磁性纳米粒子和产生自由基的酶的介孔催化剂及其使用方法
阅读：686发布：2024-01-05
专利汇可以提供磁性纳米粒子和产生自由基的酶的介孔催化剂及其使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种包括 磁性 纳米粒子 的介孔聚集物和产生自由基的酶（即，结合酶的介孔聚集物）的组合物，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有介孔，在所述介孔中嵌入所述产生自由基的酶。本 申请 还描述了用于合成结合酶的介孔聚集物的方法。本申请还描述了使用所述结合酶的介孔聚集物将木质素解聚、从 水 中消除芳香族污染物、以及通过自由基反应使可聚合的 单体 聚合的工艺。，下面是磁性纳米粒子和产生自由基的酶的介孔催化剂及其使用方法专利的具体信息内容。
1.一种组合物，所述组合物包括磁性纳米粒子的介孔聚集物和产生自由基的酶，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有介孔，在所述介孔中嵌入所述产生自由基的酶。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有氧化铁组分。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有的磁性纳米粒子的粒径分布为其中至少90%的磁性纳米粒子具有至少3nm和至多30nm的粒径，以及聚集粒子的粒径分布为其中至少90%的所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有至少10nm和至多500nm的粒径。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有至少
10emu/g的饱和磁化强度。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有至多
5emu/g的剩余磁化强度。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述产生自由基的酶以至多100%的饱和容量包含在所述磁性纳米粒子的介孔聚集物中。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述产生自由基的酶选自与作为受体的过氧化物作用的EC1.11氧化还原酶和与作为供体的联苯酚及其相关物质作用的EC1.10氧化还原酶及其组合。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述产生自由基的酶包括过氧化物酶。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述过氧化物酶是II类过氧化物酶。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述II类过氧化物酶是II类微生物过氧化物酶。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述II类微生物过氧化物酶选自木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、和通用过氧化物酶。
12.根据权利要求8所述的组合物，其中所述过氧化物酶是III类过氧化物酶。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述III类过氧化物酶选自辣根过氧化物酶、花生过氧化物酶、大豆过氧化物酶、芜菁过氧化物酶、烟草过氧化物酶、番茄过氧化物酶、和大麦过氧化物酶。
14.根据权利要求7所述的组合物，其中所述产生自由基的酶是漆酶。
15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述介孔的特征为孔径分布为其中具有孔径至少2nm和至多20nm的孔形成了至少90%的孔体积。
16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述产生自由基的酶包括EC1.1.3酶和过氧化物酶。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述EC1.1.3酶是葡萄糖氧化酶EC1.1.3.4。
18.根据权利要求16所述的组合物，其中所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
19.根据权利要求1所述的组合物，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物和产生自由基的酶的表面涂覆金。
20.根据权利要求1所述的组合物，其中位于铁磁性亚微粒子表面的、所述磁性纳米粒子的介孔聚集物和产生自由基的酶具有至少20纳米的粒径。
21.一种组合物，所述组合物包括与产生自由基的酶结合的磁性纳米粒子，其中与产生自由基的酶结合的所述磁性粒子的表面涂覆金。
22.一种组合物，所述组合物包括与产生自由基的酶结合的磁性纳米粒子，其中位于铁磁性亚微粒子表面的、与产生自由基的酶结合的所述磁性纳米粒子具有至少20纳米的粒径。
23.一种用于解聚木质素的工艺，所述方法包括将含有木质素的材料与包括磁性纳米粒子的组合物反应以用所述木质素生产解聚产物，所述磁性纳米粒子与产生自由基的酶结合。
24.根据权利要求23所述的工艺，其中所述解聚产物选自松柏醇、芥子醇、和香豆醇，及其衍生物。
25.根据权利要求23所述的工艺，其中所述产生自由基的酶包括过氧化物酶。
26.根据权利要求25所述的工艺，其中所述过氧化物酶是降解木质素的过氧化物酶。
27.根据权利要求26所述的工艺，其中所述降解木质素的过氧化物酶选自木质素过氧化物酶、通用过氧化物酶、锰过氧化物酶、及其组合。
28.根据权利要求23所述的工艺，其中所述工艺与木质纤维素转化工艺连接，通过所述木质纤维素材料转化工艺生产将被解聚的所述木质素。
29.根据权利要求23所述的工艺，其中所述磁性纳米粒子包括磁性纳米粒子的介孔聚集物，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有介孔，在所述介孔中嵌入所述产生自由基的酶。
30.根据权利要求23所述的工艺，其中与产生自由基的酶结合的所述磁性粒子的表面涂覆金。
31.根据权利要求23所述的工艺，其中位于铁磁性亚微粒子表面的、与产生自由基的酶结合的磁性纳米粒子具有至少20纳米的粒径。
32.根据权利要求23所述的工艺，其中在所述工艺结束后通过磁性分离捕获与产生自由基的酶结合的所述磁性纳米粒子并在捕获后重新使用所述磁性纳米粒子，其中在被捕获和重新使用后，与产生自由基的酶结合的所述磁性纳米粒子基本上保持了其活性。
33.一种从水中除去芳香族污染物的工艺，所述方法包括将受到芳香族物质污染的水与包括磁性纳米粒子的组合物接触以便从所述水中除去所述芳香族污染物，所述磁性纳米粒子与产生自由基的酶结合。
34.根据权利要求33所述的工艺，其中将所述水与所述磁性纳米粒子接触导致来自所述芳香族污染物的不溶性材料沉淀，所述磁性纳米粒子与产生自由基的酶结合。
35.根据权利要求34所述的工艺，其进一步包括从所述水中除去所述不溶性材料。
36.根据权利要求33所述的工艺，其中所述芳香族污染物包括酚类物质。
37.根据权利要求33所述的工艺，其中所述产生自由基的酶包括过氧化物酶。
38.根据权利要求33所述的工艺，其中所述磁性纳米粒子包括磁性纳米粒子的介孔聚集物，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有介孔，在所述介孔中嵌入所述产生自由基的酶。
39.根据权利要求33所述的工艺，其中与产生自由基的酶结合的所述磁性粒子的表面涂覆金。
40.根据权利要求33所述的工艺，其中位于铁磁性亚微粒子表面的、与产生自由基的酶结合的磁性纳米粒子具有至少20纳米的粒径。
41.根据权利要求33所述的工艺，其中在所述工艺结束后通过磁性分离捕获与产生自由基的酶结合的所述磁性纳米粒子并在捕获后重新使用所述磁性纳米粒子，其中在被捕获和重新使用后，与产生自由基的酶结合的所述磁性纳米粒子基本上保持了其活性。
42.一种通过自由基反应使可聚合的单体聚合的工艺，所述方法包括将所述单体与包括磁性纳米粒子的组合物反应以产生衍生自所述单体的聚合物，所述磁性纳米粒子与产生自由基的酶结合。
43.根据权利要求42所述的工艺，其中所述单体包括乙烯基-加成单体。
44.根据权利要求42所述的工艺，其中所述磁性纳米粒子包括磁性纳米粒子的介孔聚集物，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有介孔，在所述介孔中嵌入所述产生自由基的酶。
45.根据权利要求42所述的工艺，其中与产生自由基的酶结合的所述磁性粒子的表面涂覆金。
46.根据权利要求42所述的工艺，其中位于铁磁性亚微粒子表面的、与产生自由基的酶结合的磁性纳米粒子具有至少20纳米的粒径。
47.据权利要求42所述的工艺，其中在所述工艺结束后通过磁性分离捕获与产生自由基的酶结合的所述磁性纳米粒子并在捕获后重新使用所述磁性纳米粒子，其中在被捕获和重新使用后，与产生自由基的酶结合的所述磁性纳米粒子基本上保持了其活性。
磁性纳米粒子和产生自由基的酶的介孔催化剂及其使用方
法
[0002] 本申请要求2011年12月9日提交的美国临时申请号61/568,966，和2011年3月10日提交的美国临时申请号61/451,360的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。
[0004] 本发明在康奈尔大学东北赠日计划（Northeast Sun Grant Initiative）的合同中规定的政府资助下进行的，该合同号为美国运输部资助#DTOS59-07-G-00052。政府享有本发明的某些权利。
[0005] 发明背景
[0006] 过氧化物酶（EC1.11.1）广泛存在于生物系统中，并形成氧化还原酶亚类，所述氧化还原酶亚类将过氧化氢（H2O2）还原成水，从而氧化多种类型的芳香化合物，范围从酚到芳香胺。过氧化物酶反应循环十分复杂，其始于H2O2对亚铁血红素的活化以形成双电子活化的化合物I（N.C.Veitch,Phytochemistry,2004,65,249）。然后化合物I的一个电子被有机底物的氧化反应所还原导致形成化合物II，该化合物的一个电子处于静息状态。第二个还原将酶恢复至静息状态以开始一个新循环。总的来说，对于所消耗的每个过氧化氢分子而言，产生两个芳香自由基并且其能够易于在次级反应中反应。
[0007] 过氧化物酶对主要由H2O2引起的底物抑制高度敏感，其能够导致可逆的酶灭活形式（化合物III）的形成。其活性还被产物的抑制所阻止。因此，与过氧化物酶活性相关的复合动力学能够限制其在多种工艺和生物过程中的应用。增加这一酶家族的活性及其对不同工艺条件的耐受性能够改进其目前的用途，以及为其在新应用中的用途创造条件。
[0008] 发明概述
