火箭植物的一部分的提取物在激发植物和树木的防御中的用途及相关组合物与方法
阅读：712发布：2020-05-12
专利汇可以提供火箭植物的一部分的提取物在激发植物和树木的防御中的用途及相关组合物与方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且火箭 植物 的至少一个部分的提取物的用途，所述火箭植物优选自芸芥属(芝麻菜、 水 疱性芥菜等)、二行芥属(芥菜二元体、细叶二行芥、墙生二行芥等)、匙荠属(芥匙荠、疣果匙荠)、犬芥属(鼻疽犬芥、水茄犬芥等)和海滩芥属，以便激发植物和树木的防御并且降低细菌和 真菌 对植物和树木的影响。尤其是，以下影响：-木质部难养菌细菌对桃金娘叶远志、 葡萄藤 、橄榄树、柑橘树、夹竹桃、扁桃树、咖啡树、桃树和核果树、 橡胶 树、薰衣草、迷迭香或者金雀花的影响，-树生黄单胞菌李致病变种细菌对李属的影响，优选地，李属是如下的水果/坚果树的组：杏树、扁桃树、樱桃树、桃树、李树、中国李、樱桃月桂和其它外来或观赏的李属植物，包括山桃和桂樱，-梨枯萎植原体细菌或正梨衰退病植原体对梨树的影响，-玉米红化病植原体细菌对葡萄藤、薰衣草、 马 铃薯植株、番茄植株、茄子植株、辣椒植株和 烟草 植株的影响。，下面是火箭植物的一部分的提取物在激发植物和树木的防御中的用途及相关组合物与方法专利的具体信息内容。
1.火箭植物的至少一个部分的提取物的用途，所述火箭植物优选自芸芥属(芝麻菜、水疱性芥菜等)、二行芥属(芥菜二元体、细叶二行芥、墙生二行芥等)、匙荠属(芥匙荠、疣果匙荠)、犬芥属(鼻疽犬芥、水茄犬芥等)和海滩芥属，以便激发植物或树木的防御并且降低如下影响：
-木质部难养菌细菌对桃金娘叶远志、葡萄藤、橄榄树、柑橘树、夹竹桃、扁桃树、咖啡树、桃树和核果树、橡胶树、薰衣草、迷迭香或者金雀花的影响，
-丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌对猕猴桃属植物的影响，
-树生黄单胞菌核桃致病变种细菌对核桃树的影响，
-树生黄单胞菌李致病变种细菌对李属的影响，优选地，李属是如下的水果/坚果树的组：杏树、扁桃树、樱桃树、桃树、李树、中国李、樱桃月桂和其它外来或观赏的李属植物，包括山桃和桂樱，
-梨枯萎植原体细菌或正梨衰退病植原体对梨树的影响，
-玉米红化病植原体细菌对葡萄藤、薰衣草、马铃薯植株、番茄植株、茄子植株、辣椒植株和烟草植株的影响，
-霜霉病真菌对葡萄藤的影响，或者，晚疫病菌对马铃薯植株和番茄植株的影响，或者，柠檬疫霉对柑桔树的影响，或者，恶疫霉对梨树和苹果树的影响，或者，莴苣盘梗霉对洋蓟的影响。所有这些病原真菌都会造成霉病，或者
-粉孢子型真菌的影响，诸如，月季白粉菌对玫瑰花丛的影响、真菌葡萄白粉菌(以前叫葡萄白粉菌)对葡萄藤的影响和粉孢子对番茄植株、莴苣、黄瓜、草莓、树莓植株、醋栗丛、桃树、梨树、女贞、康乃馨的影响。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，为了激发植物或树木的防御并且降低木质部难养菌细菌对桃金娘叶远志、葡萄藤、橄榄树、柑橘树、夹竹桃、扁桃树、咖啡树、桃树和核果树、橡胶树、薰衣草、迷迭香或者金雀花的影响。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，为了激发植物或树木的防御并且降低丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌对猕猴桃属植物的影响。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，为了激发植物或树木的防御并且降低树生黄单胞菌核桃致病变种细菌对核桃树的影响。
5.根据权利要求1所述的用途，其中，为了激发植物或树木的防御并且降低树生黄单胞菌李致病变种细菌对李属的影响，李属尤其是水果/坚果树，诸如杏树、扁桃树、樱桃树、桃树、李树、中国李、樱桃月桂和其它外来或观赏的李属植物，包括山桃和桂樱。
6.根据权利要求1所述的用途，其中，为了激发植物或树木的防御并且降低梨枯萎植原体细菌或正梨衰退病植原体对梨树的影响。
7.根据权利要求1所述的用途，其中，为了激发植物或树木的防御并且降低玉米红化病植原体细菌对葡萄藤、薰衣草、马铃薯植株、番茄植株、茄子植株、辣椒植株和烟草植株的影响。
8.根据权利要求1所述的用途，其中，为了激发植物或树木的防御并且降低霜霉病真菌对葡萄藤的影响，或者，晚疫病菌对马铃薯植株和番茄植株的影响，或者，柠檬疫霉对柑桔树的影响，或者，恶疫霉对梨树和苹果树的影响，或者，莴苣盘梗霉对洋蓟的影响，所有这些病原真菌都会造成霉病。
9.根据权利要求1所述的用途，其中，为了激发植物或树木的防御并且降低粉孢子型真菌的影响，诸如，月季白粉菌对玫瑰花丛的影响、真菌葡萄白粉菌(以前叫葡萄白粉菌)对葡萄藤的影响和粉孢子对番茄植株、莴苣、黄瓜、草莓、树莓植株、醋栗丛、桃树、梨树、女贞、康乃馨的影响。
10.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其中，在植物或树木上的施用是采用叶面喷洒，浇地，点滴灌溉，在水培、种子处理和/或种子包衣中使用的方式来实现的。
11.根据权利要求1-10任一项所述的用途，其中，在植物或树木上的施用是通过将组合物在水中稀释至2g/L至150g/L来实现的，稀释度表示为进行提取的植物克数每升产品。
12.根据权利要求1-11任一项所述的用途，其中，在植物或树木上的施用是通过将组合物在水中稀释至5g/L至70g/L来实现的，稀释度表示为进行提取的植物克数每升产品。
13.根据权利要求1-12任一项所述的用途，其中，火箭植物的至少一个部分的所述提取物是从所述火箭植物的研磨材料得到的芝麻菜属火箭植物的液体提取物，并且：
-火箭植物的至少一个部分的所述提取物至少包括火箭植物的叶，优选主要是叶，并且-能够得到所述液体提取物的方法包括如下步骤：
a)在水介质中研磨所述芝麻菜属的火箭植物的步骤；
b)过滤得到的研磨材料；和
c)过滤之后，回收得到的芝麻菜属的火箭植物的液体提取物。
14.根据权利要求13所述的用途，其中，火箭植物的至少一个部分的所述提取物是芝麻菜属的火箭植物的液体提取物。
15.一种激发植物或树木的防御并降低如下影响的方法：
-木质部难养菌细菌对桃金娘叶远志、葡萄藤、橄榄树、柑橘树、夹竹桃、扁桃树、咖啡树、桃树和核果树、橡胶树、薰衣草、迷迭香或者金雀花的影响，
-猕猴桃属植物上的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌，
-丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌对猕猴桃属植物的影响，
-树生黄单胞菌李致病变种细菌对李属的影响，李属尤其是水果/坚果树，诸如杏树、扁桃树、樱桃树、桃树、李树、中国李、樱桃月桂和其它外来或观赏的李属植物，包括山桃和桂樱，
-梨枯萎植原体细菌或正梨衰退病植原体对梨树的影响，
-玉米红化病植原体细菌对葡萄藤、薰衣草、马铃薯植株、番茄植株、茄子植株、辣椒植株和烟草植株的影响，
-霜霉病真菌对葡萄藤的影响，或者，晚疫病菌对马铃薯植株和番茄植株的影响，或者，柠檬疫霉对柑桔树的影响，或者，恶疫霉对梨树和苹果树的影响，或者，莴苣盘梗霉对洋蓟的影响。所有这些病原真菌都会造成霉病，或者
-粉孢子型真菌的影响，诸如，月季白粉菌对玫瑰花丛的影响、真菌葡萄白粉菌(以前叫葡萄白粉菌)对葡萄藤的影响和粉孢子对番茄植株、莴苣、黄瓜、草莓、树莓植株、醋栗丛、桃树、梨树、女贞、康乃馨的影响；
所述方法的特征在于它包括在所述植物或所述树木上施用火箭植物的至少一个部分的所述提取物，火箭植物例如是芸芥属(芝麻菜、水疱性芥菜等)、二行芥属(芥菜二元体、细叶二行芥、墙生二行芥等)、匙荠属(芥匙荠、疣果匙荠)、犬芥属(鼻疽犬芥、水茄犬芥等)和海滩芥属。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，在植物或树木上的施用是采用叶面蒸发，浇地，土壤灌溉，逐滴灌溉，在水培、种子处理和/或种子包衣中使用的方式来实现的。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，施用于所述植物或所述树木的化合物是包括从所述火箭植物的研磨材料得到的芝麻菜属火箭植物的液体提取物的组合物，并且：
-火箭植物的至少一个部分的所述提取物至少包括火箭植物的叶，优选主要是叶，并且-能够得到所述液体提取物的方法包括如下步骤：
a)在水介质中研磨所述芝麻菜属的火箭植物的步骤；
b)过滤得到的研磨材料；和
c)过滤之后，回收得到的芝麻菜属的火箭植物的液体提取物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，火箭植物的至少一个部分的所述提取物是芝麻菜属的火箭植物的液体提取物。
19.一种组合物，其包括火箭植物的至少一个部分的提取物，火箭植物例如是芸芥属(芝麻菜、水疱性芥菜等)、二行芥属(芥菜二元体、细叶二行芥、墙生二行芥等)、匙荠属(芥匙荠、疣果匙荠等)、犬芥属(鼻疽犬芥、水茄犬芥等)和海滩芥属，以便激发植物或树木的防御并且降低如下影响：
-木质部难养菌细菌对桃金娘叶远志、葡萄藤、橄榄树、柑橘树、夹竹桃、扁桃树、咖啡树、桃树和核果树、橡胶树、薰衣草、迷迭香或者金雀花的影响，
-猕猴桃属植物上的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌，
-丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌对猕猴桃属植物的影响，
-树生黄单胞菌李致病变种细菌对李属的影响，优选地，李属是如下的水果/坚果树的组：杏树、扁桃树、樱桃树、桃树、李树、中国李、樱桃月桂和其它外来或观赏的李属植物，包括山桃和桂樱，
-梨枯萎植原体细菌或正梨衰退病植原体对梨树的影响，
-玉米红化病植原体细菌对葡萄藤、薰衣草、马铃薯植株、番茄植株、茄子植株、辣椒植株和烟草植株的影响，
-霜霉病真菌对葡萄藤的影响，或者，晚疫病菌对马铃薯植株和番茄植株的影响，或者，柠檬疫霉对柑桔树的影响，或者，恶疫霉对梨树和苹果树的影响，或者，莴苣盘梗霉对洋蓟的影响。所有这些病原真菌都会造成霉病，或者
-粉孢子型真菌的影响，诸如，月季白粉菌对玫瑰花丛的影响、真菌葡萄白粉菌(以前叫葡萄白粉菌)对葡萄藤的影响和粉孢子对番茄植株、莴苣、黄瓜、草莓、树莓植株、醋栗丛、桃树、梨树、女贞、康乃馨的影响。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中，至少一种活性要素是从火箭植物属植物的叶获得。
21.根据权利要求19或20所述的组合物，其中，至少一种活性要素是从火箭植物属植物的种子获得。
22.根据权利要求19-21任一项所述的组合物，其中，至少一种活性要素是从火箭植物属植物的茎获得。
23.根据权利要求19-22任一项所述的组合物，其中，至少一种活性要素是从火箭植物属植物的根获得。
24.根据权利要求19-23任一项所述的组合物，其中，至少一种活性要素是从火箭植物属植物的花获得。
25.根据权利要求19-24任一项所述的组合物，其中，通过研磨火箭植物属植物的至少一个部分来获得至少一种活性要素。
26.根据权利要求19-25任一项所述的组合物，其中，通过水提取、油提取、溶剂提取或者通过提取油料饼或糊状物来获得至少一种活性要素。
27.根据权利要求19-26任一项所述的组合物，其中，所述组合物以粉末、可溶性粉末、可湿性粉末、颗粒、分散颗粒、可湿性颗粒或慢扩散颗粒的形式制成制剂，在使用时在水中稀释。
28.根据权利要求19-27任一项所述的组合物，其中，所述组合物以液体、可溶性浓缩液、可乳化浓缩物、浓缩悬液或即用型的形式制成制剂。
29.一种生产权利要求19-28任一项所述的组合物的方法，其包括研磨火箭植物属植物的至少一个部分以提供研磨材料的步骤(110)，以及提取所述研磨材料的固体部分并得到液体的过滤步骤(115)。
火箭植物的一部分的提取物在激发植物和树木的防御中的用
途及相关组合物与方法
技术领域
[0001] 本发明涉及火箭植物(Rocket plant)的提取物用于激发植物和树木的防御的用途，相关的组合物和方法。本发明目的在于降低治病因素的侵害对植物或树木的影响，以便至少使植物和树木尽管被感染仍然能继续生长、战胜疾病，即，通过降低或消除病原体的影响，使植物或树木尽管有病原体但仍生长发育。在某些用途中，火箭植物的提取物也能够使植物根除某些病原体。这种用途可以是治愈性的或预防性的。
[0002] 尤其，它涉及如下植物或树木的治疗：
[0003] -木质部难养菌(Xylella fastidiosa bacteria)细菌感染的植物和树木，尤其是如下植物和树木：
[0004] -桃金娘叶远志(Myrtle-leaf milkwort)，
[0005] -葡萄藤，
[0006] -橄榄树，
[0007] -柑橘树，
[0008] -夹竹桃，
[0009] -杏树，
[0010] -咖啡树，
[0011] -桃树和核果树，
[0012] -橡树，
[0013] -薰衣草，
[0014] -迷迭香，和
[0015] -金雀花；
[0016] -丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌(Pseudomonas syringae pv.actinidiae bacteria)感染的猕猴桃属植物；
[0017] -树生黄单胞菌核桃致病变种细菌(Xantomonas arboricola pv juglandis bacteria)感染的树木，尤其是核桃树，或者，树生黄单胞菌李致病变种细菌(Xanthomonas arboricola pv.Pruni bacteria)感染的树木，特别是李属(Prunus spp.)，尤其是水果/坚果树，诸如杏树、扁桃树、樱桃树、桃树、李树、中国李、樱桃月桂和其它外来或观赏的李属植物，包括山桃和桂樱；
[0018] -梨枯萎植原体细菌(Pear Decline Phytoplasma bacteria)或正梨衰退病植原体(Candidatus Phytoplasma pyri)感染的梨树；
[0020] -霜霉病(Plasmapora viticola)侵害的葡萄藤，以及(晚疫病菌(Phytophtora infestans)感染的)马铃薯植株和番茄植株，(柠檬疫霉(phytophtora citrophtora)感染的)柑桔树，(恶疫霉(Phytophtora cactorum)感染的)梨树和苹果树，或者(莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)感染的)洋蓟；或
[0021] -分别称作月季白粉菌(Podosphaera pannosa)和真菌葡萄白粉菌(Erysiphe necator)(以前叫葡萄白粉菌(Uncinula necator))的真菌的白粉病(粉孢子)侵害的玫瑰花丛和葡萄藤，和粉孢子感染的番茄植株、莴苣、黄瓜、草莓、树莓植株、醋栗丛、桃树、梨树、女贞、康乃馨。
[0023] 针对减少使用化学杀虫剂的社会和监管压力持续增加。很多农民在寻找更加环境友好的、可持续用于新农业系统、使用简单并且对他们的农产品有积极作用的产品。越来越多地，消费者想要有益于健康的产品，这些产品没有受到杀虫剂的近些年来已被大众所知的有害影响。
[0024] 拒绝使用化学杀虫剂与获得更加环境友好的产品之间存在分歧是有原因的。更具体地，但非穷尽地，下述原因最频繁被提及：
[0025] -商品化生物杀虫剂的生产较为困难；
[0026] -生物杀虫剂的制剂(稳定性有限)；
[0027] -生物杀虫剂的有效性(很少等效于合成的化学分子)；
[0028] -生物杀虫剂研究的资金；和
[0029] -审批成本，其非常昂贵。
[0030] 下面详细描述了使用火箭植物对抗病原体的已知效果。在针对病原体的植物保护领域，文献报道了涉及火箭植物(芝麻菜(Eruca sativa))的几种措施：
[0031] 从火箭植物(芝麻菜)的叶、种子、花和采用溶剂提取生物活性化合物使得可在体外观察抗菌活性(Solana et al.,2014；Koubaa et al.,2015)。已经针对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌研究了该抗菌活性。结果显示了体外效力梯度和依赖于所使用的溶剂的显著差异。
[0032] 来源于芥子油苷(glucosinolates)(GLS)的化合物(其在芥子酶(MYR)催化的水解过程中产生)也已经显示具有抗菌作用。当存在MYR酶时，随着β-D-葡萄糖、硫酸根离子和诸如异硫氰酸酯、腈类或硫氰酸盐的某些化合物的形成，GLS被水解。
