技术领域
[0001] 本
发明涉及高通量筛选领域，具体涉及一种基于串联质谱和分子对接联用的活性多肽高通量筛选方法，为一种以串联质谱鉴定活性部位/成分群中混合多肽序列，利用分子对接筛选活性多肽并验证其活性的方法。
背景技术
[0002] 活性多肽是指由2～20个
氨基酸残基以酰胺键构成，具有一定生理活性的物质，通常分子量不高于2000Da。现代研究表明，活性多肽具有多种生理活性，而海洋来源的活性多肽具有来源丰富，活性显著等特点，近年来受到广泛关注。如从海洋
生物中发现的活性肽类物质，如Dolastatin-10、芋螺毒素、鱼皮降压肽等，均表现出重要的市场价值与社会经济效益，越来越多科学家及科研团队将目光转向海洋生物中活性多肽的寻找与开发。
[0003] 传统的海洋活性多肽的研究主要以活性导向下的系统分离纯化，结构鉴定为主，该方法虽经典，但存在耗时、费
力、通量低等缺点。海洋生物中的活性多肽因种类丰富、结构特殊、含量低等特点，目前仍缺乏行之有效的分离、分析、筛选、鉴定解决方案，很难高通量的完成活性物质的筛选与发现。
[0004] 因此，很有必要在
现有技术的
基础之上，研究开发出一种快速、高效寻找海洋活性多肽的方法，本发明集成LC-MS/MS快速鉴定混合多肽与计算机高效筛选优化的优势，可从海洋生物(或酶解产物)中快速寻找活性多肽。
发明内容
[0005] 发明目的：本发明要解决的问题在于：建立一种基于串联质谱与分子对接的海洋活性多肽高通量筛选方法，这种方法既可用于海洋生物中自身存在的初级/
次级代谢产物多肽的发现与筛选，亦可用于经过生物酶处理后的混合多肽中活性多肽的发现与筛选，此外，该方法不局限于一种作用靶点的活性多肽的筛选，可应用于多种已知的靶点的活性多肽的发现与筛选。
[0006] 技术方案，为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] 基于串联质谱与分子对接的活性多肽高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0008] (1)首先对海洋蛤类通进行提取或生物酶酶解，然后分离制备得到总多肽提取物，然后在活性导向下进行活性筛选，确定活性部位；
[0009] (2)然后通过LC-MS/MS对活性部位进行质谱分析，将得到的质谱数据通过从头测序分析(de novo sequencing)和/或与
蛋白质数据库比对，快速确定蛋白质或多肽的氨基酸序列；
[0010] (3)然后通过计算机虚拟筛选，将药物作用靶点与活性物质进行分子对接，从而寻找受体与配体作用的最佳构象，筛选出与受体亲和力最佳的配体，完成高通量多肽的活性筛选，并通过固相合成多肽序列验证其活性。
[0011] 以上所述的基于串联质谱与分子对接的活性多肽高通量筛选方法，所述的分离方法包括分级沉淀、分子排阻、离子交换、反相柱层析、疏
水层析等。
[0012] 作为优选海洋蛤类提取物的制备方法有：
[0013] 将文蛤软体洗净泥沙，加水煎煮，分离煎煮液与肉渣，沥干；取肉渣，加水匀浆后，加入生物酶酶解，酶解结束后,于沸水浴灭活，离心，浓缩，得文蛤酶解物。
[0014] 或者将文蛤软体洗净泥沙，加入3～8倍量60～80％
乙醇煎煮1～3次，每次30～60分钟，合并提取液，浓缩后，
冷冻干燥，得冻干粉。
[0015] 将文蛤提取物分离，获得不同部位/成分群，并评价分离获得的不同部位/成分群的活性，确定活性部位/成分群，浓缩，冷冻干燥，得到冻干粉备用。
[0016] 其中生物酶包括：胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、
碱性蛋白酶、
风味蛋白酶等。
[0017] 以上所述的基于串联质谱与分子对接的活性多肽高通量筛选方法，所述的活性筛选的靶点包括：血管紧张素转化酶(ACE)、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)、凝血酶(thrombin)、乙酰胆碱酯酶(AChE)等。
[0019] ACE与HHL溶液的配制：取适量ACE用0.1mol/L含0.3mol/LNaCl
