促进马铃薯试管苗繁育的复合菌剂及其制备和使用方法
阅读：876发布：2020-05-08
专利汇可以提供促进马铃薯试管苗繁育的复合菌剂及其制备和使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种促进 马 铃薯试管苗繁育的复合菌剂及其制备和使用方法。该复合菌剂的功能菌种包括Fictibacillus halophilus、Bacillus gobiensis和Hymenobcter jeollabukensis，三种菌种的有效活菌数比为(1～3)：(2～5)：(2～5)。本发明复合菌剂接种于马铃薯试管苗，可显著促进试管苗 节点 数、根长和茎粗增加，增加约60％～80％，显著提高了试管苗繁殖量和繁殖速度，显著促进了移苗后苗的成活率和生长，显著促进移栽后苗的生长发育，提高 块 茎数量、增加单个块茎体积和重量；增强了苗对土传病害的抗性，具有抗晚疫病和疮痂病等土传病害和盐 碱 胁迫等逆境潜 力 。，下面是促进马铃薯试管苗繁育的复合菌剂及其制备和使用方法专利的具体信息内容。
1.一种促进马铃薯试管苗繁育的复合菌剂，其中，该复合菌剂的功能菌种包括嗜盐芽孢杆菌(Fictibacillus halophilus)、戈壁芽孢杆菌(Bacillus gobiensis)和全罗北道薄层菌(Hymenobcter jeollabukensis)；
所述嗜盐芽孢杆菌、所述戈壁芽孢杆菌和所述全罗北道薄层菌的有效活菌数比为(1～
3)：(2～5)：(2～5)。
2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其中，该复合菌剂为液态复合菌剂或固体粉状复合菌剂；
优选地，液态复合菌剂包括缓冲液和功能菌种；所述功能菌种在复合菌剂中的总有效活菌数浓度为109～1012CFU/mL；
优选地，固体粉状复合菌剂包括功能菌种和维持菌种存活的添加剂，所述功能菌种在复合菌剂中的总有效活菌数浓度为109～1012CFU/g。
3.根据权利要求2所述的复合菌剂，其中，所述功能菌种中，所述嗜盐芽孢杆菌、所述戈壁芽孢杆菌和所述全罗北道薄层菌的有效活菌数比为1:2:2。
4.根据权利要求2所述的复合菌剂，其中，所述缓冲液包括pH为7.2的K2HPO4-KH2PO4缓冲液。
5.权利要求1～4任一项所述复合菌剂的制备方法，其包括以下步骤：
将功能菌种嗜盐芽孢杆菌、戈壁芽孢杆菌和全罗北道薄层菌分别进行活化、培养获得指数生长中后期的培养液，培养液离心重悬分别获得各个功能菌种；
按照各个功能菌种的有效活菌数比例制备成液态或固体粉状的复合菌剂。
6.权利要求1～4任一项所述复合菌剂在促进马铃薯试管苗繁育中的应用。
7.一种促进马铃薯试管苗繁育的方法，其包括以下步骤：
取权利要求1～4任一项所述复合菌剂与高温高压灭菌后温度降至约50～55℃的MS培养基混合均匀，迅速转入培养瓶中；待凝固后，插入马铃薯试管苗的茎段，于光照培养。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，MS培养基中，每毫升MS培养基中初始接种的功能菌种总有效活菌数为103～107CFU。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，MS培养基中，每毫升MS培养基中初始接种的功能菌种总有效活菌数为105CFU。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，光照培养的温度为25～30℃，培养时间为3～6d。
促进马铃薯试管苗繁育的复合菌剂及其制备和使用方法
技术领域
背景技术
[0002] 马铃薯是全球粮菜兼用作物，是水稻、小麦和玉米之外的第四大主粮作物。马铃薯生产中，病害是影响马铃薯产量和品质的最重要因素，很多病害都可通过种薯(含块茎切块)携带传播。通过试管苗的工业化和规模化繁育种薯可防止种薯带病带毒、降低病害传播，促进马铃薯产业发展。