[0009] 本申请发现了由产生自由基（FRP）的酶，例如辣根过氧化物酶（HRP），和自组装磁性纳米粒子（MNP）组成的生物纳米催化剂（BNC）增强了酶活性。特别地，本申请令人惊讶地发现，与游离酶和不含酶的磁性纳米粒子簇相比，FRP酶和磁性纳米粒子的自组装簇一般具有更加迅速的翻转和对酶更低的抑制。而且本申请还发现MNP的粒径和磁化强度影响BNC的形成和最终结构，其均对所包封酶的活性具有显著影响。特别地凭借在不同反应条件下令人惊讶的适应性，本申请所述的BNC能够在其它此类试剂目前可以使用的地方用作改进的FRP剂，而且其能够用于FRP酶尚未被考虑或发现适用的其它应用。
[0010] 本申请所描述的方法非常不同于依赖通过复合生化方法将蛋白偶联于表面修饰粒子的经典方法，经典方法通常情况下是以消耗酶活性和反应效率为代价的。通过本方法，仅当酶与MNP紧密结合时HRP的动力学被根本改良，例如初级MNP微晶和过氧化物酶的自组装簇（聚集）。在生物相关底物浓度下，所得的BNC的总活性能够有利地高于游离酶或MNP若干数量级。
[0011] 在一个方面，本发明涉及一种组合物，在所述组合物中FRP酶被包埋（即，包封）在磁性纳米粒子或其簇中。在特定实施方式中，所述组合物是由磁性纳米粒子和一种FRP酶或FRP酶组合组装成的介孔簇。所述介孔簇的簇状组装件具有包埋了FRP酶的介孔。在其它实施方式中，前述簇组合物包括表面涂覆了金的磁性纳米粒子。在又一个实施方式中，前述簇组合物进一步包括微米或亚微米粒径的磁性微粒，上有包埋了FRP的磁性纳米粒子。
[0012] 在其它方面，本发明涉及一种工艺，上文所述的包埋了FRP的磁性纳米粒子的组合物可用于所述工艺中。在特定实施方式中，所述包埋了FRP的磁性纳米粒子组合物参与了用于解聚木质素的工艺、用于从水中除去芳香族污染物的工艺和用于通过自由基反应使单体聚合生产聚合物的工艺。
[0013] 在另一个方面，本发明涉及用于生产上文所述的包埋了FRP的磁性纳米粒子组合物的工艺。在某些实施方式中，首先制备磁性纳米粒子或其聚合物，随后将FRP酶吸附于其中或与其连接。在其它实施方式中，在存在FRP酶的条件下，通过进行磁性纳米粒子的合成生产包埋了FRP的磁性纳米粒子组合物，从而通过自组装机制在MNP簇中包埋所述FRP酶。附图说明
[0014] 图1：在25℃和90℃下合成的磁性纳米粒子的X-射线衍射图。合成的纳米粒子显示了磁铁特征性的X-射线衍射图。在25℃（较小粒径）和90℃（较大粒径）下形成的纳米粒子之间的微晶衍射峰强度存在差异。
[0015] 图2A，2B：在25℃和90℃下合成的磁性纳米粒子的粒径分布图。在25℃和90℃下合成的纳米粒子具有不同的粒径分布。M25纳米粒子（图2A）的平均粒径为8nm，而M90纳米粒子（图2B）的平均粒径为约10nm。
[0016] 图3：在25℃和90℃下合成的磁性纳米粒子的磁化强度图。在25℃和90℃下合-1成的纳米粒子具有的饱和磁化强度（Ms）分别为约20和50emu g 。其均具有可以忽略不计的剩余磁化强度（Mr），这使其具有超顺磁性。超顺磁性的性质使其超声后在溶液中形成充分的单分散磁性纳米粒子。
[0017] 图4A-4C：M25和M25-BNC的粒径分布图（图4A）以及M25（图4B）和M25-BNC（图4C）的显微照片。当将酶（HRP）加入初始的单分散磁性纳米粒子后，M25纳米粒子聚集物的粒径增加。酶的存在增加了所述簇的总直径。
[0018] 图5A-5G：M90纳米粒子簇的显微照片（图5A）和相应的粒径图（图5B、5C），M90-BNC纳米粒子簇的显微照片（图5D）和相应的粒径图（图5E、5F），以及对M90和M90-BNC簇进行比较的粒径分布图（图5G）。
[0019] 图6：在溶液中单位酶量的情况下，单位有效MNP表面积捕获的酶量的等温线图。测定M90和M25簇中捕获的酶量（利用MNP的表面积进行标准化）。对于在溶液中的初始酶量而言，M90MNP形成的聚集物与M25MNP形成的聚集物相比含有更多的酶。溶液中的酶低-2
于10nmol.m ，100%的酶被包封在M90形成的簇中，而约有50%包封在M25簇中。
于10nmol.m ，100%的酶被包封在M90形成的簇中，而约有50%包封在M25簇中。
[0020] 图7：M25磁性纳米粒子和M25-BNC酶簇的孔径分布图。M25-BNC是具有直径低于50nm的孔的介孔。较小的磁性纳米粒子形成具有较小孔径的聚集物。孔径分布受酶存在情况的影响，所述的总孔体积低于M25MNP簇的总孔体积，这表明酶占据了介孔的空间。
[0021] 图8：M90磁性纳米粒子和M90-BNC酶簇的孔径分布图。M90NMP聚集形成的簇是介孔的，其具有孔的直径低于50nm。较大的纳米粒子形成具有较大孔径的较大聚集物。孔径分布受酶存在情况的影响，所述的总孔体积低于M90MNP簇的总孔体积，这表明酶占据了介孔的空间。
[0022] 图9A，9B：在4μg/mL和8μg/mL浓度下，针对M25-BNC（图9A）和M90-BNC（图-19B），将活性（酚AAP检测，以U.mmole 计）作为孵育时间的函数的图，以确定孵育时间对BNC活性的影响。
[0023] 图10：归一化的活性作为检测中使用的磁性纳米粒子（HRP-BNC）浓度（以μg/mL计）的函数的图，用于确定孵育时间对HRP-BNC活性的影响。P5方案：来自稀释的HRP+纳米粒子（M90）1:1溶液（体积/体积）的3%（体积/体积）预混物；P1方案：来自高浓度的HRP和M90储备溶液的3%（体积/体积）预混物；P3方案：HRP+纳米粒子1:1（体积/体积）混悬物的14%（体积/体积）预混物；P4方案：未预混，在检测混合物中分别加入酶和粒子。方案P5和P1是比较将酶和粒子（M90）混合以形成BNC的方法。P3和P5表示BNC的浓度在检测中的影响。为了进行比较，P4显示出未孵育的影响。自组装依赖于在预混物（酶+MNP）中MNP的浓度。高浓度的MNP因过度聚集而导致活性降低。
[0024] 图11A，11B：96孔板用于酚/AAP检测并用于测定PBS缓冲液对BNC形成和活性的影响（图11A），图表中显示了在H2O和不同浓度磷酸盐缓冲液（PBS）中M90-BNC增加的活性数据（对游离酶的活性进行归一化处理）（图11B）。利用固定浓度为1mM的H2O（2 即，过氧化物）进行的酚/AAP检测研究形成BNC的条件。在不同离子强度（最高200mM）的PBS缓冲液中形成了BNC。当缓冲液的离子强度增加时增加的活性降低。在水中形成的BNC中观察到了活性的最大增加（无离子补偿电荷）。在水中形成的BNC活性增加达26倍，可以用于在检测时更高浓度的PBS中。
[0025] 图12A，12B：96孔板用于酚/AAP检测并用于测定丙二酸盐缓冲液对BNC形成和活性的影响（图12A），图表中显示了在H2O和不同浓度丙二酸钠缓冲液（SMB）中M90-BNC增加的活性数据（对游离酶的活性进行归一化处理）（图12B）。利用固定浓度的过氧化物（1mM）进行的酚/AAP检测研究形成BNC的条件。在不同离子强度（最高200mM）的有机缓冲液（丙二酸钠：SMB）中形成了BNC。当缓冲液的离子强度增加时增加的活性降低，但是比在PBS中形成的BNC高一个数量级。在水中形成的BNC中观察到了活性的最大增加（无离子补偿电荷）。在SMB中形成的BNC活性增加达26倍，可以用于在检测时更高浓度的SMB中。
[0026] 图13A，13B：96孔板用于酚/AAP检测并用于测定酒石酸盐缓冲液对BNC形成和活性的影响（图13A），图表中显示了在H2O和不同浓度酒石酸钠缓冲液（STB）中M90-BNC增加的活性数据（对游离酶的活性进行归一化处理）（图13B）。利用固定浓度的过氧化物（1mM）进行的酚/AAP检测研究形成BNC的条件。在不同离子强度（最高200mM）的有机缓冲液（酒石酸钠：STB）中形成了BNC。当缓冲液的离子强度增加时增加的活性降低，但是比在PBS中形成的BNC高一个数量级。在水中形成的BNC中观察到了活性的最大增加（无离子补偿电荷）。在STB中形成的BNC活性增加达24倍，可以用于检测时更高浓度的STB中。
[0027] 图14：分子活性（酚/AAP检测，以U.mmole-1计）作为HRP-BNC纳米粒子聚集物过氧化物浓度的函数的图，以确定介孔空间的酶饱和度的影响。令人惊讶的是，被酶所饱和的MNP聚集物没有增加酶活性，反而是具有非饱和量酶的BNC显示出了增加的活性。
[0028] 图15：Km动力学常数作为游离HRP、M25BNC和M90BNC纳米粒子浓度的函数的图，用于确定游离HRP同M25和M90形成的BNC的底物亲和常数。通过拟合HRP-BNC的速率图估算Km动力学常数。在M25形成的BNC中亲和常数增加，这表明过氧化物酶得到了更好的利用。在M90形成的BNC的介孔空间所捕获的酶中未观察到Km的差异。
[0029] 图16：Vmax作为游离HRP、M25BNC和M90BNC纳米粒子浓度的函数的图，用于确定游离HRP同M25和M90形成的BNC的最大速率常数。通过拟合HRP-BNC的速率曲线估算Vmax的动力学常数。与游离酶的Vmax相比，在M25形成的BNC中最大速率增加，这表明过氧化物酶得到了更好的利用。在M90形成的BNC的介孔空间所捕获的酶及其游离形式中未观察到Vmax的差异。
[0030] 图17：Ki动力学常数作为游离HRP、M25BNC和M90BNC纳米粒子浓度的函数的图，用于确定游离HRP同M25和M90形成的BNC的抑制常数。通过用HRP拟合BNC的速率曲线估算Ki的动力学常数。在M90形成的BNC中底物抑制常数显著增加，这表明当被BNC的介孔空间捕获后对酶产生了更好的抑制保护。与游离酶相比，如果不是更低，则M25-BNC的抑制在相同范围。
[0031] 图18：Kcat动力学常数作为游离HRP、M25BNC和M90BNC纳米粒子浓度的函数的图，用于确定游离HRP同M25和M90形成的BNC的翻转常数。通过用HRP拟合BNC的速率曲线估算Kcat的动力学常数。与游离酶相比，在M25形成的BNC中翻转常数显著增加，这表明底物得到了更好的利用。在更低的酶浓度下，M90-BNC的kcat也增加。
[0032] 图19A，19B：归一化活性（酚/AAP检测）作为检测缓冲液和pH的函数的图（图19A），以及速率作为检测缓冲液pH的函数的图（图19B）。在水中HRP（1nM）和M90MNP（4μg/ml）形成BNC，并在不同pH条件下，在5mM过氧化物和5mM缓冲液的酚/AAP检测中对BNC进行检测。在所有缓冲液和所有pH下均观察到了活性增加。
[0033] 图20A，20B：归一化活性作为检测缓冲液和pH的函数作图（图20A）和速率作为酚/AAP检测的检测缓冲液pH的函数的图（图20B）。在水中HRP（1nM）和M90MNP（4μg/ml）形成BNC，并在不同温度条件下，在5mM过氧化物和3mM缓冲液的酚/AAP检测中对BNC进行检测。在所有缓冲液和所有温度下均观察到了活性增加，最高在25℃。与游离酶相比所观察到的增加是游离酶速率更低所致，这表明BNC在较低的温度下更有效。
[0034] 图21：分子活性（酚/AAP检测，以U.mmole-1计）作为BNC的过氧化物浓度（M）的函数的图，其中BNC由万能过氧化物酶和M90和功能化的M90形成。用万能过氧化物酶（Vep：商品化形式，未进一步纯化）形成BNC并使用酚/AAP（无锰）检测。使用有机聚合物将M90-MNP功能化以修饰其表面的电荷。与游离VeP相比，所有BNC均显示出增加的活性。在未经修饰的BNC中观察到最大活性。