硼酸缓冲液(pH8.3)配成浓度为100mU/mL的ACE溶液；取适量HHL用0.1mol/L硼酸缓冲液(含0.3mol/LNaCl pH8.3)配成浓度为5mmol/L的HHL溶液；
[0020] 反应过程：将30μLHHL和10μL样品(或缓冲溶液)混匀后，于37℃环境下预热5min(37℃水浴)，再加入20μL的ACE启动反应，混匀后继续于37℃环境下反应1h(37℃水浴)，然后迅速加入70μLHCl(1mol/L)终止反应，用高效液相色谱分析结果。用硼酸缓冲液代替样品溶液做空白对照。
[0021] 色谱条件：SunFire-C18柱(2.1×100mm，3.5μm，美国Waters公司)；流动相：乙腈-0.5％
甲酸水溶液，流速：0.5mL/min；双
波长检测：220nm、254nm；柱温：30℃；进样量：10μL。
梯度洗脱条件：0～5min，2％乙腈；5～25min，2％～40％乙腈；25～30min，40％乙腈。
[0022]
[0023] 二肽基肽酶-4(DPP-IV)抑制活性评价方法：
[0024] 采用比色法测定二肽基肽酶-4抑制肽的活性，具体步骤如下：取
实施例1和实施例3分别制备得到的抑制肽溶于Tris-HCI缓冲液(含20mmol/LTris,pH 8.0,0.1mol/LNaCl，
1mmol/L EDTA)制成相应的样品液。二肽基肽酶-4(DPP-4)、Gly-Pro-PNA分别用Tris-HCl缓冲液(含20mmol/L Tris,pH 8.0,0.1mol/L NaCl，1mmol/L EDTA)配置成8U/L的DPP-4溶液和1.6mmol/L的Gly-Pro-PNA(底物)溶液。将25μL样品与25μL底物混匀，37℃孵育10min,再加入50μL DPP-4溶液，在37℃孵育1小时，后加入1mol/L
醋酸钠缓冲液(PH 4.0)100μL,
405nm处测定吸光度值(A)，并计算抑制率。同时用Tris-HCI缓冲液代替样品做空白对照。
[0025] DPP-4抑制率(％)＝[(A阴性对照-A空白对照)-(A样品-A样品空白)]/(A阴性对照-A空白对照)×100％
[0026] 式中：A为吸光度值。
[0027] 凝血酶抑制活性评价方法：
[0028] 家兔颈总动脉取血，3000rpm离心10min制备待测
血浆。在测定杯中加入待测血浆40μl，37℃预温3min后加入共同预温一定时间的0.1mol/LpH 7.4Tris-HCl缓冲液稀释的
15U/ml凝血酶溶液40μl和溶媒20μl。在加入凝血酶溶液的同时启动凝血因子分析仪记录凝血时间(TT0)。TT延长率(％)＝(TT-TT0)/TT0×100％。用不同浓度的凝血酶，测得凝血时间TT。计算TT延长率(％)。以lgTT延长率(％)对凝血酶浓度(C)作图，得C对lgTT延长率(％)的影响标准曲线。
[0029] 在测定杯中加入待测血浆40μl，37℃预温3min后，加入共同预温3min的待测样品20μl和15U/ml凝血酶40μl，记录凝血时间(TT)，计算lgTT延长率(％)，根据标准曲线，计算凝血酶活力，以溶媒作对照。
[0030] 其中分离方法包括乙醇分级沉淀、分子排阻、离子交换、反相柱层析等方法[0031] 乙醇分级沉淀：向海洋蛤类酶解液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度为30％(v/v)，4℃静置24h后，离心，下层沉淀为醇沉部位1，上清液浓缩后，加入无水乙醇，使乙醇终浓度为80％(v/v)，4℃静置24h后，离心，下层沉淀为醇沉部位2，上清为醇沉部位3。
[0032] 分子排阻色谱法：将海洋蛤类酶解液分批上样于事先处理好的Sephadex凝胶色谱柱，纯化水洗脱，流速为0.15ml/min，自动部份收集器收集，每2ml收集1管，紫外分光光度计测定每管254nm吸光度，绘制洗脱曲线，每个吸收峰收集合并，分离获得不同部位，浓缩后冷冻干燥，冻干品-20℃保存待用。其中Sephadex凝胶色谱柱包括Sephadex G-25，G-50，G-75及G-100。
[0033] 离子交换色谱法：将海洋蛤类酶解物冻干粉用缓冲液溶解(缓冲液pH范围为6.0-8.5)，上样后，用约5倍柱体积的缓冲液将未
