一种用于检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因的分子标记及
其应用
技术领域
[0001] 本
发明属于分子
生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测
微生物耐药基因的方法，具体为
一种用于检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因的分子标记及其应用。
背景技术
[0002] 抗生素的使用是
治疗病原菌感染的主要方法，但是用于临床治疗以来，病原微生物对抗生素的耐药性发展十分迅速，导致耐药菌株在全世界频繁出现，并且出现多重耐药菌株，因此，人们对细菌的耐药性问题已经愈加重视。细菌对抗生素表现出的抵抗特性，即称为细菌的耐药性，根据其发生原因可分为两种，一种是天然耐药性，是指细菌对某种抗菌药物表现出的先天性不敏感，这是因为不同的细菌自身生物学特性(如结构、代谢机制)的不同所导致的。自然界中的病原体，如细菌的某一株也可存在天然耐药性。二十获得性耐药，是指细菌对某些抗菌药物由本来的敏感状态自发转变为耐受状态的特性。当长时间频繁使用某种抗生素药物时，不断死亡的是大多数的敏感菌株，从而能导致耐药菌株的急剧生长，数量上取代敏感菌株，导致细菌对该种抗生素的耐药性不断上升。目前认为这一种方式是细菌产生耐药性的主要原因。
[0003] 应对鸭疫里默氏杆菌感染最重要的方法是使用抗生素，但由于生产实践上的盲目及滥用抗生素，导致鸭疫里默氏杆菌等细菌的耐药谱愈加广泛，并且表现出来明显的多重耐药，且不同菌株之间差异较大。
[0004] 药物敏感试验、质粒指纹图谱技术、
基因芯片技术、PCR等都是检测细菌耐药性的方法。药物敏感试验操作简便、结果直观明显、成本低、较为实用，但是其不能研究其耐药机制，以及耐药菌株的流行情况。随着科学技术的不断发展，分子生物学技术逐渐应用开来，质粒指纹图谱技术也被广泛地应用到细菌流行病学研究中，该技术不仅可以研究细菌的流行病学调查，还可以用来研究细菌产生耐药性的机制。
发明内容
[0005] 本发明的目的是：为了克服
现有技术的
缺陷，获得一种快速、大量、并直观的显示出细菌基因组中耐药基因的方法，本发明公开了一种用于检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因的分子标记及其应用。
[0006] 技术方案：一种用于检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0007] 优选的，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行
氨基化修饰并附加10个
碱基T。
[0008] 表1分子标记序列
[0009]名称 序列(5’-3’) SEQ ID NO.
P1-F NH2-T(10)GCCCGAATTGTTCAAGTTGT 1
P1-R GGTCCGAAATTGACCTGACC 2
P2-F NH2-T(10)GTCGGATCAGGAACAGGACA 3
P2-R GAGCTGTCGGAATCGGTCTT 4
P3-F NH2-T(10)GACCGCCATTGAACTAGACC 5
P3-R GCTTGATCCAATTGGTACCTTGGA 6
[0010] 所述分子标记在制备检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因
试剂盒中的应用。
[0011] 优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸
水。
[0012] 优选的，所述试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因的步骤包括：
[0013] (1)取样：选取纯化后的鸭疫里默氏杆菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入10～60μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
[0014] (2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0015] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～400倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0016] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0017] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶
电泳检测。
[0018] 优选的，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LA Taq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0019] 优选的，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0020] 优选的，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0021] 优选的，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0022] 有益效果：(1)本发明所述分子标记能够快速、大量、并直观的显示出细菌基因组中耐药基因；(2)本发明所述分子标记具有特异性好、灵敏度高、
稳定性好的优点。
附图说明
[0024] 其中，M为分子量为2000bp的Maker；1为实施例1PCR产物电泳结果；2为实施例2PCR产物电泳结果；3为实施例3PCR产物电泳结果。
具体实施方式
[0025] 实施例1
[0026] 一种用于检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0027] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。
[0028] 所述分子标记在制备检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因试剂盒中的应用。
[0029] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0030] 所述试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因的步骤包括：
[0031] (1)取样：选取纯化后的鸭疫里默氏杆菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入10μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
[0032] (2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0033] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0034] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0035] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0036] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LA Taq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0037] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0038] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0039] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0040] 实施例2
[0041] 一种用于检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0042] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。
[0043] 所述分子标记在制备检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因试剂盒中的应用。
[0044] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0045] 所述试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因的步骤包括：
[0046] (1)取样：选取纯化后的鸭疫里默氏杆菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入35μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
[0047] (2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0048] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释250倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0049] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释60倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0050] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0051] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LA Taq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0052] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0053] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0054] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0055] 实施例3
[0056] 一种用于检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0057] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。
[0058] 所述分子标记在制备检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因试剂盒中的应用。
[0059] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0060] 所述试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药基因的步骤包括：
[0061] (1)取样：选取纯化后的鸭疫里默氏杆菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入60μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
[0062] (2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0063] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释400倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0064] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0065] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0066] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LA Taq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0067] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0068] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0069] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
