一株灰色链霉菌CCCQ171及其应用
阅读：35发布：2024-01-01
专利汇可以提供一株灰色链霉菌CCCQ171及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株灰色链霉菌（Streptomyces griseochromogenes）CCCQ171及其应用，所述灰色链霉菌CCCQ171其保藏编号为：CGMCC No.6227，根据产地命名为嘉陵菌。本发明还公开了所述灰色链霉菌CCCQ171在农用 微 生物 菌剂中的应用及其农用微生物菌剂，所述农用微生物菌剂中含有灰色链霉菌CCCQ171，所述农用微生物菌剂用于防治 烟草 病害或诱导烟草对烟草病害产生抗性。所述灰色链霉菌CCCQ171是从烟田 土壤 中分离获得，与自然生态具有天然的和谐相融性，与化学 农药 相比对土壤生态无毒 副作用 、无残留，因此，在病害的 生物防治 实践中具有潜在的商业开发和应用价值。，下面是一株灰色链霉菌CCCQ171及其应用专利的具体信息内容。
1.一株灰色链霉菌（Streptomyces griseochromogenes）CCCQ171，其特征在于，其保藏编号为：CGMCC No.6227。
2.根据权利要求1所述的灰色链霉菌（Streptomyces griseochromogenes）CCCQ171，其特征在于，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示。
3.权利要求1或2所述的灰色链霉菌（Streptomyces griseochromogenes）CCCQ171在农用微生物菌剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的灰色链霉菌（Streptomyces griseochromogenes）CCCQ171在农用微生物菌剂中的应用，其特征在于，所述农用微生物菌剂用于防治烟草病害或诱导烟草对烟草病害产生抗性。
5.根据权利要求4所述的灰色链霉菌（Streptomyces griseochromogenes）CCCQ171在农用微生物菌剂中的应用，其特征在于，所述烟草病害为烟草根黑腐病、烟草黑胫病或烟草赤星病。
6.一种农用微生物菌剂，其特征在于，所述农用微生物菌剂中含有权利要求1或2所述的菌株。
7.根据权利要求6所述的农用微生物菌剂，其特征在于，所述农用微生物菌剂用于防治烟草病害或诱导烟草对烟草病害产生抗性。
8.根据权利要求6所述的农用微生物菌剂，其特征在于，所述烟草病害为烟草根黑腐病、烟草黑胫病或烟草赤星病。
一株灰色链霉菌CCCQ171及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 自然界在长期进化过程中，植物与周围环境微生物之间存在普遍互作现象。有两类有益的植物-微生物共生：一类是有营养功能的，如固氮细菌或菌根真菌(mycorrhizal fungi)；一类是有防御功能的，如抑制病原菌的内生菌和附生菌。这两类有益的共生微生物都能提高植物的适应能力。农用化学物质(化肥和农药)和“精耕细作”的栽培方式在农业生产中发挥着重要作用。在这种栽培方式下，栽培作物中植物—微生物这一平衡体系被打破，缺乏有益的植物-微生物共生，使得作物生产高度依赖于化肥和农药。而化肥农药的频繁使用造成了全球环境的污染，并且污染物最终通过食物链进入人体。因此外源应用有益微生物，重建生态友好的、有益的植物-微生物共生体受到人们的极大关注，并显示了应用这种微生物制剂进行生物防治的潜力。
[0003] 烟草病害的综合防治一直是烟叶生产中的重要环节，长期以来化学防治在烟草病害防治策略中占据非常重要的地位。烟草生产上化学农药的大量和长期连续使用以及使用技术的不合理，使得烟草根黑腐病菌产生抗药性，且不同来源的根黑腐病原菌株的抗药性也存在着差异。耐药性菌株的出现不仅增加防治病害的成本，而且加重使用农药对环境的污染，生态系统的破坏，同时也直接影响烟叶品质。在克服植物病害的抗药性、减少化学杀菌剂对环境的污染、生态的破坏及农副产品中化学农药的残留方面，生防微生物具有独特的优势，利用放线菌的次生代谢产物制备的生物农药，具有无污染、无残留、不易使有害生物产生抗药性、与环境相容性高、对人畜安全等特点已成为无公害绿色农药的主体和未来农药的发展方向。因此，大力开展生防微生物的生物防治研究是农业可持续发展的重要途径，具有重要的生产实际意义。