[0003] 马铃薯试管苗(快繁苗)采用离体茎尖培养、之后亚克隆扩繁和移苗栽培来生产马铃薯种薯。然而，离体茎尖培养或茎段扩繁过程中反复继代，常会出现试管苗生长缓慢、茎细和根不发达等发育不良问题，这些问题使得试管苗继代繁育周期延长和移栽后植株不生长、叶片脱落甚至死亡，最终导致种薯产量低、质量差、引起生产成本增加。这主要是因为试管苗根系不够发达、茎细、苗弱，无法弥补水分快速从气孔散失，不能有效从土壤中获取营养，养分不能有效运输，等等。
发明内容
[0004] 基于现有技术中所存在的技术问题，本发明的第一目的在于提供一种促进马铃薯试管苗繁育的复合菌剂和制备方法；本发明的第二目的在于提供复合菌剂在促进马铃薯试管苗繁育中的应用；本发明的第三目的在于提供一种促进马铃薯试管苗繁育的方法。
[0005] 本发明的目的通过以下技术手段得以实现：
[0006] 一方面，本发明提供一种促进马铃薯试管苗繁育的复合菌剂，其中，该复合菌剂的功能菌种包括嗜盐芽孢杆菌(Fictibacillus halophilus)、戈壁芽孢杆菌(Bacillus gobiensis)和全罗北道薄层菌(Hymenobcter jeollabukensis)；Fictibacillus halophilus和Hymenobcter jeollabukensis可于韩国菌种保藏中心购买，保藏编号分别为(KCTC 33758和KCTC 52741)，Bacillus gobiensis可于中国普通微生物菌种保藏管理中心购买，保藏编号为CGMCC 1.12902。
[0007] 所述嗜盐芽孢杆菌(Fictibacillus halophilus)、所述戈壁芽孢杆菌(Bacillus gobiensis)和所述全罗北道薄层菌(Hymenobcter jeollabukensis)的有效活菌数比为(1～3)：(2～5)：(2～5)。
[0008] 本发明的功能菌种Fictibacillus halophilus、Bacillus gobiensis和Hymenobcter jeollabukensis可通过市售获得或保藏中心购买获得。
[0009] 本发明的功能菌种中最重要的是产植物激素、其次为固氮和产ACC脱氨酶等。发明人研究发现，采取本发明的三种功能菌种可显著促进试管苗节点数、根长和茎粗的增加，增加约60％～80％，显著提高了试管苗繁殖量和繁殖速度，显著促进了移苗后苗的成活率和生长，增强了苗对土传病害的抗性，显著提高了种薯(微型薯)的产量和质量。本发明的三种功能菌种相互之间不存在明显的相互拮抗。
[0010] 上述的复合菌剂中，优选地，该复合菌剂为液态复合菌剂或固体粉状复合菌剂。
[0011] 上述的复合菌剂中，优选地，液态复合菌剂包括缓冲液和功能菌种；所述功能菌种在复合菌剂中的总有效活菌数浓度为109～1012CFU/mL。
[0012] 上述的复合菌剂中，优选地，固体粉状复合菌剂包括功能菌种和维持菌种存活的添加剂，所述功能菌种在复合菌剂中的总有效活菌数浓度为109～1012CFU/g。
[0013] 上述的复合菌剂中，优选地，所述功能菌种中，所述嗜盐芽孢杆菌(Fictibacillus halophilus)、所述戈壁芽孢杆菌(Bacillus gobiensis)和所述全罗北道薄层菌(Hymenobcter jeollabukensis)的有效活菌数比为1:2:2。
[0014] 上述的复合菌剂中，优选地，所述缓冲液包括pH为7.2的K2HPO4-KH2PO4缓冲液。
[0015] 另一方面，本发明还提供上述所述复合菌剂的制备方法，其包括以下步骤：
[0016] 将功能菌种嗜盐芽孢杆菌(Fictibacillus halophilus)、戈壁芽孢杆菌(Bacillus gobiensis)和全罗北道薄层菌(Hymenobcter jeollabukensis)分别进行活化、培养获得指数生长中后期的培养液，培养液离心重悬分别获得各个功能菌种；
[0017] 按照各个功能菌种的有效活菌数比例制备成液态或固体粉状的复合菌剂。