[0034] 因此，文献中提供的一种溶剂是直接使用含有至少一种芥子油苷和至少一种酶(葡萄糖苷或硫葡萄糖苷酶)的种子粉，其可用作土壤改良剂，消灭土壤寄生虫。为了优化GLS和酶的含量，种子是在环境温度条件下脱油的，以便保护GLS/酶复合物。以这种模式获得的种子粉能够在土壤中分散。与水接触会引发化合物的水解以及针对寄生虫的细胞毒性作用。在该内容中，芝麻菜种子粉被引用作为具有这些特性的实例之一(Lazzeri et al.,2004)。
[0035] 生物熏蒸是目的在于减少土壤中致病菌、害虫和杂草种子数目的生物方法。它以使用富含芥子油苷的植物(主要属于十字花科家族)为基础。当这些植物腐烂时，芥子油苷会通过芥子酶的作用转变为异硫氰酸酯和硫氰酸酯。异硫氰酸酯和硫氰酸酯是挥发性的并对某些土壤有机体有毒。在这方面，从文献中已知，将整个芝麻菜植株埋于土壤中，结合人工合成杀线虫剂，能够抑制线虫(哥伦比亚根结线虫、北方根结线虫、南方根结线虫)入侵(Riga et al.,2006)。在该具体实例中，芝麻菜发挥线虫诱捕器和毒性化合物储存器的作用。
[0036] 发明目的
[0038] 为了这个目的，根据第一方面，本发明提出了火箭植物的至少一个部分的提取物的用途，所述火箭植物优选自芸芥属(Eruca)(芝麻菜(Eruca sativa)、水疱性芥菜(Eruca vesicaria)等)、二行芥属(Diplotaxis)(芥菜二元体(Diplotaxis erucoides)、细叶二行芥(Diplotaxis tenuifolia)、墙生二行芥(Diplotaxis muralis)等)、匙荠属(Bunias)(芥匙荠(Bunias erucago)、疣果匙荠(Bunias orientalis))、犬芥属(Erucastrum)(鼻疽犬芥(Erucastrum nasturtiifolium)、水茄犬芥(Erucastrum incanum)等)和海滩芥属(Cakile genuses)，以便通过施用来激发植物或树木的防御并且降低如下影响：
[0039] -木质部难养菌细菌对桃金娘叶远志、葡萄藤、橄榄树、柑橘树、夹竹桃、扁桃树、咖啡树、桃树和核果树、橡胶树、薰衣草、迷迭香或者金雀花的影响，
[0040] -丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌对猕猴桃属植物的影响，
[0041] -树生黄单胞菌核桃致病变种细菌对核桃树的影响，
[0042] -树生黄单胞菌李致病变种细菌对李属的影响，优选地，李属是如下的水果/坚果树的组：杏树、扁桃树、樱桃树、桃树、李树、中国李、樱桃月桂和其它外来或观赏的李属植物，包括山桃和桂樱，
[0043] -梨枯萎植原体细菌或正梨衰退病植原体对梨树的影响，
[0044] -玉米红化病植原体细菌对葡萄藤、薰衣草、马铃薯植株、番茄植株、茄子植株、辣椒植株和烟草植株的影响，
[0045] -霜霉病真菌对葡萄藤的影响，或者，晚疫病菌对马铃薯植株和番茄植株的影响，或者，柠檬疫霉对柑桔树的影响，或者，恶疫霉对梨树和苹果树的影响，或者，莴苣盘梗霉对洋蓟的影响。所有这些病原真菌都会造成霉病，或者
[0046] -粉孢子型真菌的影响，诸如，月季白粉菌对玫瑰花丛的影响、真菌葡萄白粉菌(以前叫葡萄白粉菌)对葡萄藤的影响和粉孢子对番茄植株、莴苣、黄瓜、草莓、树莓植株、醋栗丛、桃树、梨树、女贞、康乃馨的影响。
[0047] 在本文中，应注意的是，火箭植物(“Eruca sativa”)是十字花科(Brassicaceae)(或十字花科(Cruciferae))的一年生植物，具有带棕纹或紫纹的白色或淡黄色花朵，它通常是细长的，锯齿状的叶子具有辛辣的味道。取决于地区，火箭植物称作芝麻菜(rucola)、芝麻菜(arugula)、芝麻菜(rouquette)或芝麻菜(riquette)。芝麻菜(riquette)是野生型的火箭植物，具有非常美味的小叶子。二行芥属的其它相似植物称作火箭植物。当需要对它们进行区分的时候，二行芥属火箭植物称作“野生火箭植物”和芝麻菜属火箭植物(Eruca rockets)“菜园火箭植物”(garden rocket)。本发明并不局限于这种类型的火箭植物，可以扩展到芝麻菜(Eruca sativa)。根据来源和地区，对火箭植物的描述也可不同。应注意的是，火箭植物的常用名也包括芝麻菜(Rucola)和芝麻菜(Arugula)。
[0048] 优选地，本发明采用的火箭植物是如下类型：芸芥属(Eruca)(芝麻菜(Eruca sativa)、水疱性芥菜(Eruca vesicaria)等)、二行芥属(Diplotaxis)(芥菜二元体(Diplotaxis erucoides)、细叶二行芥(Diplotaxis tenuifolia)、墙生二行芥(Diplotaxis muralis)等)、匙荠属(Bunias)(芥匙荠(Bunias erucago)、疣果匙荠(Bunias orientalis)等)、犬芥属(Erucastrum)(鼻疽犬芥(Erucastrum nasturtiifolium)、水茄犬芥(Erucastrum incanum)等)和海滩芥属(Cakile)(海洋芥(Cakile maritima)等)。在本发明的上下文中，火箭植物包括所有这些类型，这些类型可以混合。下面提及的火箭植物属于白花菜种(Capparales species)和十字花科。
[0049] 应注意的是，活性要素(或者活性化合物、活性成分或活性物质)是激发被上述病原体之一感染的上述植物和树木的防御的所有产品成分。
[0050] 这样的组合物可以由对火箭植物进行研磨和提取而得到的总粗提物组成，由此种总粗提物的富含活性化合物的部分组成，或者由混合物中一种或多种活性化合物组成。这样的组合物能够有利地以有效量抑制被上述细菌或真菌感染的上述植物和树木的症状。
[0051] 应注意，病原体对植物或树木的影响减轻在某些情况下包括症状的全部或部分减轻，甚至根除病原体。这是因为，当它们的防御系统起作用时(尤其是多亏了利用本发明而获得的刺激)，植物和树木有能力消灭寄生虫。作为本发明主题的火箭植物提取物的用途的目的是激发植物已经能够做的，但是因为它们没有识别出它们的攻击者而在“敏感”情况下没有做。因此，在说明书的一些实施例中出现了病症减轻。
[0053] 在一些实施方案中，通过将组合物在水中稀释至2g/L至150g/L(表示为每升产品中进行提取的植物的克数)来施用于植物或树木。
[0054] 在一些实施方案中，通过将组合物在水中稀释至5g/L至70g/L(表示为每升产品中进行提取的植物的克数)来施用于植物或树木。
[0055] 在一些实施方案中，火箭植物的至少一个部分的所述提取物是从所述火箭植物的研磨材料得到的芝麻菜属火箭植物的液体提取物，并且：
[0056] -火箭植物的至少一个部分的所述提取物至少包括火箭植物的叶，优选主要是叶，并且
[0057] -能够得到所述液体提取物的方法包括如下步骤：
[0058] a)在水介质中研磨所述芝麻菜属的火箭植物的步骤；
[0059] b)过滤得到的研磨材料；和
[0060] c)回收过滤之后得到的芝麻菜属的火箭植物的液体提取物。
[0061] 在本文中，术语“主要包括”意思是包括按重量计至少(例如)75-80％的火箭植物的叶，例如，在与水溶剂混合之前相对于火箭植物总重的干重。
[0062] 在一些实施方案中，火箭植物的至少一个部分的所述提取物是芝麻菜属的火箭植物的液体提取物。
[0063] 根据第二方面，本发明提出了激发植物或树木的防御并降低如下影响的方法：
[0064] -木质部难养菌细菌对桃金娘叶远志、葡萄藤、橄榄树、柑橘树、夹竹桃、扁桃树、咖啡树、桃树和核果树、橡胶树、薰衣草、迷迭香或者金雀花的影响，
[0065] -猕猴桃属植物上的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌，
[0066] -丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌对猕猴桃属植物的影响，
[0067] -树生黄单胞菌李致病变种细菌对李属的影响，优选地，李属是如下的水果/坚果树的组：杏树、扁桃树、樱桃树、桃树、李树、中国李、樱桃月桂和其它外来或观赏的李属植物，包括山桃和桂樱，
[0068] -梨枯萎植原体细菌或正梨衰退病植原体对梨树的影响，
[0069] -玉米红化病植原体细菌对葡萄藤、薰衣草、马铃薯植株、番茄植株、茄子植株、辣椒植株和烟草植株的影响，
[0070] -霜霉病真菌对葡萄藤的影响，或者，晚疫病菌对马铃薯植株和番茄植株的影响，或者，柠檬疫霉对柑桔树的影响，或者，恶疫霉对梨树和苹果树的影响，或者，莴苣盘梗霉对洋蓟的影响。所有这些病原真菌都会造成霉病，或者
[0071] -粉孢子型真菌的影响，诸如，月季白粉菌对玫瑰花丛的影响、真菌葡萄白粉菌(以前叫葡萄白粉菌)对葡萄藤的影响和粉孢子对番茄植株、莴苣、黄瓜、草莓、树莓植株、醋栗丛、桃树、梨树、女贞、康乃馨的影响；
[0072] 一种方法，其包括在所述植物或所述树木上施用火箭植物的至少一个部分的所述提取物，火箭植物例如是芸芥属(芝麻菜、水疱性芥菜等)、二行芥属(芥菜二元体、细叶二行芥、墙生二行芥等)、匙荠属(芥匙荠、疣果匙荠)、犬芥属(鼻疽犬芥、水茄犬芥等)和海滩芥属。
[0073] 在一些实施方案中，通过叶面喷洒，浇地，点滴灌溉，在水培、种子处理和/或种子包衣中使用的方式来施用于植物或树木。
[0074] 在一些实施方案中，施用于所述植物或所述树木的化合物是包括从所述火箭植物的研磨材料得到的芝麻菜属火箭植物的液体提取物的组合物，并且：
[0075] -火箭植物的至少一个部分的所述提取物至少包括火箭植物的叶，优选主要是叶，并且
[0076] -能够得到所述液体提取物的方法包括如下步骤：
[0077] a)在水介质中研磨所述芝麻菜属的火箭植物的步骤；
[0078] b)过滤得到的研磨材料；和
[0079] c)回收过滤之后得到的芝麻菜属的火箭植物的液体提取物。
[0080] 在一些实施方案中，火箭植物的至少一个部分的所述提取物是芝麻菜属的火箭植物的液体提取物。
[0081] 为了该目的，根据本发明的第三个方面，本发明提出了一种组合物，其包括火箭植物的至少一个部分的提取物，火箭植物例如是芸芥属(芝麻菜、水疱性芥菜等)、二行芥属(芥菜二元体、细叶二行芥、墙生二行芥等)、匙荠属(芥匙荠、疣果匙荠等)、犬芥属(鼻疽犬芥、水茄犬芥等)和海滩芥属，以便激发植物或树木的防御并且降低如下影响：
[0082] -木质部难养菌细菌对桃金娘叶远志、葡萄藤、橄榄树、柑橘树、夹竹桃、扁桃树、咖啡树、桃树和核果树、橡胶树、薰衣草、迷迭香或者金雀花的影响，
[0083] -猕猴桃属植物上的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌，
[0084] -丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌对猕猴桃属植物的影响，
[0085] -树生黄单胞菌李致病变种细菌对李属的影响，优选地，李属是如下的水果/坚果树的组：杏树、扁桃树、樱桃树、桃树、李树、中国李、樱桃月桂和其它外来或观赏的李属植物，包括山桃和桂樱，
[0086] -梨枯萎植原体细菌或正梨衰退病植原体对梨树的影响，
[0087] -玉米红化病植原体细菌对葡萄藤、薰衣草、马铃薯植株、番茄植株、茄子植株、辣椒植株和烟草植株的影响，
[0088] -霜霉病真菌对葡萄藤的影响，或者，晚疫病菌对马铃薯植株和番茄植株的影响，或者，柠檬疫霉对柑桔树的影响，或者，恶疫霉对梨树和苹果树的影响，或者，莴苣盘梗霉对洋蓟的影响。所有这些病原真菌都会造成霉病，或者
[0089] -粉孢子型真菌的影响，诸如，月季白粉菌对玫瑰花丛的影响、真菌葡萄白粉菌(以前叫葡萄白粉菌)对葡萄藤的影响和粉孢子对番茄植株、莴苣、黄瓜、草莓、树莓植株、醋栗丛、桃树、梨树、女贞、康乃馨的影响。
[0090] 在一些实施方案中，至少一种活性要素是由火箭植物属植物的叶获得。
[0091] 在一些实施方案中，至少一种活性要素是由火箭植物属植物的种子获得。
[0092] 在一些实施方案中，至少一种活性要素是由火箭植物属植物的茎获得。
[0093] 在一些实施方案中，至少一种活性要素是由火箭植物属植物的根获得。
[0094] 在一些实施方案中，至少一种活性要素是由火箭植物属植物的花获得。
[0095] 在一些实施方案中，通过研磨火箭植物属植物的至少一个部分来获得至少一种活性要素。
[0096] 在一些实施方案中，通过水提取、油提取、溶剂提取或者通过提取油料饼或糊状物来获得至少一种活性要素。
[0097] 在一些实施方案中，组合物可以以粉末、可溶性粉末、可湿性粉末、颗粒、分散颗粒、可湿性颗粒或慢扩散颗粒的形式制成制剂，在使用时在水中稀释。
[0098] 在一些实施方案中，组合物可以以液体、可溶性浓缩液、可乳化浓缩物、浓缩悬液或即用型的形式制成制剂。
[0099] 根据第四方面，本发明提出了生产作为本发明主题的组合物的方法，其包括研磨火箭植物属(rocket genus)植物的至少一个部分以提供研磨材料的步骤，以及提取所述研磨材料的固体部分并得到液体的过滤步骤。
[0101] 本发明的其它优点、目的和特征将参考所附附图由如下描述变得明显，如下描述作为实例而非限制，其中：
[0102] -图1以流程图的形式表示了生产与使用研磨材料的方法的特定实施方式中的步骤，其是作为本发明主题的产品的优选实施例；
[0103] -图2表示了插入点，对该插入点叶片计数来评估本年度最后树枝的生长情况；
[0104] -图3是显示经过处理的橄榄树和“对照”橄榄树的植被再生情况(新叶/嫩芽的数目)的柱状图；
[0105] -图4显示了，当作为本发明主题的产品已经包括在培养基中时，该产品对特定真菌物种的抑制潜能；
[0106] -图5显示了，当作为本发明主题的产品已经涂布于培养基表面时，该产品对特定真菌物种的抑制潜能；
[0107] -图6比较了经过处理的橄榄树和“对照”橄榄树的叶子的叶绿素含量(“Spad指数”)；
[0108] -图7比较了经过处理的橄榄树和“对照”橄榄树的叶子的气孔导度(水势)；
[0109] -图8显示了，在不同取样日期，经过处理的橄榄树和“对照”橄榄树的植被再生情况(新叶/嫩芽的数目)；
[0110] -图9显示了，在不同取样日期，经过处理的橄榄树和“对照”橄榄树的植被再生情况(幼枝的长度)；
[0111] -图10比较了不同取样日期经过处理的橄榄树和“对照”橄榄树的叶子的叶绿素含量(“Spad指数”)；
[0112] -图11比较了不同取样日期经过处理的橄榄树和“对照”橄榄树的叶子的气孔导度(水势)；
[0113] -图12表示了对分析标准溶液和三个样本重复进行分析得到的色谱图，证实了作为本发明主题的产品中没有芥酸精；
[0114] -图13以木质部难养菌细菌病百分比(DAMDIS)的形式表示了实验方案的结果，DAMDIS表示平均严重程度/每块地橄榄树的疾病严重程度；
[0115] -图14表示对橄榄树的新芽/梢的数目的评估；
[0116] -图15表示实验方案中对橄榄种植活力的评估；
[0117] -图16表示实验方案中对新橄榄芽的长度的评估；
[0118] -图17表示实验方案中对橄榄树NVDI特征的评估；
[0119] -图18表示实验方案中对橄榄树气孔导度的评估；
[0120] -图19表示实验方案中对每地块的橄榄鲜重的评估；
[0121] -图20表示实验方案中对每100个果实的橄榄的鲜重的评估；
[0122] -图21表示实验方案中对油浓度的评估；
[0123] -图22表示核桃树的处理日程；
[0124] -图23表示，相比于未处理“对照”，经过处理的薰衣草植株生长的生理参数的发展；
[0125] -图24是显示对照植株和采用本发明主题的产品处理的植株中匍匐茎植原体(玉米红化病植原体)引发的疾病演化的照片。
具体实施方式
[0126] 包括作为本发明主题的组合物的产品(后续称作“PP1”)不对应于文献中所描述的：
[0127] 1/根据如下描述的方法(图1)，用水按照优选的提取模式来提取PP1(叶、茎、花、种子、根)。在现场使用中，产品在喷淋罐中进一步被稀释以便喷于叶面(或者用途描述中描述的其它用途)。
[0128] 2/在这些提取条件下获得的产品PP1没有直接的抗菌活性(无抗细菌或抗真菌活性)。该论证在三个不同的体外实验中实现：
[0129] 2.a/在BIOPRESERV(格拉斯，法国)进行的关于即用型PP1产品的特定实验中。在实验室分析条件下，在三天和七天的接触之后，PP1样品显示对研究的菌株无毒性作用(实施例1)。
[0130] 实施例1–缺少抗细菌和抗真菌作用
[0131] 为了检测PP1的抗细菌作用，评价了PP1对生长六个月的菌株的作用：
[0132] 细菌：洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、菊苣属假单胞菌(Pseudomonas cichorii)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)
