检测口含型烟草制品中烟草特有亚硝胺释放情况的方法
阅读：139发布：2023-12-27
专利汇可以提供检测口含型烟草制品中烟草特有亚硝胺释放情况的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种检测口含型 烟草 制品 中烟草特有亚硝胺（tobacco-specificN-nitrosamines,TSNAs）释放情况的方法，其特征是：通过模拟口含型烟草制品中的TSNAs在人体 口腔 的释放情况并对释放量和释放速率进行即时定量，进而检测口含型烟草制品的TSNAs体外释放速率以及释放程度。TSNAs释放收集是通过体外释放收集装置来实现的，该装置能够模拟该类制品中的TSNAs在人体口腔的释放过程，同时该装置可以对TSNAs释放液进行在线收集；释放液中的TSNAs含量检测是通过液相色谱-电喷雾 串联 质谱联用技术实现。本方法的优点在于：能够模拟口含型烟草制品中的TSNAs在人体口腔的释放情况，快速准确的检测各种口含型烟草制品的TSNAs释放速率以及释放程度，能有效的区分不同产品TSNAs释放的差异，重复性好，便于推广应用。，下面是检测口含型烟草制品中烟草特有亚硝胺释放情况的方法专利的具体信息内容。
1.一种检测口含型烟草制品中烟草特有亚硝胺释放情况的方法，其特征在于：通过模拟口含型烟草制品中的亚硝胺在人体口腔的释放情况并对释放量和释放速率进行即时定量，进而检测口含型烟草制品的亚硝胺体外释放速率以及释放程度，该方法包括以下步骤：
1)、体外亚硝胺释放与收集：创建模拟口含型烟草制品中的亚硝胺在人体口腔中释放情况的模型，该模型包括人工唾液、体外释放、收集装置，即：模拟人在使用口含烟时的情况，使人工唾液在恒温条件下持续不断的流过口含型烟草制品，实现口含型烟草制品的体外亚硝胺释放和收集过程；所述体外亚硝胺释放和收集过程通过亚硝胺释放和收集装置实现，该装置包括依次通过管路连接的溶媒储存瓶、恒流泵、温控单元、亚硝胺溶出释放单元和释放液收集单元；所述的温控单元包括恒温槽、设置在恒温槽中的加热管线段和保温管；
所述的溶出释放单元包括溶出池及附件，溶出池为一柱状玻璃套管，玻璃套管外层通过管路与恒温槽连通，玻璃套管内腔通过穿装在溶出池上端的磨口塞中的管路与加热管线段连通，玻璃套管内腔下部设有样品支架，玻璃套管内腔底部出口通过管路与释放液收集单元中的收集瓶连通；
2)、收集液及残留样品中亚硝胺含量定量分析：利用液相色谱-电喷雾串联质谱联用技术实现对收集液及残留样品中亚硝胺含量的定量分析，采用的液相色谱与质谱检测参数如下：色谱柱：Poroshell 120 SB-C18；柱温：50.0 ℃；进样量：5 µL；流速：0.30mL/min；流动相：A：水，其中含有体积分数0.1%的乙酸，B：甲醇，其中含有体积分数0.1%的乙酸；质谱条件：离子源：电喷雾离子源ESI；扫描模式：正离子扫描；
3)、绘制体外亚硝胺释放曲线：由亚硝胺定量结果计算亚硝胺累积释放率，根据亚硝胺累积释放率，绘制亚硝胺释放曲线。
2.根据权利要求1所述的检测口含型烟草制品中烟草特有亚硝胺释放情况的方法，其特征在于：所述人工唾液组分包括三类化合物：无机盐类化合物，有机化合物，生物活性酶蛋白。
3.根据权利要求1所述的检测口含型烟草制品中烟草特有亚硝胺释放情况的方法，其特征在于：步骤3）中利用Origin软件绘制亚硝胺释放曲线。
4.根据权利要求2所述的检测口含型烟草制品中烟草特有亚硝胺释放情况的方法，其特征在于：所述无机盐类化合物为氯化钠、氯化钾、氯化钙。
5.根据权利要求2所述的检测口含型烟草制品中烟草特有亚硝胺释放情况的方法，其特征在于：所述有机化合物为柠檬酸、葡萄糖。