[0018] 另一方面，本发明还提供上述复合菌剂在促进马铃薯试管苗繁育中的应用。
[0019] 再一方面，本发明还提供一种促进马铃薯试管苗繁育的方法，其包括以下步骤：
[0021] 上述的方法中，优选地，在MS培养基中，每毫升MS培养基中初始接种的功能菌种总有效活菌数为103～107CFU；优选为105CFU。
[0022] 上述的方法中，优选地，光照培养的温度为25～30℃，培养时间为3～6d。
[0023] 本发明的有益效果：
[0024] 本发明复合菌剂接种于马铃薯试管苗，可显著促进试管苗节点数、根长和茎粗的增加，增加约60％～80％，显著提高了试管苗繁殖量和繁殖速度，显著促进了移苗后苗的成活率和生长，增强了苗对土传病害的抗性，显著提高了种薯(微型薯)的产量和质量，获得马铃薯提高移苗成活率，加速繁育；具有抗晚疫病和疮痂病等土传病害和盐碱胁迫等逆境潜力。附图说明
[0025] 图1为本发明实施例3中复合菌剂对马铃薯试管苗生长的促进效果(图中左侧为接种菌剂组，右侧为空白对照组)；
[0026] 图2为本发明实施例4中接种复合菌剂繁育出的试管苗改善了移栽后的结薯(图中左侧为接种菌剂组，右侧为空白对照组)。
[0027] 图3a为本发明实施例4中接种复合菌剂繁育出的试管苗移栽土壤后的生长情况侧视图(图中左侧为接种菌剂的实验组，右侧为空白对照组)；
[0028] 图3b为本发明实施例4中接种复合菌剂繁育出的试管苗移栽土壤后的生长情况俯视图(图中左侧为接种菌剂的实验组，右侧为空白对照组)。
具体实施方式
[0029] 为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
[0030] 本发明以下实施例中的配方组成为：
[0031] 以下各实施例中所用到的培养基配方：
[0032] 1、修改的R2A培养基：葡萄糖1.3g，细菌学蛋白胨1.3g，酸水解酪素1.3g，酵母提取物1.3g，K2HPO3·3H2O 0.8g，丙酮酸钠0.8g，MgSO4·7H2O 0.15g，蒸馏水1000mL；琼脂固体培养基另外加琼脂15g。
[0033] 2、固氮培养基：KH2PO4 0.2g，CaCO3 5g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖10g，NaCl 1.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然。
[0034] 3、无机磷培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，Ca3(PO4)2 25g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然。
[0035] 4、有机磷培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，植酸钙25g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然。
[0036] 5、MS培养基：KNO3 1.9g，NH4NO3 1.7g，KH2PO4 0.17g，MgSO4·7H2O 0.37g，CaCl2·2H2O，0.440g；KI 0.83mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，Na2MoO4·
2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，Na2EDTA 37.25mg，FeSO4·7H2O
27.85mg；肌醇100mg，甘氨酸2mg，盐酸硫胺素VB1 0.1mg，盐酸吡哆醇VB6 0.5mg，烟酸VB5或VPP 0.5mg，蔗糖30g；琼脂7g；蒸馏水1000mL。
2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，Na2EDTA 37.25mg，FeSO4·7H2O
