用于诊断和治疗肺疾病和损伤的单克隆抗体和抗原
阅读：386发布：2024-02-06
专利汇可以提供用于诊断和治疗肺疾病和损伤的单克隆抗体和抗原专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了通过检测样品中EMAP II的 水 平来诊断患有由使用 烟草 所引起之 肺 损伤的COPD、肺气肿的患者的方法。本文公开的是结合EMAP II的形式的大鼠单克隆 抗体 的高变区。本公开内容还包括EMAP II中所包含的多肽序列，其为抗体结合至其靶蛋白的靶标。该表位作为人源化抗体的 基础 ，所述抗体可用于 治疗 患有表现出EMAP II表达水平升高之病理状况的患者。，下面是用于诊断和治疗肺疾病和损伤的单克隆抗体和抗原专利的具体信息内容。
1.抗体，其包含：
重链可变区，其中所述重链可变区包含根据SEQ.ID.NO.2之第一多肽的至少一部分；
和
轻链可变区，其中所述轻链可变区包含根据SEQ.ID.NO.3之第二多肽的至少一部分，其中所述抗体是人源化的并且所述人源化抗体与人EMAPII结合。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第一多肽与SEQ.ID.NO.2有至少99％的同源性，并且所述第二多肽与SEQ.ID.NO.3有至少99％的同源性。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第一多肽与SEQ.ID.NO.2有至少95％的同一性，并且所述第二多肽与SEQ.ID.NO.3有至少95％的同一性。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第一多肽与SEQ.ID.NO.2有至少99％的同一性，并且所述第二多肽与SEQ.ID.NO.3有至少99％的同一性。
5.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第一多肽是SEQ.ID.NO.2并且所述第二多肽是SEQ.ID.NO.3。
6.抗体，其包含：
重链，其中所述重链包含重链高变区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含根据SEQ.ID.NO.5之多肽的至少一部分，CDR2包含根据SEQ.ID.NO.6之多肽的至少一部分，并且CDR3包含根据SEQ.ID.NO.7之多肽的至少一部分；以及
轻链，其中所述轻链包含轻链高变区CDR1L、CDR2L和CDR3L，其中CDR1L包含根据SEQ.ID.NO.8之多肽的至少一部分，CDR2L包含根据SEQ.ID.NO.9之多肽的至少一部分，并且CDR3L包含根据SEQ.ID.NO.10之多肽的至少一部分，其中所述重链和所述轻链形成与人EMAPII结合的人源化抗体的一部分。
7.根据权利要求6所述的人源化抗体，其中：CDR1是SEQ.ID.NO.5，CDR2是SEQ.ID.NO.6，并且CDR3是SEQ.ID.NO.7；CDR1L是SEQ.ID.NO.8，CDR2L是SEQ.ID.NO.9，并且CDR3L是SEQ.ID.NO.10。
8.表位，其包含：
人EMAP II的表位，其中所述表位包含根据SEQ.ID.NO.12之分离的多肽的至少一部分。
9.根据权利要求8所述的表位，其中所述分离的多肽与SEQ.ID.NO.12有至少95％的同源性。
10.根据权利要求8所述的表位，其中所述分离的多肽与SEQ.ID.NO.12有至少99％的同源性。
11.根据权利要求8所述的表位，其中所述分离的多肽与SEQ.ID.NO.12有至少95％的同一性。
12.根据权利要求8所述的表位，其中所述分离的多肽与SEQ.ID.NO.12有至少99％的同一性。
13.根据权利要求8所述的表位，其中所述分离的多肽是SEQ.ID.NO.12。
14.根据权利要求8所述的表位，其中所述分离的多肽与SEQ.ID.NO.11有至少95％的同一性。
15.根据权利要求8所述的表位，其中所述分离的多肽与SEQ.ID.NO.11有至少99％的同一性。
16.根据权利要求8所述的表位，其中所述分离的多肽是SEQ.ID.NO.11。
17.制造抗体的方法，其包括以下步骤：
生产合成多肽，其中所述合成多肽的至少一部分包含根据SEQ.ID.NO.12之多肽的至少一部分。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.12有至少95％的同源性。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.12有至少99％的同源性。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.12有至少95％的同一性。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.12有至少99％的同一性。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述合成多肽的至少一部分是SEQ.ID.NO.12。
23.根据权利要求17所述的方法，其中所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.11有至少95％的同源性。
24.根据权利要求17所述的方法，其中所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.11有至少99％的同源性。
25.根据权利要求17所述的方法，其中所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.11有至少95％的同一性。
26.根据权利要求17所述的方法，其中所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.11有至少99％的同一性。
27.根据权利要求17所述的方法，其中所述合成多肽的至少一部分是SEQ.ID.NO.11。
28.根据权利要求17至27所述的方法，其还包括以下步骤：
将所述合成多肽与哺乳动物的免疫系统接触。
29.根据权利要求28所述的方法，其还包括从与所述合成多肽接触的所述哺乳动物选择B细胞的步骤，其中所述B细胞产生以高亲和力结合EMAPII的抗体。
用于诊断和治疗肺疾病和损伤的单克隆抗体和抗原
[0002] 本申请要求2011年6月8日提交的美国临时申请号61／494,720的权益，其全部内容通过引用并入本文。
[0003] 政府权利声明
[0004] 本发明在国立卫生研究院给予的HL090950的政府支持下进行。美国政府享有本发明的某些权利。
技术领域
[0005] 本发明一般性地涉及诊断和治疗肺气肿(emphysema)或慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的方法，并且更特别地涉及通过检测内皮单核细胞活化蛋白II(endothelial monocyte activating protein II，EMAP II)的存在以及中和EMAP II的作用来诊断和治疗肺气肿或COPD患者的方法。
背景技术
[0006] 超过310万美国人被诊断为患有肺气肿。肺气肿和慢性支气管炎是COPD综合征的两个部分。COPD在美国是第四位死亡原因(见www.nhlbi.nih.gov／health／public／lung／other／copd_fact.htm#toc)。没有逆转该疾病进程或暂停其进展的有效治疗。
[0007] 肺部气肿(pulmonary emphysema)是普遍的致命性疾病，其特征为肺基质和细胞成分二者损失，从而影响肺泡空间和毛细管血液之间的气体交换。肺气肿被定义为“肺病症，其特征在于终端细支气管远端气室的异常的永久性扩大，伴随其壁的破坏，有或无明显纤维化”。国家心脏、肺和血液研究所肺病研讨会分会(National Heart，Lung，and Blood Institute，Division of Lung Diseases workshop)的报告，Am Rev Respir Dis132，182-185.(1985)。该定义中永久的和破坏性的概念是关键的，由于其表达了最终导致肺组织消失的疾病过程的独特和特征性区别特征。
[0008] 虽然已经鉴定了易感个体中的环境诱因，但是对这些起始肺泡损失导致肺气肿的机制了解不足。在过去的几十年中，已提出炎症和蛋白酶／抗蛋白酶失衡作为长期吸烟后肺破坏(其占肺气肿的大多数情况)的下游效应物。推测促炎性刺激募集并活化肺炎性细胞，引发基质蛋白酶的释放和肺重塑。Shapiro，S.D.，J Clin Invest106，1309-1310(2000)。然而，这些模型不能完全解释隔结构(septal structure)的消失和肺破坏的独特性质(相比于在其他炎性肺疾病中看到的变化)背后的机制。为了解释在肺气肿中看到的永久性破坏，结构肺泡细胞的过度凋亡已成为肺气肿的第二主要机制。认为过度肺泡内皮凋亡导致毛细血管退化，以及随后肺泡壁的损失。Tuder，R.M.et al.，Am J Respir Cell Mol Biol28，551-554(2003)。然而，过量肺结构细胞凋亡与活化的炎性状态在肺气肿中的共存和这两种机制的等级尚未被解释。
[0009] 可以看出，需要用于治疗肺部气肿的方法。还需要用于在早期阶段诊断肺部气肿的方法。早期诊断和后续治疗可导致所述疾病的更有效治疗和患者的较好预后。
[0010] 概述
[0011] 在本发明的一个方面，提供了诊断患者的肺气肿或COPD的方法，所述方法包括检测患者生物样品中EMAP II的过表达，其中所述样品可以是血清、血浆、肺灌洗液或肺活检物。可通过如免疫学方法例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心(sandwich)ELISA、Western印迹或质谱法来检测EMAP II。EMAP II的过表达可以通过与对照样品比较来确定。
[0012] 在本发明的另一方面，提供了通过检测患者样品中EMAP II的存在来预测患者发生肺气肿或COPD的易感性的方法。
[0013] 在本发明的另一方面，提供了用于治疗患有肺气肿或COPD的患者的方法，其包括施用治疗有效量的EMAP II中和化合物。所述EMAP II中和化合物可以是抗体、CXCR3受体的激动剂、siRNA或反义RNA。EMAP II中和化合物可全身施用或通过吸入施用。
