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调节 植物中的 种子和器官尺寸的方法

阅读：994发布：2020-05-12

专利汇可以提供调节植物中的种子和器官尺寸的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及植物的细胞中带有突变的DA1蛋白的表达，该突变打断或失活LIM结构域或LIM类似结构域。这可增加植物的产量或提高植物产量相关的性状。提供了方法、植物和植物细胞。，下面是调节植物中的种子和器官尺寸的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种提高植物种子尺寸或每单位面积种子质量的方法，包括；
在所述植物的细胞内表达突变DA1蛋白，
其中所述突变DA1蛋白包括与选自于SEQ ID NO:4-27组成的组中的DA1序列具有至少
95％的序列一致性的氨基酸序列，
所述突变DA1蛋白具有对应于SEQ ID NO：8中C172，C175，H193，C196，C199，C202，H220或C223的半胱氨酸或组氨酸残基的突变，或者具有对应于SEQ ID NO：8中C232，C235，H252，C260，H263，C271，C274，C294或C297的半胱氨酸或组氨酸残基的突变。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变DA1蛋白从植物的一个或多个细胞中的异源核酸编码序列中表达。
3.一种生产具有增加的种子尺寸或每单位面积种子质量的植物的方法，包括：
向植物细胞中引入编码突变DA1蛋白的异源核酸，其中所述突变DA1蛋白包括与选自于SEQ ID NO:4-27组成的组中的DA1序列具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列，所述突变DA1蛋白具有对应于SEQ ID NO：8中C172，C175，H193，C196，C199，C202，H220或C223的半胱氨酸或组氨酸残基的突变，或者具有对应于SEQ ID NO：8中C232，C235，H252，C260，H263，C271，C274，C294或C297的半胱氨酸或组氨酸残基的突变，或
向编码DA1蛋白的植物细胞的核苷酸序列中引入突变，所述DA1蛋白与选自于SEQ ID NO:4-27组成的组中的DA1序列具有至少95％的序列一致性，使得所述核苷酸序列编码突变DA1蛋白，所述突变DA1蛋白包括与选自于SEQ ID NO:4-27组成的组中的DA1序列具有至少
95％的序列一致性的氨基酸序列，所述突变DA1蛋白具有对应于SEQ ID NO：8中C172，C175，H193，C196，C199，C202，H220或C223的半胱氨酸或组氨酸残基的突变，或者具有对应于SEQ ID NO：8中C232，C235，H252，C260，H263，C271，C274，C294或C297的半胱氨酸或组氨酸残基的突变，以及
从所述植物细胞再生所述植物。
4.根据前述任一权利要求所述的方法，其中表达所述突变DA1蛋白的所述植物相对于对照具有增加的寿命、器官尺寸和/或种子尺寸。
5.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述突变DA1蛋白包括具有与SEQ ID NO:8的残基229至532至少20％序列一致性的C末端区域，其中所述C末端区域包括金属肽酶基序HEMMH(SEQ ID NO:32)。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述C末端区域包括氨基酸序列EK(X)8R(X)4SEEQ(SEQ ID NO:33)或EK(X)8R(X)4SEQ(SEQ ID NO:34)。
7.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，其中所述突变DA1蛋白包括SEQ ID NO:35的UIM1结构域和SEQ ID NO:36的UIM2结构域。
8.根据前述任一权利要求所述的方法，其中编码所述突变DA1蛋白的核酸可操作地连接到一个异源启动子上。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述启动子是组织特异性启动子或诱导型启动子。
10.根据权利要求8至9中任一项所述的方法，其中编码所述突变DA1蛋白的所述核酸包括在一个或多个载体中。
11.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述植物或植物细胞在EOD1表达或活性上有缺陷。
12.根据前述任一权利要求所述的方法，包括选择相比于对照植物具有增加的种子尺寸或者每单位面积种子质量的植物或植物细胞。
13.根据前述任一权利要求所述的方法，包括包括有性地或无性地繁殖或种植表达所述DA1蛋白的所述植物的子代或后代。
14.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述植物是高等植物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述植物是选自由紫草、红豆杉属、烟草、葫芦科植物、胡萝卜、蔬菜芸苔属、瓜类植物、辣椒、葡萄藤、莴苣、草莓、油料种子芸苔属、糖用甜菜、小麦、大麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、高粱、向日葵、番茄、土豆、胡椒、菊属、石竹属、亚麻籽、大麻和黑麦组成的组中的一种农业植物。

说明书全文

调节植物中的 种子和器官尺寸的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及改变植物的种子和器官的尺寸的方法，例如用以提高植物产量。

背景技术

[0002] 种子和器官的尺寸是农艺学和生态学上重要的性状，是受到遗传控制的(Alonso-Blanco,C.PNAS USA 96,4710-7(1999)；Song,X.J.Nat Genet 39,623-30(2007)；Weiss,J.Int J Dev Biol 49,513-25(2005)；Dinneny,J.R.Development 131,1101-10(2004)；Disch,S.Curr Biol 16,272-9(2006)；Science 289,85-8(2000)；Horiguchi,G.Plant J
43,68-78(2005)；Hu,Y Plant J 47,1-9(2006)；Hu,Y.Plant Cell 15,1951-61(2003)；
Krizek,B.A.Dev Genet 25,224-36(1999)；Mizukami,Y.PNAS USA 97,942-7(2000)；Nath,U.Science 299,1404-7(2003)；Ohno,C.K.Development 131,1111-22(2004)；Szecsi,J.Embo J 25,3912-20(2006)；White,D.W.PNAS USA 103,13238-43(2006)；Horvath,B.M.Embo J 25,4909-20(2006)；Garcia,D.Plant Cell 17,52-60(2005)。在给定的物种中，最终的种子和器官的尺寸是恒定的，而物种间的种子和器官的尺寸变化是非常大的，表明植物具有调节机制，能以协调的和适时地的方式控制种子和器官的生长。尽管种子和器官的尺寸很重要，但是对植物中控制最终器官和种子尺寸的分子和遗传学机制仍知之甚少。

[0003] 已经在包括番茄、大豆、玉米和水稻的植物中使用数量性状基因座(QTL)定位研究了种子尺寸的遗传学调节。迄今为止，在已公开的文献中，鉴定了两个基因(Song,X.J.Nat Genet 39,623-30(2007)；Fan,C.Theor.Appl.Genet.112,1164-1171(2006))，这两个基因是负责水稻籽粒大小的两个主要的QTL，但是这些基因的分子机制还有待阐明。在拟南芥中，在保藏物Ler和Cvi的杂交中，已经定位了十一个影响种子重量和/或长度的基因座{Alonso-Blanco，1999supra}，但是还没有鉴定到对应的基因。近期有研究揭露，AP2和ARF2参与到种子尺寸的控制中。但遗憾的是，ap2和arf2突变体具有比野生型更低的可育性(Schruff,M.C.Development 137,251-261(2006)；Ohto,M.A.PNAS USA 102,3123-3128(2005)；Jofuku,K.D.PNAS USA 102,3117-3122(2005))。此外，使用突变体植物的研究已经鉴定了多个正和负调节子，其通过作用于细胞增殖或扩增来影响器官尺寸{Krizek,B.A.Dev Genet 25,224-36(1999)；Mizukami,Y.Proc Natl Acad Sci U S A 97,942-7(2000)；Nath,U.Science 299,1404-7(2003)；Ohno,C.K.Development 131,1111-22(2004)；Szecsi,J.Embo J 25,3912-20(2006)；White,D.W.PNAS USA 103,13238-43(2006)；Horvath,B.M.Embo J 25,4909-20(2006)；Garcia,D.Plant Cell 17,52-60(2005).Horiguchi,G.Plant J 43,68-78(2005)；Hu,Y Plant J 47,1-9(2006)Dinneny,J.R.Development 131,1101-10(2004))。

[0004] 已了解涉及到泛素化相关活性的几个因子能影响种子尺寸。DA1，一种生长限制因子，是一种泛素受体，并且含有两个在体外结合泛素的泛素相互作用基序(UIM)，并且da1-1突变体通过影响胚珠的母本珠被形成大的种子(Li等，2008)。编码E3泛素连接酶BIG BROTHER(BB)(Disch等，2006；Li等，2008)的da1-1的增强子(EOD1)中的突变，协同地增da1-1的种子尺寸表型，表明DA1和EOD1/BB协同地作用从而控制种子尺寸。

[0005] 控制种子和器官两者的最终尺寸的进一步的因子的鉴定，不仅会推进植物中尺寸控制机制的理解，而且可能在例如提高农作物产量和提高用于产生生物燃料的植物生物质中具有重要的实际应用。