[0035] 图22：与M90-MNP相比，锰过氧化物酶和金涂覆的MNP形成的BNC的速率曲线。用M90或金涂覆的M90和锰过氧化物酶（FLPC阴离子交换纯化后形式，5nM）形成BNC。在这项3+
检测中，锰过氧化物酶产生了Mn 反应性阳离子，其与有机酸和氧化二甲氧基酚（显色剂）形成复合物。在用M90形成的BNC中反应的初始速率为游离酶的两倍。与游离酶相比，金涂覆BNC的反应速率增加四倍。
检测中，锰过氧化物酶产生了Mn 反应性阳离子，其与有机酸和氧化二甲氧基酚（显色剂）形成复合物。在用M90形成的BNC中反应的初始速率为游离酶的两倍。与游离酶相比，金涂覆BNC的反应速率增加四倍。
[0036] 图23：增加的漆酶BNC的活性（Lac-BNC，归一化的活性）作为缓冲液浓度和pH的函数的图。该检测（无过氧化物酶的酚/AAP）在不同缓冲液和不同pH下进行。漆酶的最佳pH约为5。仅在较低和较高pH下观察到了活性的增加（高至60%），其在较高摩尔浓度的缓冲液中更高。
[0037] 图24A-24D：高香草酸荧光二聚体形成的动力学图，用于确定使用混合酶BNC增加的过氧化酶速率，即中心（核）为辣根过氧化物酶（HRP）和外层（壳）为葡萄糖氧化酶（Gox）的簇、中心为Gox和外层为HRP的簇、或随机分布。BNC由金涂覆MNP形成，Gox和HRP的比例为1。HVA检测使用增加的葡萄糖浓度。在这个系统中，葡萄糖氧化酶将葡萄糖转化为过氧化物和葡糖酸内酯，HRP使用过氧化物将高香草酸聚合为其荧光二聚体。该动力学显示了酶在介孔空间中的分布情况。
[0038] 图25：混合酶、金包覆BNC的速率图（HVA检测，葡萄糖氧化酶：HRP的比例为1:1）。在这种配置中，在较低的葡萄糖范围的条件下，与游离酶相比Gox/HRP BNC的速率更高（反应的初始速率）。在较高的葡萄糖范围的条件下，BNC与游离酶的活性相似。在该Gox/HRP比例和葡萄糖浓度范围下未观察到底物抑制。具有HRP核的BNC的初始反应速率为随机分布的两倍。这些结果表明可以使用聚酶系统，并且可以控制酶的分布以便有利地影响该系统的活性。
[0039] 图26A，26B：商品化磁性微粒（图26A）和使用金包覆BNC（葡萄糖氧化酶和HRP）将表面功能化的微粒的SEM显微照片。可以利用残余磁化强度将预制成的BNC固定在铁磁性微粒上。这种新材料具有将酶捕获于磁性簇的介孔空间中的优点，并且还具有将其固定在稳定和高磁性材料上的优点。
[0040] 图27：利用葡萄糖氧化酶/HRPμBNC产生的高香草酸荧光二聚体形成的动力学的图。μBNC使用金包覆Gox/HRP BNC制备，其具有中心为HRP和外层为Gox的簇、中心为Gox和外层为HRP的簇、或随机分布。核/壳μBNC的速率高于游离酶或随机分布的BNC。这些结果表明BNC能够固定在微粒上，并且保持了仅存在BNC时观察到的增加的活性。
Gox:HRP=1:1。酶:MNP=1:2。MNP:微球=1:100（W/W）。
Gox:HRP=1:1。酶:MNP=1:2。MNP:微球=1:100（W/W）。
[0041] 图28A-28C：照片显示了μBNC在被外部磁体捕获方面具有优越的性能。图28A中比较了在1mM葡萄糖溶液中的HRP/Gox（左图）和HRP/Gox BNC（右图）溶液。图28B中比较了暴露于外部磁体后的相同溶液。图28C为经外部旋转磁体搅拌后的μBNC。如图所示，反应后即使在较低磁场下仅需要几秒中就能够将μBNC从溶液中回收，也能够使用外部磁场容易地对其进行搅拌。10小时后，固定在微粒上的HRP/Gox-BNC系统的颜色较深（右管）还表明与游离酶（左管）相比其反应程度较高。
[0042] 图29：使用M90磁性纳米粒子的HRP-BNC、LiP-BNC、VeP-BNC（不含Mn）、和MnP-BNC的波长吸收光谱。扣除相同浓度下游离酶的光谱。在M90-BNC介孔空间中捕获的真菌过氧化物酶与其游离形式相比显示了更高的活性（即，增加了木质素解聚反应释放的芳香族化合物）。
[0043] 图30：游离木质素过氧化物酶（纯LiP）、和LiP+M8（由2nM LiP和8μg/ml M90形成的BNC）、和LiP+M16（由2nM LiP+16μg/ml M90形成的BNC）与硫酸盐木质素作用后可溶性芳香族分子增加情况的图表。在特征性吸收波长下观察用BNC使硫酸盐木质素释放的可溶性芳香族化合物。BNC由2nM木质素过氧化物酶（商品形式，未经纯化）形成。扣除上清液在T0下（初始条件）和纳米粒子本底的OD值。
[0044] 图31：游离通用过氧化物酶（纯VP）、VP+M8（由2nM VP和8μg/ml M90形成的BNC）、和VP+M16（由2nM VP+16μg/ml M90形成的BNC）与硫酸盐木质素作用后可溶性芳香族分子增加情况的图表。在特征性吸收波长下观察用BNC使硫酸盐木质素释放的可溶性芳香族化合物。BNC由2nM通用过氧化物酶（商品形式，未经纯化）形成。扣除上清液在T0下（初始条件）和纳米粒子本底的OD值。
[0045] 图32：存在Mn的游离通用过氧化物酶（纯VP）、VP+M8（由2nM VP和8μg/ml M90形成的BNC）、和VP+M16（由2nM VP+16μg/ml M90形成的BNC）与硫酸盐木质素作用后可溶性芳香族分子增加情况的图表。在特征性吸收波长下观察用BNC使硫酸盐木质素释放的可溶性芳香族化合物。BNC由2nM通用过氧化物酶（商品形式，未经纯化）形成。扣除上清液在T0下（初始条件）和纳米粒子本底的OD值。
[0046] 图33：游离锰过氧化物酶（纯MnP）、MnP+M8（由1nM MnP和8μg/ml M90形成的BNC）、和MnP+M16（由1nM MnP+16μg/ml M90形成的BNC）与硫酸盐木质素作用后可溶性芳香族分子增加情况的图表。在特征性吸收波长下观察用BNC使硫酸盐木质素释放的可溶性芳香族化合物。BNC由1nM锰过氧化物酶（商品形式，未经纯化）形成。扣除上清液在T0下（初始条件）和纳米粒子本底的OD值。
[0047] 图34：照片显示了HRP和M90形成的BNC的酚聚合作用和多酚的沉淀。利用NaCl将浓缩的多酚沉淀并离心，用吸光度测定溶液中残余酚。在存在MNP的情况下校正吸光度。
[0048] 图35：平均酚消除（%）作为MnP/HRP比率的函数的图，用于确定纳米粒子与酶的比率对酚消除百分率的影响。固定总酶（辣根过氧化物酶）量以及过氧化物和酚的浓度（各1mM）。增加形成BNC的MNP的比例。当酶被磁性M90簇的介孔空间捕获时，从溶液中消除的酚量增加。酚消除的效率接近95%。
[0049] 图36：酚消除%作为过氧化物与酚比率的函数的图，用于确定过氧化氢与酚的比率对HRP和BNC的酚消除百分率的影响。将酚的终浓度固定为1mM。改变过氧化物的量。当过氧化物与酚的比率为1.1时，酚消除效率增至100%，而游离酶的效率仅为约30%。当过氧化物的浓度增加导致底物抑制时，游离酶的效率降低。而与此相反，在依赖于MNP/HRP比率的检测范围内BNC很少或未被抑制。
[0050] 发明详述
[0051] 在一方面，本发明涉及一种产生自由基（FRP）的组合物，所述组合物包括与FRP酶结合的磁性纳米粒子。与FRP酶结合的磁性纳米粒子在本申请中也称为“生物纳米催化剂”或“BNC”。如本文所使用的，术语“结合”旨在包括使FRP酶能够附着于磁性纳米粒子之上，且在其使用或供后续使用的储存条件下不会使FRP酶从磁性纳米粒子上释放的任何方法。FRP酶能够通过，例如共价键、离子键、氢键、亲和力、或范德华相互作用，结合。可以将FRP酶定位于磁性纳米粒子的任意位置，例如在其表面和/或包埋于磁性纳米粒子内部，例如如果磁性纳米粒子是多孔的，可以在磁性纳米粒子的介孔中。如本文所使用的，术语“磁性”包括所有的有效磁性特性类型，包括永磁性、超顺磁性、顺磁性、铁磁性和亚铁磁性状态。
[0052] 所述磁性纳米粒子或BNC具有纳米级粒径，即一般不超过500nm。如本文所使用的，当磁性纳米粒子近似或基本上为球形时，术语“粒径”可以指磁性纳米粒子的直径。在磁性纳米粒子不是近似或基本上为球形的情况下（例如，基本上是椭圆形或不规则的），术语“粒径”可以指磁性纳米粒子的最长维度或三维的平均值。术语“粒径”还可以指磁性纳米粒子群的平均粒径（即，“平均粒径”）。在不同实施方式中，磁性纳米粒子具有的粒径不超过，例如500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、50nm、40nm、30nm、25nm、20nm、15nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm或1nm，或者以任意两个前述示例性粒径为边界的范围内的粒径。
[0053] 上文所述的磁性纳米粒子或其BNC可以是成簇的，即作为聚集物或聚集，在这种情况下，将上文所述的磁性纳米粒子认为是原始纳米粒子（即，原始微晶），并且可以将上文提供的磁性纳米粒子粒径认为是原始纳米粒子粒径。聚集物通常具有的粒径（即，二级粒径）为至少5nm。在不同实施方式中，聚集物具有的粒径精确地、约为或至少，例如5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、
150nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm或800nm，或者以任意两个前述示例性粒径为边界的范围内的粒径。
150nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm或800nm，或者以任意两个前述示例性粒径为边界的范围内的粒径。
[0054] 典型地，原始的和/或聚集的磁性纳米粒子或其BNC具有粒径分布，即其通常分布的粒径，可以是较窄的或较宽的分布。在不同实施方式中，原始或聚集物粒径的任意范围构成原始或聚集物粒径总体范围的主要或次要部分。例如，在一些实施方式中，原始粒径的特定范围（例如，至少1、2、3、5或10nm和至多15、20、25、30、35、40、45或50nm）或者聚集粒径的特定范围（例如，至少5、10、15或20nm和至多50、100、150、200、250或300nm）构成原始粒径总体范围的至少或高于50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。在其它实施方式中，原始粒径的特定范围（例如，低于1、2、3、5或10nm，或高于15、20、25、30、35、40、45或50nm）或者聚集粒径的特定范围（例如，低于20、10或5nm，或高于25、50、100、150、200、250或300nm）构成原始粒径总体范围的不超过或低于50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1%。