[0014] 本发明的一些方面包括抗体(人源化的或非人源化的)，所述抗体包含：重链可变区，其中所述重链可变区包含根据SEQ.ID.NO.2的第一多肽的至少一部分；以及轻链可变区，其中所述轻链可变区包含根据SEQ.ID.NO.3的第二多肽的至少一部分，其中所述抗体结合至EMAPII的至少一种形式。在一些实施方案中，第一多肽与SEQ.ID.NO.2有至少99％的同源性，以及所述第二多肽与SEQ.ID.NO.3有至少99％的同源性。在另一些实施方案中，所述第一多肽与SEQ.ID.NO.2有至少95％的同一性，以及所述第二多肽与SEQ.ID.NO.3有至少95％的同一性。在另一些实施方案中，所述第一多肽与SEQ.ID.NO.2有至少99％的同一性，以及所述第二多肽与SEQ.ID.NO.3有至少99％的同一性。并且在又一些实施方案中，所述第一多肽是SEQ.ID.NO.2以及所述第二多肽是SEQ.ID.NO.3。在一些实施方案中，所述抗体结合至少EMAPII的前体形式(pro form)(pro-EMAPII)，在一些实施方案中，所述抗体结合在人和／或小鼠和/或其他哺乳动物中发现的EMAPII。
[0015] 本发明的一些方面包括抗体，所述抗体包含：重链，其中所述重链包含重链高变区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含根据SEQ.ID.NO.5的多肽的至少一部分，CDR2包含根据SEQ.ID.NO.6的多肽的至少一部分，并且CDR3包含根据SEQ.ID.NO.7的多肽的至少一部分；以及轻链，其中所述轻链包含轻链高变区CDR1L、CDR2L和CDR3L，其中CDR1L包含根据SEQ.ID.NO.8的多肽的至少一部分，CDR2L包含根据SEQ.ID.NO.9的多肽的至少一部分，并且CDR3L包含根据SEQ.ID.NO.10的多肽的至少一部分，其中所述重链和所述轻链形成人源化抗体的一部分，所述抗体结合人EMAPII。在一些实施方案中，CDR1是SEQ.ID.NO.5，CDR2是SEQ.ID.NO.6，并且CDR3是SEQ.ID.NO.7；以及CDR1L是SEQ.ID.NO.8，CDR2L是SEQ.ID.NO.9，并且CDR3L是SEQ.ID.NO.10。在一些实施方案中，所述抗体结合至少EMAPII的前体形式(pro-EMAPII)，在一些实施方案中所述抗体结合在人和／或小鼠和／或其他哺乳动物中发现的EMAPII。在一些实施方案中，所述抗体是人源化的。
[0016] 本发明的一些方面包括产生与哺乳动物EMAPII的至少一种形式相结合之抗体的EMAP II表位或其他抗原性部分，其包括：人EMAP II的表位，其中所述表位包含根据SEQ.ID.NO.12的分离的多肽的至少一部分。在一些实施方案中，所述分离的多肽与SEQ.ID.NO.12有至少95％的同源性。在另一些实施方案中，所述分离的多肽与SEQ.ID.NO.12有至少99％的同源性。在又一些实施方案中，所述分离的多肽与SEQ.ID.NO.12有至少95％的同一性，而在一些实施方案中，所述分离的多肽与SEQ.ID.NO.12有至少99％的同一性。在一些实施方案中，所述分离的多肽是SEQ.ID.NO.12。在一些实施方案中，所述分离的多肽与SEQ.ID.NO.11有至少95％的同一性。在又一些实施方案中，所述分离的多肽与SEQ.ID.NO.11有至少99％的同一性。在一些实施方案中，所述分离的多肽是SEQ.ID.NO.11。一些实施方案包括附接至至少一种其他多肽的这些表位或者其部分。这样的共连接多肽可以不是天然存在的，至少不存在于表达所述多肽的生物体中。
[0017] 本发明的一些方面包括抗体的制备方法，所述抗体与人或其他哺乳动物中发现的EMPA II的至少一种形式结合，这些方法可以包括以下步骤：产生合成多肽，其中所述合成多肽的至少一部分包含根据SEQ.ID.NO.12的多肽的至少一部分。在一些实施方案中，所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.12有至少95％的同源性。在又一些实施方案中，所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.12有至少99％的同源性。在另一些实施方案中，所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.12有至少95％的同一性。在一些实施方案中，所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.12有至少99％的同一性。在另一些实施方案中，所述合成多肽的至少一部分是SEQ.ID.NO.12。在一些实施方案中，所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.11有至少95％的同源性。在另一些实施方案中，所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.11有至少99％的同源性。在另一些实施方案中，所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.11有至少95％的同一性。在另一些实施方案中，所述合成多肽的至少一部分与SEQ.ID.NO.11有至少99％的同一性。在一些实施方案中，所述合成多肽的至少一部分是SEQ.ID.NO.11。本发明的方法可以包括将合成多肽与哺乳动物的免疫系统接触的步骤，所述合成多肽包含本文公开的EMAP II的至少一个表位的至少一部分。一些方法可以包括从与所述合成多肽接触的所述哺乳动物选择B细胞的另外步骤，其中所述B细胞产生以高亲和力与EMAP II结合的抗体。以及在一些实施方案中，针对本文公开的表位产生的抗体是人源化的。在一些实施方案中，人源化的抗体用于治疗人和/或其他哺乳动物中的肺相关疾病或损伤，或用于诊断人和/或其他动物中的这样的病症。
[0020]
[0021]
[0022]
[0023] 附图简述
[0024] 图1.柱状图，其表明在人中，相比于非吸烟者，吸烟者的支气管肺泡灌洗液(BAL)中分泌的EMAP II的表达增加。
[0025] 图2A.柱状图，其显示香烟烟雾(CS)暴露对小鼠肺中胱天蛋白酶3(caspase-3)活性水平的影响。
[0026] 图2B.柱状图，其显示香烟烟雾对小鼠肺中促凋亡神经酰胺水平的水平的影响。
[0027] 图2C.在暴露于香烟烟雾6个月的小鼠中肺泡尺寸的柱状图。
[0028] 图3A.柱状图，其表明香烟烟雾暴露对EMAP II表达水平的影响。
[0029] 图3B.Western印迹，其显示来自暴露于香烟烟雾(CS)或空气(AC)的小鼠的BAL中EMAP II分泌的动力学。
[0030] 图3C.Western印迹，其显示使用SU5416的VEGF受体抑制。
[0031] 图4A.柱状图和Western印迹，其表明香烟烟雾暴露对肺溶解产物中EMAP II水平的影响。
[0032] 图4B.显微照片，其示出香烟烟雾暴露对肺组织中炎性细胞的量的影响。
[0033] 图5A.Western印迹，其示出四环素处理24小时后小鼠中EMAP II的诱导。
[0034] 图5B.肺切片的显微照片，其显示四环素处理3个月后的肺泡。
[0035] 图5C.柱状图，其显示用四环素处理3个月的小鼠和对照的肺组织的平均线性截距。
[0036] 图5D.肺切片的显微照片，其显示四环素处理6个月后的肺泡。
[0037] 图5E.柱状图，其显示用四环素处理6个月的小鼠和对照的肺组织的体积加权的平均体积。
[0038] 图6A.图，其显示3个月后在单或EMAP II双转基因小鼠的肺溶解产物中胱天蛋白酶-3的活性。
[0039] 图6B.图，其显示6个月后在单或EMAP II双转基因小鼠的肺溶解产物中胱天蛋白酶-3的活性。
[0040] 图6C.图，其显示用非特异性对照IgG和中和EMAP II抗体处理的单或EMAP II双转基因小鼠肺中的胱天蛋白酶-3的活性。
[0041] 图7A.柱状图，其显示相比于对照，在过表达EMAP II的小鼠的肺中的细胞数。
[0042] 图7B.柱状图，其显示MMP-9和TNFα阳性细胞的定量。
[0043] 图8A.柱状图，其显示EMAP II过表达对胱天蛋白酶-3活性的影响。
[0044] 图8B.图，其显示用包含EMAP II的前体和成熟同种型的重组蛋白质处理肺微血管内皮细胞对凋亡的影响。
[0045] 图8C.柱状图，其示出用低血清培养的细胞中CXCR3的表达水平。
[0046] 图8D.柱状图，其显示用来自暴露于香烟烟雾(CS)或空气(AC)之小鼠的无细胞(acellular)BAL处理的细胞中CXCR3的表达水平。
[0047] 图8E.柱状图，其显示抗CXCR3抗体对胱天蛋白酶-3活性的影响。
[0048] 图9.柱状图，其显示靶向CXCR3的siRNA对CXCR3表达的影响。
[0049] 图10A.免疫印迹，其显示香烟烟雾暴露对小鼠肺中EMAP II表达的影响。
[0050] 图10B.柱状图，其显示暴露于香烟烟雾4周的DBA2小鼠的肺实质中EMAP II的表达。
[0051] 图10C.免疫印迹，其显示凋亡依赖性肺气肿小鼠模型中肺EMAP II的表达。
[0052] 图10D.柱状图，其显示响应于香烟烟雾暴露的肺巨噬细胞在肺实质中的累积。
[0053] 图10E.柱状图，其显示香烟烟雾暴露后通过胱天蛋白酶-3活性测定测量的肺溶解产物中的肺凋亡。
[0055] 图11B.柱状图，其显示对于前体EMAP II，相比于对照大鼠IgG，用中和抗体M7／1的凋亡细胞与总细胞的比值。
[0056] 图11C.柱状图，其显示对于成熟EMAP II，相比于对照大鼠IgG，用中和抗体M7／1的凋亡细胞与总细胞的比值。
[0057] 图12A.将来自暴露于香烟烟雾(CS)4周之小鼠的肺溶解产物中的EMAP II(前体和成熟形式)和未暴露于CS的小鼠(环境空气对照组，AC)的肺中的EMAP II水平相比较的图；通过Western印迹评估EMAP II水平(对黏着斑蛋白归一化的平均密度测量单位[DU]±SEM；＊P＜0.05相比于对照，n＝5／组)
[0058] 图12B.对EMAPII染色的小鼠肺组织的显微照片；组织来自暴露于CS和暴露于环境空气(AC)的小鼠。
[0059] 图12C.处理方案的示意图。
[0060] 图12D.图，其显示在肺溶解产物中测量的通过胱天蛋白酶-3活性检测的凋亡(胱天蛋白酶单位通过蛋白质归一化；平均值+SEM；＊P＜0.05，ANOVA).