发明内容
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明提供一株灰色链霉菌（Streptomyces griseochromogenes）CCCQ171及其应用。
[0005] 一株灰色链霉菌（Streptomyces griseochromogenes）CCCQ171，其保藏编号为：CGMCC No.6227，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日为：2012年6月15日。
[0006] 所述灰色链霉菌CCCQ171的16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示。
[0007] 所述灰色链霉菌CCCQ171在农用微生物菌剂中的应用。
[0008] 如上所述灰色链霉菌CCCQ171在农用微生物菌剂中的应用，所述农用微生物菌剂用于防治烟草病害或诱导烟草对烟草病害产生抗性。
[0009] 如上所述灰色链霉菌CCCQ171在农用微生物菌剂中的应用，所述烟草病害为烟草根黑腐病、烟草黑胫病或烟草赤星病。
[0010] 一种农用微生物菌剂，含有灰色链霉菌CCCQ171。
[0011] 如上所述的农用微生物菌剂，所述农用微生物菌剂用于防治烟草病害或诱导烟草对烟草病害产生抗性。
[0012] 如上所述的农用微生物菌剂，所述烟草病害为烟草根黑腐病、烟草黑胫病或烟草赤星病。
[0013] 从烟株根际土壤中分离获得的灰色链霉菌CCCQ171，是首次发现并鉴定的一个新菌株，其本身对烟草根黑腐病病菌等多种植物病原菌有很强的抑制作用，其发酵液对烟草根黑腐病有很好的防控效果。根据菌株菌落培养性状、形态特征和生理生化性状及16S rDNA序列比对分析，确定CCCQ171菌株为灰色链霉菌，根据产地命名为嘉陵菌。因为该菌株是从烟田土壤中分离获得，与自然生态具有天然的和谐相融性，与化学农药相比对土壤生态无毒副作用、无残留，因此，在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。附图说明
[0014] 图1为本发明实施例2中CCCQ171菌株对烟草根黑腐病病菌的平板拮抗效果图。
[0015] 图2为本发明实施例3中CCCQ171菌株对烟草根黑腐病的温室控病效果图。
[0016] 图3为本发明实施例3中CCCQ171菌株对烟草根黑腐病病菌菌丝的直接抑制效果图。
具体实施方式
[0017] 为了更好的理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步描述。
[0018] 如无特殊说明，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作，试剂、菌种等均为市售产品。
[0019] 实施例1CCCQ171菌株的筛选与鉴定
[0020] 从重庆烟田土壤中分离获得的多个菌株经初筛和复筛后得到有抑菌活性的放线菌17株。初筛采用平板对峙法，复筛采用氯仿熏蒸法。最后经过控病防效试验确定对烟草根黑腐病有较好防治作用的为本发明灰色链霉菌（Streptomyces griseochromogenes）CCCQ171菌株。
[0021] 1.1菌落特征观察
[0022] 用酵母精麦芽糖琼脂培养基（ISP-2）、燕麦粉琼脂培养基（ISP-3）、无机盐淀粉琼脂培养基（ISP-4）、甘油天门冬素琼脂培养基（ISP-5）以及马铃薯浸汁培养基、查氏（Czapck）培养基和改良高氏1号培养基制成固体平板培养基。将CCCQ171菌株划线接种于以上7种培养基平板上，28℃恒温培养7-14d，待其菌丝生长稳定后，用解剖镜分别观察单菌落形态、气生菌丝、基内菌丝、孢子丝颜色。
[0023] 在不同培养基中CCCQ171菌落形态分别为：
[0024] ISP-2培养基：菌落圆形，中间有褶皱凸起，菌落边缘有晕圈，气生菌丝白色，短绒毛状，孢子丝灰白色，基内菌丝深褐色。
[0025] ISP-3培养基：菌落圆形，边缘菌丝呈短绒毛状，气生菌丝絮状或粉状，先白色后变灰，孢子丝灰色，基内菌丝绛褐色，产生色素。
[0026] ISP-4培养基：菌落边缘不规则，略圆形，气生菌丝白色长绒毛状，孢子丝白色，基内菌丝淡黄色，不产色素。