发明内容

[0006] 本发明的发明人意外地发现植物DA1蛋白中的LIM结构域和/或LIM类似结构域的打断不会消除DA同源二聚化或活性，但是反而给予了显性负性表型。

[0007] 本发明的一个方面提供了一种提高植物的产量或增强植物中的产量相关性状的方法；包括在所述植物的细胞内表达具有失活的LIM结构域或LIM类似结构域的DA1蛋白。

[0008] DA1蛋白可包括相对于野生型序列的一个或多个突变，这些突变打断或失活DA1蛋白的LIM结构域或LIM类似结构域。

[0009] 表达具有打断的或失活的LIM结构域或LIM类似结构域的DA1蛋白增强植物的一个或多个产量相关性状或提高植物的产量。

[0010] 具有失活的LIM结构域或LIM类似结构域的DA1蛋白可以从植物的一个或多个细胞中的异源核酸编码序列表达，或可以从植物的一个或多个细胞中的内源的核酸编码序列表达。

[0011] 本发明的另一个方面提供了一种产生具有提高的产量和/或一个或多个增强的产量相关性状的植物的方法，包括：

[0012] 向植物细胞中引入编码具有失活的LIM结构域或LIM类似结构域的DA1蛋白的异源核酸，或

[0013] 向编码DA1蛋白的植物细胞的核苷酸序列中引入突变，使得DA1蛋白的LIM结构域或LIM类似结构域被失活，以及

[0014] 从该植物细胞再生该植物。

[0015] 本发明的另一个方面提供了一种植物细胞，该植物细胞包含编码具有失活的LIM结构域或LIM类似结构域的DA1蛋白的异源核酸。

[0016] 本发明的另一个方面提供了一种植物，该植物包含一种或多种植物细胞，该一种或多种植物细胞包含编码具有失活的LIM结构域或LIM类似结构域的DA1蛋白的异源核酸。

[0017] 该植物可显示相对于对照的提高的产量和增强的产量相关性状。附图说明

[0018] 图1显示了基于135个人LIM序列的分析获得的LIM结构域中的八个锌结合残基(1-8)的间隔和一致性。很少观察到的LIM结构域的保守序列和拓扑图(topography)的模式(<
10％)。

[0019] 图2显示了LIM结构域的锌配位拓扑图。紫色圆圈表示锌结合残基。半保守的脂肪族的/体积大的残基以绿色显示，具有不变的间隔的非保守的残基以红色表示。虚线黄色圆圈表示在间隔内的可能的可变数量的残基(X)。

[0020] 图3显示了体外免疫沉淀反应，其显示了da1lim8对野生型DA1的结合。在用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化和对GST和FLAG进行免疫印迹之前，将大肠杆菌(E.coli)表达的GST标签的诱饵蛋白与大肠杆菌表达的FLAG标签的捕获蛋白进行温育。FLAG-DA1和FLAG-da1lim8与GST-DA1和GST-da1lim8(泳道5、6、8、9)共纯化，但是不和阴性对照GST-GUS(泳道2、3)共纯化；表明DA1中的LIM结构域的突变不足以消除DA1蛋白之间的物理相互作用。

[0021] 图4显示了在Col背景下lim8突变对种子尺寸的作用。

[0022] 发明的具体实施方式

[0023] 本发明涉及植物中DA1蛋白的表达，在DA1蛋白中LIM或LIM类似结构域被打断或失活(本文中统称为LIM打断的DA1蛋白)。这在改变影响产量，诸如种子和器官尺寸的植物性状中是有用的。

[0024] DA1是一种植物泛素受体，已在Li等(2008)、Wang等(2012)和WO2009/047525中有详细描述。

[0025] DA1蛋白的特征是存在一个LIM结构域、一个LIM类似结构域、一个保守的C末端结构域和一个或多个UIM结构域。

[0026] LIM结构域包括两个锌指基序并可以具有氨基酸序列(SEQ ID NO:1)；

[0027] C(X)2C(X)16-23(H/C)(X)2/4(C/H/E)(X)2C(X)2C(X)14-21(C/H)(X)2/1/3(C/H/D/E)X[0028] 其中X是任意氨基酸，并且锌配位残基(Zn coordinating residues)以下划线标示出。

[0029] LIM结构域中的锌配位残基可以是C、H、D或E，优选为C。

[0030] 在一些优选的具体实施方式中，LIM结构域可以包括CXXC、HXXCXXCXXC和HxxC基序，其中X是任意氨基酸。比例，LIM结构域可以包括氨基酸序列(SEQ ID NO:2)；

[0031] C(X)2C(X)16-23(H)(X)2(C)(X)2C(X)2C(X)14-21H(X)2CX

[0032] 其中X是任意氨基酸，并且锌配位残基以下划线标示出。

[0033] 在一些具体实施方式中，LIM结构域可以包括AtDA1LIM结构域的氨基酸序列；

[0034] CAGCNMEIGHGRFLNCLNSLWHPECFRCYGCSQPISEYEFSTSGNYPFHKACY

[0035] (SEQ ID NO:3；锌配位残基以下划线标示出)

[0036] 包含DA1氨基酸序列的LIM结构域在内的其它LIM结构域如表1(虚线框)所示，例如SEQ ID NO:4(Si_GI-514815267.pro)的残基141至193、SEQ ID NO:5(Bd_GI-357157184.pro)的残基123至175、SEQ ID NO:6(Br_DA1b.pro)的残基155至207,SEQ ID NO:7(Br_DA1a.pro)的残基172至224、SEQ ID NO:8(At_GI-15221983.pro)的残基172至
224、SEQ ID NO:9(Tc_GI-508722773.pro)的残基117至169、SEQ ID NO:10(Gm_GI-
356564241.pro)的残基117至169、SEQ ID NO:11(Gm_GI-356552145.pro)的残基121至173、SEQ ID NO:12(Vv_GI-302142429.pro)的残基119至171、SEQ ID NO:13(Vv_GI-
359492104.pro)的残基122至174、SEQ ID NO:14(Sl_GI-460385048.pro)的残基125至177、SEQ ID NO:15(Os_GI-218197709.pro)的残基516至568、SEQ ID NO:16(Os_GI-
115466772.pro)的残基124至176、SEQ ID NO:17(Bd_GI-357160893.pro)的残基150至202、SEQ ID NO:18(Bd_GI-357164660.pro)的残基132至184、SEQ ID NO:19(Sb_GI-
242092232.pro)的残基124至176、SEQ ID NO:20(Zm_GI-212275448.pro)的残基147至199、SEQ ID NO:21(At_GI-240256211.pro)的残基190至242、SEQ ID NO:22(At_GI-
145360806.pro)的残基162至214、SEQ ID NO:23(At_GI-22326876.pro)的残基1240至
1291、SEQ ID NO:24(At_GI-30698242.pro)的残基80至122、SEQ ID NO:25(At_GI-
30698240.pro)的残基347至402、SEQ ID NO:26(At_GI-15240018.pro)的残基286至341或SEQ ID NO:27(At_GI-334188680.pro)的残基202至252。

[0037] LIM结构域序列可以使用标准的序列分析技术(如简单模块结构研究工具(Simple Modular Architecture Research Tool，SMART)；EMBL Heidelberg，DE)来鉴定。

[0038] LIM类似结构域包括两个锌指基序并可包括CXXC、HXXXXXXXCXXH和CxxC基序，其中，X是任意氨基酸。比例，LIM类似结构域可包括氨基酸序列(SEQ ID NO:28)；

[0039] CX2CX16-23 X7 X2 X7CX2CX19CX2C

[0040] 其中X是任意氨基酸，锌配位残基以实线下划线示出，并且推定的锌配位残基以点线下划线示出

[0041] 优选地，LIM类似结构域可以包括氨基酸序列(SEQ ID NO:29)；

[0042] CXVCX16-23 PFWX3Y PX X7CCSCERXEX5YX2LXDXRXLCXXC

[0043] 其中X是任意氨基酸，锌配位残基以实线下划线示出，并且推定的锌配位残基以点线下划线示出。

[0044] 更优选地，LIM类似结构域可以包括氨基酸序列(SEQ ID NO:30)；

[0045] C(D/E/Y/H)VCXX(F/K)(I/K/F)(P/S/缺失)(T/R/V/缺失)(N/T/缺失)XX(G/缺失)(L/I/M/G)(R/K/I)(E/G/K/T)(Y/F)(R/H/S/N/K)(A/C/E/I/N) PFWX(Q/E)(K/T/R)Y P(F/V/I/S/T) (E/D)XD(G/K/R/S/A)T(P/T/A)(R/K)CCSCER(M/L)E(P/S/H)X4YX2LXD(G/F/N)R(R/K/S/W)LC(L/R/V)(E/K)C