[0061] 图12E.图，其显示BALF中的细胞数。
[0062] 图12F.图，其显示肺静态顺应性(平均值+SEM；＊P＜0.01，ANOVA)。
[0063] 图12G.代表性的H&E染色肺切片(比例尺：100μm)，其显示响应于CS的肺泡结构简化(simplification)，而用中和EMAPII处理的肺泡构造的保留(perseved)，
[0064] 图12H.MLI的形态测量(平均值+SEM：P＜0.05，ANOVA：n＝5-12)。
[0065] 图13.琼脂糖凝胶，其显示PCR扩增产物。
[0066] 图14.来自大鼠抗体序列的结果的汇总。
[0067] 图15.大鼠抗体可变区的序列数据。
[0069] 图17.能够与M7／1抗体竞争的受保护区域外的一种肽的结合竞争。在存在／不存在300倍摩尔过量的肽十六聚体的情况下，使用对照IgG和EMAPII中和M7／
1抗体对重组前体EMAP II进行Western印迹。只有肽2(QQSIAGSADSKPIDVSR)(而非肽
1(KHPDADSLYVEEVDVGE)或肽3(作为对照))能够与M7／1竞争。箭头表示分子量标准的位置(以相对kDa(rel kDa)计)。
1抗体对重组前体EMAP II进行Western印迹。只有肽2(QQSIAGSADSKPIDVSR)(而非肽
1(KHPDADSLYVEEVDVGE)或肽3(作为对照))能够与M7／1竞争。箭头表示分子量标准的位置(以相对kDa(rel kDa)计)。
[0070] 描述
[0071] 下面的详细描述是当前考虑的实施本发明的最佳方式。该描述不应被视为具有限制意义，做出该描述仅仅是为了说明本发明之一般原理的目的，因为本发明的范围通过所附权利要求最佳地限定。如本文中所使用的，除非另外明确说明或另外清楚提示，否则术语“约”指的加或减10％的范围值，例如：约1.0涵盖0.9到1.1的值。
[0072] 如本文中所使用的，除非另外明确说明或另外清楚提示，否则术语“治疗有效剂量”、“治疗有效量”等是指对人或其他动物的健康和良好状态有净有益效果的化合物的份。治疗效果可以包括寿命、生活质量等的改善，并且还可以包括疾病发生易感性或者健康或良好状态恶化的降低。所述作用可以在是在单剂量和／或治疗后立即实现，或者它们可以是累积性的并且在一系列剂量和／或治疗后实现。
[0073] 如本文中所使用的，除非另外明确说明或另外清楚提示，否则应用于多核苷酸的术语“同源性”是指3核酸长密码子(虽然不是彼此相同的)当转录成蛋白质时编码相同的信息。对于用于涉及多核苷酸的该术语的进一步讨论请参见Elliot和Elliot，Biochemistry and Molecular Biology，293-295页，1997年由Oxford University Press出版，New York，NY，该部分通过整体引用并入本文。
[0074] 如本文中所使用的，除非另外明确说明或另外清楚提示，否则应用于多肽的术语“同源性”是指被认为彼此在尺寸、结构和化学反应性上相似的在活生物体中通常发现的氨基酸。对于用于涉及多肽的该术语的进一步讨论请参见Stryer，L.，Biochemistry，第2版，13-17页，版权1981，由W.H.Freeman and Company出版，San Francisco，CA，该部分通过整体引用并入本文。
[0075] 广泛地，本发明提供了用于诊断和治疗患有肺气肿或COPD之患者的方法，所述方法包括检测来自患者的生物样品中EMAP II的存在或者使用治疗有效量的EMAP II中和化合物进行治疗。相同的方法也可以用于确定患者是否易于发生肺气肿或COPD。EMAP II是由在气肿性肺中存在的病症诱导的细胞因子，其包括氧化的、凋亡的、和缺氧细胞应激。EMAP II以43kD前体形式从细胞释放，或通过包括胱天蛋白酶和基质金属蛋白酶(MMP)的蛋白酶(已知其参与COPD)蛋白水解切割后以23kDa“成熟”蛋白质从细胞释放。鉴于EMAP II对肺内皮细胞有强促凋亡作用以及其募集促炎性单核细胞的能力，响应于吸烟的过量EMAP II释放可参与肺内皮细胞凋亡和肺巨噬细胞积聚二者，并因而可以是肺部气肿的关键分子中介体。本发明人现在已经发现，小鼠中吸烟诱导的肺气肿之前有强的EMAP II产生和凋亡，并且EMAP II在肺中的特异性升高足以引起肺凋亡和肺气肿。此外，已经在肺气肿患者的肺中测量到EMAP II水平升高，并且已发现EMAP II在吸烟者的BAL中有强上调(图1)。因此，EMAP II可以是用于肺气肿和COPD的生物标志物，其使得能够更早地检测和治疗这些病症。
[0076] 在一个实施方案中，提供用于诊断患者是否患有肺气肿或COPD的方法，其中所述方法可以包括检测来自患者的生物样品的EMAP II的步骤。已经发现在来自患有肺气肿或COPD之患者的样品中EMAP II的表达显著升高了至少两倍。所述方法还可以包括将在患者样品中检测的EMAP II与对照进行比较并诊断患者患有肺气肿或COPD。所述对照可以是来自不患有肺气肿或COPD之患者(更特别地，来自不吸烟的患者)的样品。EMAP II的对照水平可以通过来自对照患者的多个样品中EMAP II之表达水平来确定。应当理解的是，可获得的对照样品越多，比较得越好。所述比较可以是观察升高的EMAP II水平的视觉(visual)比较，或者可以定量样品和/或对照中EMAP II的量然后进行比较。
[0077] 在一个实施方案中，所述生物样品可以是血清、血浆、BAL或肺活检物。获得这样的样品在本领域中是常规的。可以在蛋白质或核酸水平上评估EMAP II在生物样品中的过表达。在一个示例性实施方案中，提供了利用抗体来检测生物样品中EMAP II的过表达的免疫细胞化学技术。在本发明的这个方面，可以使用至少一种针对EMAP II的抗体。EMAP II的过表达也可以通过基于核酸的技术(包括例如杂交和RT-PCR)检测。还提供了试剂盒，其包含用于实施本发明方法的试剂。
[0078] 用于检测EMAP II的方法可以包括在核酸或蛋白质水平确定EMAP II的量或存在的任意方法。这样的方法在本领域是熟知的并且包括但不限于Western印迹、northern印迹、southern印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞术、免疫细胞化学、核酸杂交技术、核酸逆转录法和核酸扩增法。在一些示例性实施方案中，EMAP II的过表达可以在蛋白质水平上进行检测，其使用例如针对特定生物标志物蛋白的抗体。所述抗体可以是(但不限于)多克隆和单克隆抗体。单克隆抗体的实例在本文中以及在美国专利5,641,867中提供，该专利通过引用并入本文。这些抗体可以用于多种方法如Western印迹、ELISA、免疫沉淀法或免疫细胞化学技术。
[0079] 在一个实施方案中，可以在蛋白水平确定EMAP II过表达。可以利用对EMAP II特异的抗体来检测生物标志物蛋白在身体样品中的过表达。所述方法包括获得来自患者的身体样品，将所述身体样品与至少一种针对EMAP II的抗体接触，以及检测抗体结合以确定EMAP II是否在患者样品中过表达。可以通过将结果与对照样品进行比较以确定EMAP II的过表达。
[0080] 在一个替代性实施方案中，可以在核酸水平检测EMAP II过表达。用于评估表达的基于核酸之技术是本领域中熟知的，并且包括例如确定身体样品中生物标志物mRNA的水平。许多表达检测方法使用分离的RNA。任何不选择不分离mRNA的RNA分离技术可用于从宫颈细胞中纯化RNA(参见例如Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，1987-1999)。此外，可以使用本领域技术人员熟知的技术(例如美国专利号4,843,155的单步RNA分离法，其通过引用并入本文)容易地处理大量的组织样品。
[0081] 分离的mRNA可以在杂交或扩增测定中使用，所述杂交或扩增测定包括但不限于Southern或Northern分析、聚合酶链反应分析和探针阵列。一种用于检测mRNA水平的方法涉及使分离的mRNA与核酸分子(探针)接触，所述核酸分子(探针)可以与被检测基因所编码的mRNA杂交。核酸探针可以是，例如全长cDNA或其部分，如长度为至少7、15、30、50、100、250或500个核苷酸并且在严格条件下足以与编码本发明生物标志物之mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。EMAP II的多核苷酸序列在本领域是已知的(例如，美国专利号6,013,483，其通过引用并入本文)，并且可以无需过度实验地选择核酸探针。mRNA与探针的杂交指示目标生物标志物正在被表达。
[0082] 在另一个实施方案中，提供了用于确定患者发生肺气肿或COPD之易感性的方法。尽管可以不存在症状，但是吸烟者或者曾经的习惯吸烟者发生肺气肿的风险显著高于从未吸烟的人。因此，可期望的是确定作为吸烟者的患者发生肺气肿的易感性。早期诊断可以导致更好的治疗方案(treatment regime)。所述方法可以包括如上所述在患者样品中检测EMAP II的步骤。所述方法还可以包括如上所述将患者样品中的EMAP II与对照进行比较。
[0083] 在另一个实施方案中，还提供了用于实施本发明方法的试剂盒。所述试剂盒可包含至少一种用于特异性检测EMAP II表达的试剂(例如，抗体、核酸探针等)。所述试剂盒还可以包含阳性和/或阴性对照，以确认按照本发明使用之试剂的活性和正确使用。对照可以包括生物样品，如来自对照患者的肺组织或肺灌洗样品(阴性对照)。EMAP II可被添加到对照样品中以提供阳性对照。
[0084] 在另一个实施方案中，提供了用于治疗患有肺气肿或COPD之患者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的至少一种EMAP II中和化合物的步骤。所述中和化合物可以是降低或抑制患者中EMAP II的活性或作用的任何化合物或分子。在一个实施方案中，所述中和化合物可以是抗EMAP II抗体，其中所述抗体可以是多克隆或单克隆抗体、抗体片段、保留与EMAP II特异性结合的结合区的人源化或嵌合抗体。
[0085] 在一个替代性实施方案中，所述中和化合物可以是CXCR3受体的激动剂。所述激动剂可以是肽、肽模拟物或干扰EMAP II与CXCR3受体之间相互作用的任何其他化合物。在一个示例性实施方案中，所述中和化合物是EMAP II类似物。阻止EMAPII与CXCR3结合可以干扰EMAPII在肺组织中的有害作用。