[0055] 磁性纳米粒子的聚集物（即“聚集物”）或其BNC可以具有任意的多孔程度，其中包括基本上缺乏多孔性，这取决于制备其的各原始微晶的量。在特定实施方式中，聚合物通过含有间隙介孔（即，位于原始磁性纳米粒子之间的介孔，通过堆积排布形成）从而是介孔性的。介孔的孔径通常为至少2nm和至多50nm。在不同实施方式中，介孔具有的孔径精确地或约为，例如2、3、4、5、10、12、15、20、25、30、35、40、45或50nm，或者以任意两个前述示例性孔径为边界的范围内的孔径。与粒径类似，介孔通常具有孔径分布，即其通常分布的孔径，可以是较窄的或较宽的分布。在不同实施方式中，介孔孔径的任意范围构成介孔孔径总体范围或其总孔体积的主要或次要部分。例如，在一些实施方式中，介孔孔径的特定范围（例如，至少2、3、或5，和至多8、10、15、20、25、或30nm）构成介孔孔径总体范围或其总孔体积的至少或高于50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。在其它实施方式中，介孔孔径的特定范围（例如，低于2、3、4或5nm，或者高于10、15、20、25、30、35、40、45或50nm）构成介孔孔径总体范围或其总孔体积的不超过或低于50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1%。
[0056] 磁性纳米粒子能够具有本领域公知的任意组分。在一些实施方式中，磁性纳米粒子是或者包括磁性的零价金属部分。一些这种零价金属的例子包括钴、镍和铁，及其混合物和合金。在其它实施方式中，磁性纳米粒子是或者包括磁性金属的氧化物，如钴、镍或铁的氧化物或其混合物。在一些实施方式中，磁性纳米粒子具有区分开的核和表面部分。例如，磁性纳米粒子可以具有由铁、钴或镍元素组成的核部分和钝化层组成的表面部分，钝化层如金属氧化物或稀有金属涂层，如金、铂、钯或银层。在其它实施方式中，金属氧化物磁性纳米粒子或其聚集物上涂覆一层稀有金属涂层。稀有金属涂层可以，例如减少磁性纳米粒子表面的电荷数，这可以有益地增加在溶液中的分散性和更好地控制BNC的粒径。稀有金属涂层保护粒子防止其氧化，因溶出或螯合造成的溶解，例如在生物反应或工艺中使用螯合有机酸，如柠檬酸、丙二酸、酒石酸时。钝化层可以是任意适宜厚度，和特别地，至少、至多或者低于，例如0.1nm、0.2nm、0.3nm、0.4nm、0.5nm、0.6nm、0.7nm、0.8nm、0.9nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm或10nm，或者在以这些值中的任意两个为边界的范围内的厚度。
[0057] 在特定实施方式中，磁性纳米粒子具有氧化铁组分。氧化铁组分可以是本领域公知的任意磁性或超顺磁性氧化铁组分，例如磁铁矿（Fe3O4）、赤铁矿（α-Fe2O3）、磁赤铁矿2+ 2+ 2+
（γ-Fe2O3）、或者如式AB2O4所示的尖晶石型铁酸盐，其中A是二价金属（例如Zn 、Ni 、Mn 、
2+ 2+ 2+ 3+ 3+
Co 、Ba 、Sr 或其组合），并且B是三价金属（例如Fe 、Cr 或其组合）。
（γ-Fe2O3）、或者如式AB2O4所示的尖晶石型铁酸盐，其中A是二价金属（例如Zn 、Ni 、Mn 、
2+ 2+ 2+ 3+ 3+
Co 、Ba 、Sr 或其组合），并且B是三价金属（例如Fe 、Cr 或其组合）。
[0058] 在一些实施方式中，磁性纳米粒子或其聚集物或其BNC位于铁磁性亚微米粒子表面。通过位于铁磁性微粒表面，磁性纳米粒子或聚集物或BNC通过任意适宜的缔合、吸附或结合相互作用附着在铁磁性微粒表面。铁磁性微粒可以或可以不涂覆金属氧化物或稀有金属涂层。而且，铁磁性微粒可以具有任意适宜的表面基团，根据本领域所公知的，该表面基团可以促进向磁性纳米粒子的附着。在不同实施方式中，铁磁性微粒子具有的粒径大约、精确地、或至少为20、30、40或50、60、70、80、90、100、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000nm，或者在以任意两个前述示例性粒径为边界的范围内的粒径。由于具有更大的粒径（超微结构），因而附着于铁磁性粒子表面的BNC能够更容易地被外部磁场捕获。更大的粒径还有助于保护酶活性。这些更大的磁性粒子能够容易地被外部磁场捕获。当处于磁场中时，附着于铁磁性亚微米粒子表面上的BNC不会产生过度聚集的倾向。
[0059] 磁性纳米粒子或其聚集物或其BNC具有任意适宜的磁度。例如，磁性纳米粒子或其聚集物或其BNC能够具有至少或至多为5、10、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90或100emu/g的饱和磁化强度（Ms）。磁性纳米粒子或其聚集物优选具有不超过（即，至多）或低于5emu/g的剩余磁化强度（Mr），更优选地，至多或低于4emu/g、3emu/g、2emu/g、1emu/g、
0.5emu/g或0.1emu/g。磁性纳米粒子或其聚集物的表面磁场可以是大约或至少，例如5、
10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000高斯（G），或在以任意两个前述值为边界的范围内的磁场。
0.5emu/g或0.1emu/g。磁性纳米粒子或其聚集物的表面磁场可以是大约或至少，例如5、
10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000高斯（G），或在以任意两个前述值为边界的范围内的磁场。
[0060] 可以使磁性纳米粒子或其聚集物吸附适量的FRP酶以产生产物BNC，酶量根据用途达到或低于饱和水平。在不同实施方式中，磁性纳米粒子或其聚集物可以吸附大约、至2
少、至多、或少于，例如1、5、10、15、20、25或30pmol/m 的FRP酶。或者，磁性纳米粒子或其聚集物可以吸附的FRP酶量是大约、至少、至多、或少于，例如饱和水平的10%、20%、30%、40%、
50%、60%、70%、80%、90%或100%。
少、至多、或少于，例如1、5、10、15、20、25或30pmol/m 的FRP酶。或者，磁性纳米粒子或其聚集物可以吸附的FRP酶量是大约、至少、至多、或少于，例如饱和水平的10%、20%、30%、40%、
50%、60%、70%、80%、90%或100%。
[0061] 磁性纳米粒子或其聚集物或其BNC具有任意适宜的孔体积。例如，磁性纳米粒子或其聚集物可以具有的孔体积大约、至少、至多、或少于，例如0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、3
0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95 或 1cm/g，或者在以任意两个前述值为边界的范围内的孔体积。
0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95 或 1cm/g，或者在以任意两个前述值为边界的范围内的孔体积。
[0062] 磁性纳米粒子或其聚集物或其BNC具有任意适宜的比表面积。例如，磁性纳米粒子或其聚集物可以具有的比表面积大约、至少、至多、或少于，例如50、60、70、80、90、100、2
110、120、130、140、150、160、170、180、190或200m/g。
110、120、130、140、150、160、170、180、190或200m/g。
[0063] FRP酶可以是产生自由基的任意酶。而且，FRP酶可以是任意来源的，例如真菌、微生物、动物或植物。在特定实施方式中，FRP酶是属于EC1酶家族的氧化还原酶。EC1氧化还原酶可以是，例如作用于供体CH-OH基团的EC1.1氧化还原酶、作用于供体醛基或氧代基团的EC1.2氧化还原酶、作用于供体CH-CH基团的EC1.3氧化还原酶、作用于供体CH-NH2基团的EC1.4氧化还原酶、作用于供体CH-NH基团的EC1.5氧化还原酶、作用于NADH或NADPH的EC1.6氧化还原酶、作用于供体各种氮化合物的EC1.7氧化还原酶、作用于供体硫基团的EC1.8氧化还原酶、作用于供体亚铁血红素基团的EC1.9氧化还原酶、作用于供体二酚及其相关物质的EC1.10氧化还原酶、作用于受体过氧化物的EC1.11氧化还原酶、作用于供体氢的EC1.12氧化还原酶、通过掺入分子氧（加氧酶）作用于单一供体的EC1.13氧化还原酶、通过掺入或还原分子氧作用于成对供体的EC1.14氧化还原酶、作用于受体超氧化物的EC1.15氧化还原酶、氧化金属离子的EC1.16氧化还原酶、作用于CH或CH2基团的EC1.17氧化还原酶、作用于供体铁-硫蛋白的EC1.18氧化还原酶、作用于供体还原型黄素氧化还原蛋白的EC1.19氧化还原酶、作用于供体磷或砷的EC1.20氧化还原酶、作用于X-H和Y-H以形成X-Y键的EC1.21氧化还原酶、EC1.97氧化还原酶、使用氢作为还原剂的EC1.98氧化还原酶和使用氧作为氧化剂的EC1.99氧化还原酶。还可以更特别地将氧化还原酶鉴定为属于上文所述的任意EC1.1群组的亚型。
[0064] 在第一个特定实施方式的集合中，FRP酶选自EC1.1型的氧化还原酶。可以进一步将EC1.1酶鉴定为属于任意下述亚型：NAD或NADP作为受体的EC1.1.1、细胞色素作为受体的EC1.1.2、氧作为受体的EC1.1.3、二硫化物作为受体的EC1.1.4、醌或类似化合物作为受体的EC1.1.5和作用于其它受体的EC1.1.99。在更特定的实施方式中，将FRP酶鉴定为属于上文所述的任意EC1.1亚型的亚型。例如，可以将FRP酶鉴定为属于任意EC1.1.3亚型，如EC1.1.3.3（苹果酸氧化酶）、EC1.1.3.4（葡萄糖氧化酶）、EC1.1.3.5（己糖氧化酶）、EC1.1.3.6（胆固醇氧化酶）、EC1.1.3.7（芳基-醇氧化酶）、EC1.1.3.8（L-古洛糖酸内酯氧化酶）、EC1.1.3.9（半乳糖氧化酶）EC1.1.3.10（吡喃糖氧化酶）、EC1.1.3.11（L-山梨糖氧化酶）EC1.1.3.12（吡哆醇4-氧化酶）、EC1.1.3.13（醇氧化酶）、EC1.1.3.14（儿茶酚氧化酶）、EC1.1.3.15（2-羟基酸氧化酶）、EC1.1.3.16（蜕皮素氧化酶）、EC1.1.3.17（胆碱氧化酶）、EC1.1.3.18（仲醇氧化酶）、EC1.1.3.19（4-羟基扁桃酸氧化酶）、EC1.1.3.20（长链醇氧化酶）、EC1.1.3.21（甘油-3-磷酸氧化酶）、EC1.1.3.22、EC1.1.3.23（硫胺素氧化酶）、EC1.1.3.24（L-半乳糖内酯氧化酶）、EC1.1.3.25、EC1.1.3.26、EC1.1.3.27（羟基植烷酸氧化酶）、EC1.1.3.28（核苷酶）、EC1.1.3.29（N-酰基己糖胺氧化酶）、EC1.1.3.30（聚乙烯醇氧化酶）、EC1.1.3.31、EC1.1.3.32、EC1.1.3.33、EC1.1.3.34、EC1.1.3.35、EC1.1.3.36、EC1.1.3.37（D-阿拉伯糖-1,4-内酯氧化酶）、EC1.1.3.38（香草醇氧化酶）、EC1.1.3.39（核苷氧化酶，H2O2形成）、EC1.1.3.40（D-甘露醇氧化酶）和EC1.1.3.41（木糖醇氧化酶）。