吸附部分洗脱出柱。而后0-0.5M NaCl缓冲液阶段洗脱或梯度洗脱，流速为1ml/min，自动部份收集器收集，每3ml收集1管，紫外分光光度计测定每管254nm吸光度，绘制洗脱曲线，每个吸收峰收集合并，分离获得不同部位，浓缩后冷冻干燥，得冻干品。其中色谱填料包括DEAE Sepharose、CM Sepharose、Q Sepharose等。
[0034] 反相柱层析方法：采用制备型HPLC系统，二元梯度
泵，紫外可见分光光度检测器；色谱柱选择反相C18、T3、HILIC等。流动相A：0.1％TFA，流动相B：甲醇；洗脱条件为：2％B，0-
1.5min，2％-60％B，流速为15ml/min。上样量为1ml。收集色谱峰，分离获得不同部位，浓缩后冷冻干燥，冻干品-20℃保存待用。
[0035] 本发明活性部位中活性多肽序列鉴定，采用C18固相萃取小柱脱盐后，进LC-MS/MS分析，选择性挑选离子带电荷≥2的母离子进行碰撞解离获得二级碎片信息(MS/MS)，通过
软件进行de novo sequencing分析，结合蛋白质数据库比对分析(蛋白质数据库下载于www.uniprot.org)，确定活性部位中所有多肽的氨基酸序列。
[0036] 活性部位采用nano LC-MS/MS进行分析，戴安U3000NanoRSLC纳升液相系统，色谱柱为5μm Reprosil C18AQ(75μm×150mm)，LC-MS/MS系统分析水
牛角不同样品。上样量为5μL，流速400nL/min，流动相A(乙腈/甲酸/水＝2/0.2/98，v/v/v)，流动相B(乙腈/甲酸/水＝80/0.2/20，v/v/v)，2～30％B线性梯度洗脱60min。Thermo LTQ Orbitrap XL质谱仪用于进行肽段分析，喷雾
电压为2.5kV，离子传输毛细管
温度为200℃；质谱一级全扫描范围为m/z100～2000，分离宽度为3Da；串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离(CID)二级串联质谱。采用Xcalibur软件进行数据分析。串联质谱数据用PEAKS 8.0软件搜库，选择合适的数据库，检索参数设置为：前体离子误差10ppm；子离子误差1Da；半胱氨酸残基固定修饰(氨甲酰甲基化57.0215Da)；甲硫氨酸残基可变修饰(
氧化+15.9949Da)；允许2个位点误切，
假阳性率(FDR)≤1％；根据水牛角水提液样品不同，选择不同酶切方式：非酶切(No enzyme)或胰蛋白酶酶切(Trypsin)；其他参数为默认参数，在上述检索条件下所得分值有显著性意义(P<
0.05)被认定为有效的鉴定结果。
[0037] 从而确定活性部位/成分群中全部多肽的氨基酸序列信息。
[0038] 作为优选：本发明将所有的活性多肽序列进行同源模建，将所有多肽(配体)与靶点蛋白质(受体)导入分子对接软件中，设定参数，用CDOKER进行分子对接，确定配体与受体的结合情况与结合参数，筛选确定能与受体结合的配体，明确具有潜在活性的多肽序列；进一步通过固相合成验证分子对接筛选确定的多肽活性。
[0039] 作为优选：本发明配体构建方法为：
[0040] 根据多肽的氨基酸序列信息进行同源模建：使用Chem BioDraw Ultra 13.0软件绘制各个多肽结构，然后将其导入Discovery Studio 4.0(DS 4.0)软件中，再使用CHARMm
能量场优化并使其能量最小化，利用DS 4.0中的PREPAR LIGAND模
块准备配体。
[0041] 从the Protein Data Bank的数据库中(http://www.rcsb.org/pdb/)下载蛋白质的
晶体结构，作为计算机分子对接的受
体模型，使用软件DS 4.0中的CDOCKER模块进行分子对接研究，参数为默认设置。
[0042] 经过筛选获得能够与受体结合的配体，确定配体的氨基酸序列，采用固相合成技术合成多肽，采用体外活性评价方法验证其生物活性。
[0043] 有益效果：本发明和现有技术相比具有以下优点：
[0044] 本发明通过大量实验筛选，研究开发出一种快速、高效寻找海洋活性多肽的方法，本发明集成LC-MS/MS快速鉴定混合多肽与计算机高效筛选优化的优势，可从海洋生物(或酶解产物)中快速寻找活性多肽，可操作性强，具有重要的应用价值。