[0046] 其中X是任意氨基酸，锌配位残基以实线下划线示出，并且推定的锌配位残基以点线下划线示出。

[0047] 在一些具体实施方式中，LIM类似结构域可以包括AtDA1LIM类似结构域的氨基酸序列；

[0048] CDVCSHFIPTNHAGLIEYRA PFWVQKY PS EHDATPRCCSCERMEPRNTRY VELNDGRKLCLEC(SEQ ID NO:31)

[0049] 包括DA1氨基酸序列的LIM结构域在内的其它LIM类似结构域如表1(实线框)所示，例如SEQ ID NO:4(Si_GI-514815267.pro)的残基200至266、SEQ ID NO:5(Bd_GI-357157184.pro)的残基182到248、SEQ ID NO:6(Br_DA1b.pro)的残基214到280、SEQ ID NO:7(Br_DA1a.pro)的残基231到297、SEQ ID NO:8(At_GI-15221983.pro)的残基231到
297、SEQ ID NO:9(Tc_GI-508722773.pro)的残基176到242、SEQ ID NO:10(Gm_GI-
356564241.pro)的残基176到242、SEQ ID NO:11(Gm_GI-356552145.pro)的残基180到246、SEQ ID NO:12(Vv_GI-302142429.pro)的残基178到244、SEQ ID NO:13(Vv_GI-
359492104.pro)的残基181到247、SEQ ID NO:14(Sl_GI-460385048.pro)的残基184到250、SEQ ID NO:15(Os_GI-218197709.pro)的残基575到641、SEQ ID NO:16Os_GI-
115466772.pro)的残基183到149、SEQ ID NO:17(Bd_GI-357160893.pro)的残基209到275、SEQ ID NO:18(Bd_GI-357164660.pro)的残基191到257、SEQ ID NO:19(Sb_GI-
242092232.pro)的残基183到249、SEQ ID NO:20(Zm_GI-212275448.pro)的残基206到272、SEQ ID NO:21(At_GI-240256211.pro)的残基249到315、SEQ ID NO:22(At_GI-
145360806.pro)的残基221到287、SEQ ID NO:23(At_GI-22326876.pro)的残基1298到
1363、SEQ ID NO:24(At_GI-30698242.pro)的残基130到176、SEQ ID NO:25(At_GI-
30698240.pro)的残基406到465、SEQ ID NO:26(At_GI-15240018.pro)的残基345到404或SEQ ID NO:27(At_GI-334188680.pro)的残基256到319。

[0050] 其它DA1蛋白中的LIM类似结构域序列可以利用上述信息使用标准的序列分析技术(如简单模块结构研究工具(例如Simple Modular Architecture Research Tool，SMART)；EMBL Heidelberg，DE)来鉴定。

[0051] 除了LIM结构域和LIM类似结构域外，DA1蛋白可以进一步包括羧基末端区域，该羧基末端区域具有与下列序列至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％和至少98％氨基酸一致性的氨基酸序列：SEQ ID NO:4的残基198至504、SEQ ID NO:5的残基180到487、SEQ ID NO:6的残基212到514、SEQ ID NO:
7的残基229到532、SEQ ID NO:8的残基229到532、SEQ ID NO:9的残基174到487、SEQ ID NO:10的残基174到474、SEQ ID NO:11的残基178到478、SEQ ID NO:12的残基176到462、SEQ ID NO:13的残基179到482、SEQ ID NO:14的残基182到486、SEQ ID NO:15的残基573到878、SEQ ID NO:16的残基181到486、SEQ ID NO:17的残基207到512、SEQ ID NO:18的残基189到
491、SEQ ID NO:19的残基181到486、SEQ ID NO:20的残基204到508、SEQ ID NO:21的残基
247到553、SEQ ID NO:22的残基219到528、SEQ ID NO:23的残基1296到1613、SEQ ID NO:24的残基128到450、SEQ ID NO:25的残基404到702、SEQ ID NO:26的残基343到644或SEQ ID NO:27的残基256到587。

[0052] DA1蛋白的羧基末端区域可以包括金属肽酶活性中心基序HEMMH(SEQ ID NO:32)。

[0053] 该羧基末端区域可以进一步包括位于LIM结构域和HEMMH基序之间的EK(X)8R(X)4SEEQ(SEQ ID NO:33)或EK(X)8R(X)4SEQ(SEQ ID NO:34)基序。

[0054] 除了LIM结构域和保守的羧基末端区域之外，DA1蛋白可以包括UIM1结构域和UIM2结构域。UIM1和UIM2结构域可以位于DA1蛋白的N末端和LIM结构域之间。

[0055] UIM1结构域可以由SEQ ID NO:35的序列组成，并且UIM2结构域可以由SEQ ID NO:36的序列组成。

[0056] p---pLpbAl pb.Sbp-.pp p(SEQ ID NO:35)

[0057] p---pLpbAl pb.Sbp-spp p(SEQ ID NO:36)

[0058] 其中；

[0059] p是极性氨基酸残基，例如C、D、E、H、K、N、Q、R、S或T；

[0060] b是大的氨基酸残基，例如E、F、H、I、K、L、M、Q、R、W或Y；

[0061] s是小的氨基酸残基，例如A、C、D、G、N、P、S、T或V；

[0062] l是脂肪族的氨基酸残基，例如I、L或V；

[0063] .是缺失或是任意氨基酸，以及

[0064] -是任意氨基酸。

[0065] UIM1和UIM2结构域序列的进一步例子可以使用如本文所述的标准的序列分析技术(如简单模块结构研究工具(SMART)；EMBL Heidelberg，DE)来鉴定。

[0066] 在一些优选的具体实施方式中，DA1蛋白可以包括；

[0067] SEQ ID NO:1的LIM结构域，

[0068] SEQ ID NO:28的LIM类似结构域，

[0069] C末端区域，该C末端区域具有与SEQ ID NO:8的残基229至532至少20％序列一致性或具有与如上列举的SEQ NO 4至7或9至27中任意一个相同的区域，并包括EK(X)8R(X)4SEEQ或EK(X)8R(X)4SEQ基序以及HEMMH基序，

[0070] SEQ ID NO:35的UIM结构域，以及

[0071] SEQ ID NO:36的UIM结构域。

[0072] DA1蛋白可以包括如表1所示的植物DA1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:4至27)或可以是这些序列中一个的具有DA1活性的等位基因或变体。

[0073] 例如，DA1蛋白可以包括AtDA1、AtDAR1、AtDAR2、AtDAR3、AtDAR4、AtDAR5、AtDAR6、AtDAR7、BrDA1a、BrDA1b、BrDAR1、BrDAR2、BrDAR3-7、BrDAL1、BrDAL2、BrDAL3、OsDA1、OsDAR2、OsDAL3、OsDAL5、PpDAL1、PpDAL2、PpDAL3、PpDAL4、PpDAL5、PpDAL6、PpDAL7、PpDAL8、SmDAL1、SmDAL2或ZmDA1(ACR35367.1GI:238008664)的氨基酸序列，优选地包括AtDA1、AtDAR1BrDA1a、BrDA1b、OsDA1或ZmDA1的氨基酸序列或这些序列中的一个的等位基因或变体。

[0074] 在一些优选的具体实施方式中，DA1蛋白可以包括AtDA1(SEQ ID NO:8；AT1G19270；NP_173361.1GI:15221983)的氨基酸序列或可以是这个序列的具有DA1活性的等位基因或变体。

[0075] 在任何感兴趣的植物物种中，包含如上所述的特征和编码DA1核酸序列的其它DA1蛋白序列可以使用标准的序列分析技术工具来鉴定。

[0076] 感兴趣的植物物种中的DA1蛋白可以具有本文列出的DA1蛋白参考氨基酸序列的变体的氨基酸序列。

[0077] 一种DA1蛋白，它是参考植物DA1序列，如SEQ ID NO:4-27中任意一个的同源物或变体，可以包括具有与参考序列至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的序列一致性的氨基酸序列。

[0078] 出现在一个植物物种中的特定的氨基酸序列变体可以通过1个氨基酸、2、3、4、5-10、10-20 20-30、30-50或超过50个氨基酸的插入、增加、替换或缺失与本文列出的参考序列形成差异。

[0079] 在一些具体实施方式中，SEQ NO:4至27中任意一个的DA1多肽，其是AtDA1序列的变体，可以包括具有SEQ ID NO:3的序列的LIM结构域和具有SEQ ID NO:31的序列的LIM类似结构域。