[0065] 在第二个特定实施方式集合中，FRP酶选自EC1.10型的氧化还原酶。可以进一步将EC1.10酶鉴定为属于任意下述亚型：NAD或NADP作为受体的EC1.10.1、细胞色素作为受体的EC1.10.2、氧作为受体的EC1.10.3和具有其它受体的EC1.10.99。更特别地，EC1.10.1酶可以是，例如EC1.10.1.1，即反式-苊-1,2-二醇脱氢酶。更特别地，EC1.10.2酶可以是，例如EC1.10.2.1（细胞色素-b5还原酶）或EC1.10.2.2（细胞色素-c还原酶）。更特别地，EC1.10.3酶可以是，例如EC1.10.3.1（儿茶酚氧化酶）、EC1.10.3.2（漆酶）、EC1.10.3.3（L-抗坏血酸氧化酶）、EC1.10.3.4（o-氨基苯酚氧化酶）、EC1.10.3.5（3-羟氨苯甲酸氧化酶）、EC1.10.3.6（利福霉素-B氧化酶）、EC1.10.3.7或EC1.10.3.8。更特别地，EC1.10.99酶可以是，例如EC1.10.99.1（塑醌-质体蓝素还原酶）、EC1.10.99.2（核糖二氢烟酰胺脱氢酶，醌）或EC1.10.99.3（紫黄质去环氧酶）。
[0066] 在第三个特定实施方式集合中，FRP酶选自EC1.11型的氧化还原酶。可以将EC1.11酶进一步鉴定为属于EC1.11.1亚型（过氧化物酶）。更特别地，EC1.11.1酶可以是例如EC1.11.1.1（NADH过氧化物酶）、EC1.11.1.2（NADPH过氧化物酶）、EC1.11.1.3（脂肪酸过氧化物酶）、EC1.11.1.4、EC1.11.1.5（细胞色素-c过氧化物酶）、EC1.11.1.6（过氧化氢酶）、EC1.11.1.7（过氧化物酶）、EC1.11.1.8（碘过氧化物酶）、EC1.11.1.9（谷胱甘肽过氧化物酶）、EC1.11.1.10（氯过氧化物酶）、EC1.11.1.11（L-抗坏血酸过氧化物酶）、EC1.11.1.12（磷脂-过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶）、EC1.11.1.13（锰过氧化物酶）、EC1.11.1.14（二芳基丙烷过氧化物酶）或EC1.11.1.15（过氧化物氧化还原酶）。
[0067] 在特定实施方式中，FRP酶是过氧化物酶。过氧化物酶还可以进一步按照功能分类，例如木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶或通用过氧化物酶。还可以将过氧化物酶分为真菌、细菌、动物或植物过氧化物酶。还可以将过氧化物酶分为I类、II类或III类过氧化物酶。还可以将过氧化物酶分为髓过氧化物酶（MPO）、嗜曙红细胞过氧化物酶（EPO）、乳酸过氧化物酶（LPO）、甲状腺过氧化物酶（TPO）、前列腺素H合成酶（PGHS）、谷胱甘肽过氧化物酶、卤化过氧化物酶、过氧化氢酶、细胞色素c过氧化物酶、辣根过氧化物酶、花生过氧化物酶、大豆过氧化物酶、芜菁过氧化物酶、烟草过氧化物酶、番茄过氧化物酶、大麦过氧化物酶或者过氧蛋白。在特定实施方式中，过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
[0068] 在一些实施方式中，使用单一的FRP酶。在其它实施方式中，使用FRP酶的组合，如任意两种或三种选自任意上述类型或亚类的氧化还原酶。在一些实施方式中，使用FRP酶（例如，EC1酶）的组合。在特定实施方式中，使用EC1.1酶的组合。在其它特定实施方式中，使用EC1.10酶的组合。在其它特定实施方式中，使用EC1.11酶的组合。在其它实施方式中，使用上文所述的任意特定FRP酶和过氧化物酶的组合（例如，EC1.1或EC1.1.3酶和过氧化物酶的组合）。当使用FRP酶的组合时，可以将两种或更多酶排布在核-壳类型的排布中，即第一种FRP酶在磁性纳米粒子或其聚集物的核部分或表面部分，并且第二种（不同的）FRP酶覆盖存在第一种FRP酶的区域。第二种FRP酶可以是磁性纳米粒子的聚集物或者在其表面上，覆盖在第一种酶的上面。在多酶系统中，控制不同酶在介孔聚集物内分布的情况为不同反应的解偶联以及允许反应底物和产物从一层向另一层或向BNC的核扩散提供了益处。因而，当在BNC的狭窄孔结构内进行酶反应时，核/壳分布为更好地控制所捕获的不同FRP酶的动力学提供了可能性。将进行类似反应（例如，两种或多种过氧化物酶或者一种过氧化物酶和一种漆酶）但具有不同反应要求（底物、底物浓度等）的酶进行组合能够有利地增加BNC的通用性以便在广泛和多变的反应条件下进行高效率的反应。将酶与所偶联的反应组合能够确保在酶附近产生底物，并且避免需要有害的和不稳定的化学底物，如过氧化氢。例如，葡萄糖氧化酶能够从葡萄糖中产生过氧化氢，葡萄糖是一种便宜和无害的化合物。
[0069] 本发明还涉及一种制备引入酶的（例如，结合酶、捕获酶、或包埋酶）磁性纳米粒子及其聚集物的方法。在特定实施方式中，通过在用于制备磁性纳米粒子或聚集物的反应条件下引入FRP酶制备引入酶的磁性纳米粒子或其聚集物。例如，可以在产生金属纳米粒子（例如，钴、镍或铁）或金属氧化物磁性纳米粒子（例如，钴、镍或铁的氧化物）的工艺中引入FRP酶。产生金属和金属氧化物磁性纳米粒子的合成方法是本领域所公知的。一种用于生产金属纳米粒子的公知方法包括在溶液中还原金属离子（例如，作为金属的盐）。还原反应可以通过，例如还原化学方法（例如，通过与还原剂反应，如氢、硼烷、肼、连二磷酸盐或柠檬酸）或者还原或分解物理方法（例如，在溶液中超声或热处理）。或者，所述方法可以是通过，0
例如超声、热处理或暴露于放射源如紫外线，分解零价金属复合物（例如，Ni 羰基或膦复合物）。生产金属氧化物磁性纳米粒子的一种特别的公知的方法包含在使金属氧化物纳米粒子沉淀的条件下与金属盐（例如，金属卤化物）发生碱性反应。例如，使用已建立的方法，可以通过在溶液中与碱如NaOH反应将铁（II）和铁（III）离子（例如，在FeCl2和FeCl3中的）共沉淀生产铁氧化物纳米粒子。可以在任意的此类方法中引入FRP酶，只要所述方法不会实质上不利于FRP酶的活性即可。
例如超声、热处理或暴露于放射源如紫外线，分解零价金属复合物（例如，Ni 羰基或膦复合物）。生产金属氧化物磁性纳米粒子的一种特别的公知的方法包含在使金属氧化物纳米粒子沉淀的条件下与金属盐（例如，金属卤化物）发生碱性反应。例如，使用已建立的方法，可以通过在溶液中与碱如NaOH反应将铁（II）和铁（III）离子（例如，在FeCl2和FeCl3中的）共沉淀生产铁氧化物纳米粒子。可以在任意的此类方法中引入FRP酶，只要所述方法不会实质上不利于FRP酶的活性即可。
[0070] 在其它实施方式中，首先制备磁性纳米粒子或其聚集物，然后将FRP酶引入磁性纳米粒子或其聚集物上或内部。特别地，在磁性纳米粒子或聚集物是多孔的情况下，可以在水性溶液中通过简单扩散、吸附或自组装将FRP酶包埋于磁性纳米粒子或聚集物的孔中。在其它实施方式中，使用结合剂将磁性纳米粒子或其聚集物的表面和/或孔衍生化，这引起或促进FRP酶与磁性纳米粒子或其聚集物的结合。结合剂可以是，例如具有与磁性纳米粒子结合的一个反应性末端和与FRP酶结合的另一个反应性末端的双功能连接子。对于金属纳米粒子，与磁性纳米粒子结合的反应性末端可以是，例如氨基、巯基、巯醚基或膦基。对于金属氧化物纳米粒子，与磁性纳米粒子结合的反应性末端可以是，例如磷酸基、膦酸基、硫酸基或磺酸基。在这两种情况下，与FRP酶结合的反应性末端可以是，例如本领域公知的任意胺反应性基团（例如N-羟基琥珀酰亚胺基），或者本领域公知的将酶或其它蛋白与另外一部分偶联的任意其它基团。或者，结合剂可以是，例如基于亲和偶联的，例如分别产生磁性纳米粒子-生物素或-亲和素偶联物并将其与FRP-亲和素或-生物素偶联物反应。
[0071] 磁性纳米粒子或其聚集物或其BNC还可以涂覆稀有金属如金、铂或钯。可以使用涂覆磁性纳米粒子的任意适宜方法。例如，在特定实施方式中，将磁性纳米粒子分散于含有稀有金属盐的溶液中，并稀有金属盐处于还原条件。在稀有金属盐被还原前，通过在磁性纳米粒子的表面上结合双功能分子能够使上述方法易于进行。用于这一目的的双功能分子应含有用于与磁性纳米粒子结合的部分（如上文所述）和用于与稀有金属离子结合的稀有金属结合部分（例如，胺、巯基、膦或螯合部分）。任选地，一旦金属离子与纳米粒子表面结合，则可以对磁性纳米粒子进行洗涤以除去过量的稀有金属盐（例如，通过过滤或倾析）。由于稀有金属粒子附着于所述表面，因而上述方法提供了用于生产稀有金属涂层的具有更高选择性的方法（即，不会伴随着稀有金属纳米粒子的产生），并且涂层更加均一。在一些实施方式中，在将FRP酶引入磁性纳米粒子前进行稀有金属涂层，在这种情况下FRP酶随后与稀有金属涂层结合。FRP酶能够通过，例如使用与稀有金属涂层结合并具有另一个与FRP酶结合的反应性基团的双功能性分子将稀有金属涂层功能化，从而与稀有金属涂层结合。
[0072] 含有酶的磁性纳米粒子或其聚集物或其稀有金属涂覆的形式还可以结合或附着于（即，定位于）铁磁性微粒的表面。在一个实施方式中，将含有酶的磁性纳米粒子或其聚集物或其稀有金属涂覆的形式通过将其在水溶液中接触以使得纳米粒子附着于微粒的表面上，从而将其附着于铁磁性微粒的表面。在其它实施方式中，将纳米粒子和微粒适宜地使用界面剂进行功能化以利于结合相互作用，其可以基于，例如共价键、离子键、亲和力、氢键或范德华（分散）相互作用。
[0073] 在另一个方面，本发明涉及一种解聚木质素的工艺，即木质素解聚工艺，其中将上文所述的任意结合酶的磁性纳米粒子或其聚集物（即，BNC）用于解聚或促进木质素解聚。被解聚的木质素可以是任意含有木质素的材料。前体木质素可以是自然界中存在的或本领域公知的多种多样木质素成分中的任意一种。
[0074] 如本领域所公知的，在自然界中没有统一的木质素成分。木质素是在不同种属的植物之间呈现出显著组分差异的随机聚合物。多种其它条件如环境条件、寿命和处理方法均影响木质素的成分。木质素的差异主要是三种醇单元的比率，即p-香豆醇、愈创木醇和芥子醇。p-香豆醇、愈创木醇和芥子醇的聚合作用分别形成木质素聚合物的p-羟苯基（H）、愈创木基（G）和紫丁香基（S）组分。前体木质素可以具有多种多样的H、G和S组分相对重量百分百（wt%）中的任意一种。除了木质素的天然差异之外，其可能还进一步存在由于对木质素处理方法不同造成的成分差异。例如，前体木质素可能是硫酸盐木质素、亚硫酸盐木质素（即，木质素磺酸盐）或无硫木质素。
[0075] 木质素是地球上最丰富的芳香生物聚合物，但是由于其化学成分和物理结构存在明显的随机性，因而其对转化和生物转化具有化学抗性。可以将木质素认为是多糖纤维之间的“胶”或“环氧树脂”，其为脉管植物的细胞壁提供了强度、刚性和保护。从化学的角度看，木质素是由类苯基丙烷分子包括松柏醇、芥子醇和香豆醇通过芳基键、醚键和碳碳键聚合形成的高度异质性的聚合物。
[0076] 基于1吨生物质生产100加仑乙醇且所述生物质（例如木材和草）含有平均约20%的木质素的假设，能够迅速估算出生物提炼处理1亿加仑的年生产能力能够产生约
200,000吨木质素材料。仅就美国而言，为达到2020年时替代20%汽油的目标，相当于约
350亿加仑乙醇，每年将产生共计约7亿吨木质素。在世界范围内木质素的实际产生情况约为每年9千万吨，其主要为造纸的副产物硫酸盐木质素。换言之，在世界范围内木质素的产生将以高于一个数量级的方式增长。