27.85mg；肌醇100mg，甘氨酸2mg，盐酸硫胺素VB1 0.1mg，盐酸吡哆醇VB6 0.5mg，烟酸VB5或VPP 0.5mg，蔗糖30g；琼脂7g；蒸馏水1000mL。
[0037] 6、LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，去离子水1000mL，pH 7.4。
[0038] 7、DF培养基：KH2PO4 4g，Na2HPO4 6g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖2g，葡萄糖酸1.62mL，柠檬酸2g，(NH4)2SO4 2g，去离子水1000mL，pH为7.2。
[0039] 8、ADF培养基：将DF培养基中的(NH4)2SO4去掉即为ADF培养基。
[0040] 实施例1：菌种分离鉴定
[0041] 采集田间马铃薯幼苗根，以涂布划线技术分离根有关(根面和内生)的固氮、解磷、产植物激素、产多糖、产铁载体和产ACC脱氨酶等植物促生性状的菌株功能；以分离纯化得到的菌株基因组DNA为模板，以1492R和27F为引物，PCR扩增菌株的16S rRNA基因，测序扩增产物，所得序列通过在线EzTaxon来进行分类(16S rRNA基因序列相似度大于97％的初步确定为同种)，所获得180株细菌的16S rRNA基因序列与模式种的相似度98％～100％。结果如表1所示，表1为具有较强植物促生功能菌株的16S rRNA基因相似度分析。
[0042] 表1：
[0043]
[0044] 实施例2：单菌对马铃薯试管苗生长的影响
[0045] 活化培养具有较强植物促生能力的菌株：吸取甘油保菌液100μL涂布于修改的R2A固体培养基、置于25℃下培养，挑取具有典型菌落特征、生长迅速的单菌落置修改的R2A液体培养基、置于25℃下培养；培养至对数期中后期时以8000g离心力离心，以K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH7.2)反复洗涤3次后用同样缓冲液重悬至有效活菌数浓度为1012CFU/mL。
[0046] 将各悬浮菌液与高温高压灭菌后温度降至约50℃～55℃的MS培养基混合，轻轻地摇动混合均匀，迅速倒入培养瓶中；完全凝固后，接入试管苗茎段、于22℃～26℃下光照培10 9 8
养。设置各菌在MS培养基中的有效活菌数浓度系列为10 CFU/mL、10 CFU/mL、10 CFU/mL、
107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL、0CFU/mL。
试管苗培养约3周时，分析比较处理(接菌)相比对照(未接菌)在根长、节点数和茎粗3个关键指标上的提高百分比，部分结果见表2，表2为接种单菌对马铃薯试管苗生长的影响(处理相比对照的提高百分比％)。
养。设置各菌在MS培养基中的有效活菌数浓度系列为10 CFU/mL、10 CFU/mL、10 CFU/mL、
107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL、0CFU/mL。
试管苗培养约3周时，分析比较处理(接菌)相比对照(未接菌)在根长、节点数和茎粗3个关键指标上的提高百分比，部分结果见表2，表2为接种单菌对马铃薯试管苗生长的影响(处理相比对照的提高百分比％)。
[0047] 表2：
[0048]
[0049]
[0050]
[0051] 注：表中“-”表示接菌后抑制生长；P<0.05。
[0052] 由表2可以看出：接菌浓度过高(1010、109和108CFU/mL)会抑制马铃薯试管苗的生长(这可能是由于接菌量大、使菌迅速大量繁殖，导致试管苗缺氧和营养)，但浓度过低对试管苗影响不大(101、102CFU/mL)。因此，综合对试管苗生长的三个关键指标(根长、茎粗和节点数；前二者决定生长健壮程度，最后决定继代繁殖量)接菌浓度为103～107CFU/mL时可获得较好的促进效果，最佳量为105CFU/mL；菌株L10、FN14和B28分别在根长、茎粗和节点数提高量最大、提高效果最为显著，且在其余2个指标上也有一定的促进，而其它菌株提高不明显、甚至有抑制现象。