[0086] 在另一实施方案中，所述中和化合物可以是降低EMAP II表达的化合物或分子。非限制性实例可以是靶向EMAP II RNA或DNA的siRNA或反义RNA。或者，所述中和化合物可以是干扰和降低CXCR3表达的化合物或分子，例如但不限于siRNA或反义RNA。如图9所示，当在靶向CXCR3之siRNA的存在下对人肺微血管内皮细胞进行电穿孔时，CXCR3表达水平显示出约60％至约80％的降低。由于EMAP II和CXCR3二者的核苷酸序列均是已知的，本领域技术人员将能够选择用于EMAP II和/或CXCR3的siRNA和/或反义RNA序列而无需过度实验。用于调节EMAP II表达的化合物和组合物的实例在美国专利申请公开号
2004／0110114和美国专利号5,665,593中公开，两者均通过引用特别地并入本文。
2004／0110114和美国专利号5,665,593中公开，两者均通过引用特别地并入本文。
[0087] 在一个实施方案中，用于施用EMAP II中和化合物的方案类似于用于施用任何其他通常施用于肺疾病的药剂的方案。作为一般指导，为施用用于肺疾病治疗的任意药剂所开发的方案形成用于施用本发明EMAP II中和化合物的起点。因此，所述EMAP II中和化合物和组合物通过吸入剂或治疗疾病(诸如哮喘)的任何其他机制来施用。在本发明的一个实施方案中，本发明的活性化合物或药物制剂通过任何合适的手段直接施用至对象的肺中，但优选地通过施用含有活性化合物的可呼吸(respirable)颗粒的气溶胶悬浮剂(对象吸入)来施用。活性化合物可以以多种形式气溶胶化，例如但不限于，干粉吸入剂、计量剂量吸入剂或液体／液体悬浮剂。可呼吸颗粒可以是液体或固体。或者，EMAP II中和化合物可通过静脉内施用或通过本领域已知的其他方式全身施用。
[0088] 之前已经在肺疾病治疗中使用的任何施用方案、制剂、途径等可以容易地被修改以用于本发明中。在一些情况下，机械通气是适当的。这种通气可包括高频振荡通气(high-frequency oscillatory ventilation，HFOV)或其他机械通气的非常规形式。从理论上讲，部分液体通气(partial liquid ventilation，PLV)提供肺灌洗结合呼吸机(ventilator)支持的益处。
[0089] 在另一个实施方案中，使用动物模型(例如对本领域技术人员已知的EMAP II双转基因模型)确定剂量，并且对其进行修改并适用于高等哺乳动物。治疗剂的总剂量以多剂量或以单剂量施用。在某些实施方案中，单独施用所述组合物，在另一些实施方案中，所述组合物与其他针对疾病或针对其其他症状的治疗联合施用。
[0090] 无论本发明活性化合物或制剂的施用途径为何，任一活性化合物(其使用在本发明的范围内)的治疗有效剂量在化合物与化合物、患者与患者之间会稍有不同，并且将取决于因素如年龄、体重和患者的状况以及递送途径。这样的剂量可以根据本领域技术人员已知的常规药理学方法来测定。在一个示例性实施方案中，约0.1mg／kg至约50mg／kg的剂量将具有治疗功效，其中基于活性化合物的重量计算所有重量。较高水平时的毒性顾虑可将静脉内剂量限制到较低水平例如至多约10mg／kg。约10mg／kg至约50mg／kg的剂量可以用于口服施用。通常地，约0.5mg／kg至约5mg／kg的剂量可以用于肌内注射。用于静脉内或经口施用的优选剂量为1μmol／kg至50μmol／kg，以及更优选22μmol／kg至33μmol／kg化合物。
[0091] 在另一个示例性实施方案中，本发明化合物的剂量、对于反义寡核苷酸剂量优选为产生寡核苷酸细胞内浓度的剂量为0.05μM至50μM。通常地，对于人的剂量将为约0.01、0.1或1mg／Kg多至50、100或150mg／Kg。在一个另外的实例中，对于抗体，剂量通常地为0.01、0.05或0.1mg／Kg多至20、40或60mg／Kg。
[0092] 当所述活性化合物或药物制剂的施用是通过吸入时，活性化合物的剂量也将根据所治疗的病症和对象的状态而异，但通常可以是这样的量，其足以实现活性化合物在对象-9 -1 -6气道表面的溶解浓度为约10 摩尔／升至约10 摩尔／升，更优选为约10 摩尔／升至约-4
10 摩尔／升。
10 摩尔／升。
[0093] 配制用于治疗性施用的抗体、肽或其他化合物的方法对本领域技术人员是已知的。配制siRNA或反义RNA的方法在本领域中也是已知的。根据本发明的这些组合物的施用将经由任何常见途径，只要靶组织通过该途径是可达到的即可。最常见的是，配制这些组合物用于经口施用，例如通过吸入剂。然而，也使用其他常规施用途径(例如，皮下、静脉内、皮内、肌内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼内、眼球后、肺内(例如，期限释放(term release))、气雾剂、舌下、经鼻、经肛门、经阴道或经皮递送，或通过手术在特定部位植入)，特别是当经口施用有问题时。治疗可以由单剂量或经一段时间的多剂量组成。
[0094] 本领域技术人员将可以理解，本发明的化合物可以以多种药物形式使用；所述化合物可以以纯的形式使用或与可药用载体或其他赋形剂或添加剂混合。一般来说，所述化合物将经口或静脉内施用。可以理解的是，也可以使用本发明化合物的治疗可接受的盐。剂量、率／频率和施用方式的选择完全在技术人员的能力范围内，并且可依据治疗医师的判断。本发明的方法可以单独使用或与其他治疗方案联合使用。
[0095] 在配制后，以与剂量制剂相容的方式并且以治疗有效的量施用溶液。所述制剂可以以多种剂型(如吸入剂、可注射溶液、药物释放胶囊等)容易地施用。对于水性溶液中的肠胃外施用，例如，如需要，适当缓冲溶液并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释物等渗。这些特定的水性溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。
[0096] 给药频率将取决于药剂的药代动力学参数和施用途径。最佳的药物制剂将由本领域技术人员根据施用途径和期望剂量来确定。这样的制剂可以影响所施用药剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。根据施用途径，依据体重、体表面积或器官大小计算合适的剂量。动物模型的可获得性对方便给定治疗之合适剂量的确定尤为有用。确定合适治疗剂量所需的进一步精细计算由本领域普通技术人员常规地进行而无需过度实验，尤其是在参照本文公开的剂量信息和测定以及在动物或人临床试验中观察到的药代动力学数据的情况下。
[0097] 通常地，合适的剂量是通过使用已建立的用于确定血液水平的测定与相关剂量响应数据相结合来确定的。最终的剂量方案将由主治医生考虑改变药物作用的因素(例如药物的比活性，损伤的严重程度和患者的响应性，患者的年龄、状况、体重、性别和饮食，任何感染的严重程度，施用时间和其他临床因素)来确定。随着研究的进行，将出现关于对特定疾病和病症之治疗适当的剂量水平和治疗持续时间的进一步信息。
[0098] 在本发明一个实施方案中，提供了通过确定EMAP II的表达水平来监测正在接受治疗的肺气肿和/或COPD患者的治疗有效性的方法。该方法可以包括如上所述的检测患者样品中的EMAP II的步骤。该方法还可以包括如上所描述的将患者样品中的EMAP II与对照相比较。或者，可以将EMAP II表达水平与来自治疗前(即，来自诊断)的相同患者的样品和／或治疗较早期的样品相比较。在一个示例性实施方案中，提供了方法，其包括以下步骤：通过确定EMAP II的表达水平诊断患者的肺气肿和/或COPD，如果诊断为阳性则治疗患者，并在治疗期间通过确定EMAP II的表达水平监测治疗的有效性。
[0099] 实施例1
[0100] 方法
[0101] 试剂和抗体。所有的化学试剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，除非另有说明。按照最近描述的生产EMAP II抗血清(Knies，U.E.，Kroger，S.，和Clauss，M.2000.Expression of EMAP II in the developing and adult mouse.Apoptosis5：141-151)。所使用的其他抗体是商业来源的，包括MAC-3(Becton Dickinson Biosciences，Franklin Lakes，NJ)、CXCR3(R&D systems，Minneapolis，Mi)和MMP-12(R&D)。
[0102] 细胞。人肺微血管内皮细胞(HLMVEC)获得自Lonza(Allendale，NJ)并且在由以下组成的培养基中维持：EMB-2、10％FBS、0.4％氢化可的松、1.6％hFGF、1％VEGF、1％的IGF-1、1％抗坏血酸、1％hEGF、1％GA-100和1％肝素。所有的原代细胞培养物在37℃下于5％CO2和95％空气中维持。进行实验至多10次传代并且细胞为80-100％汇合。
[0103] 单克隆抗EMAP II抗体。抗小鼠EMAP II的大鼠单克隆中和抗体M7通过用重组鼠前体EMAP II免疫Lewis大鼠开发。将从经免疫大鼠之脾和淋巴结中分离的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤SP2／0融合，并通过在ELISA中检测杂交瘤上清液对前体和成熟EMAP II二者的结合来选择克隆。在ELISA中最有活性的克隆通过Western印迹和在组织培养实验中EMAP II诱导之内皮凋亡的中和(原稿在准备中)来进一步表征。对于用于体内研究的MoAb的纯化，杂交瘤在无蛋白质的杂交瘤培养基(GIBCO-BRL)中生长并使用蛋白G-Sepharose(Pharmacia，Uppsala，Sweden)纯化抗体。