200,000吨木质素材料。仅就美国而言，为达到2020年时替代20%汽油的目标，相当于约
350亿加仑乙醇，每年将产生共计约7亿吨木质素。在世界范围内木质素的实际产生情况约为每年9千万吨，其主要为造纸的副产物硫酸盐木质素。换言之，在世界范围内木质素的产生将以高于一个数量级的方式增长。
[0077] 根据用途和化学纯度，可以将木质素用于生产低价和高价产品。直到最近，与回收来自其燃烧的能量相比，木质素产品的市场并没有足够庞大、具有竞争力和吸引力，从而抵偿分离和纯化木质素的成本。这主要是因为油料的成本仍较低且供应较高，其足以为化学和材料工业提供基础材料。然而，在基于生物燃料和生物产物共同生产的碳水化合物经济框架下，预计用于转化的高纯度的分离木质素将为每kg原始材料$1.10，相比之下用于混烧时为$0.04。低端应用主要用作分散剂、用于碳固定的土壤改良剂、肥料和杀虫剂的吸附剂、以及燃料，这些应用在提取后很少或不需要进一步的转化。高端应用需要将木质素解聚，包括产生酚前体（DMSO、香草醛、酚和芳香化合物）和聚合物组分（例如环氧树脂、聚氨酯泡沫、酚醛树脂粉末、碳纤维以及胶和粘合剂）。
[0078] 在自然界中，木质素的转化通过特定微生物进行，特别是真菌和细菌。木质纤维细菌和真菌具有降解木质素以获得生物质纤维素成分的能力。为实现这一目标，木质纤维细菌和真菌分泌一系列氧化还原酶，包括漆酶、氧化酶和过氧化物酶，以及产生有机酸和H2O2的过氧化氢酶。最强的氧化还原酶由被称为白腐真菌的特定类型的真菌产生，其专门用于木质纤维的降解。不同类型真菌过氧化物酶底物的性质不同。
[0079] 木质素过氧化物酶（LiP，E.C.1.11.1.14）催化大量模型化合物的C-C键氧化裂解，并将苄基醇氧化为醛或酮。木质素过氧化物酶催化的典型反应为Cα-Cα裂解、Cα氧化、烷基芳基裂解、芳环裂解、脱甲基化、羟基化和聚合。白腐担子真菌中，木质素过氧化物酶参与了木质素的氧化分解。木质素过氧化物酶利用H2O2催化非酚芳环成为芳基阳离子自由基的氧化反应。典型的例子是藜芦醇（3,4-二甲氧基苄基醇）通过中间形成藜芦基阳离子和苄基自由基成为藜芦醛（3,4-二甲氧基苄基醛）的氧化反应：藜芦醇+H2O2→藜芦醛+2H2O。锰过氧化物酶（MnP；E.C.1.11.1.13）与LiP（至多1.5V）相比具有更低的氧化还原电位（至多1.1V），其催化木质素和酚化合物由Mn介导的氧化反应。这种酶利用H2O2催化Mn(II)成为Mn(III)的氧化反应。在存在二羧基酸的条件下，高反应性Mn(III)通过螯合+作用稳定化：2Mn(II)+2H+H2O2→2Mn(III)+2H2O。MnP的目的为产生小而高效的氧化剂，其扩散进入木质化细胞壁中，并从内部实现对木质素的解聚。通用过氧化物酶（合成的混合过氧化物酶，锰-木质素过氧化物酶：VeP EC1.11.1.16）是一种相当新颖的木质素分解酶，其具有锰过氧化物酶（Mn(II)的氧化反应）、木质素过氧化物酶（非酚芳香化合物不依赖于Mn的氧化反应）和植物过氧化物酶（氢醌和取代酚的氧化反应）的组合催化性质。在本文所述的木质素解聚工艺中可以使用上文所述过氧化物酶中的任意一种或其组合。
[0080] 在第一个实施方式中，含有木质素的材料是部分地或基本上与木材的其它成分（例如，纤维素和半纤维素成分）分离的形式，因为其通常经过木质纤维素材料的预处理工艺，上述工艺的细节是木质纤维素处理和转化领域所公知的。预处理工艺用于将木质素与含木质素的来源中的其它成分分离，或者用于削弱木质素与其它成分之间的结合。可以通过例如提取对木质素进行进一步分离，这也是本领域所公知的。在第二个实施方式中，含有木质素的材料是含有木质素的消耗品如纸张或纸板，其可以或可以不经过预处理。在第三个实施方式中，含有木质素的材料是含有木质素的天然原料（即，粗木质纤维材料）如木屑、草（例如，柳枝稷和混合草）、玉米秸秆（例如，玉米植物的叶、外皮、茎或穗轴）、甘蔗、锯末、麻或其组合，其通常均经过预处理以使得木质素能够用于解聚反应。
[0081] 在木质素解聚工艺中，在利用酶结合磁性纳米粒子或其聚集物的自由基活性使木质素部分或完全解聚的条件下，将上文所述的任意与酶结合的磁性纳米粒子或其聚集物与含有木质素的材料接触。通常通过将酶结合磁性纳米粒子或其聚集物与含有木质素的材料一同加入水溶液中使其接触，该水溶液如对含有木质素的材料进行预处理工艺使用的水溶液。在一些实施方式中，在解聚工艺中使用室温条件（例如，至少15、18、20或22℃和至多25℃或30℃）。在其它实施方式中，在解聚工艺中使用升高的温度条件（例如，高于30℃，或者至少或高于35、40、45、50或60℃，或者达到FRP酶降解或活基本上失去活性的温度）。
在其它实施方式中，在解聚工艺中使用降低的温度条件（例如，低于15℃，或者至多或低于
10、5或0℃）。与其原有形式相比，解聚时木质素断裂为更短的片段。完全解聚后全部或绝大部分木质素（例如，至少80、90或95%）转化为至少一个或多个木质素的基本结构单元，即松柏醇、芥子醇和香豆醇及其衍生物。一般而言，部分解聚使得少于80%或者至多70、60、
50、40、30、20、10、5或1%的木质素转化为原始的结构单元，其余的木质素转化为含有两个、三个、四个或更多的（甚至至多10、20、50、100、200、500或1000）结构单元重复（例如，分别为来自松柏醇、芥子醇和香豆醇的p-羟苯基、愈创木基和紫丁香基单元）。由于不同的木质素解聚度可以优选用于不同的应用，因而可以对解聚条件进行适当调整以提供适宜的解聚度或与其它相比偏向于产生一种或多种类型的解聚产物。
在其它实施方式中，在解聚工艺中使用降低的温度条件（例如，低于15℃，或者至多或低于
10、5或0℃）。与其原有形式相比，解聚时木质素断裂为更短的片段。完全解聚后全部或绝大部分木质素（例如，至少80、90或95%）转化为至少一个或多个木质素的基本结构单元，即松柏醇、芥子醇和香豆醇及其衍生物。一般而言，部分解聚使得少于80%或者至多70、60、
50、40、30、20、10、5或1%的木质素转化为原始的结构单元，其余的木质素转化为含有两个、三个、四个或更多的（甚至至多10、20、50、100、200、500或1000）结构单元重复（例如，分别为来自松柏醇、芥子醇和香豆醇的p-羟苯基、愈创木基和紫丁香基单元）。由于不同的木质素解聚度可以优选用于不同的应用，因而可以对解聚条件进行适当调整以提供适宜的解聚度或与其它相比偏向于产生一种或多种类型的解聚产物。
[0082] 由于每种含有木质素材料的各自结构单元具有不同的分布情况和相对量，因而解聚产生的各种产物的相对量非常依赖于含有木质素材料的类型。在解聚工艺中通常还产生其它的解聚产物，例如芳香醛、酮、醇和酸，一般量较少。在不需要此类其它产物的实施方式中，通过调整反应条件可以方便地将其有益的减少或消除，上述反应条件包括对FRP结合磁性纳米粒子或其聚集物进行适当的选择。
[0083] 可以将上文所述的任意酶结合磁性纳米粒子和聚集组合物用于木质素解聚工艺。在特定实施方式中，用于木质素解聚工艺的FRP酶是过氧化物酶，特别地，是降解木质素的过氧化物酶如木质素过氧化物酶、通用过氧化物酶、锰过氧化物酶或其组合（包括其核-壳组合）。更特别地，FRP酶还可以是真菌、细菌或植物过氧化物酶。在特定实施方式中，FRP酶是两个FRP酶的系统，如真菌过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的组合，或者过氧化物酶和/或氧化酶与漆酶的组合。
[0084] 在一些实施方式中，木质素解聚工艺与下游工艺是偶联的（即，整合的），在所述下游工艺中将木质素解聚工艺生产的解聚产物用于生产其它产品。下游工艺可以将木质素解聚产物转化为，例如生物燃料或工业化学产品，例如聚合物、塑料、聚合物前体（单体）、溶剂、粘合剂、涂料、洗涤剂、润滑剂、食品、药品、或香料或其前体。或者，下游工艺可以将木质素解聚产物掺入任意此类最终产品。
[0085] 在一些实施方式中，木质素解聚工艺与上游工艺是偶联的，在所述上游工艺中提供用于本申请所述的木质素解聚工艺的含有木质素的材料。上游工艺可以是，例如纸或纸浆生产工艺、生物质转化为生物燃料的工艺（即，主要是将纤维素材料水解并转化为生物燃料）或者生物质转化为乙醇的发酵工艺（即，主要是将纤维素材料水解并转化为乙醇）。
[0086] 在另一个方面，本发明涉及一种从水中除去芳香族污染物的工艺（即，水体修复工艺）。在所述工艺中，将受到一种或多种芳香族物质污染的水与任意上文所述的酶结合磁性纳米粒子或其聚集物接触，以使得芳香族物质沉淀，即形成不溶性物质。然后优选对沉淀的（即，沉积）材料如通过离心或沉降进行进一步分离，并通过例如过滤或倾晰将其从水中除去。不囿于任何理论，可以相信芳香族物质与酶结合磁性纳米粒子产生的自由基反应产生了来源于芳香族物质的聚合物质。芳香族污染物可以是任意芳香族物质，包括较常见于受污染水中的那些。在一些实施方式中，芳香族污染物是苯或苯的衍生物，如卤代苯（例如，氯苯、二氯苯、溴苯或多氯联苯即PCB）、烷基苯（例如，甲苯、乙苯或二甲苯）、酚类物质（例如，苯酚、间苯二酚、儿茶酚或甲酚）、醚化苯（例如，茴香醚）、稠环化合物（例如，萘或聚芳烃）、苯胺类物质（例如，苯胺和N-烷基或N,N-二烷基取代苯胺）或者苯甲酸化合物（例如，苯甲酸及其酯和苯甲酸的羟基取代衍生物）。在其它实施方式中，芳香族污染物是杂芳香族物质如呋喃、吡喃、二恶英、噻吩、吡啶、吡嗪、嘧啶、吡咯、咪唑、吲哚及其衍生物。
[0087] 可以将任意上文所述的酶结合磁性纳米粒子和聚集组合物用于水体修复工艺。在特定实施方式中，在水体修复工艺中使用的FRP酶是辣根过氧化物酶或者辣根过氧化物酶与氧化酶的组合。
[0088] 在另一个方面，本发明涉及一种通过自由基反应使可聚合的单体聚合的工艺。在所述工艺中，将一种或多种类型的单体与任意上文所述的酶结合磁性纳米粒子或其聚集物反应以使得单体聚合。所述单体可以是，例如上文所述的水体修复工艺中的任意物质。在特定实施方式中，所述单体是或者包括乙烯基加成单体。在聚合中，产生乙烯基加成聚合物。此类单体的一些例子包括乙烯、丙烯、丁二烯、丙烯酸及其酯、异丁烯酸及其酯、丙烯腈、乙酸乙烯酯、苯乙烯、二乙烯基苯、氟化乙烯和氯化乙烯。在其它实施方式中，所述单体是酚类化合物。在聚合中，产生酚树脂或聚合物。聚合工艺可以采用本领域公知的用于实施聚合反应的任意条件和装置，特别是用于自由基引发的聚合反应的那些。
[0089] 对于上文所述的任意工艺而言，酶结合磁性纳米粒子及其聚集物能够方便地通过磁分离进行捕获以防止污染最终产品。而且，本文所述的酶结合磁性纳米粒子或其聚集物进一步的优点是在多种情况下保持活性并在被捕获后再生的能力，这允许其在被捕获后重新使用。有益的是，在经过若干个循环后，失活的BNC能够被容易地提取和浓缩成其固体形式以减少浪费和提供更有效的工艺。通过酶的变性、超声和纯化处理以使其重新储存和重新使用新鲜的功能性酶可以将金属涂覆的BNC用于其它用途。由在表面上磁性捕获自组装BNC制备的微-生物纳米催化剂（微-BNC）在使用较低强度磁场的工艺应用中具有吸引力。与介孔和低密度的MNP聚集物相比，更大和密度更高的铁磁性粒子具有更高的质量磁化率。微BNC是稳定的、纳米化的和具有介孔结构的，其有助于保持酶的活性同时增加磁性催化剂的整体密度和质量磁化率。这些超微结构使其本身更易于被由小永磁体和弱场电磁体产生的外部磁场所控制。在将微-BNC磁性捕获时，可以清除和更换反应溶液，因此只要酶保持其工艺水平的活性，微-BNC就可以连续使用。