[0027] ISP-5培养基：菌落圆形，边缘菌丝呈放射状，稀疏，气生菌丝灰色长绒毛状，孢子丝灰褐色，基内菌丝从淡黄色到褐黄色，产生色素。
[0028] 马铃薯浸汁培养基：菌落中间凸起，边缘有晕圈，气生菌丝白色长绒毛状，孢子丝灰色，基内菌丝从绛紫色到灰色，略产淡褐色色素。
[0029] Czapck培养基：菌落边缘呈放射状，气生菌丝白色长绒毛状，边缘稀疏，中间孢子丝呈絮状，灰色，基内菌丝无色，不产色素。
[0030] 改良高氏1号培养基：菌落较大，呈圆形，中间凸起，气生菌丝白色，孢子丝灰白色，基内菌丝绛黄色至深褐色，产生色素。
[0031] 1.2菌丝体与孢子特征观察
[0032] 采用插片法观察CCCQ171菌株的菌丝形态以及孢子特征。取CCCQ171菌株菌悬液涂布于改良高氏1号培养基上，用镊子夹取已灭菌的盖玻片，以大约45°斜插入培养基内，每平板插4-5片。将插片后的平板倒置于28℃培养，3-5天后用镊子小心取出盖玻片，然后将有菌的一面盖在载玻片上，直接用显微镜观察CCCQ171菌株的气生菌丝、孢子链及孢子的着生情况。CCCQ171菌株的菌丝体与孢子特征：孢子链长而直，成簇，有少数孢子链螺旋状，孢子近球形。由此从形态上初步确定CCCQ171菌株的分类属于放线菌，链霉菌科链霉菌属。
[0033] 1.3分子生物学鉴定
[0034] 通过提取CCCQ171菌株基因组DNA和16S rDNA PCR扩增，CCCQ171菌株扩增出的16S rDNA片段长度为1487bp，序列如SEQ ID No.1所示，与链霉菌属（Streptomyces sp.）在遗传上相近。
[0035] 灰色链霉菌CCCQ171是首次发现并鉴定的一个新菌株，结合分子生物学鉴定、培养特性、形态特征、革兰氏染色及生理生化试验结果，将CCCQ171菌株确定为灰色链霉菌（Streptomyces griseochromogenes），根据产地命名为嘉陵菌。该菌种的活体纯培养已于2012年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.6227，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0036] 实施例2CCCQ171菌株抑菌谱试验
[0037] 采用平板对峙法，取不同病菌菌株进行活化，用灭菌打孔器(直径6mm)在菌落边缘区域打孔制成菌片，转接至PDA平板中央，28℃培养48h，待其定殖后，在距离中心30mm处两侧接入CCCQ171菌株，每处理重复3次。28℃恒温培养7d，测量抑菌带宽，测量病菌的菌落直径，计算抑菌率。CCCQ171菌株对烟草病菌的拮抗效果如表1所示。
[0038] 表1CCCQ171菌株抗菌谱筛选
[0039]
[0040] 注：表1中“-”表示没有抑菌圈。
[0041] 测定CCCQ171菌株对9种病菌的拮抗活性进行筛选，分别测量抑菌圈、计算抑菌率。结果表明CCCQ171菌株对烟草根腐病病菌、赤星病病菌、黑胫病病菌具有明显的的抑菌效果，抑菌率达到50%以上，其中CCCQ171菌株对烟草根腐病菌抑菌率可达到80.01%，抑菌带宽达17.09mm（如图1所示）。显微观察发现，CCCQ171对病菌菌丝作用主要表现为菌丝分枝增多，前端细长，泡囊不明显。
[0042] 实施例3CCCQ171菌株的应用
[0043] 3.1CCCQ171菌株发酵液对孢子萌发的抑制作用
[0045] 按以下配方配制改良高氏一号培养基，然后高压灭菌备用：KNO31.0g；K2HPO40.5g；MgSO4·gS2O0.5g；NaCl0.5g；FeSO4·eS2O0.01g；可溶性淀粉20.0g；琼脂17.0g；pH：7.2～
7.4。将CCCQ171菌株在改良高氏1号斜面培养基上28℃恒温培养7～10d，待其产生足量的孢子，将无菌水沿斜面倒入，倾斜后刚好没过斜面，用无菌环刮取表面菌体制成菌悬液。
于250mL的三角瓶中装入100mL改良高氏1号培养液，灭菌冷却后，接入上述菌悬液，接种量为100mL/L，摇床转速为180rpm，28℃振荡培养8d后收集发酵液，发酵液于4℃，15000rpm
8
离心20min，取上清液，即得浓度为4×10 个/mL的CCCQ171菌株发酵液原液。
7.4。将CCCQ171菌株在改良高氏1号斜面培养基上28℃恒温培养7～10d，待其产生足量的孢子，将无菌水沿斜面倒入，倾斜后刚好没过斜面，用无菌环刮取表面菌体制成菌悬液。