[0080] 编码DA1蛋白的核酸可以包括在选自由NM_101785.3GI:42562170(AtDA1)；NM_001057237.1GI:115454202(OsDA1)；BT085014.1GI:238008663(ZmDA1)组成的组的数据库条目中选出的核苷酸序列，或可以是这些序列中的一个编码有活性的DA1蛋白的等位基因或变体。

[0081] 在一些优选的具体实施方式中，编码DA1蛋白的核酸可以包括AtDA1(NM_101785.3GI:42562170)、ZmDA1(BT085014.1GI:238008663)、OsDA1(NM_001057237.1GI:
115454202)的核苷酸序列，或可以是这些序列中的一个编码具有DA1活性的蛋白的等位基因或变体。

[0082] 一种核酸，其编码感兴趣的植物物种中的DA1蛋白，可以具有如本文列出的DA1蛋白参考核苷酸序列的变体的核苷酸序列。

[0083] DA1多肽和编码核酸可以使用常规的序列分析技术，在植物物种，尤其是诸如小麦、大麦、玉米、水稻和其它农业植物的作物中鉴定。

[0084] 例如，变体核苷酸序列可以是本文列出的参考DA1序列的同源物，并且可以通过核酸中一个或多个核苷酸的一个或多个增加、插入、缺失或替换，例如核酸中2、3、4、5-10、10-20、20-30、30-50或超过50个核苷酸的增加、插入、缺失或替换，导致编码的蛋白中的一个或多个氨基酸的增加、插入、缺失或替换，从而与参考DA1核苷酸序列形成差异。当然，也包括对核酸的不造成编码的氨基酸序列变化的改变。编码DA1蛋白的核酸可以包括具有与参考核酸序列至少20％或至少30％序列一致性的序列，优选地，至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的序列一致性。序列一致性如本文描述的。

[0085] 序列一致性根据算法GAP(Wisconsin Package，Accelerys，圣地亚哥，美国)进行通常地定义。GAP使用Needleman和Wunsch算法将两个完整的序列进行比对，最大化匹配(match)的数量并最小化空位(gap)的数量。通常，使用默认参数，空位产生罚分＝12且空位延伸罚分＝4。可以优选使用GAP，但是也可以使用其它算法，例如BLAST(其使用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:405-410中的方法)、FASTA(其使用Pearson和Lipmanwhich(1988)PNAS USA 85:2444-2448中的方法)或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman(1981)J.Mol Biol.147:195-197)或Altschul等(1990)supra中的TBLASTN程序，通常采用默认参数。特别地，可使用psi-Blast算法(Nucl.Acids Res.(1997)25 3389-3402)。

[0086] 可对本文描述的相关序列的全长进行序列比较。

[0087] 一种DA1核苷酸序列，其是本文列出的参考DA1核酸序列的变体，可以在严谨条件下与该参考核酸序列或其互补序列选择性地杂交。

[0088] 严谨条件包括，例如对于大约80-90％一致性的序列的杂交，在pH 7.2的0.25M Na2HPO4、6.5％SDS、10％硫酸葡聚糖中于42℃杂交过夜，并在0.1X SSC、0.1％SDS中55℃最终洗涤。对于大于大约90％一致性的序列的检测，合适的条件包括在pH 7.2的0.25M Na2HPO4、6.5％SDS、10％硫酸葡聚糖中于65℃杂交过夜，并在0.1X SSC、0.1％SDS中60℃最终洗涤。

[0089] 一种可替换的选择，其可能对植物核酸制备尤其适合，是5x SSPE溶液(最终0.9M NaCl、0.05M磷酸钠、0.005M EDTA pH 7.7)、5X Denhardt's溶液、0.5％SDS，在50℃或65℃过夜。根据需要，可以在0.2x SSC/0.1％SDS中，于65℃进行洗涤，或者于50-60℃在1x SSC/0.1％SDS中进行洗涤。

[0090] DA1蛋白和编码核酸，可以使用常规的序列分析技术和/或与本文列出的参考序列的比较，在植物物种，尤其是诸如小麦、大麦、玉米、水稻和其它农业植物的作物中鉴定。

[0091] DA1蛋白的LIM结构域、LIM类似结构域或LIM结构域和LIM类似结构域两者，根据本文描述的应用，可能被失活或打断(“LIM打断的DA1蛋白”)。

[0092] LIM结构域和LIM类似结构域已在上方详细描述，并且可以使用标准序列分析技术在任何DA1蛋白中被鉴定。

[0093] 具有失活的或打断的LIM结构域或LIM类似结构域的DA1蛋白可能显示出异常的肽酶活性，例如提高的或激活的肽酶活性。例如，LIM结构域或LIM类似结构域的失活或打断可能减少或阻止该结构域与DA1蛋白的C末端区域的相互作用，并且抑制DA1肽酶活性。

[0094] 在一些具体实施方式中，与野生型DA1蛋白相比，具有失活的或打断的LIM结构域或LIM类似结构域的DA1蛋白在泛素化后可能会显示出在植物细胞中降低的稳定性。

[0095] 打断的或失活的LIM结构域或LIM类似结构域可能不能与锌配位(coordinate)或形成锌指基序，以致该结构域的功能被消除，即打断的LIM或LIM类似结构域不能介导蛋白：蛋白相互作用。例如，打断的LIM结构域或LIM类似结构域可能不能和DA1蛋白的C末端区域进行分子内的相互作用以抑制肽酶活性。

[0096] 失活的或打断的LIM结构域或LIM类似结构域可以包括消除LIM或LIM类似结构域中的一个或多个锌指基序的序列改变或突变。

[0097] DA1蛋白的氨基酸序列可以通过相对于野生型氨基酸序列的一个或多个氨基酸的插入、替换或缺失改变或突变，以失活LIM结构域或LIM类似结构域。例如，可以相对于野生型氨基酸序列改变，例如缺失或替换1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸。在一些具体实施方式中，可以改变1至30、1至20或1至10个残基。

[0098] LIM结构域和LIM类似结构域中的单个氨基酸的替换已经足够引起LIM敲除表型。例如，LIM结构域可以通过LIM结构域中的锌配位残基或其它残基的突变来失活(McIntosh等(1998)Am J Human Genet 63 1651-1658l；Clough等(1999)Human mutation 14 459-
465；Hamlington等(2001)Human mutation 18 458-464；Taira等，Nature1994 372，677-9；
Agulnick等，Nature 1996 384，270-2)。LIM类似结构域也可以通过LIM类似结构域中的锌配位残基(即保守的Cys残基)或其它残基的突变来失活(Yang等The Plant Journal，(2010)，63，283–296)。

[0099] 合适的失活或打断突变优选地在LIM结构域或LIM类似结构域中或其附近。

[0100] 失活的或打断的LIM结构域或LIM类似结构域可以包括一个或多个锌配位残基、或推定的锌配位残基，例如CxxC或CXXH环境中的半胱氨酸或组氨酸残基的突变、和/或一个或多个非锌配位氨基酸残基的突变。

[0101] 失活的或打断的LIM结构域可以包括如上述SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的LIM结构域中第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个和第八个锌配位残基中的一个或多个的突变。例如，失活的或打断的LIM结构域可以包括CXXC基序中的一个或多个半胱氨酸残基或HXXC基序中的半胱氨酸或组氨酸残基处的突变，例如SEQ ID NO:3的位点1、4、22、25、28、31、49和52所示的半胱氨酸/组氨酸残基，以及上述SEQ ID NO 1和2中以下划线标示出的半胱氨酸/组氨酸残基。所述DA1蛋白的LIM结构域可以包括上方所示的DA1LIM结构域中的以下划线标示出的残基中的一个或多个的突变，优选地SEQ ID NO:4的DA1序列的C141、C144、H162、C165、C168、C171、H189和C192，SEQ ID NO:5的DA1序列的C123、C126、H144、C147、C150、C153、H171和C174，SEQ ID NO:6的DA1序列的C155、C158、H176、C179、C182、C185、H203和C206，SEQ ID NO:7的DA1序列的C172、C175、H193、C196、C199、C202、H220和C223，SEQ ID NO:8的AtDA1序列的C172、C175、H193、C196、C199、C202、H220和C223，SEQ ID NO:9的DA1序列的C117、C120、H138、C141、C144、C147、H165和C168，SEQ ID NO:10的DA1序列的C177、C180、H198、C201、C204、C207、H225和C228，SEQ ID NO:11的DA1序列的C121、C124、H142、C145、C148、C151、H169和C172，SEQ ID NO:12的DA1序列的C119、C122、H140、C143、C146、C149、H167和C170，SEQ ID NO:13的DA1序列的C122、C125、H143、C146、C149、C152、H170和C173，SEQ ID NO:14的DA1序列的C125、C128、H146、C149、C152、C155、H173和C176，SEQ ID NO:15的DA1序列的C516、C519、H537、C540、C543、C546、H564和C567，SEQ ID NO:16的DA1序列的C124、C127、H145、C148、C151、C154、H172和C175，SEQ ID NO:17的DA1序列的C150、C153、H171、C174、C177、C180、H198和C201，SEQ ID NO:18的DA1序列的C132、C135、H153、C156、C159、C162、H180和C183，SEQ ID NO:19的DA1序列的C124、C127、H145、C148、C151、C154、H172和C175，SEQ ID NO:20的DA1序列的C147、C150、H168、C172、C175、C178、H196和C199，SEQ ID NO:21的DA1序列的C190、C193、H211、C204、C207、C210、H228和C231，SEQ ID NO:22的DA1序列的C162、C165、H183、C186、C189、C192、H210和C213，SEQ ID NO:23的DA1序列的C1240、C1243、H1261、C1264、C1267、C1270、H1287和C1290，SEQ ID NO:25的DA1序列的C347、C350、H368、C371、C374、C377、H398和C401，SEQ ID NO:26的DA1序列的C286、C289、H307、C310、C313、C316、H337和C340，SEQ ID NO:27的DA1序列的C201、C204、H222、C225、C228、C231、H248和C251，或其它DA1蛋白序列中的等价的半胱氨酸残基。