6.根据权利要求2所述的检测口含型烟草制品中烟草特有亚硝胺释放情况的方法，其特征在于：所述生物活性酶蛋白为粘蛋白mucin、溶菌酶、淀粉酶α-amylase。
检测口含型烟草制品中烟草特有亚硝胺释放情况的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及烟草领域，具体讲是涉及一种检测口含型烟草制品烟草特有亚硝胺（tobacco-specific N-nitrosamines，TSNAs）释放情况的方法，通过该方法可以为研究或衡量口含型烟草制品的安全性和进行品质调控提供具体的数据支撑。
背景技术
[0002] 袋装口含型烟草制品是将烟叶粉碎后，将不同颗粒度的烟粉经过水蒸汽热处理等工艺加工后包装制成的烟草制品。该类制品与卷烟的最大区别是：属于无烟气烟草制品，使用时是将其放在口腔上唇侧部与牙龈之间，烟草成分经唾液溶解后通过口腔粘膜吸收。
[0003] 近年来，由于各国政府对公共场所吸烟行为的限制，使得口含型烟草制品的消费量呈逐年增加的趋势。在美国，口含型烟草制品的销量已经连续5年（2001-2006年）以6%的速度持续增长，2007年增速达到7.1%。据统计，2006年度，美国的口含型烟草制品销售量已超过40亿美元[Tobacco Control 2008, 17, (5), 332-338]。而该类产品的质量检测与控制却缺少相关技术方法。
[0004] 烟草特有亚硝胺（TSNAs）是烟草最主要的一类致癌物质[D. Hoffmann. Chemical Composition and Carcinogenicity of Smokeless Tobacco[J]. Adv Dent Res ,1997,11:322-329]，包括N—亚硝基降烟碱（nnn），4－（n—甲基亚硝基）－（1－3—吡啶基）－1—丁酮（nnk）、n—亚硝基假木贼碱（nab）和n—亚硝基新烟草碱（nat）等4种。一些研究报道了不同类型品牌的无烟气烟草制品TSNAs的含量[Patricia Richter, Knachelle Hodge, Stephen Stanfill, et al. Surveillance of moist snuff: total nicotine, moisture, pH, un-ionized nicotine, and tobacco-specific nitrosamines[J]. Nicotine & Tobacco Research, 2008, 10 (11), 1645 – 1652]。然而，消费者从无烟气烟草制品中获得的TSNAs量除与该产品的TSNAs含量有关外，还可能与产品的pH、粒度、水分、小袋的材料以及消费者使用习惯等因素有关。无烟气烟草制品TSNAs的生物影响度的研究鲜见报道，消费者使用该烟草制品可获得的TSNAs量仍然不清楚，通过TSNAs释放实验将为相关品控及研发工作提供数据依据。
发明内容
[0005] 本发明正是针对目前口含型烟草制品TSNAs释放检测方法的缺失，提出了一种检测口含型烟草制品TSNAs释放情况的方法，利用该方法能够模拟口含型烟草制品中的TSNAs在人体口腔的释放情况并对释放量和释放速率进行即时定量，可以检测不同品牌、规格、口味的各种口含型烟草制品的TSNAs释放速率以及释放程度，为研究和衡量口含型烟草制品安全性和进行品质调控提供技术支持。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0007] 本发明的检测口含型烟草制品中烟草特有亚硝胺释放情况的方法，通过模拟口含型烟草制品中的亚硝胺在人体口腔的释放情况并对释放量和释放速率进行即时定量，进而检测口含型烟草制品的亚硝胺体外释放速率以及释放程度，该方法包括以下步骤：
