿童包皮环切术所切除的包皮组织。
一种组织工程皮肤构建新方法
技术领域
背景技术
发明内容
具体实施方式
剪除脂肪和皮下组织，剪成0.5×0.5cm 的小块，移入Dispase Ⅱ(2.4U/ml)中，4℃过夜。
分离真皮、表皮，收集表皮皮片并剪碎，37℃条件下置0.25％胰酶与0.02％的EDTA混合消化液内消化30分钟，血清终止，200目细胞筛子过滤。1000rpm离心5分钟，弃上清，表皮干
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细胞专用培养基重悬，调定细胞密度为(1～2)×10ml，接种于IV型胶原包被的培养瓶中，快速筛选15分钟后，弃去未贴壁细胞，更换新的培养基于CO2培养箱中培养，每3天换液1次，约7天细胞达80％汇合时，传代。所述的表皮干细胞专用培养基为含5％胎牛血清的
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