于250mL的三角瓶中装入100mL改良高氏1号培养液，灭菌冷却后，接入上述菌悬液，接种量为100mL/L，摇床转速为180rpm，28℃振荡培养8d后收集发酵液，发酵液于4℃，15000rpm
8
离心20min，取上清液，即得浓度为4×10 个/mL的CCCQ171菌株发酵液原液。
[0046] 用无菌水将CCCQ171菌株发酵液原液（4×108个/mL）稀释成25%，50%，75%的浓度，用移液枪从低浓度到高浓度，依次吸取0.5mL的CCCQ171菌株发酵液加入小试管中，然5
后吸取1×10 个/mL烟草根黑腐病菌孢子悬浮液0.5mL，充分混合均匀，设无菌水为对照。
用微量加样器吸取上述混合液滴到凹玻片上，然后放于带有浅层水的培养皿中，加盖。15～
20℃保湿培养48h。每处理3次重复。在显微镜下观察统计，以孢子芽管长度大于孢子短半径者为萌发。
后吸取1×10 个/mL烟草根黑腐病菌孢子悬浮液0.5mL，充分混合均匀，设无菌水为对照。
用微量加样器吸取上述混合液滴到凹玻片上，然后放于带有浅层水的培养皿中，加盖。15～
20℃保湿培养48h。每处理3次重复。在显微镜下观察统计，以孢子芽管长度大于孢子短半径者为萌发。
[0047] 按下式计算抑制孢子萌发率：
[0048] 相对孢子萌发抑制率(%)=[(对照孢子萌发率－处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率]×100
[0049] ……………………………………（1）
[0050] 表2CCCQ171菌株发酵液对烟草根腐病孢子萌发的抑制作用
[0051]
[0052] 试验结果如表2所示，CCCQ171菌株发酵液不同浓度处理组均对烟草根腐病病原孢子的萌发具有显著的抑制作用；同对照比较，75%、100%浓度CCCQ171菌株发酵液处理后，烟草根腐病病原孢子均未萌发，萌发抑制率达100%。
[0053] 3.2CCCQ171菌株无菌发酵液对菌丝生长的抑制作用
[0054] 采用含菌平板法，用无菌水将CCCQ171菌株发酵液稀释成50%的浓度，吸取1mL的CCCQ171菌株发酵液与9mLPDA培养基混合后，倒入培养皿，以无菌水为对照。用直径为6mm的打孔器在培养7d的烟草根黑腐病菌落边缘切下菌饼接种于上述含CCCQ171发酵液的平板中心，菌丝面朝下，28℃培养7～8d，用十字交叉法测量菌落扩展直径，按下式计算菌丝生长抑制率。
[0055] 菌丝生长抑制率(%)=[(对照菌落扩展直径－处理菌落扩展直径)/对照菌落扩展直径]×100
[0056] ……………………………………（2）
[0057] 如图3所示，烟草根黑腐病菌在含CCCQ171菌株无菌发酵液的培养基上表现出菌丝前端生长受阻，菌落扩展缓慢，原液抑制效果达57.22%，表明CCCQ171菌株发酵液中的次生代谢产物对病菌菌丝生长具有抑制作用。
[0058] 3.3CCCQ171菌株的温室控病试验
[0059] 选取长势良好的4～6叶烟苗，每株灌施10mL CCCQ171菌株发酵液原液（1×108个孢子/mL），共处理30株烟苗，以灌施等量无菌水的30株烟苗作为对照。72h后采用菌饼法接种烟草根黑腐病菌。观察发病情况，8d后将烟苗拔出，冲洗干净后按以下标准调查病株数和严重度等，按下式计算发病率、病情指数和相对防效，用SPSS软件进行统计分析。
[0060] 发病率(%)=发病植株/总株数×100 ……………………………（3）[0061] 病情指数(DI)=[∑(病情级数×同病级株数)]/[最高病级数×总株数]×100 ……（4）
[0062] 相对防效(%)=[(CK病情指数-处理病情指数) /CK病情指数]×100 ……（5）[0063] 烟草根黑腐病病情分级标准(以整株为单位)如下：
[0064]
[0065] 表3CCCQ171菌株对烟草根腐病温室控病试验
[0066]
[0067] 如图2和表3所示，CCCQ171菌株温室盆栽防治效果较好，菌液处理烟草幼苗后，实验组根系颜色正常，对照组根系变黑。实验组植株的发病率和病情指数明显降低，防治效果达到70.53%，与对照相比，在α=0.05水平上达到显著，在α=0.0l水平上达到极显著。