[0008] 1)、体外亚硝胺释放与收集：创建模拟口含型烟草制品中的亚硝胺在人体口腔中释放情况的模型，该模型包括人工唾液、体外释放、收集装置，即：模拟人在使用口含烟时的情况，使人工唾液在恒温条件下持续不断的流过口含型烟草制品，实现口含型烟草制品的体外亚硝胺释放和收集过程；
[0009] 2)、收集液及残留样品中亚硝胺含量定量分析：利用液相色谱-电喷雾串联质谱联用技术实现对收集液及残留样品中亚硝胺含量的定量分析；
[0011] 所述人工唾液组分包括三类化合物：无机盐类化合物，如氯化钠、氯化钾、氯化钙；有机化合物：如柠檬酸、葡萄糖；生物活性酶蛋白：如粘蛋白（mucin）、溶菌酶、淀粉酶（α-amylase）。该人工唾液是由下列用量配比的物质组分制成：氯化钠0.85 mg/mL；氯化钾 0.35 mg/mL；氯化钙0.15 mg/mL；磷酸二氢钾0.18 mg/mL；氯化镁0.25 mg/mL；柠檬酸0.06 mg/mL；葡萄糖0.20 mg/mL；尿素0.08 mg/mL；粘蛋白（mucin）2.45 mg/mL；溶菌酶（lysozyme）0.60 units/mL；淀粉酶（α-amylase）2.50 units/mL；酸性磷酸酶（acid phosphatase）0.01 units/mL。加入粘蛋白等活性物质前，pH用盐酸或氢氧化钠调节至6.2 - 7.5的某一值，室温搅拌10 min后加入粘蛋白等活性物质，再室温搅拌30 min即完成制备。人工唾液可以按上述配方自行配置，也可以通过市场渠道购买。本介质的有益效果是：使用本发明所制的人工唾液与口含型烟草制品混合后，能模拟其化学成份在口腔分泌物中的释放行为，与真实情况接近，为口含型烟草制品化学成份的提取搭建统一的平台，便于分析测定该类制品的化学成分及含量，进而客观地评价该制品的品质及特点。
[0012] 在本发明中，口含型烟草制品的体外亚硝胺释放和收集过程通过亚硝胺释放和收集装置实现，该装置包括依次通过管路连接的溶媒储存瓶、恒流泵、温控单元、亚硝胺溶出释放单元和释放液收集单元。
[0013] 所述温控单元包括恒温槽、设置在恒温槽中的加热管线段和保温管；
[0014] 所述溶出释放单元包括溶出池及附件，溶出池为一柱状玻璃套管，玻璃套管外层通过管路与恒温槽连通，玻璃套管内腔通过穿装在溶出池上端的磨口塞中的管路与加热管线段连通，玻璃套管内腔下部设有样品支架，玻璃套管内腔底部出口通过管路与释放液收集单元中的收集瓶连通；
[0015] 所述液相色谱-电喷雾串联质谱联用技术中采用的液相色谱与质谱检测参数如下：
[0016] HPLC参数：色谱柱：Poroshell 120 SB-C18（3.0 x 100 mm i.d., 2.7 µm, 美国Agilent公司）；柱温：50.0 ℃；进样量：5 µL；流速：0.30mL/min；流动相：A：水（含0.1%乙酸，体积分数），B：甲醇（含0.1%乙酸，体积分数）；预平衡时间：5min；梯度洗脱条件如表1：
[0017]
[0018] 质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（Ion Spray Voltage, IS）：5000V；雾化气流速（GS1,N2）：55psi；辅助加热气流速（GS2,N2）：55psi；气帘气流速（Curtain gas,CUR,N2）：15psi；撞气流速（Collision gas，CAD，N2）：6psi；离子源温度（TEM）：550℃；驻留时间（Dwell Time）：50ms；