[0104] 动物研究。C57／Bl6小鼠购自Jacksons Lab。肺特异性可诱导EMAP II转基因小鼠通过将EMAP II响应小鼠与纯合转基因小鼠杂交产生(包含由肺上皮特异性CCSP控制的反式活化子)。EMAP II响应转基因小鼠包含在最小启动子(含四环素可诱导序列)下的EMAP II的分泌(成熟)形式。因此，将从meth小鼠肿瘤细胞克隆(Knies，U.E.，Behrensdorf，H.A.，Mitchell，C.A.，Deutsch，U.，Risau，W.，Drexler，H.C.，and Clauss，M.1998.Regulation of endothelial monocyte-activating polypeptide II release by apoptosis.Proc Natl Acad Sci U S A95：12322-12327)且与衍生自INFb之信号肽融合的鼠成熟EMAP II通过使用Sac II和Xho I位点插入到包含tet重复的质粒pUD10-3中。将所得的质粒注射到卵母细胞用于植入寄养(foster)小鼠并建立转基因品系。将所得到的响应小鼠与rtTA反式式活化子小鼠杂交后，将第一代EMAP II响应转基因杂合的小鼠与CCSP反式活化子(仅具有CCSP反式活化子)转基因小鼠进行了比较。值得注意的是，只有EMAP II／CCSP反式活化子而不是仅CCSP反式活化子转基因可诱导EMAP II表达。使用这个设计，可以排除CCSP反式活化子的背景影响和四环素影响，因为两个组都可以用四环素处理。转基因小鼠饲养在AAALAC认证的动物设施中。给予双转基因EMAP II/CCSP-rtTA和单转基因CCSP-rtTA小鼠定期的水一直培养到3至4月龄。然后，将小鼠置于多西环素处理长达6个月。在实验结束时，为小鼠实施安乐死，并依照所述处理组织(Petrache，I.，Natarajan，V.，Zhen，L.，Medler，T.R.，Richter，A.T.，Cho，C.，Hubbard，W.C.，Berdyshev，E.V.，和Tuder，R.M.2005.Ceramide upregulation causes pulmonary cell apoptosis and emphysema-like disease in mice.Nat Med11：491-498)。此外，用0.6ml PBS对小鼠进行BAL三次。通过离心沉降BAL细胞并且无细胞流体随后在液氮中快速冷冻并贮存于-80℃用于进一步分析。
[0105] 香烟烟雾暴露。按照之前所述进行香烟烟雾暴露(Cavarra，E.，Bartalesi，B.，Lucattelli，M.，Fineschi，S.，Lunghi，B.，Gambelli，F.，Ortiz，L.A.，Martorana，P.A.，和Lungarella，G.2001.Effects of cigarette smoke in mice with different levels of alpha(1)-proteinase inhibitor and sensitivity to oxidants.Am J Respir Crit Care Med164：886-890)。将小鼠(C57／BL6小鼠、雌性、12周龄，每组n＝5-10)暴露于香烟烟雾中或环境空气中长达24周。在独立的实验中，将双转基因EMAP II／CCSP反式活化子或单转基因CCSP反式活化子对照同窝仔鼠(雄性和雌性，12周龄，每组n＝5-10)通过与上述类似的方案暴露于香烟烟雾或环境空气。香烟烟雾暴露之前(所示持续时间)和期间，所有转基因小鼠接受含有多西环素的水。在独立的实验中，将小鼠(DBA2、雌性、12周龄，每组n＝5-12)如上所述暴露于香烟烟雾或环境空气四个月；香烟烟雾暴露的第三个月期间，两组暴露于香烟烟雾的小鼠通过雾化作用接受EMAP II抗体或同种型IgG对照，暴露在环境空气中的一组接受同种型IgG对照。香烟烟雾程序结束后的那天，对所有实验中的小鼠进行安乐死并按如前所述进行肺处理(Petrache，I.，Natarajan，V.，Zhen，L.，Medler，T.R.，Richter，A.T.，Cho，C.，Hubbard，W.C.，Berdyshev，E.V.，和Tuder，R.M.2005.Ceramide upregulation causes pulmonary cell apoptosis and emphysema-like disease in mice.Nat Med11：491-498)。
[0106] VEGF受体阻滞。按照之前所述进行VEGF受体阻滞(Petrache，I.，Natarajan，V.，Zhen，L.，Medler，T.R.，Richter，A.T.，Cho，C.，Hubbard，W.C.，Berdyshev，E.V.，和 Tuder，R.M.2005.Ceramide upregulation causes pulmonary cell apoptosis and emphysema-like disease in mice.Nat Med11：491-498)。对小鼠(n＝4-6／组)注射SU5416(Calbiochem；20mg／kg，皮下)或载剂(羧甲基纤维素)并在指定的时间对小鼠进行安乐死。
[0107] 如所述使用由R.M.T.开发的用于Metamorph的近摄(macro)(Tuder，R.M.，Zhen，L.，Cho，C.Y.，Taraseviciene-Stewart，L.，Kasahara，Y.，Salvemini，D.，Voelkel，N.F.，和Flores，S.C.2003.Oxidative stress and apoptosis interact and cause emphysema due to vascular endothelial growth factor receptor blockade.Am J Respir Cell Mol Biol29：88-97；Aherne，W.A.，and Dunnill，M.S.1982.Morphometry.London：E.Arnold.xiv，205pp)在经编码的载片上进行形态学分析。
[0108] 人肺组织。人肺组织由以下组成：来自COPD患者和无肺疾病的患者的经固定石蜡包埋的移出肺组织(在约翰霍普金斯大学收集)。标本采集和存储由来自约翰霍普金斯大学的研究机构董事会批准。
[0109] 通过活化的胱天蛋白酶3IHC(Abcam and Cell Signaling)或鼠肺上对凋亡DNA进行原位标记在溶解产物(Petrache，I.，Natarajan，V.，Zhen，L.，Medler，T.R.，Richter，A.T.，Cho，C.，Hubbard，W.C.，Berdyshev，E.V.，and Tuder，R.M.2005.Ceramide upregulation causes pulmonary cell apoptosis and emphysema-like disease in mice.Nat Med11：491-498)或膨胀且固定的肺切片(使得能够专注于肺泡而不是大气道和血管)(Tuder，R.M.，Zhen，L.，Cho，C.Y.，Taraseviciene-Stewart，L.，Kasahara，Y.，Salvemini，D.，Voelkel，N.F.，and Flores，S.C.2003.Oxidative stress and apoptosis interact and cause emphysema due to vascular endothelial growth factor receptor blockade.Am J Respir Cell Mol Biol29：88-97)中检测凋亡，用大鼠血清作为阴性对照。活性胱天蛋白酶3和TUNEL二者的免疫染色后进行通过DAPI(Molecular Probes)核反染色。处决者胱天蛋白酶(胱天蛋白酶-3和/或-7)的活性用ApoONE同类胱天蛋白酶-3／
7测定试剂盒(Promega，Madison，WI)测量。人重组的胱天蛋白酶-3(Calbiochem)用作阳性对照。
7测定试剂盒(Promega，Madison，WI)测量。人重组的胱天蛋白酶-3(Calbiochem)用作阳性对照。
[0110] 脂质提取和通过串联质谱法测量神经酰胺类群(ceramide species)。提取细胞或肺组织脂质并通过测量总脂磷(Pi)评估脂质含量(Petrache，I.，Natarajan，V.，Zhen，L.，Medler，T.R.，Richter，A.T.，Cho，C.，Hubbard，W.C.，Berdyshev，E.V.，和Tuder，R.M.2005.Ceramide upregulation causes pulmonary cell apoptosis and emphysema-like disease in mice.Nat Med11：491-498)。脂质提取后，监测神经酰胺的各个以下分子类群：14：0、16：0、18：0、18：1、20：0、24：0、和24：1-神经酰胺，并利用C17神经酰胺为内部标准，神经酰胺通过组合的液相色谱-串联质谱(LC-MS／MS)测量。
[0111] IHC。石蜡切片用10％兔(或山羊血清，如果二抗来自山羊)封闭，并用抗体或对照抗体孵育。多克隆兔抗血清包含EMAP II(1∶500稀释)，胱天蛋白酶3(Cell signaling)和抗MMP-12(1∶100，Sigma)。根据制造商的说明书或缀合生物素的山羊抗大鼠IgG二抗(Dianova，1∶100)和缀合链霉亲和素的藻红蛋白(Dianova，1∶1000)检测结合抗体。对于某些应用(抗CD144，Pharmingen)，使用冷冻切片。切片用DAPI反染色并用Mowio1488(Calbiochem)封片。在Nicon Eclipse(TE200S)倒置荧光或组合的共聚焦／多光子(Spectraphysics laser，BioRad MRC1024MP)倒置系统中进行显微观察。用MetaMorph成像软件(Universal)处理图像和定量的强度(表达)数据。
[0112] Western印迹。肺组织在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中被匀浆(冰上)并通过以10000g在4℃离心10分钟分离。收集来自转基因小鼠或者患者的BAL上清液并通过添加三氯乙酸浓缩和沉淀蛋白质。按照BCA蛋白浓度测定((Pierce，Rockville，IL)确定的相等量上样蛋白质(10mg，除非另有说明)。用Novex凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)经SDS-PAGE将总蛋白分离，随后按照之前所述进行EMAPII免疫印迹(Knies，U.E.，Behrensdorf，H.A.，Mitchell，C.A.，Deutsch，U.，Risau，W.，Drexler，H.C.，和Clauss，M.1998.Regulation of endothelial monocyte-activating polypeptide II release by apoptosis.Proc Natl Acad Sci U S A95：12322-12327)。简言之，将样品与Laemmli缓冲液混合，在95℃煮沸10分钟并上样至15％SDS／PAGE凝胶。蛋白通过电泳分离，并使用半干印迹装置印迹到硝酸纤维素(Pierce)上。通过在TBS／0.1％吐温20／5％无脂干乳中封闭来减少非特异性结合。施加一抗(兔抗-EMAP II抗血清SA2847，1∶1000稀释在TBS／0.1％吐温20／5％BSA)在4℃过夜。洗涤后，将膜在偶联过氧化物酶的山羊抗兔IgG(Dianova／Jackson Immuno Research，1∶3500在封闭缓冲液中稀释)中室温孵育1小时，并使用增强的化学发光试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)显色。对肺溶解产物或BAL中EMAP II的免疫印迹通过与以1∶250稀释于TBST中的EMAP II-特异性抗体在室温孵育1小时进行(兔血清，如上所述生产)。通过密度法(ImageQuant；Amersham，Piscataway，NJ)定量化学发光信号并通过管家基因归一化(肌动蛋白、GAPDH或黏着斑蛋白(vinculin))。