[0133] 霉菌：互隔交链孢霉(Alternaria alternata)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)(原短梗霉(A.pullulans))
[0134] 分析的样本是即用型PP1产品，以使用剂量。
[0135] 实验条件：
[0136] 如下方案是基于欧洲药典-第9版§5.1.3.抗菌防腐效果。
[0137] 样本以0.22μm过滤并在使用之前冷藏保存。
[0138] 研究的菌株的细节详见下表的接种组合物：
[0139]微生物 参考
细菌
洋葱伯克霍尔德菌 DSM 7288
菊苣属假单胞菌 DSM 50259
荧光假单胞菌 DSM 50090
酵母菌/霉菌
互隔交链孢霉 DSM 620 10
巴西曲霉 DSM 1988
产黑色素短梗霉 DSM 2404
细菌
洋葱伯克霍尔德菌 DSM 7288
菊苣属假单胞菌 DSM 50259
荧光假单胞菌 DSM 50090
酵母菌/霉菌
互隔交链孢霉 DSM 620 10
巴西曲霉 DSM 1988
产黑色素短梗霉 DSM 2404
[0140] 对于每个菌株，104-106CFU/ml的接种物在22℃±2℃与产品接触三至七天。对生理水(NaCl 9g/l)进行相同处理，作为对照。
[0141] 为了量化每次测量时间的污染，通过分布于表面或将0.1ml样本以十进制稀释于下述培养基中来进行计数：
[0142] -TSA(胰蛋白大豆琼脂，注册商标)琼脂，用于细菌计数(培养：30℃±2℃条件下2-5天)
[0143] -Sabouraud(注册商标)琼脂，用于霉菌计数(培养：23℃±2℃条件下3-7天)[0144] 结果以每毫升的“菌落形成单位”(CFU/ml)来表示。
[0145] 该分析方法能够检测10CFU/ml(检测极限)的污染。不能检测低于10CFU(<10)的污染。
[0146] 结果：
[0147] 结果列于以下表格，概括了不同接触时间的活微生物数目。
[0148]
[0149]
[0150] 结论：
[0151] 关于细菌，从三种菌株(洋葱伯克霍尔德菌、菊苣属假单胞菌、荧光假单胞菌)观察到了相同的表现。菌群保存在生理水中，在与PP1样本接触时增加。
[0152] 关于霉菌，
[0153] -对于互隔交链孢霉，观察到菌群在生理水中和PP1样本中随时间减少。
[0154] -对于产黑色素短梗霉，观察到菌群在生理水中保持且在PP1样本中增加。
[0155] -对于巴西曲霉，观察到菌群在生理水中有轻微减少且在PP1样本中保持。
[0156] 然而，已注意到，霉菌菌丝的形成会使其计数不如细菌的计数那么精确，霉菌的结果应由该事实来调整。
[0157] 在实验室分析条件下，在接触三天和七天之后，PP1样本显示对研究的菌株无毒性作用。
[0159] 2.c/在木质部难养菌(Xylella fastidiosa)上，PP1产品在体外直接应用在细菌上是没有抗菌作用的(实施例3和4)，但是在意大利南部进行的田地实验证实了其对该细菌的有效性。
[0160] 此外，在这些相同的实验中，在体外条件下在与“CoDiRO”疾病相关的其它主要真菌物种上也检测了PP1产品，前述其它主要真菌物种是：Phaeoacremonium、Phaeomoniella、Pleurostomophora、Colletotrichum、Botryosphaeriaceae。PP1产品在体外似乎不直接抑制真菌生长，每种微生物都生长。然而，在田地中，在处理的树木的核果中都没有发现这些微生物，然而在对照树木中发现了它们。来自于用本发明的产品处理的树木的橄榄上没有分离到致病真菌。
[0161] 类似地，
[0163] 十字花科(火箭植物是其成员之一)的一个主要特征是产生特定的次级代谢物，称作芥子油苷(阴离子硫苷)(Fahey et al.,2001；Bones和Rossiter,2006)。芥子油苷形成一组重要的非挥发性的含硫次级代谢物。
[0164] 然而，芥子油苷自身几乎没有生物活性，但是它们被称作芥子酶的葡糖硫苷酶水解形成多种水解产物，包括异硫氰酸酯、腈类、亚硫腈和硫氰酸酯(Bones和Rossiter,1996)。这些水解产物造成芥子油苷对食草动物的毒性、它们的味道和气味、它们的抗癌活性和芥子油苷的几乎所有其它生物活性(Halkier和Gershenzon,2006)。植物中芥子油苷的自发水解是被阻止的，因为芥子油苷和芥子酶在不同组织或细胞区室中是分开的。芥子油苷/芥子酶防御体系分布在所有植物器官中，包括叶、根、花、果实和种子(Textor和Gershenzon,2009)。当植物组织发生损坏时，根据pH和其它条件，芥子油苷会被固有的芥子酶(β-硫代葡萄糖苷水解酶、葡糖硫甘酶)快速水解，产生水解代谢物(Bones和Rossiter,
2006,1996；Fenwick et al.,1983)。当组织破坏时芥子油苷和芥子酶在其中接触的系统称为“芥子油苷-芥子酶”(Bones和Rossiter,2006,1996)。
2006,1996；Fenwick et al.,1983)。当组织破坏时芥子油苷和芥子酶在其中接触的系统称为“芥子油苷-芥子酶”(Bones和Rossiter,2006,1996)。
[0165] 因此，芥子油苷-芥子酶复合物是针对食草动物进化形成的化学防御系统，在十字花科成员中发现(其中一个是火箭植物(芝麻菜))。该复合物被认为是组成的且可诱导的防御体系。它是动态的，与害虫互动并形成防御害虫的完善的综合管理机制(Bones和Rossiter 2006,1996；Rask et al.,2000；Wittstock et al.,2004；Müller和Sieling,2006)。防御复合物在植物防御中是无活性的，两个分子储存在它们在植物叶片的各自区室内，直到叶片被食草动物撕掉(Tong-Xian Liu和Le Kang,2011)。
[0166] 芥子酶水解芥子油苷之后产生的异硫氰酸酯(ITC)在保护植物防御各种害虫(包括昆虫和微生物体系)方面发挥着重要的生态作用。
[0167] 多种研究已经显示ITC展示了针对多种细菌病原体的杀生物活性。关于ITC对于各种类型细菌的效果，没有一般规则。羟基和/或芳香族ITC的抗菌活性似乎总是高于脂肪族ITC(Dudour et al.,2015)。然而，该作用与剂量密切相关(Aires et al.,2009)。
[0168] 因为这些特征，由于在称作生物熏蒸的技术中作为农业杀虫剂的潜在用途，已经对芥子油苷和它们的降解产物进行了研究。在生物熏蒸中，富含芥子油苷的培养物覆盖在田地中，释放芥子油苷的毒性次级副产物，以便减少后续农业和园艺作物中虫害、杂草和疾病的发生率(Ngala et al.,2015；Lord et al.,2011)。
[0169] 然而，在植物提取产物中获得该复合物是非常复杂的。芥子油苷的水解产物是难以提取的重要的挥发性代谢物。不同的条件，诸如提取方法、溶剂和干燥方法，是成功提取的原因。因此，精确且有效的提取方法对于提取这些有价值的化合物来说是必需的，前述这些有价值的化合物然后能够用于不同生物活性，诸如抗癌、抗诱变、生物除草、抗菌、抗原性毒性的和抗肿瘤活性(Arora et al.,2014)。
[0170] 在我们的实例中，在PP1生产过程中，叶、茎、种子、根或花被研磨并在水中高度稀释，使得芥子油苷-芥子酶复合物的形成非常困难，因为芥子酶与其芥子油苷底物进行接触的概率是非常低的，从而阻止了毒性产物的形成。
[0171] 实施例2–证实PP1提取物中缺少芥酸精(Erucin)
[0172] 在火箭植物(芸芥和细叶二行芥)中，芝麻菜苷是以高浓度发现的一种芥子油苷，其可水解为芥酸精。
[0173] 如前文所述，异硫氰酸酯(ITC)是植物芥子油苷与芥子酶(植物组织分解释放的酶)反应的产物。该芥子酶-芥子油苷体系存在于十字花科植物中，诸如火箭植物。ITC是挥发性物质，以低浓度对大量致病微生物具有抑制效果，这使得它们成为有前途的抗菌候选物(Dufour et al.,2015)。与萝卜硫素(SF)密切相关的天然异硫氰酸酯已经显示具有杀菌作用(芥酸精、木兰苷(berteroin)、毛钩藤碱(hirsutine)、异硫氰酸苯乙酯(phenethyl isothiocyanate)和醛赖氨酸(allysine))(Wittstock和Gershenzon,2002；Fahey et al.,2013)。例如，Ganin(2013)发现萝卜硫素和芥酸精(在花椰菜、火箭植物和其它十字花科蔬菜中含量丰富的两种天然异硫氰酸酯)强烈抑制铜绿假单胞菌中的群体感应和毒性。
[0174] 按照下面的方案，PP1提取方法基于火箭植物的叶、茎、花、种子或根的研磨和水提取，在使用过程中该提取的结果在水中高度稀释。该技术使得芥子油苷/芝麻菜苷/芥子酶复合物的形成非常困难。
[0175] 为了证实该主张，我们选择检测作为本发明主题的产品中的芥酸精(火箭植物(芝麻菜)叶中的主要异硫氰酸酯)，本文中其提取自芝麻菜：
[0176] 在专门从事植物提取的实验室中进行定量测定：AKINAO，佩皮尼昂，法国。AKINAO已经研发了分析PP1样本中芥酸精的方法，稀释使用。
[0177] 材料和方法：
[0178] 分析标准和试剂：
[0179] 分析标准和试剂在下表中标明：
[0180]
[0181] 该研究中使用的主要设备在下表中标明：
[0182]
[0183] 执行：
[0184] 已经研发了提取芥酸精的方法，并采用标准加入法对其性能进行了验证。使用有机溶剂采用液/液萃取来提取芥酸精。进行第二次固相萃取(SPME)来验证结果。
[0185] 采用GC-MS(注册商标)来分析提取物。分析方法是基于芥酸精的分析标准溶液而研发。对芥酸精的特定离子进行检测与定量，以便通过外部校准来改进分析的灵敏度。
[0186] 结果：
[0187] 图12显示了对分析标准溶液和三个样本重复进行分析过程中获得的色谱图：三个样本重复的芥酸精标准(1μg/mL)的SIM模式的色谱图。
[0188] 线性范围从0.1μg/mL的样本延伸至50μg/mL的样本。这些条件下芥酸精检测限估计是0.2μg/mL。
[0189] 样本中没有识别出芥酸精。
[0190] 本发明涉及优选从芸芥属(芝麻菜、水疱性芥菜等)、二行芥属(芥菜二元体、细叶二行芥、墙生二行芥等)、匙荠属(芥匙荠、疣果匙荠等)、犬芥属(鼻疽犬芥、水茄犬芥等)和海滩芥属的组中选出的火箭植物的至少一部分的提取物的用途，以便激发植物或树木的防御并降低如下影响：
[0191] -木质部难养菌细菌对桃金娘叶远志、葡萄藤、橄榄树、柑橘树、夹竹桃、扁桃树、咖啡树、桃树和核果树、橡胶树、薰衣草、迷迭香或者金雀花的影响，
[0192] -丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌对猕猴桃属植物的影响，
[0193] -树生黄单胞菌核桃致病变种细菌对核桃树的影响，
[0194] -树生黄单胞菌李致病变种细菌对李属的影响，优选地，李属是如下的水果/坚果树的组：杏树、扁桃树、樱桃树、桃树、李树、中国李、樱桃月桂和其它外来或观赏的李属植物，包括山桃和桂樱，
[0195] -梨枯萎植原体细菌或正梨衰退病植原体对梨树的影响，
[0196] -玉米红化病植原体细菌对葡萄藤、薰衣草、马铃薯植株、番茄植株、茄子植株、辣椒植株和烟草植株的影响，
[0197] -霜霉病真菌对葡萄藤的影响，或者，晚疫病菌对马铃薯植株和番茄植株的影响，或者，柠檬疫霉对柑桔树的影响，或者，恶疫霉对梨树和苹果树的影响，或者，莴苣盘梗霉对洋蓟的影响。所有这些病原真菌都会造成霉病，或者
[0198] -粉孢子型真菌的影响，诸如，月季白粉菌对玫瑰花丛的影响、真菌葡萄白粉菌(以前叫葡萄白粉菌)对葡萄藤的影响和粉孢子对番茄植株、莴苣、黄瓜、草莓、树莓植株、醋栗丛、桃树、梨树、女贞、康乃馨的影响。
[0199] 为了清晰和简洁，下面描述的实施例没有涵盖上述致病菌和植物或树木的所有组合，但证实了本发明在所有这些组合中的有效性。
[0200] 在没有抗细菌和抗真菌作用的情况下，PP1通过刺激植物的防御以及通过使经过处理的植物自身抵抗致病菌来发挥作用。PP1可以定义为诱导子(elicitor)，前提是植物中有具有诱导性能的分子，针对致病菌的一系列防御反应称为诱导子。
[0201] 防御机制的诱导子活性的证实也在几个水平进行了论证：
[0202] 4.1/如上所述，PP1显示没有直接的抗细菌或抗真菌活性。
[0203] 4.2/在采用PP1处理之后，证实防御分子(诸如茉莉酸、水杨酸或过氧化物酶)产生，这是在对如下作物感染条件下进行的：采用PP1处理并被树生黄单胞菌感染的核桃树以及采用PP1处理并被玉米红化病植原体细菌感染的葡萄藤(防御有效性和刺激的证实)(实施例8和11)。
[0204] 实际上，在没有直接的抗细菌和抗真菌活性的情况下，即使在侵入性病原体难以对抗的情况下，PP1仍具有刺激植物防御并使它们有效反应的性质。
[0205] 在如下情况下证实了PP1的有效性，并刺激植物防御：
[0206] -PP1防御野油菜黄单胞菌致病变种(Xanthomonas campestris pv juglandis)的有效性：体外检测显示PP1对黄单胞菌属没有抗菌活性。经过处理与感染的植物中观察到高产量的水杨酸和过氧化物酶。
[0207] -PP1防御葡萄藤(欧洲葡萄(Vitis vinifera))上玉米红化病植原体细菌(匍匐茎植原体(Stolbur phytoplasma))的有效性。采用PP1处理并被感染的树木中检测到茉莉酸。
[0208] -橄榄树中检疫生物木质部难养菌攻击的情况下，PP1显示在体外对细菌生长没有影响。但是，对于其它模型，通过使橄榄树恢复活力并从新开始产生新芽和果实(实施例3至5)，PP1显示了在橄榄树防御木质部难养菌的显著有效性(实施例3至5)。
[0209] -为了理解PP1对患病橄榄树的作用，重要的是解释受感染橄榄树中观察到的症状是如何通过被木质部难养菌感染而产生的。植物在被特定的木质部病原感染之后会产生多种防御应答，包括构建物理屏障(例如形成侵填体)中涉及的化合物或者包括与防御有关的代谢途径的化合物(例如酚类化合物、PR蛋白质、植物抗毒素和过氧化物酶)。这些化合物目的在于阻止病原体传播并由此抑制它们复制(Rapicavoli et al.,2018)。
[0210] 在某些非常特殊的情况下，木质部细胞经历程序化细胞死亡，结果是木质部细胞不能通过它们自己的方式启动防御应答(Yadeta和Bart,2013；Hilaire et al.,2001；Berne和Javornik,2016；Rep et al.,2002)。然后，维管病原体有可能被木质部周围活的薄壁组织中的受体识别(Yadeta和Bart,2013；Berne和Javornik,2016)。
[0211] 在木质部难养菌的特定情况下，细菌克隆宿主植物木质部的维管并导致木质部中多产性闭塞(prolific occlusions)的产生，这降低了植物中水分传导(Sun et al.,2013；Choat et al.,2009)。木质部功能失调引起的植物部分枯萎是这种类型疾病的最显著症状。Daugherty(2010)已经在他的研究中清楚显示木质部小菌属(Xylella)引起苜蓿中氢应力。很多因素会促成木质部闭塞，诸如木质部定植过程中细菌分泌的高分子量和低分子量多糖，或者病原生物量的存在(细菌细胞)(Yadeta和Bart,2013)。
[0212] 然而，植物的防御应答也会造成木质部闭塞，诸如由薄壁细胞形成侵填体以及树胶和凝胶的分泌(Fradin和Thomma,2006；Klosterman et al.,2009；Beattie,2011)。木质部维管中栓塞(形成气泡)是能够降低木质部水分传导的另一因素(Pérez-Donoso et al.,2007)。
[0213] 然而，这种有效的应激反应反过来会对植物本身不利。多种研究，尤其是对葡萄藤(欧洲葡萄)的研究，已经显示植物中维管闭塞的大量形成不会阻碍病原体的系统性传播，但是会显著降低植物水传导并由此导致疾病症状的发展(Sun et al.,2013)。
[0214] 基于针对木质部难养菌攻击的其它作物(诸如葡萄藤)进行的研究，表明了细菌增殖是阻断植物木质部中水运动的唯一因素。然而，Pérez-Donoso(2007)的研究(采用磁共振成像)显示葡萄藤对存在木质部小菌属的主动响应引起的维管阻塞引起木质部传导和疾病可能的其它方面的降低。这些阻断症状可能与植物防御有关，而不是与细菌的直接作用有关。
[0215] 然而，由PP1得到的结果显示采用PP1感染和处理的橄榄树能够克服侵填体、树胶或凝胶形成所造成的微管中的这些阻塞，因此阻断症状变得可逆(实施例3至5)。受感染的树木在采用PP1处理之后从新开始它们的生长。这使我们提出两个假设，它们是补充性的而非排他性的：
[0216] 1.PP1使机制能够实施以便由特定的酶或过程(与和防御有关的代谢机制诸如酚类化合物、PR蛋白质、植物抗毒素等联合)来分解橄榄树中阻塞维管的侵填体、树胶或凝胶。