EP（Entrance Potential）：10V；CXP（Collision Cell Exit Potential） ：9V。4个TSNAs的MRM参数见表2。
EP（Entrance Potential）：10V；CXP（Collision Cell Exit Potential） ：9V。4个TSNAs的MRM参数见表2。
[0019]
[0020] 在最佳色谱条件下，4个TSNAs出峰快速、峰型尖锐、对称性好，方法以信噪比（S/N）不低于3和10时NNN、NNK、NAT和NAB的浓度为检出限和定量限，结果见表3。
[0021]
[0022] NNN、NNK、NAT和NAB的加标回收率分别在93.17%～105.25 %之间，相对标准偏差（RSD）分别在2.03 %～4.80 %之间，该方法满足定量要求。
[0023] 所述残留样品中的TSNAs含量定量分析采用以下方法：首先选用合适的萃取介质（加标乙酸铵溶液）对TSNAs进行萃取，该萃取介质对样品中的TSNAs萃取完全，且不破坏TSNAs的存在形态。
[0024] 本发明的具体操作是：将人工唾液加入到溶媒存储瓶中，打开恒流泵、恒温槽，设定恒流泵流速，恒温槽温度，待系统稳定后，将样品放置在溶出池下端的样品支架上，同时计时，并将释放液按1-5 min的时间间隔收集到相应的收集瓶中。释放液收集完毕后，将释放后残留样品取出放入50-100 mL的三角瓶中，加入0.2 mL 2µg/mL的内标溶液（d4-NNK、d4-NNN、d4-NAB和d4-NAT的混合溶液）和20 mL 100 mM的乙酸铵溶液，用振荡器以130 rpm振荡40分钟。TSNAs释放液和残留样品萃取溶液过0.22µm滤膜后，进入色谱仪进行定量检测，根据定量结果计算4个TSNAs化合物及总TSNAs释放程度和速率。累积释放率由一段时间的释放量除以样品固有含量计算（样品固有含量为释放量与残留样品中含量的总和），并根据需要绘制口含型烟草制品NNN、NNK、NAT、NAB及烟草特有亚硝胺总量释放曲线。
[0025] 本发明能够模拟口含型烟草制品中的TSNAs在人体口腔的释放情况，并对释放量进行即时定量，可以检测口含型烟草制品的TSNAs释放速率以及释放程度, 为研究衡量口含型烟草制品安全和品质提供具体技术数据支持。该检测方法快速准确、重复性好，适用于各种规格口含型烟草制品的检测，适用于进行较大批量样品的快速分析。
[0026] 本发明所述检测方法从唾液组成、口腔温度、唾液分泌速度等三个方面来模拟口腔环境，该方法重复性好，灵敏度高，与人体消费口含型烟草制品的真实情况接近，可在医药、烟草等行业推广应用，推广后可以为相关研究搭建统一平台。附图说明
[0027] 图1为本发明中所用检测装置的结构示意图。
[0028] 图1中各部件标号如下：1.溶媒存储瓶，2.恒流泵，3.恒温槽，4.加热管线段，5.保温管，6.溶出池，7.玻璃磨口塞，8.导管，9.样品支架，10. 释放液收集瓶，11. 溶出池支架。
[0029] 图2为实施例1条件下TSNAs释放曲线。
[0030] 图3为实施例2条件下TSNAs释放曲线。
[0031] 图4为实施例3条件下TSNAs释放曲线。
具体实施方式
[0032] 本发明以下结合附图（实施例）做进一步说明：