附图说明
[0045] 图1是本发明肽段His-Asp-Gln-Leu-Pro-Gly-Tyr的从头测序(de novo sequencing)结果图。
[0046] 图2是肽段Thr-Pro-Glu-Lys-Glu-Asp-Glu-Leu-Arg的de novo sequencing结果图。
[0047] 图3是肽段Ala-Asp-Leu-Asp-Trp-Leu-Asp-Gly-Arg的de novo sequencing结果图。
具体实施方式
[0048] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的
修改均落于本
申请所附
权利要求所限定的范围。
[0049] 实施例1
[0050] 杂色蛤中筛选二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制剂：
[0051] 1.杂色蛤酶解物的制备：
[0052] 将杂色蛤软体洗净泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次40分钟，分离煎煮液与肉渣，沥干；取肉渣，加3倍量水匀浆后，加入酶活性为50000U/g的木瓜蛋白酶酶解，木瓜蛋白酶的加入重量为肉渣重量的1％，酶解的温度为55℃，酶解的pH为7，酶解反应时间为4h；酶解结束后,于沸水浴灭活，然后加入一定量的无水乙醇进行分级醇沉，最终制备30％乙醇沉淀部位(醇沉部位1)、70％的醇沉沉淀部位(醇沉部位2)及醇沉上清液(醇沉部位3)，各部位经浓缩，冷冻干燥，得到冻干粉。
[0053] 2.DPP-IV抑制活性评价
[0054] 将醇沉部位1，2，3溶于Tris-HCI缓冲液(含20mmol/L Tris,pH 8.0,0.1mol/LNaCl，1mmol/L EDTA)制成相应的样品液。二肽基肽酶-4(DPP-4)、Gly-Pro-PNA分别用Tris-HCl缓冲液(含20mmol/L Tris,pH 8.0,0.1mol/LNaCl，1mmol/L EDTA)配置成8U/L的DPP-4溶液和1.6mmol/L的Gly-Pro-PNA(底物)溶液。将25μL样品与25μL底物混匀，37℃孵育10min,再加入50μL DPP-4溶液，在37℃孵育1小时，后加入1mol/L醋酸钠缓冲液(PH 4.0)
100μL,405nm处测定吸光度值(A)，并计算抑制率。同时用Tris-HCI缓冲液代替样品做空白对照。
[0055] DPP-4抑制率(％)＝[(A阴性对照-A空白对照)-(A样品-A样品空白)]/(A阴性对照-A空白对照)×100％
[0056] 式中：A为吸光度值。
[0057] 结果见表，醇沉部位3的DPP-IV抑制活性最佳。
[0058] 表1不同醇沉部位的DPP-IV抑制活性比较
[0059]
[0060] 3.活性部位3的LC MS/MS分析
[0061] 活性部位3经质谱分析得MS/MS质谱碎片信息，采用非酶切(No enzyme)模式进行数据库比对分析，从其中共分析鉴定出了124个多肽氨基酸序列。以其中肽段His-Asp-Gln-Leu-Pro-Gly-Tyr为例，MS/MS图谱见图1，分子量(MW)为828.38Da，碎片信息包括b1-b6，y1-y6，此肽段为de novo sequencing分析结果，未在蛋白质库中搜索到来源蛋白质。
[0062] 4.124个多肽氨基酸序列的DPP-IV抑制活性分子对接研究
[0063] 将124个多肽氨基酸序列同源建模，在DS 4.0中进行PREPARE LIGAND，DPP-IV靶点由http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝2P8S下载，在DS 4.0中进行去水、加氢再进行PREPARE PROTEIN，然后将配体与DPP-IV靶点进行CDOCKER对接，参数设置如下：Top Hits-10；RandomConformations-10；Orientations to Refine-10；Force field-CHARMm；Use Full Potential-False，其他参数选择默认设置。