[0113] 使用SigmaStat软件通过ANOVA结合Student-Newman-Keuls事后检验进行统计学分析。接受的统计学差异为p＜0.05。
[0114] 实施例2
[0115] 香烟烟雾暴露或VEGF受体抑制对小鼠肺中EMAP II表达的影响
[0116] 为了检验吸烟诱导细胞应激导致EMAP II释放的假设，测量了吸烟对EMAP II蛋白质产生的影响。也评估了吸烟在小鼠肺中引起的凋亡的程度。为了更特别地研究内皮死亡和EMAP II过度产生之间的相关性，检测了用VEGF受体阻断剂(其诱导内皮细胞凋亡)处理的小鼠中肺EMAP II的表达。
[0117] 将对香烟烟雾诱导之肺气肿易感的小鼠于香烟烟雾中暴露多种时间段(从4天至6个月)。通过Western印迹在肺溶解产物中测量EMAP II表达，以及通过胱天蛋白酶3活性和神经酰胺产生测量凋亡。最终，在三周时(肺通常显示肺气肿形态学改变的时间)通过Western印迹检测用VEGF受体阻断剂SU5416(20mg／kg皮下)处理的小鼠之肺的EMAP II表达。
[0118] 在C57／Bl6小鼠中，香烟烟雾CS暴露4天增加肺中胱天蛋白酶3活性，从而在早至香烟烟雾暴露后1周增加凋亡活性(图2A)，这比香烟烟雾暴露6个月时发生的肺气肿通常的气室增大早得多(图2C)。在1个月时，在DBA2小鼠中神经酰胺的肺含量增加(图2B)。这些凋亡活性的早期增加与前体和成熟两种形式的EMAP II表达的增加平行(图3A和3B)。类似地，在另一个凋亡依赖性肺气肿试验模型中，在C57／Bl6小鼠肺中，在4周时，SU5416诱导了强EMAP II表达(图3C)。
[0119] 这些结果提示在小鼠(包括那些暴露于香烟烟雾的)的气肿性肺中凋亡率和EMAP II产生的增加。不希望被理论限制，EMAP II的增加可因直接细胞应激产生，或者因凋亡活化的胱天蛋白酶产生。此外，EMAP II释放本身可以是诱导进一步肺内皮细胞凋亡的原因。
[0120] 实施例3
[0121] 小鼠肺中升高的肺EMAP II水平对香烟烟雾诱导损伤的严重性的影响
[0122] 为了检测肺中EMAP II的增加是否与吸烟具有相加或协同效应，在香烟烟雾暴露前8周诱导EMAP II在肺中表达。条件性转基因过表达系统在实施例4中更详细的呈现。
[0123] 相比于单独的吸烟，肺中基线EMAP II水平的增加以及之后4周的香烟烟雾暴露显著升高了成熟EMAP II的水平并增加了肺泡／间质组织间的炎性细胞的数目，这与实质炎症的进一步增加一致。
[0124] 这些结果提示，EMAP II有助于香烟烟雾诱导的肺损伤并且可独立地使肺恶化或倾向于对烟雾有更严重的炎性应答。
[0125] 实施例4
[0126] 在肺中转基因诱导EMAP II引起小鼠中的肺气肿样疾病
[0127] 为了研究增加EMAP II肺水平触发肺气肿的机理，使用由肺上皮特异性CCSP启动子控制的四环素可诱导反式活化子(TTA)建立肺中可诱导表达EMAP II的转基因小鼠模型。尽管两种EMAP II形式都可作为可诱导构建体获得，但是首先评估了成熟EMAP II，因为它经典地参与EMAP II的凋亡和炎性作用。此外，前体EMAP II通常容易被切割以产生成熟EMAP II，使得难以评估其特异性、不依赖于成熟形式的作用。
[0128] 转基因小鼠tet EMAP II(响应小鼠(responder mouse))含有EMAP II的成熟形式，其在含有四环素可诱导序列的最低限度启动子下。该小鼠品系不表达升高水平的EMAP II由于其缺乏反式活化基因产物。将响应小鼠与纯合转基因小鼠(含有由肺上皮特异性CCSP启动子控制的反式活化子)(CCSP小鼠品系)杂交，其以这种形式主要靶向肺泡II型细胞中的基因表达(相对于Clara细胞)。Clark，J.C.，等.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol280，L705-715(2001)；Li，Y.，等.Cancer Res67，8494-8503(2007)。将第一代EMAP II响应转基因杂合的小鼠与CCSP反式活化子(仅具有CCSP反式活化子)转基因小鼠进行比较。应注意，该仅CCSP反式活化子转基因不能诱导EMAP II过表达。使用该设计，可以排除最近描述的CCSP反式活化子背景影响(Sisson，T.H.，et al.Am J Respir Cell Mol Biol34，552-560(2006))和四环素影响，因为两组都使用四环素处理。此外，在该诱导系统中使用的四环素浓度不足以改善任何炎症和MMP活性。使用EMAP II抗血清通过BAL和肺溶解产物的Western和通过肺切片的IHC分析表达。为了确定肺中长期EMAP II过表达是否引起肺气肿样表型，在饮水中含有四环素的双转基因小鼠被处理长达6个月。
[0129] 在早至24小时后，EMAP II的转基因诱导引起双转基因小鼠肺中高的EMAP II分泌(图3B、4B和5A)。注意，肺实质中的EMAP II表达模式类似于肺泡II型细胞的通常染色模式，这与所报道的该转基因启动子的选择性一致。用四环素处理EMAP II双转基因小鼠3或6个月以诱导EMAP II表达，气室表现出显著的肺气肿样增加(图7A)。这通过平均线性截距(mean linear intercept)和最近建立的体积加权平均气室体积(volume-weighted mean airspace volume)方法二者测量。肺气肿的形态学参数表现出与EMAP II诱导持续时间成比例地增加，其通过形态学反映：体积加权平均气室体积为1.36E+08±0.15，n＝5(在对照小鼠中)；1.56E+08±0.3(在诱导3个月的EMAPII转基因小鼠中)；和
1.91E+08±0.3，n＝6(在诱导6个月的那些中；p＝0.027)。
1.91E+08±0.3，n＝6(在诱导6个月的那些中；p＝0.027)。
[0130] 肺中增加的EMAP II产生导致肺气肿样形态学改变的形成。这是过度水平的蛋白质引起内皮细胞死亡导致肺气肿的第一个证据。
[0131] 实施例5
[0132] 肺中EMAP II的过度产生引起肺部细胞凋亡
[0133] 为了研究EMAP II过量产生通过内皮细胞凋亡促进肺气肿的假设，评估了EMAPII过表达小鼠的肺中的凋亡。为了确定凋亡的EMAPII特异性，以及为了测试EMAP II中和抗体在体内的效力，向EMAP II转基因动物组施用抗EMAP抗体。
[0134] 使用特异性活性胱天蛋白酶-3抗体对来自EMAP II／CCSP双转基因(EMAP II tg)或CCSP对照转基因动物(ctl)的肺切片进行荧光显微镜观察，以检测肺中凋亡的存在和位置。使用抗-VE-黏着斑蛋白抗体用于凋亡与内皮细胞的共定位。此外，通过荧光酶测定(Promega)测试肺溶解产物的胱天蛋白酶-3活性。对于中和试验，EMAP II tg(收获肺前诱导48小时)通过诱导后12小时的单次i.p.注射接受抗EMAP II大鼠单克隆抗体或同种型IgG对照。
[0135] 早至诱导后三周，EMAP II显著增加胱天蛋白酶-3阳性细胞在EMAP II tg(相对于对照)肺实质中的数量(约6倍，p＝0.003，通过在盲载片(blinded slide)上使用Metamorph荧光定量)。如通过来自肺溶解产物的IHC和胱天蛋白酶-3活性二者所评估的，增加的肺凋亡持续到EMAP II诱导3个月和6个月后(图6A和6B)。主要的胱天蛋白酶-3阳性细胞为内皮细胞。在接受中和EMAP II抗体的小鼠中有凋亡降低的趋势(图6C)。
[0136] 认为通过原位检测活化胱天蛋白酶-3的改变更大程度地显著是由于，由具有许多其他未死亡细胞(而非内皮细胞)产生的溶解产物中信噪比更高。最终，尽管仍没有统计学显著性，但是抗EMAP II抗体的中和作用是极度鼓舞的，因为观察到的凋亡是EMAP II依赖的，并且中和抗体在体内是有效的。综合考虑这些数据支持了以下结论，即内皮细胞凋亡在EMAP II诱导的肺气肿形成中可以是关键事件。
[0137] 实施例6
[0138] 肺中肺特异性EMAP II过表达对单核细胞募集的影响
[0139] 之前已经显示，当局部注射时，EMAP II以剂量依赖的方式吸引和活化单核细胞造成炎症，并且在系统性应用后在肺中引发白细胞淤滞(leukostasis)。Kao，J.，等，J Biol Chem269，25106-25119(1994)；Kao，J.，等，J Biol Chem269，9774-9782(1994)。EMAP II对单核细胞的趋化作用在与肺气肿相关的炎性应答中可以是重要的。
[0140] 使用MAC-3(巨噬细胞标志物)以及TNFα、MMP-9和MMP-12特异性抗体进行肺切片中肺巨噬细胞积聚和活化之标志物的荧光免疫染色的共聚焦成像，所述肺切片来自EMAP II／CCSP双转基因相比于CCSP单转基因动物。
[0141] 成熟EMAP II的肺特异性过表达急剧增加了表达MAC-3的细胞数目以及对肺中TNFα，MMP-9，MMP-12的染色(图7A和7B)。绝大多数TNFα、MMP-9、MMP-12和MAC-3阳性细胞表现出大核表型(巨噬细胞的特征)，而MMP-12阳性不只与Mac-3共定位(图7A)，还与肺泡壁内的其他细胞(可能上皮细胞)共定位。
[0142] Mac-3阳性细胞的增加最有可能是由于将单核细胞从循环募集到肺，由于已定居(resident)的肺巨噬细胞的增殖能力是非常低的。这些巨噬细胞可以是EMAP II转基因的肺中炎性活化的来源。
[0143] 实施例7
[0144] 前体和成熟EMAP II二者在人原代微血管肺内皮细胞中诱导显著的凋亡