[0033] 首先对检测装置及使用方法结合图1予以描述：该装置包括依次通过管路连接的溶媒储存瓶1、流速控制器2、温控单元、TSNAs溶出释放单元和释放液收集单元，溶媒存储瓶1中装有人工唾液，通过管路与流速控制器2相连；温控单元包括恒温槽3、加热管线段4和保温管5等。加热管线段4放置在恒温槽3中，一端与流速控制器2相连，另一端通过管路与溶出池6相连，暴露在恒温槽外与溶出池磨口塞之间的管路为保温管5，保温管为一内径稍大于管路外径的柱状玻璃套管，通过管路与恒温槽3连通，使保温管处于恒温环境，该保温管内芯为人工唾液流经通道。TSNAs溶出释放单元包括溶出池6及附件。溶出池6为一外径6-8 cm、内径4-6 cm的柱状玻璃套管，玻璃套管外层通过管路与保温管5串联并与恒温槽3连通，使溶出池处于恒温环境。溶出池6上端装有玻璃磨口塞7，玻璃套管内腔下部设有样品支架9，玻璃磨口塞7有一内置玻璃导管8可使人工唾液稳定流经样品，流经样品的释放液通过玻璃套管内腔底部出口、管路载入收集瓶10中，溶出池6外装有溶出池支架11，可调节溶出池高度并保持其平稳。释放液收集单元包括收集瓶及托盘，收集瓶10分别编号（与收集时间相对应），其体积为2-50 mL，放置在收集瓶托盘上，用于收集释放液。
[0034] 使用该装置时，设定恒温槽温度为37℃，通过恒温槽、加热线圈、保温管以及恒温溶出池使体系维持在37℃的人体温度，并通过流速控制器实现释放液不断流出，新鲜介质不断流入，调节流速模拟TSNAs在口腔中的释放-吸收的过程。具体过程如下：将人工唾液加入到溶媒存储瓶1中，打开流速控制器、恒温槽，设定流速（0.1 – 2 mL/min），恒温槽温度，待系统稳定后，打开玻璃磨口塞，将样品平放在支架上，盖上磨口塞，同时计时，按1-5 min的时间间隔收集到相应的收集瓶中。释放液进行定量分析，根据定量结果计算TSNAs释放程度和释放速率，绘制释放曲线。
[0035] 以下结合实施例对本发明做进一步描述：
[0036] 实施例1
[0037] 流速为0.2 mL/min，温度为37°C，释放介质为人工唾液（pH 6.7）；其释放液和残留样品中TSNAs通过液相色谱-电喷雾串联质谱联进行测定。
[0038] 液相色谱-电喷雾串联质谱联用技术采用的液相色谱操作条件与质谱检测参数是：
[0039] HPLC参数：色谱柱：Poroshell 120 SB-C18（3.0 x 100 mm i.d., 2.7 µm, 美国Agilent公司）；柱温：50.0 ℃；进样量：5 µL；流速：0.30mL/min；流动相：A：水（含0.1%乙酸，体积分数），B：甲醇（含0.1%乙酸，体积分数）；预平衡时间：5min；梯度洗脱条件如前面所附表1。
[0040] 质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（Ion Spray Voltage, IS）：5000V；雾化气流速（GS1,N2）：55psi；辅助加热气流速（GS2,N2）：55psi；气帘气流速（Curtain gas,CUR,N2）：15psi；撞气流速（Collision gas，CAD，N2）：6psi；离子源温度（TEM）：550℃；驻留时间（Dwell Time）：50ms；
EP（Entrance Potential）：10V；CXP（Collision Cell Exit Potential） ：9V。4个TSNAs的MRM参数见前面所附表2。
EP（Entrance Potential）：10V；CXP（Collision Cell Exit Potential） ：9V。4个TSNAs的MRM参数见前面所附表2。