[0090] 下文中列出的实施例用于解释和描述本发明的最佳方式。然而，本发明的范围不应以任何方式受到本文所述实施例的限制。实施例
[0091] 试剂和仪器
[0092] 本研究中使用的酶是辣根过氧化物酶（HRP,E.C.1.11.1.7，VI-A型）、木质素过氧化物酶（LiP,E.C.1.11.1.14）、锰过氧化物酶（MnP;E.C.1.11.1.13）、通用过氧化物酶（合成的混合过氧化物酶，锰-木质素过氧化物酶：VeP EC1.11.1.16）和漆酶。本文中使用的所有酶均是从商业来源获得。辣根过氧化物酶（HRP,E.C.1.11.1.7，VI-A型）的纯度值指数（OD A403/A280）为约2.9。高活性形式通过使用阴离子交换柱（Resource Q,GE Bioscience）的FPLC（AKTA Explorer,GE Bioscience）进一步纯化获得。使用的漆酶没有经过进一步纯化。在280处监测蛋白信号，在405nm处监测亚铁血红素信号。对于各酶而言，将RZ高于1的成分合并在一起、浓缩和分装。苯酚、高香草酸、藜芦醇、甲氧基苯酚、4-氨基安替比林（AAP）、葡萄糖（上述的纯度为98%）、pH7.4和67mM的磷酸钠缓冲液（PBS）、磁铁矿微粒粉末、硫酸锰、过氧化氢、FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O、O-乙基磷酸二胺、四氯化金，以及丙二酸和酒石酸二钠盐均是从商业来源获得。
[0093] 合成氧化铁磁性纳米粒子
[0094] 在碱性条件下，通入氮气于25℃（M25）或90℃(M90）通过Fe2+和Fe3+的共沉淀合成磁性纳米粒子。在持续搅拌条件下，将铁盐（2g FeCl2·4H2O和5.2g FeCl3·6H2O）的酸性溶液（25ml）滴加至NaOH（250ml，1.5M）中。反应前在所有溶液中通入氮气15分钟以实现非氧化条件。使用铷磁铁捕获Fe3O4的瞬时黑色沉淀、洗涤、中和并保持在蒸馏水中直至进一步使用。
[0095] 使用金包覆氧化铁磁性纳米粒子
[0096] 通过在超声条件下将四氯化金离子在O-乙基磷酸二胺（OPEA）功能化的MNP上温和地还原以实现磁性纳米粒子的包覆。在氮气下使用改良的与声波浴偶联的旋转蒸发装置进行涂覆操作。简言之，将20mg MNP（1mg/ml）超声处理30min。加入OPEA（2g）并使其在超声和旋转条件下与MNP（终体积为40mL）反应2小时。使用稀土磁体捕获OPEA功能化的MNP，并洗涤3次以除去过量的OPEA。将OPEA功能化的MNP重悬于含100μL硝酸（1N）的milliQ水中，并超声1小时。将四氯化金（10至30mg）加入OPEA功能化的MNP中，并使其反应30分钟。将声波浴的温度升高至85℃，并在该温度注入柠檬酸/柠檬酸盐（50:50，总计50mM，pH5.5）。在超声和快速旋转条件下以不同体积（至多100mL）和不同包覆时间（至多60min）进行金包覆。将反应容器至于冰上，加入5g CaCO3终止反应。磁性捕获MNP-OPEA-Au纳米粒子，洗涤四次以除去过量试剂，并储存直至进一步使用。
[0097] 合成生物纳米催化剂（BNC）
[0098] 所有的BNC均由涂覆金或不涂覆的M90或M25磁性纳米粒子形成。BNC由辣根过氧化物酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶或通用过氧化物酶形成。典型的BNC合成要求MNP在初始是单分散的（即，个体化的和非聚集的MNP）。在室温条件下将MNP在超声浴中超声20分钟，并立即用于形成BNC。在预实验中，研究缓冲液组分、缓冲液强度和孵育时间以测定其对BNC的形成和酶活性的影响。由于无离子补偿电荷，因而认为在水中BNC的形成超过一小时最有效；在研究的其余部分使用该方案。检测使用的过氧化物酶终浓度的范围为0.1至10nM。还发现BNC具有50%或更低的饱和度（单位表面积）时增加的活性更高，因-1而相应地调整加入酶中的MNP的量。典型地，检测中MNP的终浓度在0.5至50μg.ml 之-1
间。典型的比率为1nM酶（HRP）对2μg.ml MNP（检测中的终浓度）。将酶和MNP同时加入，并在4℃下持续搅拌孵育至少12小时。典型地，在储备溶液中形成BNC以进行生化反应需要的5或10倍浓度存在。在临检测前，将BNC最终稀释成检测所需的终浓度。对于核/壳聚-酶系统BNC的合成而言，首先通过将第一种酶（过氧化物酶或葡萄糖氧化酶，核心的酶）反应形成核BNC，超声MNP7小时，然后将第二种酶（过氧化物酶或葡萄糖氧化酶=外壳的酶）加入适当比率的经超声的MNP，并孵育至少7小时。对于随机的葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的BNC而言，将经超声的MNP和酶同时加入，并孵育14小时。
间。典型的比率为1nM酶（HRP）对2μg.ml MNP（检测中的终浓度）。将酶和MNP同时加入，并在4℃下持续搅拌孵育至少12小时。典型地，在储备溶液中形成BNC以进行生化反应需要的5或10倍浓度存在。在临检测前，将BNC最终稀释成检测所需的终浓度。对于核/壳聚-酶系统BNC的合成而言，首先通过将第一种酶（过氧化物酶或葡萄糖氧化酶，核心的酶）反应形成核BNC，超声MNP7小时，然后将第二种酶（过氧化物酶或葡萄糖氧化酶=外壳的酶）加入适当比率的经超声的MNP，并孵育至少7小时。对于随机的葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的BNC而言，将经超声的MNP和酶同时加入，并孵育14小时。
[0099] 合成微-生物纳米粒子（微-BNC）
[0100] 通过形成的BNC和商品化的亚微米磁性粒子反应合成微-BNC（μBNC）。将亚微米粒子在水中重悬，并且在超声浴中超声20分钟。在4℃将形成的BNC和经超声的微粒在水中于持续搅拌下孵育6小时。以重量计亚微米商品粒子的量至少要比形成BNC的MPN的量高一个数量级。当在经小磁体磁性捕获后的上清液中检测不到纳米粒子时，认为BNC捕获完全。
[0101] 表征磁性纳米粒子和介孔聚集物
[0102] 使用 （Quantum Design）磁强计利用超导量子干涉仪（SQUID）技术对磁特性进行检测。在300K外部磁场范围40Oe至50kOe下确定磁滞曲线。使用透射电子显微镜（TEM）图像处理测定平均粒径、粒径分布和簇粒径。使用UHV-STEM显微镜（VG,UK）进行TEM检测。使用Image Analysis Image J软件（NIH,Washington DC）和JmicroVision（V1.27）对图像进行处理。由最少1000个粒子计算纳米粒子和簇的粒径分布。使用Micrometrics ASAP2020物理吸附仪获得氮吸附-解吸附等温线。使用Barrett–Joyner–Halenda（BJH）法利用N2吸附等温线计算孔径分布。
[0103] 解析磁性纳米粒子
[0104] 图1中的X-射线衍射图确证了MNP由磁铁矿制备。上文所述的合成使用廉价试剂并且能够容易地定制粒径（图2A，2B）和磁场（图3）。如图2A和2B所示，M90具有更加均一的粒径分布，其平均粒径为10nm（±1），而M25具有更宽的粒径范围，其平均粒径为8nm，粒子最小为5nm。如图3所示，两种MNP均具有总体上可以忽略不计的剩余磁化强度（MR），这是表示超顺磁性。如图4A-4C和5A所示，在检测使用的磁铁矿浓度下，M25MNP大部分是单分散的小簇和游离的纳米粒子，而M90形成了平均直径为100nm的大簇。如图7和8所3 -1 3 -1
示，M90和M25的总孔体积分别为0.39cm.g 和0.14cm.g 。当对孔隙度进行校正时，发-3 -3
现簇的平均密度为ρM253.03g.cm 和ρM901.72g.cm 。
示，M90和M25的总孔体积分别为0.39cm.g 和0.14cm.g 。当对孔隙度进行校正时，发-3 -3
现簇的平均密度为ρM253.03g.cm 和ρM901.72g.cm 。
[0105] 使用辣根过氧化物酶（HRP）定量所捕获的酶
[0106] 通过使用高通量FTIR光谱仪（HTS-XT-Vertex70,Bruker，德国）对具有变性HRP的磁性纳米粒子进行定量。在60℃的真空条件下将50微升BNC浆体在透射硅96孔板上干-1燥一小时，并在真空条件下室温继续干燥过夜。记录4,000和400cm 之间的光谱，扫描32次，在测定各样品前记录本底。设置三复孔对样品进行分析；在板上使用磁铁矿和磁铁矿加HRP作为标准品以检测各样品中蛋白和纳米粒子的浓度。使用Matlab软件的最小二乘拟合法通过拟合Langmuir方程的二次型获得吸附等温线参数：
[0107]
[0108] 在上述式（1）中，Q是表面上所吸附的酶（nmol·m-2），C*是初始酶浓度（nmol.m-2），Qm是结合酶的最大量（nmol.m-2），以及Ka是吸附常数（m2.mol-1）。在动力学实验中使用这些参数以直接从HRP的初始浓度计算平衡时HRP的结合部分。
[0109] 表征过氧化物酶活性
[0110] 酚/AAP检测：使用显色酚/AAP检测监测原本HRP和BNC的过氧化物酶活性，所述检测产生易于与氨基芘反应形成粉色醌亚胺染料的苯氧基自由基。使用具有进样能力和温度控制室的自动酶标仪（Synergy4,Biotek）记录30分钟96孔板（四复孔）中的溶液在510nm的吸光度。检测中酚和AAP标准试剂（200μl）的浓度分别为80mM和13mM。检测不同的缓冲液和缓冲液强度。注入过氧化氢以引发反应，其浓度范围为10-7M至1M。扣除纳米粒子和底物产生的本底。对于HRP而言，利用使用Langmuir吸附参数估算结合量的差以计算游离酶的量，因为HRP的浓度较低和MNP的本底较高使得无法直接估算游离酶的量。对于各批次而言，建立游离酶的速率标准曲线，并用于校正当不是全部酶分子均结合时游离酶对总活性的贡献。根据初始反应率计算速率（V）和比活度（A）（mmol产物.s-1.mmol酶-1）。
[0111] 使用模型底物的真菌过氧化物酶活性：在96孔UV透明微孔板（Falcon）中使用标准比色法方案在酒石酸钠或丙二酸钠中进行比色法检测（LiP：藜芦醇，pH3，310nm；MnP：2,6二甲氧基酚，pH4.5，468nm和针对形成的Mn3+-有机酸复合物为270nm；VeP：藜芦醇或
2,6二甲氧基酚，pH4.5，310nm、468nm、270nm）。
2,6二甲氧基酚，pH4.5，310nm、468nm、270nm）。
[0112] 采用高香草酸（HVA）荧光检测过氧化物酶活性：开发一种荧光检测以测定过氧化物酶动力学的初始速率。HVA自由基能够聚合形成荧光二聚体（λex310nm，λem405nm）。在具有注射器混合能力以进行反应引发剂（H2O2或葡萄糖）稀释的Biotek酶标仪上执行自动序列程序。通过将HVA（10mM）与亚铁氰化钠（15mM）和氢氧化铵（15mM）反应合成用于化学反应的荧光二聚体原料，并在用于酶反应的缓冲液中将其用作定量标准品。所有的反应均设三复孔，数据以相对荧光单位（mRFU）表示。