[0217] 2.PP1使新的木质部维管积极发育(对感染进行响应)。
[0218] 4.3/虽然它没有抗菌活性，但是PP1对于难以防范的领域中防御各种病原体具有显著有效性(实施例3至5)。
[0219] 如图1所示，在实施方案中，作为本发明主题的组合物的生产和使用方法包括步骤105的提取火箭植物提取物。例如，该提取按照如下过程进行：
[0220] -在研磨步骤110过程中，火箭植物的叶、根、茎、种子和/或花在合适的混合设备中用自来水中细磨15分钟以便得到均质的研磨材料；
[0221] -在过滤步骤115过程中，将研磨材料过滤以便分离叶物质并得到没有叶残留物的绿色液体(滤液)，其构成本发明主题的产品。
[0222] 在一种变型中，采用油提取得到研磨材料的至少一种活性要素。
[0224] 在一种变型中，采用机械提取或微波提取得到至少一种活性要素。
[0225] 在一种变型中，提取步骤105包括压缩火箭植物的叶、根、茎、种子或花的步骤以及通过重力作用或离心分离来收集液体提取物的步骤。在一种变型中，在提取步骤105中利用简单的离心分离来从使用的火箭植物的部分提取液体。
[0226] 如下面所描述，发明人已经发现使用该产品对上面提及的并被上述病原体之一所感染的植物和树木具有显著效果。
[0227] 要注意的是，步骤105结束时得到的液体产品可制成制剂以使其更容易使用。例如，它可以以粉末、可溶性粉末、可湿性粉末、颗粒、分散颗粒、可湿性颗粒或慢扩散颗粒(在使用时在水中稀释)、液体、可溶性浓缩液、可乳化浓缩物、浓缩悬液或即用型的形式来使用，取决于选择的制剂和设定的用途。按照本领域技术人员熟知的技术使用提取步骤105的产品来实现制剂。
[0228] 可以采用任何方法来纯化活性部分以便于形成制剂。可以增加不同的提取步骤以便改善其质量。
[0229] 本发明主题的产品依据所需剂量在使用时可以在水中稀释。
[0230] 关于使用，在步骤120和制成产品的过程中，本发明主题的成品可以采用任何形式来施用(液体、粉末、可溶性粉末、颗粒、分散颗粒、慢扩散颗粒等制剂)，取决于用途和设定的制剂。本发明主题的产品的使用可以是通过叶面蒸发、浇地、土壤灌溉、逐滴灌溉、用于水培、种子处理和/或种子包衣。
[0231] 本发明主题的产品可以按照1天至120天的频率来使用，或者连续使用，或者根据植物的关键生长阶段使用，或者按照最佳农业实践与每种植物物种的处理日程来使用。本发明主题的产品可以与其它产品(植物检疫产品、栽培基质和施肥材料、肥料、灭微生物剂或用于农业的任何其它产品)混合。
[0232] 根据用途和植物类型来调整施用剂量和施用频率。
[0233] 施用剂量可以是0.001g/L至500g/L的植物提取物，优选2g/L至150g/L的植物提取物，更优选5g/L至70g/L的植物提取物，表示为进行提取的植物的克数每升产品。
[0234] 每升或每公顷剂量可根据感染植物的类型调整至感染水平或细菌引起的症状水平。本发明产品的剂量和处理率也将根据对这些细菌有治疗作用或预防作用的策略来调整。
[0235] 关于用于本发明的提取物从其中获得的火箭植物，它们优选是新收集的。可选地，火箭植物或其令人感兴趣的部位是以本领域技术人员熟知的方法适当干燥。
[0236] 可以使用两个研磨机(功率1000W和700W)进行研磨，这两个研磨机以不同的叶片速度来使用。研磨10分钟得到的第一研磨材料然后放置在具有更快叶片速度的第二研磨机。研磨材料是均质的，没有叶、茎或花的可见残余物。研磨过程中加入的水的量是每100g叶、茎、根、花或种子加入200mL环境温度的水。
[0237] 使用尼龙制成的滤布(Dutcher，注册商标)(先1000μm，再500μm)进行两次连续过滤。过滤在环境温度下进行，不施加压力。
[0238] 为了回收有效的滤液，根据喷洒的量，调整稀释度(每公顷剂量)。根据用途，如实施例所述，每升喷洒浆液5g植物提取物至每升喷洒浆液20g植物提取物。
[0239] 发明人已经观察到得到的滤液可在环境温度在容器中保存至少6天，不会损失其激发植物和树木防御的性质。
[0240] 因此，至少部分火箭植物的提取物可以是从所述火箭植物的研磨材料得到的芝麻菜属的火箭植物的提取物。
[0241] -所述至少部分火箭植物的提取物包括至少火箭植物的叶，优选主要是叶，和[0242] -能够得到所述液体提取物的方法包括如下步骤：
[0243] a)在水介质中研磨所述芝麻菜属的火箭植物的步骤；
[0244] b)过滤得到的研磨材料；和
[0245] c)回收过滤之后得到的芝麻菜属的火箭植物的液体提取物。
[0246] 对于粉末、颗粒、分散颗粒或慢扩散颗粒形式的制剂，采用了干燥温度，在一些实施方案中，采用在水中能够很好溶解的其它天然分子(优选非常亲水的)包裹颗粒。制剂是农业标准制剂，尤其是植物检疫产品，旨在以粉末等形式运输和储存，并在施用前在水中稀释。
[0247] 在一种实施方案中，本发明涉及使用从火箭植物的至少一个部分得到的植物提取物以激发植物或树木的防御并降低木质部难养菌(X.fastidiosa)细菌对如下树木之一的影响：
[0248] -桃金娘叶远志，
[0249] -葡萄藤，
[0250] -橄榄树，
[0251] -柑橘树，
[0252] -夹竹桃，
[0253] -杏树，
[0254] -咖啡树，
[0255] -桃树和核果树，
[0256] -橡树，
[0257] -薰衣草，
[0258] -迷迭香，和
[0259] -金雀花。
[0260] 木质部难养菌是革兰氏阴性细菌，会在很多重要经济作物种引发严重疾病，诸如葡萄藤的皮尔斯病(Pierce's disease)、柑橘树的斑叶萎黄病、或杏树的叶焦病等。
[0261] 木质部难养菌是木杆菌属(Xylella genus)的唯一种。该细菌由6个亚种和若干菌株(遗传系)组成，它们的宿主范围、毒性和症状表现各不相同。
[0262] 木质部难养菌仅仅定植在受感染植物的木质部(传导组织)的维管。该细菌由以木质部原液为食的昆虫(韧皮部进食者)从患病植物传播至健康植物。
[0263] 木质部难养菌定植在木质部维管会阻断水和营养由根向茎与叶的运输，这导致受感染植物死亡。
[0264] 地理感染模式覆盖了世界上大部分国家。
[0265] 在缺少植物检疫方案的情况下，木质部难养菌造成对世界范围的大量重要经济作物的无法补救的损害。因木质部难养菌产生的产量方面的经济损失估计是每年数十亿美元。
[0266] 实施例3–下面给出了显示本发明主题的产品防御橄榄植物上木质部难养菌的有效性的要素。出于使说明书更容易阅读并更短的目的，下面仅给出了涉及橄榄树的要素。
[0267] 在图3和6至11中，从左到右，垂直条形代表自上而下的表格数据。因此，对于每个日期，最左边七个垂直条形涉及进行处理的树，最右边七个垂直条形涉及“对照”树。
[0268] 下面显示的结果是在申报检疫区(意大利当局的官方决定)在对受木质部难养菌感染的橄榄树进行初次实验期间使用本发明的产品得到的。实验由使用产品在如下日期进行的六次处理组成：
[0269] -9月3日
[0270] -9月16日
[0271] -9月26日
[0272] -10月5日
[0273] -10月31日，和
[0274] -11月12日。
[0275] 在如下日期在该区域收集数据：
[0276] -10月5日
[0277] -10月27日
[0278] -11月30日
[0279] -12月18日，和
[0280] -1月20日。
[0282] 在上述研究过程中，读取了下列读数。
[0284] 2.处理的植物和对照植物中木质部难养菌相关的橄榄树顶梢枯死水平。
[0285] 3.处理的橄榄树和“对照”橄榄树植被再生长水平(新的幼叶的数目)。
[0286] 4.在体外条件下用木质部难养菌细菌(在认可的实验室)和其它与CoDiRO疾病(木质部难养菌引起橄榄快速脱水综合征)相关的主要真菌物种测试产品：Phaeoacremonium,Phaeomoniella,Pleurostomophora,Colletotrichum,Botryosphaeriaceae。
[0287] 5.处理的橄榄树和“对照”橄榄树的叶的叶绿素含量(Spad指数)。
[0288] 6.处理的橄榄树和“对照”橄榄树的气孔导度(水势)。
[0289] 下面逐一讨论了得到的结果。
[0290] 活性/结果：
[0291] 1.叶片坏死表面或棕色表面的百分比(估值)，使用了能够评价侵染指数的经验评价量表。
[0292] 结果：
[0293] 在所有监测研究中，在采用产品处理的树木上没有观察到木质部难养菌(坏死叶)相关的症状。所有进行过处理的树木都生长良好，直到1月20日(最后读数)都没有症状。
[0294] 2.木质部难养菌相关的橄榄树顶梢枯死水平
[0295] 结果：
[0296] 在前四次监测研究中，本发明的产品处理过的树上没有观察到顶梢枯死相关的症状。1月20日的最后一次监测研究中，仅一棵橄榄树显示了顶梢枯死症状。相反，症状出现在所有“对照”植物上并恶化。
[0297] 在有症状的叶片上进行的ELISA测试结果是阳性的，证实存在木质部难养菌。此外，不论是否进行过处理，来自所有树木的所有样本的结果也都是阳性的。
[0298] 3.植被再生长水平(新的幼叶的数目)
[0299] 如图3所示，所有树木都显示了对采用产品进行处理的良好响应。通过对插入点(图2)叶片计数来评估本年度最后树枝的生长情况。
[0300] 实际上，检查的未处理橄榄树产生较少量的新叶，每枝少于20，而经过处理的橄榄树产生的数量远高于20，在某些情况中是27。在图中，数目是指12个数据的平均值，每个基点三个数据。
[0301]
[0302] 4.在体外条件下用木质部难养菌细菌(在认可的实验室)和其它与CoDiRO疾病相关的主要真菌物种测试产品：Phaeoacremonium,Phaeomoniella,Pleurostomophora,Colletotrichum,Botryosphaeriaceae。
[0303] 结果：
[0304] 进行了两种不同类型的实验，如文：
[0305] 蒸发：产品喷在含有马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的皮氏培养皿上。当产品被培养基完全吸收时，接种真菌物种。每7天观察一次每个物种的真菌生长，进行21天。图4代表最后的观察。从左到右，培养皿列依次代表100ppm,10ppm,1ppm,100ppm,10ppm,1ppm。在左侧，从上到下，是Botryosphaeriaceae,C.gloeasporioides,R.necatrix,V.dahliae,Pl.richardsiae的培养皿。在右侧，从上到下，是Pm.scolyti,Pm.italicum,Pm.minimum,Pm.parasiticum,Phaeomoniella spp的培养皿。
[0306] 包含：在凝固之前将产品包括在PDA培养基中。使用三个不同浓度：100、10和1ppm。当皮氏培养皿完全凝固时，接种真菌物种。每7天观察一次每个物种的真菌生长，进行21天。
图5代表最后的观察。
图5代表最后的观察。
[0307] 图5中上面的行从左到右显示Phaeomoniella spp,Pl.richardsiae,Pm.parasiticum和Pm.Minimum。图5中下面的行从左到右显示Pm.italicum,Pm.scolyti,V.dahliae和R.necatrix。
[0308] 结果：
[0309] 因为产品是没有经过热压处理的天然提取物，当它喷在培养基表面时或者当它包含在该培养基中时，很多腐生细菌减慢并阻碍被检测的病原真菌的生长(参见图4和5)。用木质部难养菌实验期间检测到相同的问题。这是因为木质部难养菌是非常缓慢生长的细菌，因此它的生长很容易被生长更快的腐生细菌所减慢。尽快这些观察结果，产品看似没有直接抑制真菌生长，测试的每种微生物似乎能够在两种情况(产品喷洒和包含)生长。
[0310] 5.叶的叶绿素含量(Spad指数)
[0311] 结果：
[0312] 使用美能达叶绿素计SPAD–50(注册商标)检测该参数。该设备测量植物组织(体内)含有的叶绿素的总量，且因此间接测量植物的营养状况。如图6所示，产品处理的叶的光合作用质量的结果优于未经处理植物的叶。能够肯定，与未经处理的植物相比，用产品处理的植物具有更强的运输营养和水的能力。
[0313]
[0314]
[0315] 6.气孔导度(水势)
[0316] 结果：
[0317] 图7列出了气孔导度值。它们与植物运输水分的潜力(即它将液汁从根移至叶的能力)具有直接关系。较高的气孔导度值表明维管将原液汁运输至叶的极佳能力。如图7所示，使用本发明的产品处理的橄榄树的数值一直(在监测研究期间)高于未处理橄榄树。在冬季，差别会减弱，这应视为与树木在该季节的代谢有关。
[0318]
[0319] 结论
[0320] 基于得到的结果，可以认定，采用本发明的产品进行处理能够限制所有经过处理的植物上木质部难养菌的症状，即使对10月5日和1月20日收集的样本进行的ELISA分析显示细菌存在是阳性。
[0321] 这意味着，在这些实验条件下，产品不能将细菌从植物完全根除，但是它确实能够使橄榄树在仅六次处理之后就恢复正常生长能力(叶数目增加、光合作用增强、气孔导度增强)。产品能够显著地限制木质部难养菌细菌的影响。此外，处理从夏末开始(开始实验的最差时节)，在整个秋季(此时植物不易响应)持续进行。
[0322] 出于确认产品对橄榄树效果的目的，进行了另一实验。
[0323] 实施例4–下面的结果是从采用本发明的产品防御橄榄树上木质部难养菌的第二实验中得到的。用于实验的橄榄树林位于传染病流行区，2013年10月在那里发现存在木质部难养菌。
[0324] 实验由采用本发明产品进行的7个处理组成，在如下日期进行：
[0325] -5月19日
[0326] -5月26日
[0327] -6月10日
[0328] -7月22日
[0329] -8月10日
[0330] -9月7日，和
[0331] -10月7日
[0332] 在以下日期在该区域收集数据：
[0333] -5月13日
[0334] -6月15日
[0335] -10月6日，和
[0336] -11月24日。
[0337] 1.处理的植物和“对照”植物中叶片坏死表面或棕色表面的百分比(估值)，使用了能够评价侵染指数的经验评价量表。处理开始后一个月测量新叶。
[0338] 2.处理的植物和对照植物中木质部难养菌相关的橄榄树顶梢枯死水平。
[0339] 3.处理的橄榄树和“对照”橄榄树植被再生长水平(新的幼叶的数目)。
[0340] 4.收获的重量(如果有收获)。毫无疑问可能的是，用于实验的橄榄树不能结橄榄果，因为它们已经被大面积剪枝。
[0341] 5.在体外条件下用木质部难养菌细菌(在认可的实验室)和其它与CoDiRO疾病相关的主要真菌物种测试产品：Phaeoacremonium,Phaeomoniella,Pleurostomophora,Colletotrichum,Botryosphaeriaceae。
[0342] 6.处理的橄榄树和“对照”橄榄树的叶的叶绿素含量(Spad指数)。
[0343] 7.对照橄榄树和处理的橄榄树的气孔导度(水势)。
[0344] 8.针对每个收集时期(包括处理之前(5个测试))收集的橄榄样本上木质部难养菌细菌存在的ELISA测试。
[0345] 下面逐一讨论了得到的结果。
[0346] 活性/结果：
[0347] 1.叶片坏死表面或棕色表面的百分比(估值)
[0348] 结果：
[0349] 在5月13日修剪了所有植物以便清除所有有症状部分。在5月19日，读取初始读数以便记录叶绿素和气孔导度水平，并且也确认存在木质部难养菌细菌。在此之后以及在整个监测研究期间，采用本发明的产品处理的植物上没有再观察到与坏死叶有关的木质部难养菌的症状。直到11月24日，采用产品处理的所有树木的生长良好且无症状，然而未处理的“对照”植物显示了枯萎症状，诸如叶顶端坏死和叶变黄。
[0350] 2.木质部难养菌相关的橄榄树顶梢枯死水平
[0351] 结果：
[0352] 在实验过程中，本发明的产品处理过的树上没有观察到顶梢枯死相关的症状，并且处理过的树木在整个期间都显示正常发育。未处理的“对照”植物快速显示顶梢枯死症状。
[0353] 11月24日的最后监测研究中，只有一棵经过处理橄榄树显示顶梢枯死症状。在这种情况下，这些症状与真菌病原体诸如Phaeoacremonium spp.和Botryosphaeriaceae spp.,Phaeocaremonium spp的存在有关。这些分离物是橄榄树木材的维管病原体，是木材褐化以及树枝和茎枯萎与顶梢枯死的原因。葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)分离物是造成包括橄榄树在内的木本植物顶梢枯死的致病因素。显示木质部难养菌的枯萎特征症状的未处理的“对照”植物收集的样本也被上述相同真菌所感染。维管真菌和木材真菌的存在与植物年龄有关。这些真菌在橄榄树中是常见的并且是感染树木缓慢枯萎的原因。一些真菌可能是侵袭性更强的并造成植物的部分或整株的快速顶梢枯死。通常，良好的农业操作诸如剪枝适合降低这些病原体的影响和它们的侵袭性。