[0064] 经过对接后，确定5个多肽序列能够与DPP-IV很好的对接，表明其为潜在的DPP-IV抑制活性多肽，5个多肽序列见表2。
[0065] 通过固相合成技术获得5个多肽，纯度均>98％，体外DPP-IV活性评价5个多肽，结果见表2。
[0066] 表2 5个多肽的DPP-IV抑制活性比较
[0067]
[0068]
[0069] 由上表2结果表明，从杂色蛤酶解物中快速确定了DPP-IV抑制活性多肽。
[0070] 实施例2
[0071] 文蛤提取物中筛选血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽：
[0072] 1、文蛤提取物的制备
[0073] 将文蛤软体洗净泥沙，加入3倍量60％乙醇煎煮2次，每次30分钟，合并两次提取液，浓缩后，冷冻干燥，得冻干粉。
[0074] 2、文蛤提取物反相柱层析分离
[0075] 将文蛤提取物冻干粉复溶，采用Waters制备型HPLC系统(2545-2489HPLC系统)，分离文蛤提取物，采用C18色谱柱(5μm,19×150mm)，二元梯度泵，检测波长为220nm；流动相A：0.1％TFA，流动相B：甲醇；洗脱条件为：2％B，0-3min，2％-35％B，3-9min，流速为10ml/min。
上样量为500μl。收集色谱峰，分离获得5个不同部位，浓缩后冷冻干燥，冻干品-20℃保存待用。
[0076] 3、对5个部位进行ACE抑制活性评价
[0077] ACE与HHL溶液的配制：取适量ACE用0.1mol/L含0.3mol/LNaCl硼酸缓冲液(pH8.3)配成浓度为100mU/mL的ACE溶液；取适量HHL用0.1mol/L硼酸缓冲液(含0.3mol/LNaCl pH8.3)配成浓度为5mmol/L的HHL溶液；
[0078] 反应过程：将30μLHHL和10μL样品(或缓冲溶液)混匀后，于37℃环境下预热5min(37℃水浴)，再加入20μL的ACE启动反应，混匀后继续于37℃环境下反应1h(37℃水浴)，然后迅速加入70μLHCl(1mol/L)终止反应，用高效液相色谱分析结果。用硼酸缓冲液代替样品溶液做空白对照。
[0079] 色谱条件：SunFire-C18柱(2.1×100mm，3.5μm，美国Waters公司)；流动相：乙腈-0.5％甲酸水溶液，流速：0.5mL/min；双波长检测：220nm、254nm；柱温：30℃；进样量：10μL。
梯度洗脱条件：0～5min，2％乙腈；5～25min，2％～40％乙腈；25～30min，40％乙腈。
[0080]
[0081] ACE抑制活性评价结果见表3，其中部位3活性较好。
[0082] 表3文蛤提取物5个部位的ACE抑制活性比较
[0083]
[0084] 其中部位3的ACE抑制活性最佳。
[0085] 4、ACE抑制活性部位3的LC MS/MS分析
[0086] 活性部位3经质谱分析得MS/MS质谱碎片信息，采用非酶切(No enzyme)模式进行数据库比对分析，从其中共分析鉴定出了131个多肽氨基酸序列。以其中肽段Thr-Pro-Glu-Lys-Glu-Asp-Glu-Leu-Arg为例，MS/MS图谱见图2，分子量(MW)为1115.55Da，碎片信息包括b2-b8，y1-y8，此肽段为de novo sequencing分析结果，未在蛋白质库中搜索到来源蛋白质。
[0087] 5.131个多肽氨基酸序列的ACE抑制活性分子对接研究
[0088] 将131个多肽氨基酸序列同源建模，在DS 4.0中进行PREPARE LIGAND，ACE靶点由http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝1O86下载，在DS 4.0中进行去水、加氢再进行PREPARE PROTEIN，然后将配体与ACE靶点进行CDOCKER对接，参数设置如下：Top Hits-10；RandomConformations-10；Orientations to Refine-10；Force field-CHARMm；Use Full Potential-False，其他参数选择默认设置。
[0089] 经过对接后，确定6个多肽序列能够与ACE很好的对接，表明其为潜在的ACE抑制活性多肽，6个多肽序列见表4。