[0145] 与应激相关的情形可诱导EMAP II的两种形式。不知道的是哪一种形式在诱导内皮细胞凋亡中更有效力，以及其发生的机制是否是形式依赖的。这些详细的机制测定仅可以在细胞培养物中进行。然而为了增加其意义，仅测试了商业可得的((Lonza)人来源原代肺微血管内皮细胞。
[0146] 以10μg／ml至16μμg／ml使用重组前体和成熟EMAP II处理原代人肺微血管内皮细胞。通过胱天蛋白酶-3活性和用流式细胞术的Annexin／PI染色测量凋亡。如通过胱天蛋白酶-3活性(图8A)和Annexin／PI染色(图8E)测量的，使用EMAP II的两种形式处理都导致凋亡的增加。
[0147] 前体和成熟两种EMAP II形式在培养条件下诱导内皮细胞凋亡方面表现出相同效力。
[0148] 实施例8
[0149] 应激敏感的CXCR3受体介导EMAP II诱导的肺内皮细胞凋亡
[0150] 为了研究CXCR3受体是否介导EMAP II诱导的肺内皮细胞凋亡，首先评估了其在原代人肺微血管内皮细胞中的表达，然后，其功能被特异性阻断抗体抑制。
[0151] 原代人肺微血管内皮细胞在正常生长培养基中培养，以及在含有低血清浓度(2％)的培养基中培养，或甚至用来自吸烟或对照小鼠的非细胞BAL处理。BAL被浓缩(50倍)并且以代表原始未稀释细胞BAL之10％的体积孵育细胞。使用经标记的抗CXCR3抗体经FACS检测来检测CXCR3。为了评估CXCR3胱天蛋白酶-3活化在肺微血管内皮细胞中的作用，预处理具有阻断性抗CXCR3抗体的细胞(1μg／ml，预处理30分钟)。
[0152] 原代人肺微血管内皮细胞以低水平表达CXCR3。应激性条件诸如血清饥饿、使用来自吸烟而非不吸烟小鼠的BAL处理、或者甚至电穿孔(图9)显著增加其表达(图8A至8D)。抗CXCR3抗体(但不是同种型IgG抗体)显著降低成熟EMAP II诱导的内皮细胞死亡(图8A至8D)。
[0153] 这些结果有力地证明在肺中EMAP II诱导的内皮细胞凋亡可以主要通过CXCR3受体介导。这表明CXCR3介导EMAP II对内皮细胞和单核细胞二者的功能性影响并对于香烟烟雾肺气肿的发生可以是重要的。
[0154] 实施例9
[0155] 香烟烟雾增加两种EMAP II形式在小鼠肺中的表达
[0156] 基于前述发现，即，由凋亡释放成熟EMAP II以及应激后释放前体形式，研究了香烟烟雾暴露后于体内在肺中EMAP II的诱导。因此，在两种自交小鼠系C57／Bl6和DBA2(已被报道分别长期暴露于香烟烟雾6或4个月后发生肺气肿)中测量了EMAP II表达。香烟烟雾暴露(CSE)(持续多达24周)显著地增加在BAL中分泌的EMAP II之前体和成熟两种形式(分别约8倍和2倍)并通过Western印迹检测(图10A)。合并(每个时间点n＝5)来自各个小鼠的等体积(100μl)无细胞BAL，然后相等地浓缩(10x)并相等地上样(10μl)在各个泳道。特异性EMAP II抗体(1∶250)检测到在灌洗液中EMAP II前体和成熟两种形式。利用来自EMAP II过表达转基因(Tg)小鼠的BAL作为阳性(Pos)对照。在暴露于香烟烟雾四周的DBA2小鼠的肺实质中注意到EMAP II表达的两种形式类似地增加(图10B)。
[0157] 令人感兴趣的是，在不同的凋亡依赖性鼠肺气肿试验模型(其针对VEGF受体抑制继发地产生)中，EMAP II表达在小鼠(其与对照小鼠相比发生气室扩大)的肺中也显著上调，但主要以前体形式(图10C)。图10C显示，在用VEGF受体抑制剂(VEGFR-inh)处理后四周时在C57／Bl6小鼠的肺实质中EMAP II表达。各泳道用40μg肺溶解产物上样，所述溶解产物来自用载剂(羧甲基纤维素)或VEGFR-inh SU5416(20mg／kg，皮下)处理的个体小鼠。经免疫印迹的黏着斑蛋白作为上样对照。EMAP II升高的动力学响应香烟烟雾表明肺EMAP II分泌增加先于肺泡巨噬细胞聚集，在香烟烟雾暴露4周时首次注意到，而不是两周时(图10D)。在肺中EMAP II增加与胱天蛋白酶-3活化之间的动力学关系更复杂，由于在小鼠中响应香烟烟雾的EMAP II增加的整个时间阶段均注意到显著的胱天蛋白酶-3活化(图10E)。因为EMAP II的生物特性包括单核细胞趋化和增殖与低氧内皮细胞凋亡，EMAP II可以在肺响应于香烟烟雾暴露的炎性和凋亡应答中发挥重要作用。
[0158] 实施例10
[0159] 中和前体和成熟EMAP II诱导的内皮细胞凋亡
[0160] 由于已经显示成熟EMAP II诱导内皮凋亡，研究了大鼠抗体杂交瘤克隆M7／1(M／71抗体)是否也能够中和由EMAP II诱导的凋亡。特别地，研究了该M7／1抗体是否能够中和前体EMAP II和成熟EMAP II二者的促凋亡活性。
[0161] EMAP II诱导的凋亡通过TUNEL阳性细胞的定量评估(图11A)。内皮细胞用前体EMAPII蛋白质(50μg／ml)或成熟EMAPII蛋白质(50μg／ml)孵育，如通过TUNEL所示(＊p＜0.01)显示了显著的凋亡(箭头)。如从TUNEL测定之后代表性荧光显微镜成像示出的，用中和M7／1抗体(10μg／ml)(而不是对照大鼠IgG)预处理这些细胞显著地抑制由前体和成熟EMAPII二者引起的凋亡(＊＊p＜0.03)。通过MetaMorph软件将定量的TUNEL阳性细胞针对总DAPI核阳性细胞进行归一化，也显示前体EMAPII(图11B)和成熟EMAPII(图11C)。所示数据来自以一式三份进行的代表性实验，独立地重复另外2次且具有相似结果。比例尺＝50μm。
[0162] 这样，EMAP II诱导的凋亡显著地(p＜0.03)被抗EMAP II M7／1抗体抑制，但不被对照大鼠IgG抑制(图11A至11C)。有意思的是，观察到与成熟EMAP II摩尔浓度相同的前体EMAP II也是内皮凋亡的强诱导剂。同样，M7／1抗体能够完全中和该活性(p＜0.01)。这些数据证明，M7／1抗体可以有效地中和两种EMAP II形式的促凋亡功能，并且可以是抑制该蛋白在小鼠中的病理生理活性的合适工具(Rajashekhar，G.等，A monoclonal rat anti-mouse EMAP II antibody that functionally neutralizes pro-and mature-EMAP II in vitro，J Immunol Meth ods.2009October31；350(1-2)：22-28)。
[0163] 实施例11
[0164] EMAPII水平的中和显著减少小鼠中CS诱导的肺气肿
[0165] 由于已经显示EMAP II通过凋亡、缺氧和细胞应激产生和释放，研究了暴露于香烟烟雾(CS)后，EMAP II是否在体内于肺中被诱导。分别地，在DBA／2小鼠品系中测量EMAPII蛋白表达，其在长期暴露于CS早至16周后发生肺气肿，表现出气室尺寸增加20％(相比而言，在该时间点在C57BL／6品系中仅测量到增加9％)。通过免疫印迹测量地，仅4周CS暴露显著地增加EMAPII前体和成熟形式在DBA／2小鼠肺实质中的表达(相比于暴露于环境空气(空气对照[AC])的对照小鼠中)(图12A)。
[0166] 下一步，通过用EMAPII抗血清、CD11b抗体和DAPI的共免疫荧光研究了EMAP II表达在正常和CS暴露小鼠中的细胞定位。在环境空气条件下，对照小鼠的肺显示稀少的EMAPII表达，大多与细胞CD11b标记的肺泡巨噬细胞共定位(图12B，左图)。反之，香烟烟雾强烈增加胞内和胞外二者的EMAPII产生，这与巨噬细胞(图12B，中图)和肺泡隔细胞(图12B，右图)二者共定位。
[0167] 来自实施例10的M7／1抗体被用于功能性评估分泌的EMAPII在CS诱导之肺损伤和肺气肿中的作用。M7／1抗体(50μg／应用)通过雾化溶液的吸入直接施用至肺，在15分钟时通过肺的荧光显微镜检查以及在4小时通过免疫吸附分析从血浆回收的生物素化抗体表明其有效沉积在肺实质。该施用方法具有靶向局部EMAPII池的优点并且先前已经证明，与全身途径相比允许使用较低剂量的抗体。选择M7／1抗体递送的时间，以追踪所检测的响应于CS暴露的EMAPII增加，而抗体M7／1处理的持续时间被限制到4周，以最小化或避免非特异性免疫副作用。首先将DBA／2小鼠暴露于单独CS8周，随后在9周至12周用中和M7／1抗体靶向EMAPII，以及进行额外4周的CS暴露(图12C)。
[0168] EMAPII中和M7／1抗体的施用显著降低在组织溶解产物中通过胱天组织蛋白酶-3活性测量的肺凋亡(图12D)。此外，这种处理减少了BALF中回收的炎性细胞的数量(图12E)，特别是肺泡巨噬细胞和嗜中性粒细胞，并降低了嗜中性粒细胞在肺实质中的数目。此外，抗EMAPII M7／1抗体显著提高肺静态顺应性近40％(图12F)。重要的是，与这些功能性数据相一致，EMAPII中和消除了CS诱导的气室扩大，测量为相比暴露在空气中的小鼠MLI中增加19.4％，其是用于CS诱导的肺气肿小鼠模型的通常范围(图2G和2H)。有趣的是，中和EMAPII抗体对CS引起的大气道上皮重塑没有影响，但恢复了由CS暴露显著降低的小气道(小于150微米的直径)上皮层的厚度。(Clauss，M.等，Lung endothelial monocyte-activating protein2is a mediator of cigarette smoke-induced emphysema in mice，J Clin Invest doi：10.1172／JCI43881)。
[0169] 实施例12
[0170] 肺特异性EMAP II过表达诱导肺的肺气肿样病理
[0171] 内皮细胞死亡、肺泡巨噬细胞聚集和MMP-12的表达在肺气肿发病机制中有涉及。肺特异性EMAP II过表达长达6个月显著增加气室直径，与简化的肺泡结构相一致(图
5B-5E)。气室扩大是进展性的，在苏木精-伊红染色的肺切片上观察到的和通过体积加权平均气室体积测量的，其从在对照小鼠中1.36E+08(±0.15，n＝5)到EMAPII肺过表达三个月时1.56E+08(±0.3SD，n＝6)(未显示)到在6个月时1.91E+08(±0.3SD，n＝6)显著增加(p＝0.027)(图5E)。肺泡隔膜的损失通过与对照小鼠相比，在过表达EMAP II3个月的小鼠中平均线性截距的增加进一步支持(图5C)。注意，图5B和5D中的条代表300微米。这些数据表明，EMAP II单独增加可足以引发肺气肿样气室扩大。