[0053] 实施例3：复合菌剂制备
[0054] 单独接种时L10、FN14和B28分别对马铃薯试管苗的根长、茎粗和节点数的提高最高，而其它菌提高效果不明显、甚至多有抑制现象。因此，将L10、FN14和B28选作复合菌剂菌种。平板对峙实验结果表明，此3个菌种之间不存在相互明显拮抗，可用于复合。以不同有效活菌数量比例(表3)复合后的促进效果，以确定不同菌种初始最佳有效活菌数量。表3为复合菌剂中菌种有效活菌数量不同对生长的影响。
[0055] 表3：
[0056]
[0057]
[0058] 注：P<0.05。
[0059] 分别单一接种L10、FN14和B28时茎粗和节点数的提高量相对根长提高量低，预实验中尝试提高了FN14和B28的比例、尤其是后者，使得根长、茎粗和节点数总体提高量趋于平衡。因此比例设计中控制L10为低比例(20％、30％)，FN14为中比例(30％和40％)，而B28为高比例(50％和60％)。如前所述，以离心各菌种、缓冲液(pH为7.2的K2HPO4-KH2PO4缓冲液)清洗和重悬，按比例混合、摇匀，接种使用。
[0060] 由表3可看出，三株菌分别对根长、茎粗和节点数具有显著促进效果，复配后虽然在在节点数上稍微下降，但另外两个指标的促进效果明显，尤其是茎粗促进较为显著，快繁苗的质量需综合考量三个指标而不是只针对单一指标，因此可能会出现单一指标变化不显著的特点，但综合整体指标复配菌株效果要优于任何单一菌株。在复合菌剂中L10、FN14和B28的初始有效活菌数量比例分别为20％、40％和40％较为合适，对马铃薯试管苗根长、茎粗和节点数提高的总体促进效果最佳(图1)。此外，类似单一接种时总有效活菌数量对马铃薯试管苗生长影响的实验结果表明，复合菌剂最适总有效活菌数量与单一接种时的相近，即约105CFU/mL。
[0061] 实施例4：复合菌剂对马铃薯试管苗生长和移栽后结薯的影响
[0062] 含L10、FN14和B28的复合菌剂具有的植物促生功能有产植物激素(IAA、GA、CTK和ABA)、固氮、产ACC脱氨酶、产铁载体、解Ca3(PO4)2-P。L10、FN14和B28的初始有效活菌数量比例分别为20％、40％和40％，对马铃薯试管苗根长、茎粗和节点数的提高最大，分别高达81％、62％和69％，影响效果达到了差异极其显著水平(P<0.01)。接种实验室分离得到的单菌/复合菌与对应菌种保藏中心单菌/复合菌在成活率、结薯数量和单个种薯重量上均无显著性差异，但较未接菌的空白处理均有提高(表4)。移苗后接种复合菌剂的处理较单菌处理在成活率、结薯数量和单个种薯重量方面均有提高，较未接菌的空白处理的移苗成活率提高了26％，种薯数量增加了约100％，而平均单个种薯的重量也增加了约89％，差异也极其显著(P<0.01)(图2，表4)。此外，试管苗和移苗后苗的地上和地下部生物量都增加(图3a和图3b)，说明对营养的吸收增加，测试还发现接种菌剂还提高了培养基或土壤中的速效氮和速效磷含量。
[0063] 表4：
[0064]
[0065] 注：P<0.01。
[0066] 实施例5：菌剂拮抗马铃薯病原微生物
[0067] 菌剂中菌种对危害马铃薯生产较重的病原微生物如晚疫病、枯萎病、疮痂病和黑痣病等病菌有一定的抑制作用，结果如表5所示，接种实验室分离得到的单菌/复合菌与对应菌种保藏中心单菌/复合菌在抑制晚疫病、疮痂病、黑痣病和枯萎病病原菌效果上均无显著性差异，但较未接菌的空白处理均有提高。
[0068] 表5：
[0069]
[0070]
[0071] 注：P<0.05。
[0072] 由表5平板对峙实验结果表明：抑菌率可达38％～92％，展现出了一定的防治马铃薯土传病害的潜力，且与菌株保藏中心菌株抑制病原菌效果无异。
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