[0354] 对有症状的叶进行的ELISA测试的结果显示木质部难养菌细菌阳性。此外，对于从处理的或未处理的植物收集的所有叶样本，结果也是阳性。
[0355] 3.植被再生长水平(新的幼叶的数目)
[0356] 结果：
[0357] 在图8/表1中，经过处理的所有植物显示对本发明产品进行处理的良好响应。通过计算插入点叶片数和下次收集时(11月24日)相同树枝的长度来评估本年度最后树枝的生长情况。
[0358] 最后评估：未处理的橄榄树产生较少数量的新叶，每枝少于21(东部，对照树T7，11月24日)，然而采用产品处理的橄榄树产生超过25片新叶，在某些情况下，新叶数目是41(西部，对照树T5，11月24日)。
[0359] 此外，相同树枝长度的差异是显著的(图9/表2)。事实上，对照树达到的最大长度是63cm(南部，对照树T7，11月24日)，然而经过处理的树的最大树枝长度是111cm(西部，对照树T5，11月24日)。图9/表2显示的数目代表12个数据的平均值，每个基点三个数据。对数据进行方差分析(Anova)和P<0.01的费歇尔检验。
[0360] 4.收获的重量(如果有收获)。
[0361] 结果：
[0362] 处理前对树木进行重剪之后，橄榄的产量非常小。每棵树的产量数据在11.5kg至25.8kg之间变化。
[0363] 然而，树木之间不同水平的初剪不可能使每棵树总产量产生显著差别。
[0364] 5.真菌学分析
[0365] 对来自每棵处理和未处理的树的100枚橄榄进行真菌学分析。来自本发明产品处理的树的橄榄(700)没有分离到病原真菌。仅检测到腐生菌诸如Penicillium spp.,Aspergillus spp.,Mucor spp.,Rhizopus spp.(总计分离到17株)等。
[0366] 相反，从未处理“对照”橄榄树的橄榄分离的真菌是：
[0367] -442株胶体霉属(Collototrichum spp.)(炭疽病)分离物，
[0368] -136株葡萄球菌科(Botryosphaeriaceae spp.)(核果腐烂)分离物，
[0371] -25株青霉属(Penicillium spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、毛霉属(Mucor spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)等分离物
[0372] 5.在体外条件下用木质部难养菌细菌(在认可的实验室)和其它与CoDiRO疾病相关的主要真菌物种测试产品：Phaeoacremonium,Phaeomoniella,Pleurostomophora,Colletotrichum,Botryosphaeriaceae
[0373] 进行了两种不同类型的实验，如文：
[0374] 蒸发：产品喷在含有马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的皮氏培养皿上。当产品被培养基完全吸收时，接种真菌物种。每7天观察一次每个物种的真菌生长，进行21天。
[0375] 包含：在凝固之前将产品包括在PDA培养基中。使用三个不同浓度：100、10和1ppm。当皮氏培养皿完全凝固时，接种真菌物种。每7天观察一次每个物种的真菌生长，进行21天。
[0376] 结果：
[0377] 因为产品是没有经过热压处理的天然提取物，当它喷在培养基表面时或者当它包含在该培养基中时，很多腐生细菌生长，它们减慢了被检测的病原真菌的生长。当使用木质部难养菌时，发现了相同的问题。产品看似没有直接抑制真菌生长。
[0378] 该结果与第一次实验的结果相同。
[0379] 6.叶的叶绿素含量(Spad指数)
[0380] 结果：
[0381] 使用美能达叶绿素计SPAD–50检测该参数。该设备测量植物组织(体内)含有的叶绿素的总量，且因此间接测量植物的营养状况。如图10/表3所示，可以看出，产品处理的叶的光合作用质量的结果优于未经处理植物的叶。能够肯定，与未经处理的植物相比，用产品处理的植物具有更强的运输营养和水的能力。
[0382] 对数据进行方差分析(Anova)和P<0.01的费歇尔检验。
[0383] 在几次处理之后，结果显著地更好(最后监测研究)。
[0384] 7.气孔导度(水势)
[0385] 结果：
[0386] 图11/表4列出了气孔导度值。它们与植物运输水分的潜力(即它将原液汁从根移至叶的能力)具有直接关系。较高的气孔导度值表明维管将原液汁运输至叶的极佳能力。使用本发明的产品处理的橄榄树的数值一直(所有监测研究)高于未处理橄榄树。对数据进行方差分析(Anova)和P<0.01的费歇尔检验。几次处理之后的结果是更好的(最后监测研究)。
[0387] 图8/表1.每棵处理的植物的植被再生长(新的幼叶的数目)，包括对照植物(*显示的数值代表12个数据的平均值，每个基点3个数据)。
[0388] 叶片数
[0389]
[0390]
[0391] 图9/表2.每棵处理的植物的植被再生长(新树枝的长度)，包括对照植物(*显示的数值代表12个数据的平均值，每个基点3个数据)。相同的字母表示数值之间没有显著性差异。
[0392]
[0393] 图10/表3.叶绿素含量(Spad指数)(*显示的数值代表12个数据的平均值，每个基点3个数据)。相同的字母表示数值之间没有显著性差异。
[0394] 叶绿素指数
[0395]
[0396]
[0397] 图11/表4.叶的水势和气孔导度(*显示的数值代表12个数据的平均值，每个基点3个数据)。
[0398]
[0399] 结论
[0400] 基于得到的结果，采用本发明的产品进行处理能够限制所有经过处理的树木上木质部难养菌细菌的症状，即使对11月24日收集的样本进行的ELISA分析对于木质部难养菌存在总是阳性。这意味着，在实验条件下，产品不能将细菌从植物完全根除。然而，产品能够使树木非常显著地限制木质部难养菌细菌的致病作用并预防症状。
[0401] 此外，基于真菌分析得到的结果，本发明的产品能够完全防止橄榄感染真菌病原体诸如Colletotrichum,Botryosphaeriaeae,Alternaria/Stemphylium,和Fusarium spp，它们会引发橄榄树严重疾病，且通常与木质部难养菌造成的损坏有关。
[0402] 产品在橄榄树上的应用显示它还是针对其它橄榄疾病的良好保护剂。
[0403] 产品处理的植物发育良好，因为橄榄树的植冠(vegetable crown)丰富，叶的颜色极好，幼枝的长度显著，橄榄的品质极佳，树的状态完美，它们看起来很健康。
[0404] 在紧急植物检疫环境(此时，对于木质部难养菌细菌造成的疾病而言，时间紧迫)中，产品是有价值的，并且，已经发现了使树木免患该非常严重疾病的解决方案。正在研究一种方案以便也能够用作多年防治处理手段，并遏制木质部难养菌引发的流行病，以便在意大利南部以及世界其它部分保护与防护橄榄树资源。
[0405] 实施例5–为了证实产品对木质部小菌属的有效性，在意大利南部检疫区的橄榄树上由BPE授权组织再次测试产品。在该实验中，产品名称是PP1。
[0406] 请注意，实验进行了三年，以便有足够的时间来回顾产品防御木质部难养菌的效果(恢复树木活力、增加橄榄产量)以及它限制细菌传播和遏制流行病的能力。
[0407] 概述
[0408] 实验目的在于评价实验性生物刺激剂防御病原菌木质部难养菌的效果。以三种不同浓度(0.5N、1N和2N)测试实验产品，并将其与Ossiclor(注册商标)35WG标准品(氯氧化铜35％,WG)进行比较，Ossiclor 35WG标准品是一种铜基特殊产品，仅用作防御细菌疾病的参考，对木质部小菌属没有很大的效果。
[0409]
[0410] 简介
[0411] 实验在莱切省阿普利亚区乌真托(意大利南部)的一个农场进行，就用于生产油的橄榄的品种、耕作技术而言，该农场在这一地区是典型的。
[0412] 选择属于卡罗莱亚变种的油橄榄基因型(genotype Olea europaea of the variety Carolea)的橄榄树进行该实验，1993年1月在一橄榄园进行移植。
[0413] 这是四次重复的随机化完全区组(RCB)实验。小块土地的表面积是96m2(6x 16m)，每块地4株植物。
[0414] 实验期间记录的天气条件变得比平均季节值更干燥且更温暖，特别是在建立实验的第一阶段，即六月至八月末，这通常对橄榄树的植物茂盛程度和疾病的恶化具有不利影响。
[0415] 由实验方案，除了铜基处理之外，进行了总计11叶面施用，按照当地实践，对于铜基处理只安排了3次施用(按照使用说明书)。2017年1月1日，在BBCH 70阶段(可见初果)进行第一次施用(施用A)，2017年10月26日，在BBCH 81阶段(果实开始成熟)进行最后一次施用(施用K)。所有的实验施用在这二者之间每隔13-15天进行。
[0416] 使用背包式喷雾器以4巴的操作压力来实施所有的模式，每个处理使用体积是80升的水。
[0417] 评估：
[0418] 实验过程中进行了8次评估：施用A之前(0DA-A)(表示“A之后的天”)、0DA-D、0DA-E、0DA-G、0DA-I、7DA-J、0DA-K和11DA-K。评估涉及如下参数：
[0419] ·疾病百分比(DAMDIS)：每块地上疾病的平均严重程度；
[0420] ·每个幼苗的新芽数目；
[0421] ·栽培活力，以0至10表示，其中“10”＝最大栽培活力，“0”＝死植株；
[0422] ·新芽的平均长度；
[0423] ·NDVI指数(0-1)：标准化差分植被指数。标准化差分植被指数(NDVI)通过测量近红外(其被植被强烈反射)与红光(其被植被吸收)之间的差异来量化植被；
[0424] ·叶的蒸腾作用，表示为气孔导度(mmol/m2 x秒)，用气孔计测量(每棵树四次测量的平均值)；
[0425] ·收获时(11DA-K)，评价产量(kg/每块地)，100个橄榄的重量(g)和油含量(％)；
[0426] ·种植期间对种植进行了选择性评估(0DA-B；0DA-C；0DA-D；0DA-F；0DA-G；0DA-I.0DA-H)，以便通过与未处理的地块进行比较来检测因施用实验产品而产生的植物毒害(PHYGEN)的所有症状，诸如萎黄病、黄化。结果表示为百分比，其中“0”表示没有症状，“100”表示对作物的最大损害。
[0427] 统计分析
[0428] 在农业科研管理(ARM)版本2017.4研究数据库系统中使用ANOVA分析数据。当这包括显著性统计学差异时，接着采用Student-Newman-Keuls检验以95％进行分析。当两个平均值有相同的字母评级时，它们不是显著不同的。
[0429] 结果：疾病百分比(DAMDIS)：每块地疾病的平均严重程度/严重性(图13)。图13显示：
[0430] 2017年6月1日(0DA-A，阶段BBCH 70)，第一次施用产品(施用A)之前，实验的疾病压力特点(DAMDIS)是10.8％至18.8％(参见图13)。
[0431] 2017年8月24日(0DA-G，阶段BBCH 76)，DAMDIS数值与前次评估相比没有改变，在10.8％至18.8％之间变化(参见图13)。
[0432] 不同模式之间疾病分布均匀，这证实了实验的有效性。
[0433] 1.每个幼苗的新芽数目
[0434] 2017年9月22日(0DA-I，阶段BBCH 78)，关于记录的每个幼苗的新芽平均数，未处理的对照产生0.0新芽/幼苗(参见图14)。对其它处理记录的结果在实验过程中几乎没有变化。处理4(PP1 2N)得到最高的结果，2.13新芽/幼苗，之后是处理3(PP1 1N)和处理2(PP1 0.5N)，分别是1.23和1.15新芽/幼苗。最后，处理5(Ossiclor 35WG)记录了最小的新芽/幼苗的数，等于0.28。
[0435] 2017年10月26日(0DA-K，阶段BBCH 81)，记录的结果与在2017年9月22日进行的先前评估相同。
[0436] 应注意，在该区域，天气状况(严重干旱)通常影响树木生长。此外，如果受木质部难养菌侵袭，树木通常易于枯萎并在3至5年内死亡。此外，对照模式的植物没有产生新芽(图14)。
[0437] 采用本发明的产品处理的树能够使树在每个幼苗上产生新芽，这反映出新陈代谢被激发。
[0438] 在采用铜参照(抗菌作用)处理的植物上可以看出，这不能使树产生很多新芽，这表明其防御细菌的作用有限(图14)。图14：新芽/幼苗的数目的评估。
[0439] 2.栽培活力：图15：栽培活力的评估
[0440] 2017年7月14日(0DA-D，阶段BBCH 73)/2017年7月28日(0DA-E，阶段BBCH 74)/2017年8月10日(0DA-F，阶段BBCH 75)/2017年8月24日(0DA-G，阶段BBCH 78)，处理之间没有识别出统计学差异(图15)。
[0441] 2017年9月22日(0DA-I，阶段BBCH 78)，在处理4(PP1 2N，参见图15)得到了最佳表现，其继续具有10.0的最大活力值。处理3(PP1 1N)显示稍微较低的值9.5，然后是处理2(PP1 0.5N)，值是9.0。处理之间最低的栽培活力在铜基商品处理(Ossiclor 35WG)得到，值是8.8，其与对照的8.3之间没有统计差异。
[0442] 2017年10月26日(0DA-K，阶段BBCH 81)，在处理4(PP1 2N，参见图15)实现了最佳表现，其继续具有10.0的最大活力值。处理3(PP1 1N)显示稍微较低的值9.5，然后是处理2(PP1 0.5N)，值是9.0。处理之间最低的栽培活力在铜基商品处理(Ossiclor 35WG)得到，值是8.8，未处理的对照是7.5。
[0443] 因此，最后的读数显示PP1以显著性模式对树木活力具有首要的积极影响，但是对照树木中疾病继续恶化。
[0444] 3.新芽平均长度：图16：新芽长度的评估
[0445] 2017年9月22日(0DA-I，阶段BBCH 78)，处理4(2N)实现芽的最大平均长度，(6.18cm，参见图16)，然后是处理3和2(1N和0.5N)，测得的平均值分别是2.69cm和2.10cm，而处理5(铜参照)再次记录了最低结果，仅0.65cm。
[0446] 2017年10月26日(0DA-I，阶段BBCH 81)，处理4(2N)得到芽的最大平均长度，(8.72cm，参见图16)，然后是处理3和2(1N和0.5N)，测得的平均值分别是5.38cm和3.43cm，而处理5(铜参照)再次记录了最低结果，仅1.22cm。
[0447] 如上面第2点所示，与对照相比，采用本发明的产品进行处理不仅能够使新芽的产生显著更高，而且处理还能够使新芽显著更快生长。
[0448] 4.NVDI：图17：NVDI特征评估
[0449] 2017年9月22日(0DA-I，阶段BBCH 78)，处理4和3(PP1 N和2N)得到了最佳性能水平，平均NDVI是0.77和0.76，然后是处理2(PP1 0.5N)，其平均NDVI等于0.74。处理5(Ossiclor 35WG)记录了最低NDVI，相比于对照(NDVI等于0.71，参见图17)。
[0450] 2017年10月26日(0DA-I，阶段BBCH 81)，处理4和3(PP1 N和2N)得到了最佳性能水平，平均NDVI是0.78和0.77，然后是处理2(PP1 0.5N)，其平均NDVI等于0.75。处理5(Ossiclor 35WG)记录了最低NDVI，相比于对照(NDVI等于0.71，参见图17)。
[0451] 5.气孔导度：图18：气孔导度的评估
[0452] 2017年10月12日(7DA-J，阶段BBCH 78)，用气孔计测量气孔导度(每棵树四个测量值得到平均值)。处理4(2N)和处理3(1N)达到最高结果，分别显示平均值374.5和378.2mmol/m2 x秒，然后是处理2(0.5N)，其显示360.1mmol/m2 x秒的平均值。处理5
2
(Ossiclor 35WG)得到最低气孔导度，值是331.6mmol/m x sec，其与未处理的对照(308.8mmol/m2 x sec，参见图18)没有统计学差异。
2
(Ossiclor 35WG)得到最低气孔导度，值是331.6mmol/m x sec，其与未处理的对照(308.8mmol/m2 x sec，参见图18)没有统计学差异。
[0453] 2017年11月6日(11DA-K，阶段BBCH 87)，处理4(2N)和处理3(1N)达到最高结果，分别显示平均值383和379.5mmol/m2 x秒，然后是处理2(0.5N)，其显示348.1mmol/m2 x秒的2
值。处理5(Ossiclor 35WG)得到最低气孔导度，值是329.5mmol/m x sec，其与未处理的对照(299.6mmol/m2 x sec，参见图18)没有统计学差异。