[0113] 木质素解聚检测：使用HRP、LiP、VeP和MnP，及其BNC进行硫酸盐木质素解聚检测。在存在锰的条件下进行MnP和VeP检测。检测设为三复孔，在pH5.5的酒石酸钠或丙二酸钠缓冲液中进行。将硫酸盐木质素浆体（10mg/ml）孵育1或4小时，然后通过0.2μm孔的膜滤器过滤以除去粒子。使用Biotek酶标仪获得溶液的UV-Vis光谱。在280和310nm处监测木质素解聚释放的芳香分子。对光谱进行背景校正。
[0114] 酚聚合检测：酚消除检测为两步法。第一步为在1mM的PBS缓冲液中用辣根过氧化物酶形成多酚。反应体积固定为2mL或10mL。将酚终浓度固定为1mM，HRP的终浓度固定为30nM。M90形成的BNC的酶与纳米粒子的比率是变化的。第二步为通过加入氯化钠（500mM）沉淀这些多酚。将样品12,000g离心20分钟，并收集上清液。使用Biotek酶标仪在280nm处检测溶液中的可溶性酚。
[0115] 动力学参数
[0116] 使用在监测波长下形成的各产物消耗的V/mmolHRP的比率计算比活度A（mmol产-1 -1物.s .mmolHRP ）。使用衍生自乒乓双向（ping-pong bi-bi）2底物抑制模型的H2O2底物抑制模型通过GraphPad Prism（La Jolla,CA,USA）的最小二乘拟合法得到反应的动力学参数。经修订的模型方程为：
[0117]-1
[0118] 在式（2）中，Vmax是最大酶速率（mmol.s ），酶反应能够达到的最大速率，单位与V-1相同，Km是Michaelis-Menten常数（mM），Ki是H2O2的抑制常数（mM）。kcat（s ）由Vmax和结合HRP的总量计算得到。
[0119] 与HRP形成的磁性BNC的形成、鉴定和活性
[0120] 通过BNC簇粒径的总体增加确证了在MNP簇中捕获了酶分子（图4A和5G）。尽管M25-BNC的粒径略有增加且簇更大，但是M25MNP（图4B）和M25-BCN（图4C）均具有较小的簇粒径。M90NMP（图5A）和M90-BNC（图5D）的比较表明M90纳米粒子聚集物的粒径增加比M25更大。而且，与M90本身的聚集物（图5B和5C）相比，M90BNC的聚集物（图5E和5F）具有更高的密度，即由更多的MNP和更紧密的MNP制成。通过M25和M90在HRP吸附性能之间的差异进一步确证了MNP簇内捕获了酶分子（图6）。这两种BNC均具有孔小于50nm的介孔（图7和8）。与M25-BNC相比，M90-BNC具有更大的总孔体积和更大的平均孔径。复合物形成的差异结果导致了MNP簇超微结构不同，结果使得纳米粒子的磁化强度和所得到的簇介孔孔隙度不同。特别地，M90-BNC的自组装似乎是在介孔聚集物中的表面吸附和分子捕获的双重机制导致的。
[0121] M90具有较高的Ka，这表明与其对酶具有比M25更高的亲和性（图6）。在对所捕获-1的酶进行的定量时，发现当使用1nM HRP和4μg.ml 磁性粒子时，少于50%的总HRP负载能够与M25结合形成M25-BNC复合物，而在M90中捕获的酶为100%。如图11A、11B、12A、12B和13所示，增加的活性随BNC形成的不同条件而改变。在pH6.5的超纯水中形成具有最高
2+
活性的BNC，这表明在纳米粒子的表面上存在Fe-OH 阳离子物质。在这一pH和不存在任何其它补偿电荷的条件下，HRP分子巨大的表面上均带有负电，这使得其能够与磁铁矿通过静电相互作用形成复合物。当对在PBS中形成的BNC进行检测时（图11A），增加的活性低于在水中形成的BNC（图11B）。在PBS中形成的BNC在全体中增加的活性最低。当对在丙二酸盐中形成的BNC进行检测时（图12A），其增加的活性与在水中形成的BNC具有相同的范围或更低（图11B）。当对在酒石酸盐中形成的BNC进行检测时（图13A），其增加的活性低于在水中形成的BNC（图13B）。亦如图11B、12B和13B所示，与在其它离子缓冲液中形成的BNC相比，仅在水中形成的BNC持续显示出具有更高的增加的活性，即使当在检测中使用其它缓冲液时盐的浓度更高。
2+
活性的BNC，这表明在纳米粒子的表面上存在Fe-OH 阳离子物质。在这一pH和不存在任何其它补偿电荷的条件下，HRP分子巨大的表面上均带有负电，这使得其能够与磁铁矿通过静电相互作用形成复合物。当对在PBS中形成的BNC进行检测时（图11A），增加的活性低于在水中形成的BNC（图11B）。在PBS中形成的BNC在全体中增加的活性最低。当对在丙二酸盐中形成的BNC进行检测时（图12A），其增加的活性与在水中形成的BNC具有相同的范围或更低（图11B）。当对在酒石酸盐中形成的BNC进行检测时（图13A），其增加的活性低于在水中形成的BNC（图13B）。亦如图11B、12B和13B所示，与在其它离子缓冲液中形成的BNC相比，仅在水中形成的BNC持续显示出具有更高的增加的活性，即使当在检测中使用其它缓冲液时盐的浓度更高。
[0122] 使用酚/APP检测测定瞬时自由基浓度，使用这些测定结果来计算归一化的BNC活性。根据BNC的活性除以相同浓度下游离酶的活性得到的比率计算归一化的活性。对于M90-BNC而言，在预孵育1小时后达到与游离酶相比的最大活性。归一化活性的增加可以稳定超过24小时。如图9A和9B所示，在孵育10分钟后M25-BNC增加的活性达到最大。这些结果清楚地表明增加的活性仅仅是由固定化的酶引起，而不仅仅因在溶液中存在MNP。而且，如图10所示，该结果还表明HRP与不同粒径、磁性和比率磁性纳米粒子的结合产生具有不同比活度的复合物。如图14所示，具有最大量捕获酶的BNC的饱和状态会一致地降低活性。
[0123] 使用初始反应速率估算Km、Vmax、Ki和kcat，分别进一步在如图15-18所示的曲线中显示。M25或M90MNP的Vmax低于游离HRP和BNC若干数量级。转换率kcat与游离HRP、M25-BNC和M90-BNC的数据集非常一致。由M25和M90形成的BNC均具有更高的Km。M25-BNC的Vmax和kcat比相同浓度的游离酶高两至三倍。而且，M25-BNC的kcat随结合酶组分增加，而Ki与游离HRP在相同范围内。在结合酶为0.5nM时，M25-BNC和M90-BNC根据kcat/Km估3 3 -1 -1
算的MNP效率分别为6.75x10 和5.5x10s mM 。这些动力学结果与所观察到的反应速率的趋势一致。M90-BNC的Ki比游离HRP高约10倍，而其Vmax类似。M90具有更高的Ki表明与游离酶和M25-BNC相比来自H2O2的底物抑制程度更低。
算的MNP效率分别为6.75x10 和5.5x10s mM 。这些动力学结果与所观察到的反应速率的趋势一致。M90-BNC的Ki比游离HRP高约10倍，而其Vmax类似。M90具有更高的Ki表明与游离酶和M25-BNC相比来自H2O2的底物抑制程度更低。
[0124] 对不同缓冲液、pH和温度下M90-BNC的活性进行了进一步研究（图19A、19B、20A和20B）。在所检测的无机和有机缓冲液和温度范围内也观察到了M90-BNC的活性具有类似的增加。与单独的HRP相比，发现在较低温度下BNC更有效率，因为游离酶在较高温度下具有更高的速率。发现M90-BNC对pH敏感，其速率随pH的升高而增加，且在无机缓冲液中归一化的活性具有pH依赖性。在有机酸缓冲液中未观察到pH的显著影响。
[0125] 其它酶系统中BNC的活性
[0126] 通用过氧化物酶-BNC的活性：BNC由通用过氧化物酶形成（图21）。如图21中的活性曲线所示，在由M90形成的BNC中观察到了最大活性。使用有机聚合物的表面修饰仅使得活性适度增加但过氧化氢的抑制降低。
[0127] 锰过氧化物酶-BNC的活性：BNC由锰过氧化物酶形成（图22）。如图22中的速率曲线所示，与未涂覆的磁性纳米粒子相比，金涂覆MNP的反应速率进一步增加。在不同涂覆条件（和纳米粒径）之间观察到的差异造成速率增加不同。
[0128] 漆酶-BNC的活性：BNC由漆酶形成（图23）。如图23中的检测曲线所示，当在非最佳条件下（较低或较高的pH）使用酶时，观察到了漆酶活性的增加。活性的增加虽然不像过氧化物酶一样高，但是与游离的漆酶相比仍具有显著性。值得注意的是，漆酶实现其功能不需要过氧化物，因而不会受到强的底物抑制。如上文所观察到的，BNC针对底物抑制和更严苛的反应条件（例如，pH、温度和离子强度）提供了较强的保护作用。
[0129] 葡萄糖氧化酶和过氧化物酶系统的活性：BNC由葡萄糖氧化酶/过氧化物酶二元系统形成（图24A-24D和25）。在这种配置中，葡萄糖氧化酶的活性提供过氧化物以便将过氧化物酶活化。使用高度单分散的金涂覆MNP对不同配置进行检测。如图24A-24D和25所示，在所使用的Gox和HRP的比率下，未观察到酶系统的抑制。采用HRP在簇核心，Gox在外层及与之相反的或者随机分布的核/壳设计。在葡萄糖浓度较低时，与游离酶和随机分布的BNC相比，核/壳BNC显示出增加的活性。值得注意的是，该系统允许使用葡萄糖替代过氧化氢，与过氧化氢相比，葡萄糖的成本低得多、更丰富且危害更低。
[0130] 将这些新型的BNC进一步固化在更大的铁磁性亚微米粒子上。商品化的磁性粒子及使用BNC对其表面功能化后的扫描电子显微镜（SEM）的显微照片如图26A和26B所示。尽管这些铁磁性粒子聚集物的粒径为微米级，但是单个微晶均是亚微米级的。铁磁性微粒易于捕获在其表面形成小簇的较小的BNC。尽管MNP具有一定的磁性，但是需要强磁场才能将其捕获。而且，MNP越小和单分散性越高，外部磁场捕获其所需的时间越长。BNC-微粒簇基本上克服了该缺陷。而且，如图27和28A-28C所示，BNC-微粒簇的酶活性与BNC的活性相似（图27），并且能够被非常小的磁性所捕获以再利用或搅拌（图28A-28C）。这种μBNC配置使得该催化剂工艺能够在现实世界中应用。
[0131] 由真菌过氧化物酶形成的磁性BNC对木质素的解聚
[0132] 展示了使用BNC进行的木质素解聚。进行木质素解聚检测以测定可溶性芳香族化合物（例如，松柏醇、芥子醇和香豆醇及其衍生物）的产生。如图29中的吸收曲线所示，在真菌过氧化物酶系统的特征波长下观察到了增加的信号。亦如图29所示，由辣根过氧化物酶（植物过氧化物酶）形成的BNC不会使木质素释放任何芳香族分子。如图30-33所示，使用真菌过氧化物酶BNC时观察到了木质素的解聚。
[0133] 由HRP形成的BNC对酚的聚合
[0134] 展示了使用辣根过氧化物酶的BNC的酚消除作用。如图34中的图片所示，采用两步法进行酚聚合检测：（i）酶促聚合成多酚，和（ii）利用氯化钠将多酚聚合物浓缩。如图35中的活性曲线所示，与游离酶相比在，由HRP和M90MNP形成的BNC具有更高的酚消除效率。上述结果表明当使用BNC而不是游离HRP系统时，酚消除作用得到显著改善。如图36所示，除了增加酚消除的程度以外，在BNC系统中的H2O2浓度改变以达到最大的消除作用（或聚合作用）。这表明与游离酶相比BNC具有较低的H2O2抑制。而且，BNC系统提供了更加宽泛的H2O2浓度范围。这些特性表明与其游离形式相比BNC能够在不稳定的和更加严苛的工艺条件下使用。
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