[0102] 例如，LIM打断的DA1蛋白可以在这些位点中的一个或多个处具有C到Y、C到G或其它替换。

[0103] DA1蛋白的LIM结构域中的锌配位残基可以通过标准序列分析来鉴定。与SEQ ID NO:8中C172、C175、H193、C196、C199、C202、H220和C223等价的半胱氨酸和组氨酸残基是一个不同的DA1蛋白序列中的相同序列环境中的序列残基，并且可以通过标准序列分析来鉴定，如表1所示。

[0104] 失活的或打断的LIM结构域可以包括如上述SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示的LIM结构域中的一个或多个非锌配位残基的突变。非锌配位残基可以位于LIM结构域序列中的锌配位残基中的4个残基之内，或可以位于从锌配位残基起的4个或更多个残基。

[0105] 失活的或打断的LIM类似结构域可以包括如上述SEQ ID NO:28-31所示的LIM类似结构域中的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个和第八个锌配位残基或推定的锌配位残基中的一个或多个的突变。例如，失活的或打断的LIM类似结构域可以包括CXXC基序中的一个或多个半胱氨酸残基或CXXH基序中的半胱氨酸或组氨酸残基处的突变，例如SEQ ID NO:31的位点1、4、29、32、40、43、63或66所示的半胱氨酸/组氨酸残基以及上述SEQ ID NO 28至31中以下划线标示的半胱氨酸/组氨酸残基。LIM类似结构域中的三个推定的锌配位残基H252、C260、H263中的两个负责锌配位(即H252和C260；H252和H263；或C260和H263)。所述DA1蛋白的LIM类似结构域可以包括上方所示的AtDA1LIM类似结构域中的以下划线标示出的残基中的一个或多个的突变，优选地SEQ ID NO:8的AtDA1序列的C232、C235、H252、C260、H263、C271、C274、C294和/或C297，或其它DA1蛋白序列中的等价半胱氨酸残基。例如，LIM打断的DA1蛋白可以在这些位点中的一个或多个处具有C到Y、C到G或其它替换。

[0106] 与SEQ ID NO:8中的C232、C235、H252、C260、H263、C271、C274、C294和C297等价的半胱氨酸残基，是一个不同的DA1蛋白序列中的相同序列环境中的序列残基，并且可以通过标准序列分析来鉴定，如表1所示。

[0107] 失活的或打断的LIM类似结构域可以包括如上述SEQ ID NO:28至SEQ ID NO:31中所示的保守的半胱氨酸或组氨酸残基之外的LIM类似结构域中的一个或多个残基的突变。合适的残基可能位于LIM类似结构域序列中的保守的半胱氨酸或组氨酸残基的4个残基之内，或可能位于从保守的半胱氨酸或组氨酸残基起的4个或更多个残基。

[0108] 一些优选的突变包括LIM或LIM类似结构域中的锌配位残基的转变，诸如半胱氨酸或组氨酸变到诸如甘氨酸的中性氨基酸。

[0109] 打断锌指基序以及适合于消除DA1蛋白中的LIM或LIM类似功能的其它突变对本领域技术人员而言是显而易见的。不像DA1蛋白中的其它结构域中的突变，LIM结构域和LIM类似结构域突变破坏了植物细胞中在与DA1蛋白相互作用的配合体EOD1存在下的DA1蛋白的稳定。合适的LIM结构域和LIM类似结构域突变因此可以通过使用标准实验技术，通过测定在EOD1存在下突变体DA1蛋白的稳定性来鉴定。相对于野生型DA1降低的稳定性指示了打断LIM或LIM类似结构域的突变。

[0110] 本文描述的LIM打断的DA1蛋白可以包括保守的R残基，其位于DA1氨基酸序列中等价于拟南芥(A.thaliana)DA1的SEQ ID NO:8的位点358、玉米(Z.mays)DA1的SEQ ID NO:8的位点333、或其它DA1氨基酸序列的等价位点的位点处，例如表1的DA1序列(保守的R残基以箭头表示)。位于DA1氨基酸序列中等价于拟南芥DA1的SEQ ID NO:8的位点358或SEQ ID NO:20的玉米DA1的位点333的位点的保守的R残基，是位于DA1氨基酸序列内的对应于SEQ ID NO:20的R333和SEQ ID NO:8的R358的位点处的，即该保守的R残基相对于DA1蛋白中的其它基序或结构域是在相同的位点处。该保守的R残基位于LIM结构域和C末端区域的HEMMH(SEQ ID NO:32)肽酶基序之间，并且在DA1蛋白的相同序列环境中是完全保守的。该保守的R残基可以被包含在C末端区域内的EK(X)8R(X)4SEEQ(SEQ ID NO:33)或EK(X)8R(X)4SEQ(SEQ ID NO:34)中。

[0111] 本文的数据显示，LIM结构域和LIM类似结构域不介导DA1同源二聚化，并且LIM打断的DA1蛋白保持了与野生型DA1结合的能力。

[0112] 植物的一个或多个细胞中的LIM-打断的DA1蛋白的表达降低了细胞中的DA1活性，并增强了产量相关的植物性状，诸如种子和器官尺寸(例如参见Li等(2008)；WO2009/047525；Wang等2012)，因此提高了植物产量。表达LIM打断的DA1蛋白的植物可能具有da1-1或类似da1-1的表型。

[0113] 在一些具体实施方式中，可以从一个或多个植物细胞中的异源核酸表达LIM-打断的DA1蛋白。

[0114] LIM打断的DA1蛋白可以通过本领域中任何方便的技术和合适的技术在植物的一个或多个细胞中表达。

[0115] 编码LIM-打断的DA1蛋白的核酸可以在来自它最初分离时的同一种植物物种或变种或在不同的植物物种或变种(即异源植物)中重组地表达。

[0116] 提供的核酸可以是双链或单链、cDNA或基因组DNA、或RNA。该核酸根据设计，可以是全部地或部分地合成的。自然地，技术人员了解当核酸包括RNA时，涉及到所示的序列，应当解释为涉及以U替代T的RNA等价物。

[0117] “异源的”表明讨论中的基因/核苷酸序列或调节讨论中的基因/序列的序列，通过遗传工程或重组方法，即通过人为干涉被引入到所述植物的细胞中或其祖先中。对一个植物细胞是异源的核苷酸序列可以是非自然地出现在那种类型、变体或物种中(即外源的或异质的)，或可以是非自然地出现在细胞的亚细胞的或遗传环境中的序列，或可以是细胞中非自然地被调节的序列，即可操作地连接到非自然的调节元件上。

[0118] 编码LIM-打断的DA1蛋白的核酸可以可操作地连接到异源调节序列上，诸如启动子，例如如上所述的组成型的、诱导型的、组织特异性的或发育特异性的启动子。

[0119] 编码LIM-打断的DA1蛋白的核酸可以包含在核酸构建体或载体中。构建体或载体优选地是适合于植物细胞内的转染进入和/或表达。一种载体是、尤其是双链或单链的线性或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌双元载体，其可以或不可以自我转移或移动，并且其能通过整合到细胞的基因组或以染色体外的存在(例如具有复制起点的自主复制质粒)转化原核的或真核的宿主，尤其是植物宿主。