值。处理5(Ossiclor 35WG)得到最低气孔导度，值是329.5mmol/m x sec，其与未处理的对照(299.6mmol/m2 x sec，参见图18)没有统计学差异。
[0454] 因此，PP1产品能够使树木获得比对照树木显著更高的气孔导度，这间接反映了木质部难养菌感染降低。
[0455] 6.产量评估
[0456] a/每块地橄榄的鲜重(Kg/块地)：图19：以kg/块地评估橄榄鲜重
[0457] 2017年11月6日(11DA-K，阶段BBCH 87)，处理4(PP1 2N)记录了每块地橄榄最高鲜重，176.30kg/块地(参见图19)。处理3(PP1 1N)显示了稍微较低的值，等于167.74kg/块地，然后是处理2(PP1 0.5N)，157.51kg/块地。处理5(Ossiclor 35WG)记录了140.02kg/块地，反而比对照(141.79kg/块地，参见图19)稍低。
[0458] b/果实重量(g/100个果实)：图20：评估橄榄鲜重(g/100个果实)
[0459] 到目前为止，处理4也记录了100个果实的最高重量，等于439.99g，然后是处理3(PP1 1N)，值是426.99g，以及处理2(PP1 0.5N)，值是406.19g。处理5(Ossiclor 35WG)是349.02g，低于对照(358.15g，参见图20)。到目前为止，PP1产品不仅能够在每块地实现最高产量(每块地橄榄的Kg)(因为观察到了几乎40Kg的产量差异(考虑到每块地的尺寸，这个数值是相当大的))，而且就每100个果实橄榄重量而言也能够达到最高产量。
[0460] c/油浓度：图21：评估油浓度
[0461] 关于油含量(％重量，参见图21)，即使观察到了区别，但它们不是显著性的。处理5(Ossiclor 35WG)和未处理对照得到了统计学相似的结果，分别等于21.27％和21.28％，然后是处理3(PP1 1N)和处理2(PP1 0.5N)，分别是19.63％和19.14％。处理4(PP1 2N)记录了17.89％的油含量(参见图21)。
[0462] 结论.基于实验过程中收集的数据，得到下述观察结果：
[0463] 不管测试的剂量(0.5N,1N和2N)，测试的产品在木质部难养菌感染的橄榄树中显示了令人感兴趣的植物响应。这些结果包括了植物的植物活性的改进，其由新芽数目、新芽长度、栽培活力和NDVI的升高来表征。采用上述所有参数，测试产品的总体性能总是优于农民经常使用的铜基制剂(Ossiclor35WG)。
[0464] 还需注意的是，出现了剂量效应。2N剂量显示了比1N或0.5N剂量整体更好的效果。
[0465] 就橄榄鲜重和果实大小(以克计每100个果实的重量)而言，不管使用的剂量，与未处理对照和铜基制剂相比，测试的产品显示了显著的提高。到目前为止，2N剂量总体给出了最高结果。所有模式的油产量(作为橄榄重量的％)在统计学上等效。以2N剂量施用测试产品似乎降低了油产量的百分比(差异不显著)。如果现象持续，PP1激发了防御像木质部难养菌这样侵袭性细菌的代谢能够对其进行解释。
[0466] 不管使用的剂量，在实验期间，测试产品的应用没有引起“卡罗莱亚”品种的橄榄树的植物毒性症状。
[0467] 处理实验产品过程中没有出现问题。
[0468] 在特定实施模式中，本发明涉及从“火箭”植物的至少一个部分得到的磨碎材料的用途，以激发植物防御并降低丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌(“PSA”)对猕猴桃属植物的影响。
[0469] 用于提供本发明主题的组合物的提取物在本文中通过叶面喷洒来使用。
[0470] 实施例6–PP1在奇异果(猕猴桃)防御丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌的效果[0471] 简介：
[0472] 由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌引发的奇异果细菌病造成奇异果植物虚弱，引起植物在较短或较长时期死亡。
[0474] 花朵、剪枝伤口、动物造成的损伤和落叶留下的损伤都是细菌的进入点。结果是，秋季结束和春季开始的时候，感染期达到其高峰。
[0475] 当前，没有植物检疫产品可用于针对该疾病的治愈性处理。仅仅是有可能在秋季和冬季进行防治处理(通常是铜基的)。然而，有理由担心使用铜分子的植物中毒问题，并且，逐渐出现了针对该活性物质的细菌抗性。
[0476] I/实验布置：
[0477] ·年份：2016
[0478] ·奇异果品种：海沃德
[0479] ·树龄：5年
[0480] ·位置：德龙省(法国)
[0481] ·接种：自然
[0482] ·模式的数目：测试了三种模式
[0483] 每种模式使用了15种形式。
[0484] 模式如下:
[0485] 1/对照
[0486] 2/PP1(f)叶面水平喷洒。PP1(f)提取自芝麻菜的叶。
[0487] 3/上一年n-1和当前年n的预防性铜处理+在叶面喷PP1(f)
[0488] ·推荐：
[0489] 收获之后立即、落叶开始时以及在50％落叶阶段施用铜。
[0490] 从2-3叶期至果实成熟，每10天施用PP1。
[0491] ·体积：700L/公顷(施于植物的最终浆液体积。在这种情况下，例如，对于700L水/公顷，相当于10g植物/L，进行研磨，即7Kg的植物。)
[0492] II/进行如下观察：
[0493] A/被PSA攻击的叶的平均百分比，每株奇异果植株。
[0494] B/叶子上症状的严重程度(存在症状的叶面积的平均％)。
[0495] 读数：存在黄色晕圈包围的枯斑。
[0496] 每个模式随机选择100片叶子进行读数。
[0497] C/出现液体的树枝/植株的平均百分比
[0498] 读数：可以观察到在所有木材(树干、树枝)上出现颜色是米黄色至褐色的粘液。
[0499] III/结果：
[0500] A/被PSA攻击的叶的平均百分比，每株奇异果植株：表1
[0501]
[0502] 每个模式随机选择100片叶子进行读数。
[0503] 不同的字母表示按照Newman-Keuls检验(误差阈值5％)差异显著的结果。
[0504] B/叶子上症状的严重程度(存在症状的叶面积的平均％)：表2
[0505] 日期：05/25/2016 存在症状的叶面积的％对照 39a
PP1 5b
PP1+Cu(预防性的) 0c
Cu(预防性的) 29a
PP1 5b
PP1+Cu(预防性的) 0c
Cu(预防性的) 29a
[0506] 在该表中，每个模式随机选择100片叶子进行读数。不同的字母表示按照Newman-Keuls检验(误差阈值5％)差异显著的结果。
[0507] C/出现液体的树枝/植株的平均百分比：表3
[0508]
[0509]
[0510] IV/结论
[0511] 选择的地块已多年显示由PSA引起的细菌病症状。每年进行大幅剪枝以便去掉受感染的树枝，并防止临近果树感染。尽管如此，疾病每年在较大范围重复出现。
[0512] PP1用于提供防御该细菌的新的解决方案，作为这些症状开始时的防治处理。因此，在植被从新生长时，以每10天施用一次的频率，施用PP1。
[0513] 仅在两块地继续采用铜进行防治处理。
[0514] 采用PP1进行处理显著减轻了症状。不仅在受感染叶的平均％方面(表1)，而且在疾病严重程度方面(表2)，该效果都是可见的。
[0515] 看得见的，采用PP1处理的地块看来是健康的且无疾病的，即使在严格评估中可检测到细菌病症状(对照地块的受感染叶/植株32％，采用PP1处理的模式中受感染叶/植株5％，采用PP1+铜作为防治处理来进行处理的模式中受感染叶/植株0％，采用铜作为防治处理来进行处理的模式中受感染叶/植株12％)(表1)。
[0516] 然而，PP1处理的地块上被细菌病攻击的叶片上，症状的严重性显著减轻(对照地块出现症状的叶面积39％，PP1地块出现症状的叶面积5％，PP1+铜(防治处理)地块出现症状的叶面积0％，铜(防治处理)地块出现症状的叶面积29％)(表2)。
[0517] 如果考虑渗出液的观察，只有PP1处理可以激发植物或树木的防御并实际上减轻所有这些症状(表3)。
[0518] 铜(用作防治处理)也可显著减轻症状。然而，它的效果水平仍低于采用PP1处理的情况中观察到的效果(表1,2,3)。
[0519] 考虑到2种活性物质(铜和PP1)完全不同的作用方式，将两种处理进行组合是令人感兴趣的。在实验条件下，将两种处理进行组合能够有效防御KIWI细菌病，因为这种程序能够将疾病限制到其最低水平。
[0520] 在一种实施方式中，本发明涉及使用“火箭”植物的至少一个部分的提取物以激发植物或树木的防御并减轻树生黄单胞菌核桃致病变种细菌对核桃树的影响，减轻树生黄单胞菌李致病变种细菌对李属的影响，尤其是水果/坚果果树诸如杏树、扁桃树、樱桃树、桃树、李树、中国李、樱桃月桂和其它外来或观赏的李属植物，包括红果树和桂樱属。
[0521] 用于提供本发明主题的组合物的磨碎材料可通过叶面喷洒或浇地来使用。
[0522] 实施例7和8：核桃树(胡桃)上PP1防御树生黄单胞菌的效果。证实PP1激发树的防御。
[0523] 简介
[0524] 核桃树细菌病由树生黄单胞菌(Xaj)细菌引起。目前，针对该疾病引起的枯萎和坚果掉落没有真正有效的处理方法。该细菌的感染会造成50％的作物损失。细菌会攻击所有生长的器官：叶、嫩枝、雌花、柔荑花序和果实。
[0525] Xaj的攻击强度会随时间增加，基于几个原因：集约化的栽培、在不合适的土壤上建设果园以及细菌对铜抗性越来越多的发生。
[0526] 缺少防御该细菌的方案，在铜剂量受限且细菌抗性增强的情况下，找到防御Xaj的其它解决方案是重要的。
[0527] 2017年使用PP1产品在核桃树上进行了两个实验：
[0528] ·一个实验是在果园条件下在19年树龄的格朗让(GrandJean)品种(自然感染)上进行(实施例7)。
[0529] ·一个实验是在苗圃条件下在7年树龄的钱德勒(Chandler)品种(人工感染)上进行。这第二个实验证实了如下事实：PP1通过激发树木防御而发挥作用(实施例8)。
[0530] 实施例7：
[0531] I/实验布置：
[0532] ·年份：2017
[0533] ·核桃品种：格朗让
[0534] ·果园种植于1998年
[0535] ·位置：格勒诺布尔(伊泽尔)
[0536] ·2013接种：自然：从2013年开始该果园就被感染
[0537] ·模式数目：3
[0538] 对三种模式进行测试：6行10棵树(共60棵树)。每种模式由2行10棵树(共20棵树)组成。
[0539] 模式如下：
[0540] 1/对照
[0541] 2/PP1(t)叶面水平喷洒。PP1(t)提取自芝麻菜的茎。
[0542] 3/PP1(f)叶面水平喷洒。PP1(f)提取自芝麻菜的叶。
[0543] ·推荐：从萌芽期(阶段Cf)开始，每14天施用PP1–7次施用
[0544] ·PP1的优点：在开花期没有植物毒性。
[0545] ·体积：600L/公顷
[0546] II/进行如下观察：
[0547] A/计数从结果实到收获掉落在地上的坚果数
[0548] 每个模式随机选择10棵树进行这些计数。在计数过程中，区分无症状的直径小于1cm的坚果。这种脱落现象被认为是生理过程(流产)。
[0549] 防水布分布在每棵树周围，每5天收集坚果。
[0550] 结果表示为坚果/树的平均％，相比于季末记录的坚果总数(生理脱落，在树上收集坚果)
[0551] B/产量(Kg的坚果/树)
[0552] C/尺寸：
[0553] 结果表示为尺寸大于32mm的坚果/树的平均％。
[0554] D/存在呈现卷叶症状的嫩枝
[0555] III：结果：
[0556] A/计数从结果实到收获掉落在地上的坚果数(表1)
[0557]
[0558]
[0559] 在该表中，不同的字母表示按照Newman-Keuls检验(误差阈值5％)差异显著的结果。
[0560] B/产量(Kg坚果/树)(表2)
[0561] 模式 每棵树的坚果的Kg对照 24+/-3.5a
PP1(t) 38+/-6.5b
PP1(f) 41+/-5.0b
PP1(t) 38+/-6.5b
PP1(f) 41+/-5.0b
[0562] 在该表中，不同的字母表示按照Newman-Keuls检验(误差阈值5％)差异显著的结果。
[0563] C/尺寸(表3)：
[0564]模式 每棵树的坚果>32mm的平均％
对照 39.6+/-3.0a
PP1(t) 52.3+/-7.3b
PP1(f) 61,0+/-6.5c
对照 39.6+/-3.0a
PP1(t) 52.3+/-7.3b
PP1(f) 61,0+/-6.5c
[0565] 在该表中，不同的字母表示按照Newman-Keuls检验(误差阈值5％)差异显著的结果。
[0566] D/存在呈现卷叶症状的嫩枝
[0567] 在没有采用PP1处理的对照植物上，大量嫩枝干枯，叶尖端卷曲。
[0568] 在采用PP1处理的其它模式中没有观察到该现象。
[0569] IV/结论：
[0570] 采用PP1(t)或PP1(f)进行处理对坚果生理脱落没有影响(表1)。
[0571] 相反，由于采用PP1进行两个处理，Xaj污染造成的掉落到地上的坚果的百分比显著下降，不管产品是提取自芝麻菜的叶还是茎(对照模式，每棵树有35％的坚果掉落到地上，PP1(t)和PP1(f)的每棵树上掉落到地上的坚果分别是12％和9％)(表1)。
[0572] 采用PP1进行的两个处理还对产量有显著效果，产量显著提高(对照模式，每棵树产坚果24Kg，模式PP1(t)和PP1(f)每棵树产坚果分别是38Kg和41Kg)(表2)。
[0573] 关于坚果尺寸，采用PP1进行的两个处理有显著效果，即使从提取自叶的PP1(f)产品观察到了更大的效果(对照模式的树上有39.6％的坚果的尺寸>32mm，模式PP1(t)和PP1(f)分别有52.3％和61.0％的坚果的尺寸>32mm)(表3)。
[0574] 应注意，只在对照上观察到了嫩枝的卷叶症状(与树严重污染有关)。模式PP1(t)和PP1(f)没有嫩枝出现卷叶症状。
[0575] 采用PP1进行处理显示了在核桃树上防御树生黄单胞菌菌的显著作用。在整个实验过程中，采用PP1处理的核桃树看起来没有因疾病而变虚弱。
[0576] 实施例8：
[0577] I/实验布置：
[0578] ·年份：2016
[0579] ·核桃品种：钱德勒
[0580] ·树龄：4年
[0581] ·位置：格勒诺布尔
[0582] ·接种：人工
[0583] Xaj菌株生长在LPGA培养基上。5℃保存菌株以降低毒力损失的风险。在检验菌株纯度之后，将菌落接种至100mL的LPG液体培养基中，以此来制备该研究中使用的接种物。培养物在30℃搅拌条件下培养12小时。然后，细菌悬液以6000g离心10分钟。以分光光度计将最终的细菌悬液调整至DO600为0.1，相当于108cfu/mL。
[0585] 叶由悬液透过，如此，渗透可见地包括在叶的整个表面。
[0586] 对于对照植物，采用无菌水实施相同的渗透方案。
[0587] ·模式的数目：测试四种模式。每个模式由12棵树组成。
[0588] 1/未接种，未处理对照(T0)
[0589] 2/接种，未处理对照(Tin)
[0590] 3/PP1(P)叶面水平喷洒，在预防条件下(用Xaj接种之前7天处理)
[0591] 4/PP1(P)叶面水平喷洒，在治愈条件下(用Xaj接种之后7天处理)
[0592] ·推荐：从萌芽期(阶段Cf)开始，每14天施用PP1–7次施用
[0593] ·体积：相当于600L/公顷
[0594] 处理的安排示于图22。
[0595] II/进行如下观察：
[0596] A/每个嫩枝的染病的叶的百分比，作为时间的函数。
[0597] B/对叶子破坏的严重程度，根据看得见的受疾病影响的叶表面的百分比，作为时间的函数。
[0598] 对于A和B，每个模式10个嫩枝上读取读数，每棵树2个嫩枝，随机选择。观察涉及所有嫩枝上的叶。
[0599] C/PP1对Xaj的抗菌测试。
[0600] 为了理解PP1的作用方式以及它针对Xaj(该细菌用这些植物检疫产品难以治疗)的高有效性，对其抗菌潜力进行了测试。
[0601] 在黄单胞菌培养物分布24小时之后，将1毫升PP1(以使用和有效性的剂量以及以X2剂量)加于皮氏培养皿。
[0602] 每个模式(施用1mL的PP1，或1mL的无菌水)进行三次重复。
[0603] 在皮氏培养皿中应用PP1之后3天和7天，读取菌落的平均直径。
[0604] D/定量测定叶中过氧化物酶活性，作为时间的函数。
[0605] 虽然过氧化物酶活性也包括在除防御寄生虫有关的功能之外的其它功能中，但是过氧化物酶活性与植物防御植物病原菌密切相关。