[0068] 灰色链霉菌CCCQ171本身对烟草根黑腐病病菌等多种植物病原菌有很强的抑制作用，其发酵液对烟草根黑腐病有很好的防控效果。因此，所述灰色链霉菌CCCQ171可以用于制备防治烟草病害的农用微生物菌剂，所述农用微生物菌剂中可以含有常用的杀菌剂、杀虫剂，所述农用微生物菌剂可以与其他常用的杀菌剂、杀虫剂复配使用。所述农用微生物菌剂可以通过发酵方式制得。因为该菌株是从烟田土壤中分离获得，与自然生态具有天然的和谐相融性，与化学农药相比对土壤生态无毒副作用、无残留，因此，在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。
[0069] 实施例4CCCQ171菌株诱导烟草抗病性的作用
[0070] 4.1接种处理
[0071] 选取长势良好的烟苗（4～6叶龄），灌施菌液，每株灌施10mL CCCQ171菌株发酵8
液原液（1×10 个孢子/mL），以灌施等量无菌水为对照。分别在0d、2d、4d、6d、8d后采集叶片（避免损伤叶片），每处理3次重复。分别测定苯丙氨酸解氨酶PAL、过氧化物酶POD和多酚氧化酶PPO活性。
液原液（1×10 个孢子/mL），以灌施等量无菌水为对照。分别在0d、2d、4d、6d、8d后采集叶片（避免损伤叶片），每处理3次重复。分别测定苯丙氨酸解氨酶PAL、过氧化物酶POD和多酚氧化酶PPO活性。
[0072] 4.2酶活性测定
[0073] (1)苯丙氨酸解氨酶PAL的提取、活性测定：
[0074] 称取烟草叶片2.0g，加5mM pH8.8巯基乙醇硼酸缓冲液10.0mL，PVP0.5g和少量石英砂，冰浴研磨，四层纱布过滤，10000rpm冷冻离心10min。取酶液1.0mL，加0.02M L-苯丙氨酸1.0mL，蒸馏水2.0mL，总体积为4.0mL。对照不加底物，加蒸馏水1.0mL，反应液置于30℃恒温水浴中保温，0.5h后用UV-8500蒸紫外分光光度计在290nm处测定吸光值(OD值)。
[0075] (2)过氧化物酶POD的提取、活性测定：
[0076] 取烟草叶片0.2g，加0.01M pH5.9磷酸缓冲液2.0mL和少量石英砂，冰浴研磨，10000rpm冷冻离心10min。取酶液0.1mL，加pH5.9磷酸缓冲液至4.0mL，加0.02M愈创目酚1.0mL，混匀。测定时，加0.06mol/L H2O2，5min后在420nm波长下测定吸光值(OD值)。
对照不加H2O2，多加1.0mL磷酸缓冲液。
对照不加H2O2，多加1.0mL磷酸缓冲液。
[0077] (3)多酚氧化酶PPO的提取、活性测定：
[0078] 取烟草叶片0.2g，加0.051M pH6.8磷酸缓冲液0.4mL和少量石英砂，冰浴研磨，10000rpm冷冻离心10min。取酶液0.01mL，加0.05M pH7.8磷酸缓冲液1.0mL，0.02M邻苯二酚1.5mL。对照不加酶液。反应30min后在389nm波长下测定吸光值(OD值)。
[0079] 烟苗经CCCQ171菌株处理后，叶片中苯丙氨酸解氨酶活性逐渐上升，在4d后达到一个显著的峰值，第6d、8d开始下降，但经CCCQ171菌液处理后的叶片中苯丙氨酸解氨酶活性在α=0.05水平上均显著高于对照；CCCQ171菌株处理对烟草过氧化物酶活性变化影响不大，且在4、6d低于对照；CCCQ171菌株处理烟苗后叶片中多酚氧化酶活性逐渐上升，在2d后达到一个峰值，4、6d后开始下降，8d后出现另一峰值，且较2d后的峰值高。对照在2d时出现下降，之后一直上升，但皆低于处理组的活性，表明CCCQ171菌株均可诱导烟草产生对根黑腐病的抗性与多酚氧化酶活性相关。结果表明CCCQ171菌株能够在一定程度上诱导烟草植株产生抗性相关酶，从而提高对根黑腐病的抗性。
[0080] 灰色链霉菌CCCQ171本身具有诱导烟草对烟草病害产生抗性的作用。因此，所述灰色链霉菌CCCQ171可以用于制备诱导烟草对烟草病害产生抗性的农用微生物菌剂，所述农用微生物菌剂中可以含有常用的杀菌剂、杀虫剂，所述农用微生物菌剂可以与其他常用的杀菌剂、杀虫剂复配使用。所述农用微生物菌剂可以通过发酵方式制得。因为该菌株是从烟田土壤中分离获得，与自然生态具有天然的和谐相融性，与化学农药相比对土壤生态无毒副作用、无残留，因此，在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。
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