[0120] 特别地包括穿梭载体，使用穿梭载体意味着DNA媒介物能自然的或通过设计地在两个不同的有机体中复制，两种不同的有机体可以选自放线菌(Actinomyces)和相关的物种、细菌和真核(例如高等植物、哺乳动物、酵母或真菌)细胞。

[0121] 如上所述的包括核酸的构建体或载体不需要包含启动子或其它调节序列，尤其是当载体被用于将核酸引入细胞中从而重组进入基因组中时。

[0122] 构建体和载体可以进一步包括可选择的遗传标记，该可选择的遗传标记由给予可选择的表型，诸如抗生素抗性的基因组成，该抗生素诸如卡那霉素(kanamycin)、潮霉素(hygromycin)、膦丝菌素(spectinomycin)、氯磺隆(chlorsulfuron)、甲氨蝶呤(methotrexate)、庆大霉素(gentamycin)、奇霉素(spectinomycin)、咪唑啉酮
(imidazolinones)、草甘膦(glyphosate)和d-氨基酸(d-amino acids)。

[0123] 本领域技术人员能构建载体及设计方案用于例如在微生物的或植物的细胞中的重组基因表达。可以选择或构建合适的载体，其含有适合的调节序列，包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它合适的序列。进一步地细节参见，例如分子克隆：实验操作指南(Molecular Cloning:a Laboratory Manual)：第三版，Sambrook等，2001，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)和分子生物学技术(Protocols in Molecular Biology)，第二版，Ausubel等版本，John Wiley&Sons，1992。之前在植物上广泛成功使用的特定方法和载体在Bevan，Nucl.Acids Res.(1984)12,8711-8721)和Guerineau及Mullineaux(1993)植物转化和表达载体(Plant transformation and expression vectors)中描述。在：Plant Molecular Biology Labfax(Croy RRD ed)Oxford,BIOS Scientific Publishers,pp 121-148中被描述。

[0124] 当向细胞中引入选定的基因构建体时，必须要考虑一定的注意事项，本领域技术人员是清楚知道的。待插入的核酸应当组装在一个构建体中，该构建体含有有效的启动转录的调节元件。有可获得的方法将构建体转运入细胞中。一旦构建体位于细胞膜内，将会发生或不会发生与内源的染色体材料的整合。最终，优选地是目的细胞类型，使得细胞能再生成为完整植株。

[0125] 还适宜使用增强编码LIM或LIM类似-打断的DA1蛋白的核酸的表达的构建体和转化方法。单拷贝的基因在植物细胞的基因组中的整合可以有利于将沉默效应最小化。类似的，控制整合的复杂性也对这一点有益。对这一点特别值得关注的是使用例如根据EP 专利号EP1407000B1的最小基因表达构建体转化植物细胞，EP专利号EP1407000B1为了该目的通过引用并入本申请。

[0126] 可以使用本领域技术人员熟知的技术以向植物细胞中引入核酸构建体和载体，从而产生具有本文描述的特征的转基因植物。

[0127] 农杆菌转化是本领域技术人员广泛使用的转化植物种类的一种方法。产生稳定的、可育的转基因植物在本领域现在是常规的(参见例如Goriyama等(1988)Bio/Technology6,1072-1074；Zhang等(1988)Plant Cell Rep.7,379-384；Zhang等(1988)Theor Appl Genet 76,835-840；himamoto等(1989)Nature 338,274-276；Datta等(1990)Bio/Technology 8,736-740；Christou等(1991)Bio/Technology 9,957-962；Peng等(1991)International Rice Research Institute,Manila,Philippines 563-574；Cao等(1992)Plant Cell Rep.11,585-591；Li等(1993)Plant Cell Rep.12,250-255；Rathore等(1993)Plant Molecular Biology 21,871-884；Fromm等(1990)Bio/Technology 8,833-
839；Gordon-Kamm等(1990)Plant Cell 2,603-618；D'Halluin等(1992)Plant Cell 4,
1495-1505；Walters等(1992)Plant Molecular Biology 18,189-200；Koziel等(1993)Biotechnology 11,194-200；Vasil,I.K.(1994)Plant Molecular Biology 25,925-937；
Weeks等(1993)Plant Physiology 102,1077-1084；Somers等(1992)Bio/Technology 10,
1589-1594；WO92/14828；Nilsson,O.et al(1992)Transgenic Research 1,209-220)。

[0128] 当农杆菌转化效率低或无效时，例如在一些裸子植物物种中，可以优选其它的方法，诸如微弹或颗粒轰击(US 5100792、EP-A-444882、EP-A-434616)、电穿孔(EP 290395、WO 8706614)、显微注射(WO 92/09696、WO 94/00583、EP 331083、EP 175966、Green等(1987)植物组织和细胞培养(Plant Tissue and Cell Culture),Academic Press)、直接DNA摄取(DE 4005152、WO 9012096、US 4684611)、脂质体介导的DNA摄取(例如Freeman等Plant Cell Physiol.29:1353(1984))或涡旋振荡法(如Kindle,PNAS U.S.A.87:1228(1990d))。
植物细胞转化的物理方法在Oard,1991,Biotech.Adv.9:1-11中有综述。

[0129] 可替换地，可以采用不同技术的组合以增强转化步骤的效率，例如用农杆菌包被的微粒进行轰击(EP-A-486234)或微弹轰击以引起伤口，随后与农杆菌共培养(EP-A-486233)。

[0130] 在转化之后，如本领域常规的方法，可以从例如单个细胞、愈伤组织或叶盘来再生植株。几乎任何植物都能从植物的细胞、组织和器官中完整地再生。可获得的技术在Vasil等,植物的细胞培养和体细胞遗传学(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants),I,II和III卷,实验操作及其应用(Laboratory Procedures and Their Applications),Academic Press,1984，以及Weissbach和Weissbach,植物分子生物学方法(Methods for Plant Molecular Biology),Academic Press,1989中有综述。

[0131] 转化技术的特定选择将由其转化特定植物物种的效率以及采用特定选择方法论的操作本发明的人员的经验和偏好决定。将核酸引入植物细胞中的转化系统的特定选择不是本发明必须的或不是本发明的限制，植物再生技术的选择亦然。

[0132] 转化之后，表达LIM打断的DA1蛋白的植物细胞可以被鉴定和/或选择。可以从该植物细胞再生植株。

[0133] 在另一个具体实施方式中，可以在植物细胞的基因组内的核酸序列中引入突变，该核酸序列编码DA1蛋白，从而使得该核酸序列编码LIM-打断的DA1蛋白。例如，可以在编码DA1蛋白的LIM结构域或LIM类似结构域的序列中引入突变。然后可以从该突变的细胞中再生植株。

[0134] 编码DA1蛋白的核酸可以通过相对于野生型核苷酸序列的一个或多个核苷酸的插入、替换、或缺失进行突变。例如，相对于野生型核苷酸序列，可以改变1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸，从而失活编码的LIM或LIM类似结构域。这些突变失活或敲除LIM结构域和/或LIM类似结构域，并且优选地在编码LIM结构域或LIM类似结构域的核酸序列区域中。优选的突变不会引起移码。

[0135] 目的基因的突变、失活或敲除技术在本领域是公知的(参见例如体外突变技术(In Vitro Mutagenesis Protocols)；分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)(第二版)Ed Jeff Braman；Sambrook J等2012.分子克隆：实验室指南(第四版)CSH Press；分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)；Ed Ausubel等(2013)Wiley)。在一些具体实施方式中，可以通过基因组编辑技术向目标DA1编码序列中引入突变，例如RNA引导的核酸酶技术，诸如CRISPR、锌指核酸酶(ZFN)和反式激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)(Urnov,F.D.等Nature reviews.Genetics 11,636-646(2010)；Joung,J.K.等Nature reviews.Molecular cell biology 14,49-55(2013)；Gasiunas,G.等PNAS USA109,E2579-2586(2012)；Cong,L.等Science 339,819-823(2013))。

[0136] 如上所述的表达LIM打断的DA1蛋白(即具有失活的或打断的LIM结构域或LIM类似结构域的DA1蛋白)的植物可以有性地或无性地繁殖或种植以产生子代或后代。从一个或多个细胞再生的植株的子代或后代可以有性地或无性地繁殖或种植。该植株或其子代或后代可以和其它植物或它自己杂交。

