技术领域
[0001] 本
发明属于分子
生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测致病菌的方法，具体为一种用于检测黄瓜细菌性角斑病菌的分子标记及其应用。
背景技术
[0002] 黄瓜细菌病角斑病是黄瓜的一类重要的细菌性病害，病原菌为丁香假单胞菌流泪致病变种，于20世纪初首次被报道。1957年日本报道了黄瓜细菌性角斑病的发生，随后该病害在日本关东地区相继爆发，造成严重的经济损失。1980年，日本六千多公顷的
温室大棚黄瓜几乎全部被角斑病菌感染。同年加拿大报道了黄瓜细菌性角斑病的爆发，1981年美国南部黄瓜细菌性角斑病大爆发，危害相当严重，已成为目前在黄瓜生产中的重要病害。
[0003]
种子带菌是黄瓜细菌性角斑病的一个重要的初侵染来源，病原菌侵入寄主组织进入胚根或胚乳的外表皮，造成种子内部带菌。采收时直接从病瓜中收集种子，可导致种子表面带菌。一般种子的带菌率低于1％，病原菌在
土壤中的寄生能
力较弱，可在土壤中存活2-8周。目前，黄瓜角斑病田间快速诊断技术尤其是种子带菌的检测技术报道较少，给该病害的早期防治带来困难。
[0004] 现有的对于该病原菌的快速检测技术报道较少，最早出现的方法为免疫学检测技术。近年来，出现了PCR检测黄瓜细菌性角斑病菌的相关报道。应用特异PCR方法快速检测荷兰黄瓜可以对不同来源的黄瓜细菌性角斑病菌得到179bp的目标
片段，检测灵敏度较高，该方法可从接种后发病的黄瓜
叶片总DNA中检测到特异条带。但是
现有技术中尚未有从带有致病菌的种子中检测出特异条带。
发明内容
[0005] 本发明的目的是：为了克服现有技术的
缺陷，获得一种能够适用于检测黄瓜种子中细菌性角斑病菌的分子标记，本发明公开了一种用于检测黄瓜细菌性角斑病菌的分子标记及其应用。
[0006] 技术方案：一种用于检测黄瓜细菌性角斑病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0007] 优选的，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行
氨基化修饰。
[0008] 表1分子标记序列
[0009]名称 序列(5’-3’) SEQ ID NO.
P1-F NH2-GCGGTTGACGCAATCAAT 1
P1-R GGTGGTTTCACGCTTCAGG 2
P2-F NH2-CTATAGCAAATGCTTACGT 3
P2-R GCCGTTTGAATCGTATT 4
P3-F NH2-GGTGGCAGTAGAAGGATA 5
P3-R CGCTGAGTCACCGAACCGT 6
[0010] 所述的分子标记在制备检测黄瓜细菌性角斑病菌
试剂盒中的应用。
[0011] 优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LA Taq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸
水。
[0012] 优选的，所述试剂盒检测黄瓜细菌性角斑病菌的步骤包括：
[0013] (1)取样：提取黄瓜叶片样品的基因组DNA；
[0014] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0015] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50～400倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0016] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20～80倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0017] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶
电泳检测。
[0018] 优选的，所述
甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0019] 优选的，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LA Taq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0020] 优选的，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0021] 优选的，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0022] 优选的，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0023] 有益效果：(1)本发明所述分子标记适用于检测黄瓜种子中细菌性角斑病菌；(2)本发明所述分子标记具有特异性好、灵敏度高、
稳定性好的优点。
附图说明
[0025] 其中，M为分子量为2000bp的Maker；1为实施例1PCR产物电泳结果；2为实施例2PCR产物电泳结果；3为实施例3PCR产物电泳结果。
具体实施方式
[0026] 实施例1
[0027] 一种用于检测黄瓜细菌性角斑病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0028] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰。
[0029] 所述的分子标记在制备检测黄瓜细菌性角斑病菌试剂盒中的应用。
[0030] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LA Taq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0031] 所述试剂盒检测黄瓜细菌性角斑病菌的步骤包括：
[0032] (1)取样：提取黄瓜叶片样品的基因组DNA；
[0033] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0034] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0035] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释80倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0036] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0037] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0038] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LA Taq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0039] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0040] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0041] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0042] 实施例2
[0043] 一种用于检测黄瓜细菌性角斑病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0044] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰。
[0045] 所述的分子标记在制备检测黄瓜细菌性角斑病菌试剂盒中的应用。
[0046] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LA Taq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0047] 所述试剂盒检测黄瓜细菌性角斑病菌的步骤包括：
[0048] (1)取样：提取黄瓜叶片样品的基因组DNA；
[0049] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0050] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0051] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释40倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0052] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0053] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0054] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LA Taq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0055] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0056] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0057] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0058] 实施例3
[0059] 一种用于检测黄瓜细菌性角斑病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0060] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰。
[0061] 所述的分子标记在制备检测黄瓜细菌性角斑病菌试剂盒中的应用。
[0062] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LA Taq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0063] 所述试剂盒检测黄瓜细菌性角斑病菌的步骤包括：
[0064] (1)取样：提取黄瓜叶片样品的基因组DNA；
[0065] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0066] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释400倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0067] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0068] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0069] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0070] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LA Taq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0071] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0072] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0073] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
