技术领域
[0001] 本
发明涉及农业技术和
生物技术。具体是一种烟草青枯病人工发病的快捷方法背景技术
[0002] 烟草青枯病在全球普遍发生，是烟草生产的毁灭性病害，许多与防病控害有关的
基础研究和重大理论问题研究均离不开接种病菌人工发病这基本手段，特别是该病害的病原菌（Ralstonia solanacearum）是当前国际上研究
植物病原细菌致病机制的模式系统之一，对该病原菌所开展的有关研究，要频繁经过致病性检测的环节，即要实施人工接种发病的工作。高节奏的当代工作往往需要所用的手段方法能高效率、高通量、高准确度，因而高效快捷的人工发病方法是许多研究者的共同需求。烟草青枯病的人工发病至今已有不少的技术方法，归结起来可包括
土壤伤根接种、茎基部注射接种、叶腋注射接种、和叶面注射接种等。虽然这些方法技术非常成熟有效并广为应用，但应用起来或多或少存在如下一些不足：1）试验周期较长，这些方法技术的实际应用中，至今通常采用较大的烟苗，由于烟草前期生长缓慢，培育准备烟苗需要耗费较长的时期，一般需要2个月以上，因而导致试验周期较长。2）培育长况良好的烟苗，往往需要有装备良好的育苗
温室。3）技术要求较高，如采取注射接种，一般要求逐株逐点定量注射，往往需要操作者技术过关和细心操作，实施起来工作效率偏低。4）一些与发病有关的局部条件控制有难度，如接种后要求创造利于发病的湿度，这在一些普通的实验室装备条件下仍有较大难度；采用土壤伤根接种容易受土壤中其它
微生物的影响，虽然一些小试验可以采用灭菌或消毒过的土壤来育苗，但在育苗期间，当前一般实验室仍难以提供全程无菌化的条件，土壤中的微生物群体仍然无法控制。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种烟草青枯病人工发病的快捷方法。
[0004] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0005] 一种烟草青枯病人工发病的快捷方法，主要内容是利用青枯病菌可侵染烟草引起细胞组织
坏死的特性，在培养皿内接种不带土的幼小烟苗，导致烟苗快速表现清晰的发病症状。人工发病方法的步骤如下：
[0006] 1.烟草
幼苗培育准备：用普通的浅盘类器具盛装肥
力较好且疏松的土壤，用常规方法在室内培育烟苗，长至3～4片小
叶片后备用。
[0007] 2.接种用细菌液的培养准备：将烟草青枯病菌移植到NA等一般细菌培养基平板上，NA培养基的成分：
牛肉膏3克，蛋白胨10克，琼脂18克，
蔗糖10克，
水1000ml，30℃培养48小时后，用无菌水将培养基平板上生长的细菌菌落洗涤悬浮，并将此细菌悬浮液转入干净的容器内，用无菌水调配成2.5×108cfu/ml的细菌液，作接种用细菌液。
[0008] 3.烟草幼苗接种前处置：取步骤1育好的适用幼苗，接种前先浇水湿润
软化育苗土壤，以便于拔苗。取出干净的培养皿和
剪刀；选取有3～4片小叶片的幼苗，用手轻轻拔起并转到清水中轻轻晃动，洗脱幼苗根系上的土壤，用干净的剪刀剪除幼苗的部分根系；将剪根后的幼苗侧放于培养皿内，根系靠培养皿边放置，然后将培养皿转到普通桌面或培养架面上，倾斜放置，有根系的一边处于倾斜面的最低处。
[0009] 4.接种青枯病菌：取步骤2备好的接种用细菌液，轻轻注入步骤3操作完备的带苗培养皿内，以液面浸没幼苗的根系和茎基部为宜，盖上培养皿盖。
[0010] 5.接种后处置：步骤4操作完备后，接种后幼苗材料直接留在原地培育观察，培育
温度维持在25～30℃。接种后至试验完毕整个过程无需加湿或浇水等其它处置，注意避开直射阳光照晒，维持日常散射光即可。
[0011] 接种结果导致幼苗出现坏死、蔫垂症状，最后整个幼苗都坏死腐烂。通常情况下，接种后4天可见明显坏死表现，6～7天后全株腐烂。
[0012] 本发明的优点是：
[0013] 1）接种体系微型化，主要表现在用微小的幼苗，在微小的空间内接种，耗用很短的试验周期。
[0014] 2）技术体系过程简单，操作方便，技术难度小，工作效率高。
[0015] 3）全程在普通实验室内完成，无需配套温室装备，发病局部条件容易控制，受干扰小，容易实现技术方法标准化。
附图说明
[0016] 图1是本发明在普通实验室内培育的烟草幼苗示意图。
[0017] 图中，A部是用普通搪瓷方盘培育；B部是用培养皿培育，已适合使用。
[0018] 图2示意在培养架面上放置的接种后的幼苗及接种用培养皿的倾斜放置状态。
[0019] 图3是本发明的同一组幼苗接种青枯病菌发病表现过程的样例1。
[0020] 图中，A～D部是接种青枯病菌，其中A是接种后的当时，B是接种4天后，C是接种5天后，D是接种6天后。E和F是接种清水空白对照，其中E部与A部同期，F部与D部同期。
[0021] 图4是本发明的同一组幼苗接种青枯病菌发病表现过程的样例2。