[0137] 可以相对于对照检测该植株或其子代或后代的种子尺寸、器官尺寸和/或植物产量。

[0138] 表达本文描述的LIM-打断的DA1蛋白的植物相对于对照可以表现出增大的种子和/或器官尺寸，并且可以具有更高的植物产量。

[0139] 显性负性DA1等位基因对植物中的产量相关性状的作用在EOD1表达或活性缺陷的植物中被增强了(Li等(2008),WO2009/047525)。

[0140] LIM-打断的DA1蛋白可以如上所述的在EOD1表达和活性缺陷的植物中表达。

[0141] EOD1蛋白是植物E3泛素连接酶(Disch等(2006)、Li等(2008)、WO2009/047525)。EOD1蛋白包括一个EOD结构域。植物EOD结构域可以由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成；

[0142] (E/K)RCVICQ(L/M)(K/R/G/T/E)Y(K/R)(R/I)(G/K)(D/N/E)(R/Q/K/L)Q(I/M/V)(K/N/T/A)L(L/P)C(K/S)H(V/A)YH(S/T/G/A)(E/Q/D/S/G)C(I/G/T/V)(S/T)(K/R)WL(G/T/S)INK(V/I/A/K)CP(V/I)C(SEQ ID NO:37)

[0143] 在一些优选的具体实施方式中，EOD1蛋白可以包括EOD结构域，EOD结构域具有如下氨基酸序列：SEQ ID NO:38的残基150至192、SEQ ID NO:39的残基187至229、SEQ ID NO:40的残基192至234、SEQ ID NO:41的残基189至231、SEQ ID NO:42的残基194至236、SEQ ID NO:43的残基194至236、SEQ ID NO:44的残基194至236、SEQ ID NO:45的残基195至237、SEQ ID NO:46的残基189至231、SEQ ID NO:47的残基195至237、SEQ ID NO:48的残基195至237、SEQ ID NO:49的残基195至237、SEQ ID NO:50的残基218至260、SEQ ID NO:51的残基196至
238、SEQ ID NO:52的残基197至239、或SEQ ID NO:53的残基193至235。

[0144] 进一步适合的EOD结构域可以使用本文描述的标准序列分析技术(如简单模块结构研究工具(SMART)；EMBL Heidelberg，DE)来鉴定。

[0145] EOD1蛋白可以包括如表2中列出的SEQ ID NO 38至53中的任意一个的氨基酸序列，该EOD1蛋白的表达或活性在表达LIM打断的DA1蛋白的植物细胞中是降低的。在一些优选的具体实施方式中，EOD1蛋白可包括SEQ ID NO:45(AtEOD1)或SEQ ID NO:50或51(OsEOD1)的氨基酸序列，或可以是保持E3泛素连接酶活性的这种序列的变体。

[0146] 一种EOD1蛋白，其是SEQ ID NO:38至53中任意一个的变体或其它参考EOD1序列，可以包括具有与参考EOD1序列至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的序列一致性的氨基酸序列。

[0147] 一种EOD蛋白，其是SEQ ID NO:38至53中任意一个的变体，可以进一步包括一个具有SEQ ID NO:37的序列的EOD结构域。适合的序列的例子如上方列出的。

[0148] 编码EOD1蛋白的核酸可以包括选自由XM_002299911.1GI:224059639(PtEOD1)；XM_002531864.1GI:255582235(RcEOD1)；XM_002279758.2GI:359487285(VvEOD1)；XM_
003542806.1GI:356548934(GmEOD1a)；XM_003540482.1GI:356544175(GmEOD1b)；XM_
002468372.1GI:242042044(SbEOD1)；NM_001147247.1GI:226496788(ZmEOD1)；or NP_
001030922.1GI:79316205(AtEOD1；At3g63530)组成的组中的数据库条目中列出的核苷酸序列，或可以是这些序列中的一个的变体。

[0149] 在一些优选的具体实施方式中，编码植物中的EOD1蛋白的核苷酸序列可以编码AtEOD1或OsEOD1，或可以是它们的变体。

[0150] EOD1蛋白和编码核酸，其表达或活性可以如本文描述的被降低，可以通过常规的序列分析技术很容易地在任何感兴趣的植物物种中被鉴定，尤其是在作物植物，诸如小麦、大麦、玉米、水稻和其它农业作物中被鉴定。

[0151] 降低EOD1表达或活性的合适的方法是本领域中公知的。

[0152] 例如，EOD1的活性可以通过引入突变来降低，优选地消除，该突变诸如在对应于SEQ ID NO:45的位点44的位点上的缺失、插入或替换，例如，A到T的替换。EOD1蛋白序列中与SEQ ID NO：45的位点44等价的位点，可以使用标准序列分析和比对工具进行鉴定。

[0153] 在一些具体实施方式中，可以通过在所述植物的细胞内表达编码或转录抑制子核酸的异源核酸从而降低植物细胞中的EOD1蛋白的表达，抑制子核酸例如抑制子RNA或RNAi分子。抑制子RNA抑制表达LIM-打断的DA1的植物细胞中EOD1蛋白的表达。

[0154] 合适的RNAi序列可以对应于本文列出的参考EOD1核苷酸序列的片段，或可以是它的变体。

[0155] 在另一个具体实施方式中，可以在植物细胞的基因组内的核酸序列中引入突变，该核酸序列编码DA1蛋白，从而使得该核酸序列编码LIM-打断的DA1蛋白。然后可以从突变的细胞中再生植株。

[0156] 编码EOD1的核酸可以通过相对于野生型核苷酸序列的一个或多个核苷酸的插入、替换或缺失进行突变。例如，可以相对于野生型核苷酸序列改变1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。

[0157] LIM-打断的DA1蛋白如本文描述的在任何植物物种中表达。根据本文描述的发明的任何方面使用的适合的植物的例子，包括单子叶的和双子叶的高等植物，例如农业的或作物植物，诸如选自由紫草(Lithospermum erythrorhizon)、红豆杉属(Taxus spp)、烟草、葫芦科植物、胡萝卜、蔬菜芸苔属、瓜类植物、辣椒、葡萄藤、莴苣、草莓、油料种子芸苔属、糖用甜菜、小麦、大麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、高粱、向日葵、番茄、土豆、胡椒、菊属、石竹属、亚麻籽、大麻和黑麦组成的组中的植物。

[0158] 本发明的另一个方面提供了一种表达如上所述的LIM打断的DA1蛋白的转基因植物。

[0159] 该植物可以包括编码LIM-打断的DA1蛋白的外源核酸。

[0160] 相对于不表达LIM-打断的DA1蛋白的对照植物，该植物中的一个或多个产量相关性状可以在该植物中改善、提高或增强。产量相关性状可以包括寿命、器官尺寸和种子尺寸。

[0161] 相对于对照野生型植物(即不表达LIM-打断的DA1蛋白的相同植物)，该植物可以具有提高的产量。例如，相对于对照植物，每单位面积的种子质量(如谷粒)或其它植物产品提高了。

[0162] 可以通过上述描述的方法产生合适的植物。

[0163] 除了通过本文描述的方法产生的植物外，本发明还包含这样的植物、种子、自交或杂交子代或后代的任何克隆，以及这些中任意一个的可以用于有性或无性再生或繁殖的任何部分或繁殖体，例如插枝和种子。本发明还包含一种植物，其是这样一种植物、或该植物的任何部分或繁殖体、子代、克隆或后代经有性的或无性的繁殖的子代、克隆或后代。

[0164] 根据本发明的植物可以是在一个或多个特性上不是纯育的。可将一些植物变种排除在外，特别是根据植物育种者权(Plant Breeders Rights)可注册的植物变种。

[0165] 本文使用的“和/或”应理解为确切的公开了两个特定的特征或组成中的每一个与另一个一起或缺失另一个。例如“A和/或B”应理解为确切的公开了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个，就如每一个都单独的在此列出。

[0166] 除非内容有另外的描述，上述列出的特征的描述和定义不限于本发明中任何特定方面或具体实施方式，并且同样地适用于所描述的所有方面和具体实施方式。

[0167] 本说明书中提到的所有文件，由于所有的目的，它们的全文通过引用并入本申请。

[0168] 本说明书中提到的所有数据库条目的内容，由于所有的目的，它们的整体也通过引用并入本申请。这包括在本申请的提交日时的任何序列的版本。

[0169] 实验

[0170] 1、方法

[0171] 1.1共免疫沉淀分析

[0172] 这些研究的所有诱饵蛋白是GST-标记的，并且它们的下拉使用谷胱甘肽琼脂糖珠(GE Life Science 17-0756-01)。

[0173] 在带有合适抗生素的10ml LB的烧瓶中接种有合适表达构建体的BL21甘油贮存液，并让其在37℃和220rpm下生长过夜。第二天早晨，该10ml预培养物被用来接种100ml LB烧瓶(以1：100的比例)，并且这个培养物在37℃、220rpm温育两小时。将该烧瓶从保温箱中移出，添加IPTG(Melford MB1008)至终浓度为1mM，然后在28℃(以及220rpm)下继续再温育三小时。