5B-5E)。气室扩大是进展性的，在苏木精-伊红染色的肺切片上观察到的和通过体积加权平均气室体积测量的，其从在对照小鼠中1.36E+08(±0.15，n＝5)到EMAPII肺过表达三个月时1.56E+08(±0.3SD，n＝6)(未显示)到在6个月时1.91E+08(±0.3SD，n＝6)显著增加(p＝0.027)(图5E)。肺泡隔膜的损失通过与对照小鼠相比，在过表达EMAP II3个月的小鼠中平均线性截距的增加进一步支持(图5C)。注意，图5B和5D中的条代表300微米。这些数据表明，EMAP II单独增加可足以引发肺气肿样气室扩大。
[0172] 实施例13
[0173] 特异性中和分泌的EMAP II抑制小鼠中香烟烟雾诱导的气室扩大
[0174] 为研究分泌的EMAP II过量是否对响应吸烟的气室扩大的病理也是必要的，通过在暴露于香烟烟雾的小鼠中施用特异性单克隆抗体来中和EMAP II。将香烟烟雾暴露4个月后发生显著的气室扩大的DBA2小鼠首先暴露于香烟烟雾2个月。对于随后一个月的暴露，通过喷雾每周三次施用特异性EMAP II抗体或同种型IgG(1mg／kg)。在总香烟烟雾暴露的4个月末，肺形态证明响应于香烟烟雾但不响应于环境空气，气室尺寸显著增加，这与肺泡结构的简化(类似于肺气肿)一致(图12G，左图和中图，标尺为100μm)。而吸入IgG对香烟烟雾诱导的气室尺寸没有抑制效果(未示出)，使用吸入的EMAP II抗体处理小鼠显著地抑制由吸烟诱导的气室扩大(图12G，右图，和图12H)。这些数据表明，应用中和抗体可以(甚至在相当长时间的烟雾暴露后)降低肺气肿发生。
[0175] 实施例14
[0176] EMAP II和香烟烟雾暴露在肺中的协同作用
[0177] 已经表明，EMAP II在吸烟诱导的肺气肿中既是充分也是必要的，接下来要问的是肺中基线EMAP II水平的升高是否使肺对香烟烟雾诱导的损伤(特备是凋亡和巨噬细胞炎症)敏感。在双转基因小鼠中通过施用四环素8周实现了EMAP II肺水平的升高。然后双转基因(EMAP II过表达)或单转基因对照小鼠每天暴露于香烟烟雾，一周5次，持续4周。然后按照之前报道的(Petrache，I.，Natarajan，V.，Zhen，L.，Medler，T.R.，Richter，A.T.，Cho，C.，Hubbard，W.C.，Berdyshev，E.V.，和Tuder，R.M.2005.Ceramide upregulation causes pulmonary cell apoptosis and emphysema-like disease in mice.Nat Med11：
491-498)通过提取和测量全肺细胞凋亡信号转导神经酰胺评估肺。在香烟烟雾暴露这个时间点，野生型小鼠的肺仅表现出神经酰胺适度增加(Petrache，I.，Medler，T.R.，Richter，A.T.，Kamocki，K.，Chukwueke，U.，Zhen，L.，Gu，Y.，Adamowicz，J.，Schweitzer，K.S.，Hubbard，W.C.，等.2008.Superoxide dismutase protects against apoptosis and alveolar enlargement induced by ceramide.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol295：
L44-53)。有趣的是，相比于单独EMAP II过表达或吸烟，在过表达EMAP II的小鼠肺中神经酰胺早于吸烟急剧增加(图4A)。类似地，相比于暴露于相同持续时间的单独的各刺激的小鼠，过表达EMAP II的小鼠中肺巨噬细胞的数目(通过IHC使用F4／80抗体测量)早于吸烟协同增加。通过串联质谱法测量肺气肿中肺泡凋亡升高的标志物肺神经酰胺的水平(图2C)，并且将水平对脂质磷(Pi)含量归一化。水平线代表中位数且须触线(whiskers)描绘第5至第95百分位。通过ANOVA比较组，＊P＝0.01相比于对照；＊＊p＝＜0.006相比于对照和相比于对照+香烟烟雾。H＆E染色显示在CS暴露小鼠中炎性细胞增加，其在暴露于CS的Tg小鼠中进一步加剧。这些数据为EMAP II可以是肺气肿形成的预测物和中介物的假设提供了证据。
491-498)通过提取和测量全肺细胞凋亡信号转导神经酰胺评估肺。在香烟烟雾暴露这个时间点，野生型小鼠的肺仅表现出神经酰胺适度增加(Petrache，I.，Medler，T.R.，Richter，A.T.，Kamocki，K.，Chukwueke，U.，Zhen，L.，Gu，Y.，Adamowicz，J.，Schweitzer，K.S.，Hubbard，W.C.，等.2008.Superoxide dismutase protects against apoptosis and alveolar enlargement induced by ceramide.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol295：
L44-53)。有趣的是，相比于单独EMAP II过表达或吸烟，在过表达EMAP II的小鼠肺中神经酰胺早于吸烟急剧增加(图4A)。类似地，相比于暴露于相同持续时间的单独的各刺激的小鼠，过表达EMAP II的小鼠中肺巨噬细胞的数目(通过IHC使用F4／80抗体测量)早于吸烟协同增加。通过串联质谱法测量肺气肿中肺泡凋亡升高的标志物肺神经酰胺的水平(图2C)，并且将水平对脂质磷(Pi)含量归一化。水平线代表中位数且须触线(whiskers)描绘第5至第95百分位。通过ANOVA比较组，＊P＝0.01相比于对照；＊＊p＝＜0.006相比于对照和相比于对照+香烟烟雾。H＆E染色显示在CS暴露小鼠中炎性细胞增加，其在暴露于CS的Tg小鼠中进一步加剧。这些数据为EMAP II可以是肺气肿形成的预测物和中介物的假设提供了证据。
[0178] 实施例15
[0179] EMAP II在患有COPD的人肺中和在吸烟者的支气管肺泡灌洗液中升高
[0180] 为了研究升高的肺EMAPII水平与人肺气肿的相关性，评估诊断为肺气肿的对象中的EMAP II。用特异性EMAP II抗体对移植肺时从患肺气肿的患者获得的肺样品进行免疫染色(IHC)证明，相比于未患病肺，EMAP II染色显著增加。有趣的是，在组织取样时没有诊断为COPD的个体中观察到可变的EMAP II表达水平。这种可变性可以与吸烟状态相关，因为相比于非吸烟者，从没有诊断为COPD的活跃吸烟者获得的BAL表现出增加的EMAPII水平(图1)。将吸烟者BAL非细胞流体中分泌EMAP II(成熟形式)的表达与非吸烟者的相比较，如使用特异性EMAP II抗体通过Western印迹测量的。通过在个体BAL样品中EMAP II表达的密度分析法测量水平(平均值±SEM，＊p＝＜0.01)。
[0181] 实施例16
[0182] 从杂交瘤提取总RNA
[0183] RT-PCT的第一轮。使用 OneStep RT-PCR试剂盒(Cat No.210210)。按照与制造商和说明书一致的标准方法使用Qiagen试剂盒分离RNA。简言之，用为对重链和轻链特异的引物对进行RT-PCR。对于每个RNA样品，使用覆盖可变区前导序列的简并正向引物混合物建立12个单独的重链和11个轻链的RT-PCR反应。逆向引物位于轻链和重链的恒定区。没有将限制性位点改造至引物中。
[0184] 第二轮半巢式PCR。第一轮反应的RT-PCR产物在第二轮PCR中进一步扩增。使用对抗体可变区特异的半巢式引物对建立12个独立的重链和11个轻链的RT-PCR反应。
[0186] 现在参见图14和15。在测序了超过15个通过巢式RT-PCR扩增的DNA片段后，克隆了几个抗体重链和轻链。蛋白质序列和比对以及CDR分析鉴定了一条重链和一条轻链。
[0187] 实施例17
[0188] EMAP II表位肽序列鉴定
[0189] 现在参见图16和17。基于Parker和Tomer的方案，结合到另一种化合物(例如抗体)的蛋白质的胰蛋白酶消化衍生肽可以在结合位点受保护而免于被消化(Parker，C.等，MALDI／MS-based epitope mapping of antigens bound to immobilized antibodies，Molecular Biotechnology，Volume20，Number1(2002)，49-62)。据此，结合sepharose固定之M7／1抗体的蛋白质部分很可能被保护而免受蛋白水解。
[0190] 用重组人前体EMAP II和M7／1抗体进行的结合竞争。现在参见图17。在存在／不存在300倍摩尔过量的肽十六聚体的情况下使用对照IgG和EMAP II中和M7／1抗体对重组前体EMAP II进行Western印迹。只有肽2(QQSIAGSADSKPIDVSR)而不是肽1(KHPDADSLYVEEVD VGE)或肽3(作为对照)能够与M7／1竞争。箭头表明分子量标准的位置(以rel kDa)。
[0191] 下拉(pull-down)级分中的肽通过液相色谱-串联质谱(LC-MS／MS)鉴定。通过分析结合蛋白质G sepharose固定化M7／1抗体的序列，鉴定到被保护的肽的范围覆盖以下序列：QQSIAGSADSKPIDVSRLDLRI GCIITARKHPDADSLYVEEVDVGEIAPRTVVSGLVNHVPLEQMQNR M(SEQ.ID NO.11)。从该肽序列随机选择2个十六聚体用于在M7／1Western印迹中竞争：肽1：KHPDADSLYVEEVDVGE(SEQ.ID NO.13)和肽2：QQSIAGSADSKPIDVSR(SEQ.ID NO.12)。使用Western印迹竞争测定确定哪一个多肽是最好的表位。在该测定中，在300倍过量的十六聚体肽1或2或对照肽3VLKRLEQKGAEADQIIE(SEQ.ID NO.14)的存在下进行M7／1抗体与重组前体EMAP II的结合。肽2强烈竞争结合M7／1抗体，这由缺乏对M7／1染色的Western印迹带表明，而其他的经鉴定肽1和对照肽3没有作用。
[0192] 当然，应理解，前述涉及本发明的示例性实施方案，并且可以不脱离本发明的精神和范围(如下列权利要求中给出的)而作出修改。
[0193] 尽管创新技术已经在附图和前面的描述中示出并详细描述，其在性质上应被认为是说明性的而不是限制性的，应理解，仅示出和描述优选的实施方案，并且期望保护所有在创新技术精神之内的变化和修改。而且，尽管使用特定的实例、理论论点、解释和说明说明了创新技术，但是这些说明和所附的讨论绝不应被解释为限制所述技术。本申请中所引用的所有专利、专利申请以及涉及的文本、科学论文、出版物等通过整体引用并入本文。
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