[0606] 在不同的时间收集核桃树叶(每棵树5片叶，随机选择)。1克叶混合于2mL磷酸钠缓冲液(pH 5,0.05m)。提取物以10,000g离心5分钟。含氧水存在的条件下，愈创木酚(guaiacol)用作氢供体，在柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH 6,0.05m)中定量测定上清液中过氧化物酶。由A 470预估活性。总活性表示为nKat/mg的蛋白质。
[0607] 在每个模式随机选择的6个不同嫩枝的2片叶上进行定量测定。因此，结果表示为12片叶上得到的平均活性。
[0608] E/叶中内源性游离水杨酸的定量分析
[0609] 在接种之后的不同时间，抽取叶及它们的柄的样本(每株植物2片叶)。将叶沿纵向切成非常薄的条，并直立着放于离心管中。细胞间和韧皮部液体通过离心(5000g)进行收集，并在50％甲醇(v/v)水溶液中回收。样本采用HPLC进行分析，柱C18在由95％醋酸钠缓冲液50mM pH 4.5和5％乙腈构成的混合物中平衡。SA在15分钟的保留时间之后以2mL/min流速洗脱，分光荧光计(290nm激发，402nm发射)利用荧光性检测SA。以μg SA g-1的新鲜材料表示SA浓度。
[0610] 在每个模式随机选择的6个不同嫩枝的2片叶上进行定量测定。因此，结果表示为12片叶上得到的水杨酸的平均量。
[0611] III/结果：
[0612] A/每个嫩枝的被污染的叶的百分比，作为时间的函数(表4)：
[0613]2017日期 06/06 06/13 06/20 07/04 07/18 08/01
T0 0a 0a 0a 0a 0a 0a
Tin 0a 0a 0a 10+/-2b 30+/-4d 32+/-5d
PP1(P) 0a 0a 0a 0a 4+/-1b 5+/-1b
PP1(C) 0a 0a 0a 5+/-2b 7+/-2b 7+/-3b
T0 0a 0a 0a 0a 0a 0a
Tin 0a 0a 0a 10+/-2b 30+/-4d 32+/-5d
PP1(P) 0a 0a 0a 0a 4+/-1b 5+/-1b
PP1(C) 0a 0a 0a 5+/-2b 7+/-2b 7+/-3b
[0614] 每个模式10个嫩枝上读取读数，每棵树2个嫩枝，随机选择。观察涉及所有嫩枝上的叶。
[0615] 不同的字母表示按照Newman-Keuls检验(误差阈值5％)差异显著的结果。
[0616] B/对叶子破坏的严重程度，根据看得见的受疾病影响的叶表面的百分比，作为时间的函数(表5)
[0617]
[0618]
[0619] 每个模式10个嫩枝上读取读数，每棵树2个嫩枝，随机选择。观察涉及所有嫩枝上的叶。
[0620] 不同的字母表示按照Newman-Keuls检验(误差阈值5％)差异显著的结果。
[0621] C/PP1对Xaj的抗菌测试(表6)
[0622]
[0623] 没有观察到菌落数和直径的降低。
[0624] D/定量测定叶中过氧化物酶活性，作为时间的函数(nKat/mg蛋白质)(表7)[0625]
[0626] 在每个模式随机选择的6个不同嫩枝的2片叶上进行定量测定。因此，结果表示为12片叶上得到的平均活性。
[0627] 不同的字母表示按照Newman-Keuls检验(误差阈值5％)差异显著的结果。
[0628] E/叶中内源性游离水杨酸(SA)(μg/g新鲜材料)的定量分析(表8)
[0629]
[0630]
[0631] 在每个模式随机选择的6个不同嫩枝的2片叶上进行定量测定。因此，结果表示为12片叶上得到的平均活性。
[0632] 不同的字母表示按照Newman-Keuls检验(误差阈值5％)差异显著的结果。
[0633] IV/结论：
[0634] 在该实验中，在预防和治愈条件下，针对核桃树上Xaj检测了PP1产品。
[0635] 关于症状出现，在预防条件下采用PP1(P)处理可大幅且显著的减少出现症状的叶的数目。事实上，07/04/2017第一症状出现在接种了黄单胞菌且未经PP1处理的树上，但是，在用PP1(P)防治处理期间，仅在07/18症状以低水平出现(表4)。
[0636] PP1(C)，作为治愈性处理，没有推迟症状出现日期(06/04/2017)，但没有使疾病恶化(表4)。
[0637] 就发作频率而言，在08/01，采用PP1(P)和PP1(C)的两个处理与对照模式相比显著减少了被感染叶的数目(进行接种的对照模式中32％的叶受侵害，PP1(P)和PP1(C)模式中5％和7％的叶受侵害)(表4)。
[0638] 在08/01，两个处理PP1(P)和PP1(C)还显著减轻了疾病的严重程度并阻止疾病恶化(对照模式中38％的叶面积受侵害，PP1(P)和PP1(C)模式中5％和5％的叶面积受侵害)(表5)。
[0639] 抗菌活性测试显示PP1产品不直接针对Xaj起作用(表6)。
[0640] 关于这点，进行植物防御包括的两种已知生物化学标志物定量测定：
[0641] 进行过氧化物酶(已知包括在针对细菌致病菌的植物防御中)的定量测定：
[0642] 对于PP1(P)作为防治处理，接种Xaj之后3天(06/16)观察到非常高的过氧化物酶活性，在此之后，该活性继续增加，直至最后一次采样(08/01)(表7)。
[0643] 对于用PP1进行治愈性处理，从06/20起过氧化物酶活性也显著提高，但随着时间活力减慢(表7)。
[0644] 在08/01，没有接种的对照模式的植物的平均过氧化物酶活性是580nKat的SA/mg蛋白质，接种的对照模式的植物是790nKat/mg蛋白质，PP1(P)和PP1(C)模式的植物分别是2408nKat/mg蛋白质和1852nKat/mg蛋白质(表7)。
[0645] 还进行SA的定量测定：
[0646] 没有接种的对照模式中，SA合成的较晚(07/04)，在此之后有规律的升高，在08/01达到平均值0.8μg的SA/g的新鲜材料(表8)。
[0647] 在用作防治处理的PP1(P)模式中，感染之后3天，在06/16，观察到水杨酸的高合成(1μg的SA/g的新鲜材料)。该值持续升高在08/01达到2μg的SA/g的新鲜材料。在用作治愈性处理的PP1(C)模式中，从06/16起也观察到SA合成的增加，但是是以较低速度(0.5μg的SA/g的新鲜材料)，在08/01达到1.9μg的SA/g的新鲜材料(表8)。
[0648] 在用PP1进行防治处理和治愈性处理的情况下，SA合成被极大地激发。
[0649] 请注意，监控的相互作用没有对植物和细菌之间的“基因对基因”抗性的设置作出响应。的确，没有进行处理，细菌逐步侵入植物。
[0650] 就PP1处理减轻症状以及过氧化物酶和SA定量测定而言，观察到的结果显示增强作用的现象，防御病原体感染的机制增强。
[0651] 在两种情况下(防治处理和治愈性处理)，PP1通过激发核桃树的防御使核桃树有效抵抗细菌病。
[0652] 实施例9–桃树(碧桃)上PP1防御树生黄单胞菌李致病变种细菌的效果[0653] 简介
[0654] 树生黄单胞菌李致病变种细菌在核果类果树(李属)上引起细菌性斑点病。
[0655] 该病原体主要侵害杏树(大扁杏)、樱桃树(甜樱桃)、李子树(欧洲李)和桃树(碧桃)
[0656] 目前该细菌遍布全世界，几乎在每一处耕种核果类果树的地方都会发现。如果严重感染，损害会造成70％的作物损失。
[0658] 缺少对抗该疾病的方法，必要的是，开发通过显著激发树木防御来限制疾病传播的控制方法。
[0659] 采用能够有效防御该细菌的PP1进行的处理必须能够限制对其它树木的污染。
[0660] 对自然染菌的桃树进行实验，以便了解树木对疾病的反应，随后进行处理。
[0661] 预防性使用，PP1应当能够限制桃树的细菌病(树生黄单胞菌李致病变种细菌)的流行性传播。
[0662] I/实验布置：
[0663] ·年份：2017
[0664] ·桃品种：夏季甜
[0665] ·树龄：4年
[0666] ·位置：莱斯科斯蒂埃(加尔省)
[0667] ·接种：自然。对已经感染树黄单胞菌1年的植物进行实验。
[0668] ·模式数目：测试3中模式
[0669] ·模式如下：
[0670] 1/对照
[0671] 2/PP1(t)叶面水平喷洒。PP1(t)提取自芝麻菜的茎。
[0672] 3/PP1(f)叶面水平喷洒。PP1(f)提取自芝麻菜的叶。
[0673] 每种模式由20棵树组成(4组，每组5棵)。
[0674] 所有模式的每组的5棵树随机分配在地块中。
[0675] ·推荐：从萌芽期开始，每14天施用PP1
[0676] ·7次施用
[0677] ·体积：500L/公顷(相当于10g植物/L被研磨，即5Kg的植物覆盖1公顷)[0678] II/进行如下观察：
[0679] A/对嫩枝(枝叶)的损害：基于每个模式随机选择的50个嫩枝，结果表示为感染嫩枝的％。
[0680] B/对果实的损害：在收获日(08/25)预估果实的疾病。对此，对每个模式50个果实进行观察。结果表示为果实的％。
[0681] 根据形态将结果分为3类：健康果实％，中度损坏的果实％，严重损坏的果实％。
[0682] C/在06/30，每枝树枝的新芽的平均数，基于每个模式随机选择的50个嫩枝。
[0683] III/结果
[0684] A/对嫩枝(枝叶)的损害(表9)
[0685]08/25 感染嫩枝的％
对照 62
PP1(t) 5
PP1(f) 4
对照 62
PP1(t) 5
PP1(f) 4
[0686] B/对果实的损害：在收获日(08/25)预估果实的疾病(表10)
[0687]08/25 ％健康果实 ％中度损坏的果实 ％严重损坏的果实
对照 50 18 32
PP1(t) 85 15 0
PP1(f) 82 18 0
对照 50 18 32
PP1(t) 85 15 0
PP1(f) 82 18 0
[0688] C/在06/30，每枝树枝的新芽的平均数(表11)
[0689] 2017日期 06/13T 12
PP1(t) 28
PP1(f) 25
PP1(t) 28
PP1(f) 25
[0690] VI/结论：
[0691] 当从萌芽期开始以14天的频率施用PP1时，感染嫩枝的％显著下降(对照植物的感染嫩枝是62％，PP1(t)和PP1(f)模式中感染嫩枝是5％和4％)。
[0692] 关于果实：在对照模式中，50％的果实是健康的，然而85％和82％的健康果实记录在PP1(t)和PP1(f)模式中。
[0693] 应注意，在PP1模式中，没有果实被严重损坏，然而对照模式中有32％的果实显示严重损坏。
[0694] PP1对果园的活力也有作用。事实上，相比于对照模式，在PP1模式中观察到显著较高数目的新芽(对照模式中每枝树枝平均12个新芽，PP1(t)和PP1(f)模式中每枝树枝平均28和25个新芽)。
[0695] 采用PP1处理能够有效防御树生黄单胞菌李致病变种细菌。
[0696] 在一种实施方式中，本发明涉及使用“火箭”植物的至少一部分的提取物，以便激发植物或树木的防御并减轻梨枯萎植原体细菌或正梨衰退病植原体对梨树的影响，或者玉米红化病植原体细菌对葡萄藤、薰衣草、马铃薯植株、番茄植株、茄子植株、辣椒植株和烟草植株的影响。
[0697] 实施例10–梨树上PP1防御正梨衰退病植原体(梨衰退)的效果
[0698] 简介
[0699] 植原体正梨衰退病植原体引发梨树的快速衰退，其存在于种植梨树的绝大部分欧盟国家。沿着北美海岸线已经检测到该疾病。它主要影响梨属的植物，果实和观赏植物。它在木梨(榅桲)树上也被观察到。
[0700] 染菌树的韧皮部的衰退导致它们顶梢枯死。然而，取决于耕作实践和根茎的敏感性，可看出两种类型的症状：七月-八月中体现在叶片干燥的快速顶梢枯死，或者，逐渐使树木变虚弱的缓慢顶梢枯死。
[0701] 当前，没有能够清除梨树植原体的技术或处理。
[0702] 重要的是，将能够激发植物对抗正梨衰退病植原体的新处理方法落实到位。
[0703] I/实验布置：
[0704] ·年份：2017
[0705] ·梨品种：巴特利特梨
[0706] ·种植的果园：2008年
[0707] ·位置：普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸地区
[0708] ·接种：自然：从2016年开始该果园已严重感染。
[0709] ·模式数目：2
[0710] 测试的三种模式：3行，每行10棵树(共30棵树)。每种模式由1行的10棵树组成。
[0711] 模式如下：
[0712] 1/对照
[0713] 2/PP1(f)叶面水平喷洒。PP1(f)提取自芝麻菜的叶。
[0714] ·推荐：从萌芽期开始，每14天施用PP1
[0715] PP1的优点：在开花期没有危害植物的毒性。
[0716] ·体积：800L/公顷(相当于10g植物/L被研磨，即8Kg的植物覆盖1公顷)[0717] II/进行如下观察：
[0718] A/出现快速衰退症状的树木的数目，每个模式。
[0719] B/在两个日期(6月5日和8月2日)，出现症状的树枝/树木的平均数。
[0720] 这些症状分为2种观察结果：1/在春季的症状(6月5日读取)：嫩枝呈现淡绿色叶子尺寸减小并且叶片数量低，2/所谓的秋季症状(8月2日读取)：树叶过早的变红、边缘卷曲。
[0721] III/结果
[0722] A/每个模式出现症状的树木的数目(表1)
[0723]
[0724] B/出现衰退症状的树枝/树木的平均数(表2)
[0725]
[0726]
[0727] IV：讨论
[0728] 2016年树木严重染病。在寄生虫压力很大的情况下，在两个不同时间观察了症状。
[0729] 从2017年春季开始，尽管采用PP1处理，观察到2个模式中30％的树木存在春季症状(呈现淡绿色叶子尺寸减小并且叶片数量低的嫩枝)(表1)。这些嫩枝在地块其余植物中在视觉上显得很突出。
[0730] 相反，在采用PP1处理过程中，2017年8月2日读数期间，较少数量的树木观察到出现秋季症状(对照中50％的树木，PP1(f)模式中30％的树木)(表1)。
[0731] 关于出现症状的树枝/树木的平均值，从发芽开始采用PP1进行处理能够激发树木的防御并且显著减少出现症状的嫩枝的数目(表2)。
[0732] 事实上，在对照地块中观察到47％的嫩枝/树木受疾病侵害，然而在采用PP1(f)处理的地块中仅26％的嫩枝/树木受侵害。
[0733] 在八月，对照地块中100％的树木嫩枝染病，然而在采用PP1(f)处理的地块中仅30％的嫩枝受侵害。
[0734] PP1通过激发树木的防御以及新陈代谢而发挥作用。对于梨树植原体的情况，病原体会进入韧皮部的导管，并且尤其集中在最薄的维管中。这种感染会使组织显著损坏，并且使胼胝质聚集在植物细胞的细胞壁，这会阻断汁液的通路。对该感染作出反应，树木产生较大或较小的替代韧皮部，这使它能够存活较长或较短的时间。
[0735] 根据建议，PP1通过刺激以下机制的多种方式来发挥作用：1/树木防御机制，该机制会积极防御寄生虫，2/增加新维管产生的植物机制，和3/生产酶，该酶会除去阻塞维管的胼胝质、侵填体的阻塞物。
[0736] 在对橄榄树进行处理(用于防御木质部难养菌)的过程中观察到了该相同的现象。
[0737] 因此，推荐以PP1作为防治处理来对梨树园进行处理，并推荐该处理每年持续进行，以便在每年以及在出现症状时都使植物将其防御机制保持在警戒状态。
[0738] 实施例11–葡萄藤(欧洲葡萄)上PP1针对玉米红化病植原体细菌(匍匐茎植原体)的效果
[0739] I/简介：
[0740] 匍匐茎植原体(玉米红化病植原体细菌)存在于中欧和南欧，以及一些中东国家。
[0741] 该细菌属于支原体。这些细菌的特点是具有小基因组以及无细胞壁。在植物体内，这些生物体专一地位于韧皮部的筛管原件。它们的致病力可由几个现象来解释：阻碍感染植物内汁液的良好循环、产生与植物激素(这些激素与植物生长有关，例如生长素)相互作用的分子，等。
[0742] 借助于叶蝉(半翅目韧皮部取食昆虫)将匍匐茎植原体传播至植物。今天，认为田旋花麦蜡蝉(Hyalesthes obsoletus Signoret)(半翅目，菱飞虱科)在欧洲是bois noir病(黑木病)的主要载体。
[0743] 匍匐茎植原体感染茄科植物，主要是马铃薯植株、番茄植株、茄子植株、辣椒植株和烟草植株。它还造成其它栽培物种的疾病，诸如草莓植株(叶边黄化)、薰衣草植株(衰退)、葡萄藤(黑木病)和甜菜植株('basses richesses'综合征)。菊科、旋花科和豆科也包括对匍匐茎植原体敏感的植物。
[0744] 所有欧洲葡萄园都受到黑木病的侵害，黑木病是葡萄藤变黄的疾病，对葡萄园是非接触传染的，其名称由来是霜冻作用下非木质化木材变黑。从一年到另一年，葡萄藤发病率是发生变化的。
[0745] 该疾病造成作物减产并影响收获质量。它会造成藤本植物死亡，其结果是缩短葡萄藤寿命。
[0746] 从2000年开始葡萄藤黑木病例数量的增加，以及估计没有可控制载体的化学治疗方法的事实，显示了找到新的控制方案的重要性。