[0090] 通过固相合成技术获得6个多肽，纯度均>98％，体外ACE活性评价6个多肽，结果见表4。
[0091] 表4 6个多肽的ACE抑制活性比较
[0092]
[0093]
[0094] 由上表4从文蛤提取物中快速确定了ACE抑制活性多肽。
[0095] 实施例3毛蚶中具有凝血酶抑制剂活性的多肽的筛选与发现
[0096] 1.毛蚶酶解物的制备：
[0097] 将毛蚶软体洗净泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次40分钟，分离煎煮液与肉渣，沥干；取肉渣，加3倍量水匀浆后，加入酶活性为10000U/g的中性蛋白酶酶解，中性蛋白酶的加入重量为肉渣重量的2％，酶解的温度为45℃，酶解的pH为7，酶解反应时间为4h；酶解结束后，于沸水浴灭活，冷冻干燥，得到冻干粉。
[0098] 2.毛蚶酶解物分子排阻分离
[0099] 将毛蚶酶解物冻干粉复溶，离心后上清分批上样于Sephadex G-25凝胶柱，纯化水洗脱，流速为0.15ml/min，自动部份收集器收集，每2ml收集1管，紫外分光光度计测定每管254nm吸光度，绘制洗脱曲线，每个吸收峰收集合并，得到G1，G3，G3和G4部位，各部位浓缩后冷冻干燥，冻干品-20℃保存待用。
[0100] 3.对4个部位进行凝血酶抑制活性评价
[0101] 家兔颈总动脉取血，3000rpm离心10min制备待测血浆。在测定杯中加入待测血浆40μl，37℃预温3min后加入共同预温一定时间的0.1mol/LpH 7.4Tris-HCl缓冲液稀释的
15U/ml凝血酶溶液40μl和溶媒20μl。在加入凝血酶溶液的同时启动凝血因子分析仪记录凝血时间(TT0)。TT延长率(％)＝(TT-TT0)/TT0×100％。用不同浓度的凝血酶，测得凝血时间TT。计算TT延长率(％)。以lgTT延长率(％)对凝血酶浓度(C)作图，得C对lgTT延长率(％)的影响标准曲线。
[0102] 在测定杯中加入待测血浆40μl，37℃预温3min后，加入共同预温3min的待测样品20μl和15U/ml凝血酶40μl，记录凝血时间(TT)，计算lgTT延长率(％)，根据标准曲线，计算凝血酶活力，以溶媒作对照。
[0103] 凝血酶抑制活性评价结果见表5，其中G3部位活性较好。
[0104] 表5毛蚶酶解物4个部位的凝血酶抑制活性比较
[0105]
[0106] 4.G3部位的LC MS/MS分析
[0107] 活性部位G3经质谱分析得MS/MS质谱碎片信息，采用非酶切(No enzyme)模式进行数据库比对分析，从其中共分析鉴定出了87个多肽氨基酸序列。以其中肽段Ala-Asp-Leu-Asp-Trp-Leu-Asp-Gly-Arg为例，MS/MS图谱见图3，分子量(MW)为1059.50Da，碎片信息包括b2-b8，y1-y8，此肽段为de novo sequencing分析结果，未在蛋白质库中搜索到来源蛋白质。
[0108] 5.87个多肽氨基酸序列的凝血酶抑制活性分子对接研究
[0109] 将87个多肽氨基酸序列同源建模，在DS 4.0中进行PREPARE LIGAND，凝血酶靶点由http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝3C1K下载，在DS 4.0中进行去水、加氢再进行PREPARE PROTEIN，然后将配体与凝血酶靶点进行CDOCKER对接，参数设置如下：Top Hits-10；RandomConformations-10；Orientations to Refine-10；Force field-CHARMm；Use Full Potential-False，其他参数选择默认设置。
[0110] 经过对接后，确定3个多肽序列能够与凝血酶很好的对接，表明其为潜在的凝血酶抑制活性多肽，3个多肽序列见表6。
[0111] 通过固相合成技术获得3个多肽，纯度均>98％，体外凝血酶活性评价3个多肽，结果见表6。
[0112] 表6 3个多肽的ACE抑制活性比较
[0113]
[0114]
[0115] 由上表6结果表明，从毛蚶酶解物中快速确定了凝血酶抑制活性多肽。