[0174] 在该生长期之后，该培养物在4500xg离心10分钟，弃上清，并将沉淀在4℃重悬于2.5ml TGH缓冲液(50mM HEPES(pH7.5)，150mM NaCl，1％Triton-X-100，10％甘油，1mM DTT，1片完全无EDTA的蛋白酶抑制剂药片(每50ml)(Roche 11873580001))中。然后将该细菌悬浮液进行超声(在冰上)，四次十秒的脉冲以20秒的间隔隔开，然后以12 000x g离心20分钟以沉淀细胞碎片。然后将清澈的超声物储存在冰上，同时据生产商说明书准备50％洗涤的谷胱甘肽琼脂糖珠(GE Life Sciences 17-0756-01)悬浮液。随后将20μl的50％谷胱甘肽琼脂糖珠悬浮液与2.5ml来自诱饵蛋白(GST-标记的)表达细胞的蛋白提取物和2.5ml捕获蛋白(HA-/FLAG-/HIS-标记的)表达细胞的蛋白提取物结合。将该混合物在旋转轮(rotating wheel)上于4℃温育30分钟，然后用过量的(500μl)TGH缓冲液(根据生产商说明书)洗涤谷胱甘肽琼脂糖珠五次。洗涤之后，用35μl GST洗脱缓冲液(50mM TRIS-甘氨酸(pH8.0)，10mM还原型谷胱甘肽)在4℃超过30分钟来洗脱蛋白，然后用蛋白质印记分析进行分析。

[0175] 1.2蛋白质印记法

[0176] 将20％、12％或4-20％预制SDS-聚丙烯酰胺凝胶(RunBlue NXG02012、NXG01227、NXG42027)浸没在凝胶槽(Atto Japan AE6450)中的RunBlue SDS-TRIS-tricine运行缓冲液(RunBlue NXB0500)中。将样品和2x Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad Ltd 161-0737)混合，在恒温器(heat block)上96℃放置10分钟，然后以10μl或20μl等份上样到凝胶的漂洗净的孔中。凝胶与3ul小份的10至250kDa的PageRuler Plus预染蛋白梯度(Fermentas 26619)在160V运行60分钟。若合适，凝胶在此阶段染色。

[0177] 使用Bio-Rad Mini Cell 试剂盒(Bio-Rad 170-3836)进行转膜。将凝胶从它们的玻璃盒中移出，并放在一块海绵(来自Bio-Rad Mini Cell试剂盒)、两
张色谱纸(VWR WHAT3030-917)和一张甲醇洗涤的PVDF膜(Roche
Diagnostics03010040001)的最上方。将凝胶和膜之间的气泡移除，然后将另两张Whatman纸和一块海绵放到凝胶上。这个封闭在一个凝胶支架盒(来自Bio-Rad Mini
Cell试剂盒)，进入转移缓冲液(25mM TRIS，192mM甘氨酸，10％(v/v)甲醇)中，并在90V于4℃运行70分钟。

[0178] 转移之后，将膜于室温在50ml PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.3)洗涤10分钟，然后在50ml封闭液(5％(w/v)奶粉，0.1％(v/v)吐温-20)中于室温摇动一小时或于4℃摇动过夜。将一抗用封闭液稀释到它们的合适浓度(参见表2.9)，并在室温下和膜(10ml每张膜，伴随轻柔的摇动)一起温育一小时，然后用50ml PBST(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，0.1％(v/v)吐温-20，pH 7.3)洗涤五次。如果需要二抗，需要重复染色和洗涤步骤。

[0179] 洗涤的膜用镊子夹取，并小心地将一个角上放在蓝卷纸上吸干以除去过量的水分。然后将膜放在皮氏培养皿中，并用过氧化物酶底物(SuperSignal West FEMTO Max.Sensitivity substrate(Fisher Scientific PN34095))以每张膜800μl的比例进行处理。将膜放在这个底物中五分钟，如前所述吸干并放在X-射线盒中，位于一片X-射线胶片下(Fuji Film X-RAY 18x24cm–(FujiFilm 497772RXNO))。使用Konica SRX-101桌面X-射线胶片显影仪(Konica 106931659)对X-射线胶片进行显影。

[0180] 在分析之后，如有需要，将膜在50ml PBST中洗涤，并用10ml丽春红S溶液(Ponceau S solution，Sigma-Aldrich P7170)染色30分钟，之后在50ml PBST中单次洗涤并在室温下干燥。

[0181] 1.3种子尺寸测定

[0182] 使用种子面积作为种子尺寸的替代性测量(proxy measurement)。将种子分散在皮氏培养皿中，并使用桌面扫描仪(Hewlett Packard Scanjet 4370)以高分辨率(<3600dpi)对白色背景进行扫描。图像存储为黑色和白色的8位(8-bit)图像，并使用ImageJ 软件对其进行图像分析。ImageJ是公开的，并且设定阈值(Ctrl+Shift+T)以使所有种子是完全红的，然后用“矩形选区”工具选择所有的种子，并选择分析选项(分析>分析颗粒)。在对话框中，设定尺寸阈值以排除较小的(非种子)结构以及打的结构，例如种子的聚集体。种子场合和宽度通过对每颗种子拟合椭圆来计算(分析>设定测量>拟合椭圆)。当选择该选项时，分析输出对应于椭圆的长度和宽度的“主要”和“次要”值，代表种子最长和最宽的部分。
[J1]

[0183] 2、结果

[0184] LIM结构域(Prosite:PS00478)是串连的锌指结构域，充当蛋白：蛋白相互作用的平台(图1)。

[0185] 基于网络的结构域预测软件(Pfam、SMART、PROSITE)预测DA1(AtDA1170aa-230aa)中存在单个LIM结构域，其被认为参与介导推定的DA1-DA1同源二聚化(Li等，2008)。

[0186] 然而意外的是，具有突变的LIM结构域的DA1变体(此后称为‘DA1lim8’)诱导了显性负性的器官尺寸表型，等价于在拟南芥中，当向Col背景中引入da-1突变(图4)。这表明DA1的LIM结构域并不参与DA1同源二聚化。

[0187] 4个关键锌配位氨基酸(C172、C175、C199和C202)被改变成甘氨酸以产生DA1lim8突变体。这些突变被预测会消除锌指基序，锌指基序是由于通过半胱氨酸(C)残基模式的锌配位。

[0188] 重组GST-标记的诱饵蛋白与重组FLAG-标记的捕获蛋白温育，然后在谷胱甘肽琼脂糖珠上沉淀GST-标签的诱饵蛋白.纯化的蛋白之后被洗脱，并进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。使用β-葡萄糖醛酸酶(GUS)形成同源四聚体的能力设计GST-GUS对FLAG-GUS的阳性对照。还使用了两组阴性对照；他们是GST-GUS对FLAG-捕获蛋白和GST-诱饵蛋白对FLAG-GUS。

[0189] 这些体外共免疫沉淀实验表明，Da1lim8能够结合野生型DA1蛋白(图3)，并且在Col背景下的lim8种子尺寸表型与da1-1中的等价(图4)。

[0190] 使用两步结构域预测分析进一步分析DA1蛋白的序列。第一，执行起始同源性检测筛选(HHpred)以鉴定具有相似结构域和结构的蛋白。然后进行结构域预测筛选(Pfam、SMART、PROSITE)，其用这些蛋白作为作为查询序列。这个策略揭示了AtDA1的230aa-297aa区域共享了其它蛋白(包括鼠LIM/同源盒蛋白LHX3)的重要结构同源性。这个新的推断的结构域被称为LIM类似结构域。

[0191] 由于与典型LIM模式显著的序列差异，DA1的LIM类似结构域中假定的第二对锌配位氨基酸不是通过经典的结构域预测软件(Pfam、SMART、PROSITE)检测到的。通过考虑AtDA1序列中位点261aa-264aa处的CxxH配对，很明显第一锌指结构域中和指内区域(inter-finger region)中的插入引起了序列与LIM一致性模式的明显偏离。这导致了24aa的指长度和7aa的指内区域(而不是分别为16-23aa和2aa)。

[0192] 因此LIM类似结构域代表了DA1蛋白内的含第二锌指的LIM结构域。

[0193]

[0194]

[0195]

[0196]

[0197]

[0198]

[0199]

[0200]

[0201]

[0202]

[0203] 表1 DA1蛋白的比对(SEQ ID NO:4至27)

[0204]

[0205]

[0206] 表2(SEQ ID NO38至53)

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