[0747] 考虑到PP1的作用模式，能够有效激发针对细菌疾病的防御，在葡萄园和薰衣草园中已经成功使用了该产品。
[0748] II/实验布置：
[0749] ·年份：2016
[0750] ·葡萄品种：霞多丽，黑皮诺葡萄品种
[0751] ·为了获得可靠的统计学评估，考虑到疾病，使用两个不同的葡萄园来评估疾病和PP1产品的效果。在每个葡萄园中，每个模式包括100个葡萄藤。
[0752] ·树龄：霞多丽12年，黑皮诺14年
[0753] ·地块的养护：为了促进发病，在2016年，用非控制性草皮土来管理这些葡萄园[0754] ·位置：蒙彼利埃(埃罗，法国)/尼姆(加尔，法国)
[0755] ·接种：自然。
[0756] ·模式数目：对三种模式进行测试
[0757] 模式如下：
[0758] 1/对照
[0759] 2/PP1(t)叶面水平喷洒。PP1(t)提取自芝麻菜的茎。
[0760] 3/PP1(f)叶面水平喷洒。PP1(f)提取自芝麻菜的叶。
[0761] ·推荐：从2-3叶期至果实成熟，每14天施用PP1。
[0762] ·体积：500L/公顷(相当于10g植物/L被研磨，即5Kg的植物覆盖1公顷)[0763] III/进行如下观察：
[0764] A/在08/31，每个葡萄园受侵害的植株的百分比。
[0765] 在夏季，症状立即可见，并且会展示在一部分或全部葡萄树上。患病的植株可通过它们卷曲的叶子来辨认出，基于品种，叶子(包括叶脉)部分地或全部地变红或变黄。它们的葡萄果穗过早地枯萎，枝条成熟被破坏，部分或全部缺少。
[0766] B/内源性游离茉莉酸(JA)的定量测定。
[0767] 考虑到从其它模式观察到的防御刺激结果，进行AJ的定量测定看起来是令人感兴趣的。
[0768] 在第5次处理之后的两个不同时间点(6小时和24小时)，收集从10枝健康嫩枝分别随机选择的5片叶(共计50片叶)和从10枝被感染的嫩枝分别随机选择的5片叶(共计50片叶)。
[0769] 称重之后，将树叶投入液氮N2中。然后，将研磨的材料浸入乙醇中。
[0770] 按照Gundlach et al.,1992进行各种提取。由GC/质谱法分析JA。
[0771] 在一个DB-5柱(30m x 0.25mm)上进行分离。
[0772] IV/结果：
[0773] A/在08/31，每个葡萄园受侵害的植株的百分比
[0774] 在地块中分离出现症状的葡萄树，没有明显的分组
[0775]
[0776] B/内源性游离茉莉酸(JA)的定量测定(ng的JA/g的新鲜材料)：
[0777] 健康植株：
[0778]
[0779] 结果表示为ng的JA/g的新鲜材料。
[0780] 结果代表每个模式50片叶子上进行的定量测定的平均值。
[0781] 被感染的植株：
[0782]
[0783]
[0784] 结果表示为ng的JA/g的新鲜材料。
[0785] 结果代表每个模式50片叶子上进行的定量测定的平均值。
[0786] V/结论：
[0787] 很明显，与未处理的地块相比，采用PP1处理的地块上出现与匍匐茎植原体(玉米红化病植原体细菌)有关的症状的葡萄树的数量显著更少。的确，霞多丽和黑皮诺品种在对照地块上分别有17％和24％的葡萄树出现症状，采用PP1(t)处理的模式分别是3％和4％的葡萄树出现症状，采用PP1(f)处理的模式分别是2％和1％的葡萄树出现症状。
[0788] 请注意，与对照葡萄树相比，采用PP1处理的葡萄树上观察到的症状在两个品种都呈现出较少的“晚期”症状。事实上，处理模式的葡萄树上没有观察到坏死，仅仅是卷曲的叶子变黄。
[0789] 考虑到从该模式得到的结果，并考虑到从其它模式(用PP1激发植物防御)观察到的结果，令人感兴趣的是，对与植物针对昆虫的防御有关的化合物进行测试：JA。
[0790] 每个模式(健康植物和出现症状的植物)随机选择的50片叶子进行定量测定。
[0791] 相比于从对照植物收集的叶子，在没有出现症状的植物中，采用PP1进行处理在施用之后6小时和24小时引发了叶子中JA的大量产生。然而，在采用PP1进行处理的植物中，施用之后24小时，JA水平没有超过705ng的JA/g的新鲜材料(霞多丽品种)和788ng的JA/g的新鲜材料(黑皮诺品种)。
[0792] 考虑到对照植物中观察到的JA的最大值是81ng的JA/g的新鲜材料(即降低8-9倍)，处理的植物中评估水平的JA参与到了有效驱除韧皮部取食昆虫之中(与不能使寄生虫受控的其它防御机制有关)。
[0793] 在被感染的植物中，采用PP1进行处理之后6小时和24小时观察到了显著高产量的JA。
[0794] 这次，采用PP1进行处理的植物中观察到的JA的量要高得多(霞多丽品种1352ng的JA/g的新鲜材料；黑皮诺品种1489ng的JA/g的新鲜材料)，然而，对于被污染的对照植物，霞多丽品种产生102ng的JA/g的新鲜材料，黑皮诺品种产生145ng的JA/g的新鲜材料。
[0795] 采用PP1进行处理的植物的其它模式中，看起来是，从病原体到达开始建立了一个增强过程，参与防御的活性分子的产量高。
[0796] 采用PP1(叶或茎的提取物)进行处理证实了葡萄树上针对黑木病的令人感兴趣且显著的效果，推荐将PP1处理作为从2-3叶期开始的防治处理。
[0797] 实施例12–薰衣草植物(Lavandula augustiflora)上PP1针对玉米红化病植原体细菌(匍匐茎植原体)的效果
[0798] I/简介：
[0799] 薰衣草(lavender)和醒目薰衣草(lavandin)，普罗旺斯地区(法国)的标志性作物，自从2000年开始就受到顶梢枯死的侵害。薰衣草和醒目薰衣草农民面临着他们的作物的早逝，主要原因是匍匐茎植原体(玉米红化病植原体细菌)，其由载体昆虫叶蝉(Hyalesthes obsoletus)传播至植物。
[0800] 匍匐茎植原体是需要“宿主”-植物或昆虫-才能存活的无细胞壁细菌。一旦进入薰衣草植物，它会阻塞汁液循环的微管，从而使植物衰弱。因此，会观察到作物萎缩和叶子变黄，随后是植物死亡。
[0801] 不存在对植原体的直接控制，并且也不可能直接控制昆虫。
[0802] 因此，PP1产品在针对该疾病的控制策略中找到了它的位置。
[0803] II/实验布置：
[0804] ·薰衣草田地：
[0805] 用于该实验的植物是英国薰衣草(Lavandula augustiflora)，通常称为真薰衣草。在位于法国南部(表1)的6年薰衣草种植园进行该实验。
[0806] 表1.实验地位置：佩泽纳斯，法国
[0807] ·处理
[0808] 在该实验过程中，8株薰衣草植物使用PP1产品进行处理，与未处理的薰衣草植物进行比较。在该地块中，所有薰衣草植物都患病并且出现感染玉米红化病植原体细菌的症状。
[0809] 对于每个处理，使用便携式设备(BERTHOUD COSMOS 18PRO)施用100ml的PP1。在2016年3月和7月之间，施用了10次PP1产品，每次间隔12至15天(表2：PP1产品施用日程)[0810]
[0811] *"XDAY"意思是第Y次施用之后的X天
[0812] III/进行如下观察：
[0813] 在该实验期间，在2个日期进行读数。第一次读数是在第6次施用(F；05/17/2016)当天进行，第二次读数是在最后一次施用(K；07/25/2016)时进行。
[0814] 读取如下5个参数：
[0815] ·新形成的副花梗的百分比
[0816] ·新形成的花梗的高度
[0817] ·每个幼芽的轮生(花萼群)的百分比
[0818] ·植株的直径
[0819] ·植株的高度
[0820] 对于前三个参数，在随机选择的50个花梗上进行评价。对于最后两个参数，在整个薰衣草植株上进行评价。为了评价视觉可见的疾病进程，在两个评价日期(05/17/2016和07/25/2016)对未处理植物和用PP1产品处理的患病植物进行拍照。
[0821] IV/结果：
[0822] 图23：处理的薰衣草植物的生长生理参数的发展(黑条)，与未处理“对照”(白条)进行比较。图23的部分具有如下含义：A’：新形成的副花梗的平均百分比，B’：新形成的花梗的平均高度，C’：每个幼芽的轮生(花萼群)的平均百分比，D’：植株的平均直径，E’：植株的植株的高度高度。
[0823] A,B,C n＝50.D,E n＝8。由***(P<0.001)表示处理植物和“对照”植物之间的显著差异。
[0824] 图24以照片的形式显示对照植物(A,C)和PP1处理的植物(B,D)中由匍匐茎植原体(玉米红化病植原体细菌)引起疾病进展。
[0825] V/结论：
[0826] 在两个取样日，5月17日和7月25日，对于所有的读数和所有的参数，PP1处理的植物比未处理植物具有更好的生长参数。处理植物与未处理植物之间的差别非常大(图23)。
[0827] 看得见的，结果也被非常清楚的表达(图24)，因为在7月25日未处理植物就全部干枯，而处理植物是绿色的并显示花蕾。
[0828] 这些结果显示，PP1应当用于防御玉米红化病植原体细菌，以便保护薰衣草作物。应将PP1包括在预防性控制方案中，以便限制传染病并保护薰衣草和醒目薰衣草田地。
[0829] 实施例13-玫瑰丛上PP1针对粉孢子(Podosphaera pannosa)的效果
[0830] I/简介
[0831] 1.1实验目的
[0832] 对称作PP1的新的天然产品(包括100％的植物提取物)进行的实验能够证明非常满意的结果，尤其是对于触发植物防御机制而言。初步结果已经显示针对病原真菌侵害的测试作物的防治效果。
[0833] 因此，该实验的目的是在新模型上测试该新产品，即，PP1产品的防御玫瑰丛上粉孢子的效果和有效性。
[0834] 1.2关于目标病原体的信息
[0835] 玫瑰的粉孢子是隐花植物病害，通常称作“玫瑰白粉病”。该真菌造成叶片和幼枝上出现白霉。最开始的症状并不是非常明显，由叶片底面轻微变色来体现。当发生侵害时，叶子会变形并且花蕾枯萎，极大地限制了植物的发育和开花。
[0836] 粉孢子产生孢子，尤其在温暖以及大于70％的湿度水平(特别是在观赏玫瑰的温室中)，孢子会激增。粉孢子在植物之间的传播非常的快，需要快速有效的处理，以便限制粉孢子增殖并保护耕种区。
[0837] 通过人工感染粉孢子来进行该实验。
[0838] 1.3关于目标宿主植物的信息
[0839] 目标作物是玫瑰丛。
[0840] 该实验在盆栽观赏玫瑰植株进行。
[0841] 2/实验实施
[0842] 2.1执行方案
[0843] 在2018年4月，将对粉孢子敏感的观赏玫瑰品种置于博斯科普(荷兰)德尔菲公司的一个温室中。当幼枝充分发育时，采用PP1产品对一部分作物进行处理。
[0844] 在实验过程中，测量粉孢子的发育，与化学参照品和未处理植株进行比较。
[0845] 如果必要，为了避免发生其它疾病(诸如霉病)，在玫瑰植株上施用另一参照品以便避免任何可能的干扰。
[0846]
[0847] 2.3布置和规模
[0848] 1(作物)x 3(处理)x 5(重复)
[0849] 面积:≈48m2(6x 8m)
[0850] 总面积:≈1m2(30株植株)
[0851] 使用面积:≈0.4m2(12株植株)
[0852] 分界线:至少2(每个地块周围1个)
[0853] 2.4处理和读数
[0854] 处理数目：
[0855] ·PP1:5
[0856] ·参照：3
[0857] 推荐使用的施用频率：
[0858] ·PP1：10天
[0859] ·参照：20天
[0860] 读数次数：6
[0861] ·第一次施用之后立即读取
[0862] ·然后是每次处理之前读取
[0863] 方法(EPPO PP1/196(2)–杀菌剂的生物学评价-木本观赏植物的真菌)[0864] 在每个地块，随机选择至少50片类似年龄的叶子。注意感染的水平：感染叶片的数目以及被侵害叶面积的百分比。可以采用量度(scale)，但是必须进行描述。
[0865] 量表：
[0866] 粉孢子感染的叶面积的百分比 0％ 1-5％ 5-10％ 11-25％ 26-50％ >51％量度 0 1 2 3 4 5
[0867] 其它测量：天气状况(温度、湿度、光照等)
[0868] 读数的平均值：数字形式(照片)
[0869] 2.5分析和报告
[0870] 可靠性：95％(P<0.05)
[0871] 递交日期：2018年6月
[0872] 2.6实验持续时间
[0873] 温室实验持续时间最长是12周(因为作物生长发育以及为了确保最佳条件)。
[0874]
[0875]
[0876] *X DA-A:第一次处理(A)之后的X天
[0877] 表：被粉孢子侵害的玫瑰花丛叶面积百分比读数(通过重复-值0to 5)[0878]
[0879] 表：被粉孢子侵害的玫瑰花丛叶面积百分比读数(5个重复的平均值)
[0880]
[0881] 3/结论：
[0882] 在所有取样日，PP1产品处理的玫瑰植株和化学参照品处理的玫瑰植株显示了受粉孢子侵害的叶面积在统计学意义上比未处理的玫瑰植株更小。
[0883] 第一次施用之后59天(59DA-A)，结果显示采用PP1产品处理的玫瑰植株有不到5％的叶面积被粉孢子侵害。
[0884] 4月13日至6月11日，所有读数显示疾病对照等于参考。
[0885] 这些结果证实PP1产品能够在玫瑰花丛上有效防御粉孢子。
[0886] 实施例14–葡萄藤(欧洲葡萄)上PP1对霜霉病(霜霉病)的效果
[0887] 霜霉病由霜霉病引起，在世界范围内存在于大部分葡萄园中。在缺少植物检疫保护的情况下，破坏是惊人的，直到毁坏全部的收成。葡萄藤的霜霉病在葡萄藤的所有草本器官上(尤其是那些正在生长的(富含水分))生长发育。
[0888] 对于针对霜霉病进行的处理，农民通常采取铜处理的策略，其由技术服务部门推荐。此外，它是在整个生长期能够控制霜霉病的唯一产品。
[0889] 在对每公顷铜的量进行限制的情况下，有必要找到防御葡萄藤霜霉病的替代物。PP1是理想的候选物，通过激发葡萄藤的自然防护来参加针对葡萄藤疾病的自然防御。
[0890] I/实验布置：
[0891] 年份：2014
[0892] 位置：法国南部
[0893] 品种：歌海娜
[0894] 实验方案：基于每个模式4次重复的方案实施实验。
[0895] 模式：
[0896] 1/对照
[0897] 2/PP1
[0898] 3/铜基特定产品-Folpan 80WDG(注册商标)1.9kg/ha
[0899] 处理频率：10-12天
[0900] 观察：
[0901] 发病频率：每个模式染病叶子的平均％
[0902] 发病强度：染病表面的平均％
[0903] 统计学分析：Newman-Keuls检验(阈值5％)
[0904] II/结果
[0905]
[0906]
[0907] 结论：以10-13天的频率将PP1产品喷于葡萄藤以便抵御霜霉病。
[0908] 请注意，在5月24日(实验开始的日期)，还没有形成疾病。因此PP1在治疗条件下使用。
[0909] 疾病很快形成，寄生虫压力在叶子和葡萄丛上都快速变强。
[0910] 就发病频率(每个模式受到侵害的叶子或丛的％)和发病强度(受疾病侵害的叶面积或葡萄丛的％)而言，PP1能够约束和限制疾病。
[0911] 在所有取样时间，PP1产品的效果与参照品Folpan 80WDG(注册商标)实现的效果没有显著差别。
[0913] 采用PP1的实验主要是采用芝麻菜在不同植物/病原体模型(提取自叶、茎、花、种子或根)上进行的。
[0914] 在该实验中，也测试了其它一些火箭植物以便了解它们引起植物防御的能力。火箭植物的该清单并不是详尽的。
[0915] 实施例15–不同类型火箭植物防御葡萄藤上粉孢子的实验
[0916] 在温室中，在自然感染粉孢子(白粉菌属)的佳丽酿品种的两年生的根茎扦插上进行测试。
[0917] 一个易于使用的标志物是过氧化物酶活性，在这种特殊情况下以及在这些实验条件下，过氧化物酶活性可以是引发葡萄藤防御的标志物。
[0918] 采用提取自火箭植物科不同植物以及植物不同部位的PP1处理植物。
[0919] 每个模式由10株植物组成。
[0920] 当叶出现粉孢子症状时，每10天将PP1喷于葡萄藤上。然后，在第4次喷施之后24小时，每株植物取2片叶子来测量过氧化物酶活性，对模式的所有植株进行测量。
[0921] 下表概括了检测的模式和过氧化物酶活性(nKat/mg蛋白质)
[0922]
[0923]
[0924] 对于叶子、茎和花，得到的每升滤液的起始浓度范围是5g/L至20g/L。
[0925] 结论：结果代表以nKat/mg蛋白质表示的随机选择的20片叶子(每个植株2片叶子)的过氧化物酶活性的平均值。
[0926] 这些结果显示不同火箭植物对葡萄藤叶子中过氧化物酶活性的效果。
[0927] 另一植物物种(没有假设的作用)作为第二对照进行测试，以便检验模型的可行性。
[0928] 在实验条件下，4种火箭植物品种引起过氧化物酶活性(引发防御刺激的标志物)。
[0929] 参考文献
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