[0022] 图中，A～D部是接种青枯病菌，其中A是接种后的当时，B是接种4天后，C是接种5天后，D是接种6天后。E和F是接种清水空白对照，其中E部与A部同期，F部与D部同期。
具体实施方式
[0023] 下面结合附图与
实施例对本发明作进一步描述。
[0024] 本发明的烟苗培育和接种发病全程均在普通实验室内实施，实验室只需要具备窗口向南，透光良好，并配备普通
空调即行。按常规方法在室内近窗口旁培育烟苗。接种所采用的是长出3～4片小叶片的微小烟苗，如图1所示，通常需要培育3～4周。
[0025] 为了消除土壤微生物的影响，设计为采用无土状态的幼苗进行接种，这需要将幼苗拔起并洗去土壤；拔苗时造成的断根伤口可成为青枯病菌的入侵途径，为了保证统一形成伤口，对幼苗统一剪除部分根系。
[0026] 接种操作在培养皿内实施，无需注射方式将病菌导入烟草植株，只需要将青枯病菌简单地加在有伤口的烟苗根系即行，细菌自行从伤口入侵并在植株体内转移和致病。
[0027] 接种后烟苗保留在培养皿内，置于25～30℃温度下培育，培养皿内具备适合发病的稳定的湿度状态，无需在实验室中额外创建提供适合发病的湿度条件。
[0028] 发病通常先在根系和幼茎基部先出现，表现为水渍状变褐坏死，如图3和图4的B部所示，并逐步向上和向叶片扩展；组织坏死后逐步腐烂软化并变透明，小苗蔫垂，最后全株坏死腐烂，如图3和图4的C和D部所示。
[0029] 通常情况下，接种后4天可见明显坏死表现，6～7天后全株腐烂。青枯病菌菌株不同，接种造成发病的快慢或程度有差异。接种细菌液的细菌浓度和接种后环境的温度对发病的轻重或快慢有影响。结果可以用株发病率或50%烟株发病所耗费的时间等指标来表示病情轻重或病情发展的快慢。
[0030] 实施例1
[0031] 一种烟草青枯病人工发病的快捷方法，在烟草品种
云烟87微小幼苗上接种烟草青枯病菌菌株Rso-1，按如下步骤操作：
[0032] 1.烟草幼苗培育准备：用普通的搪瓷方盘盛装肥力较好且疏松的土壤，播撒烟草品种云烟87
种子，在室内窗口边培育烟苗，常规管理，待幼苗长出如图1B部所示的3～4片小叶片后备用。
[0033] 2.接种用细菌液的培养准备：将本实施例用菌株移植到NA培养基平板上，（NA培养基的成分：牛肉膏3克，蛋白胨10克，琼脂18克，蔗糖10克，水1000ml），30℃培养48小时后，用无菌水将培养基平板上生长的细菌菌落洗涤悬浮，并将此细菌悬浮液转入干净的三
角瓶内，用无菌水调配成2.5×108cfu/ml（菌落形成单位/ml）的细菌液，作接种用细菌液。
[0034] 3.烟草幼苗接种前处置：本步骤主要是拔起烟苗、去泥并作伤根处置，操作均在育苗的普通室内实施；具体操作如下：在拔苗前0.5～1小时将培育烟苗的土壤浇水充分湿润，使土壤松软便于拔起烟苗；取出日常使用的灭菌后的9cm培养皿和干净的剪刀备用；取2个干净塑料盆盛满清水，置于拔苗操作的旁边备洗苗用；选取有3～4片小叶片的幼苗，用手轻轻拔起，转到旁边的清水盆中轻轻晃动，洗脱幼苗根系所带的土壤，接着用剪刀将幼苗根系前端的三分之一剪除；将剪根后的幼苗侧放于培养皿内，根系靠培养皿边放置；并将培养皿转到普通桌面或培养架面上，倾斜放置，有根系的一边处于倾斜面的最低处，如图3和图4的A部所示。
[0035] 4.接种青枯病菌：取步骤2备好的接种用细菌液10ml，轻轻注入步骤3操作完备的带苗培养皿内，液面浸没幼苗的根系和茎基部，如图3和图4的A部所示，盖上培养皿盖。
[0036] 5.接种后处置：步骤4操作完备后，接种的烟苗材料状态如图2所示，直接留在原地培育观察，培育温度维持在26～29℃。接种后至试验完毕整个过程无需加湿或浇水等其它处置，注意避开直射阳光照晒，维持日常的散射光即可。
[0037] 接种结果导致如同图3和图4一样清晰的幼苗坏死、蔫垂和腐烂症状；接种4天后60%幼苗表现出明显的坏死症状。
[0038] 实施例2
[0039] 一种烟草青枯病人工发病的快捷方法，在烟草品种云烟87微小幼苗上接种烟草青枯病菌菌株Rso-2，按实施例1的步骤1至步骤5操作实施。
[0040] 接种结果导致如同图3和图4一样清晰的幼苗坏死、蔫垂和腐烂症状；接种4天后80%幼苗表现出明显的坏死症状。
[0041] 实施例3
[0042] 一种烟草青枯病人工发病的快捷方法，在烟草品种云烟87微小幼苗上接种烟草青枯病菌菌株Rso-3，按实施例1的步骤1至步骤5操作实施。
[0043] 接种结果导致如同图3和图4一样清晰的幼苗坏死、蔫垂和腐烂症状；接种4天后100%幼苗表现出明显的坏死症状。
[0044] 实施例4
[0045] 一种烟草青枯病人工发病的快捷方法，在烟草品种云烟87微小幼苗上接种烟草青枯病菌菌株Rso-4，按实施例1的步骤1至步骤5操作实施。
[0046] 接种结果导致如同图3和图4一样清晰的幼苗坏死、蔫垂和腐烂症状；接种4天后80%幼苗表现出明显的坏死症状。