[0041] 将pH 为7.0的人工唾液加入到溶媒存储瓶中，打开恒温槽、恒流泵，设定流速为0.2 mL/min ，待系统稳定到37°C后，打开玻璃磨口塞，将样品平放在支架上，盖上磨口塞，同时计时，每5 min收集一次，共收集60 min，释放液收集完毕后，将释放后残留样品取出放入50 mL的三角瓶中，加入0.2 mL 2µg/mL的内标溶液（d4-NNK、d4-NNN、d4-NAB和d4-NAT的混合溶液）和20 mL 100 mM的乙酸铵溶液，用振荡器以130 rpm振荡40分钟，TSNAs释放液和残留样品萃取溶液过0.2 µm滤膜后，进入液相色谱-电喷雾串联质谱联进行定量检测，根据定量结果计算TSNAs释累积放率，绘制口含型烟草制品TSNAs释放曲线（见图2）。从图2中可看出，①该口含型烟草制品4种烟草特有亚硝胺以及总TSNAs均呈指数型曲线释放，前30 min释放相对较快，30 min内NNN释放了68.8%，NNK释放了77.8%，NAT释放了56.7%，NAB释放了55.5%，总TSNAs释放了67.0%，30 min到60 min释放速率较前30 min明显减慢；②4种烟草特有亚硝胺的释放速率各不相同，其中NNK释放最快，其次为NNN， NAT和NAB释放速率较为接近且相对较慢。
[0042] 实施例2
[0043] 流速为0.4mL/min，温度为37°C，人工唾液pH 为7.0；其释放液中TSNAs的检测采用液相色谱-电喷雾串联质谱联进行测定，液相色谱操作条件与质谱检测参数同实施例1。
[0044] 将pH 为7.0的人工唾液加入到溶媒存储瓶中，打开恒温槽、恒流泵，设定流速为0.4 mL/min ，待系统稳定到37 °C后，打开玻璃磨口塞，将样品平放在支架上，盖上磨口塞,同时计时，每5 min收集一次，共收集60 min，释放液收集完毕后，将释放后残留样品取出放入50 mL的三角瓶中，加入0.2 mL 2µg/mL的内标溶液（d4-NNK、d4-NNN、d4-NAB和d4-NAT的混合溶液）和20 mL 100 mM的乙酸铵溶液，用振荡器以130 rpm振荡40分钟，TSNAs释放液和残留样品萃取溶液过0.2 µm滤膜后，进入液相色谱-电喷雾串联质谱联进行定量检测，根据定量结果计算TSNAs释累积放率，绘制口含型烟草制品TSNAs释放曲线（见图4）。从图4中可看出，①该口含型烟草制品4种烟草特有亚硝胺以及总TSNAs均呈指数型曲线释放，前30 min释放相对较快，30 min内NNN释放了75.8%，NNK释放了82.2%，NAT释放了54.9%，NAB释放了54.2%，总TSNAs释放了70.9%，30 min到60 min释放速率较前30 min明显减慢；②4种烟草特有亚硝胺的释放速率各不相同，其中NNK释放最快，其次为NNN， NAT和NAB释放速率较为接近且相对较慢。
[0045] 实施例3
[0046] 流速前5 min为0.2 mL/min后55min为1 mL/min，温度为37 °C，人工唾液pH 为7.0；其释放液中TSNAs的检测采用高效液相色谱法，色谱参数同实施例1
[0047] 将pH 为7.0的人工唾液加入到溶媒存储瓶中，打开恒温槽、恒流泵，设定流速为1 mL/min ，待系统稳定到37 °C后，打开玻璃磨口塞，将样品平放在样品支架上，盖上磨口塞,同时计时，每5 min收集一次，共收集60 min，释放液收集完毕后，将释放后残留样品取出放入50 mL的三角瓶中，加入0.2 mL 2µg/mL的内标溶液（d4-NNK、d4-NNN、d4-NAB和d4-NAT的混合溶液）和20 mL 100 mM的乙酸铵溶液，用振荡器以130 rpm振荡40分钟，TSNAs释放液和残留样品萃取溶液过0.2 µm滤膜后，进入液相色谱-电喷雾串联质谱联进行定量检测，进高效液相色谱进行定量检测，根据定量结果计算TSNAs释放累积释放率，绘制口含型烟草制品TSNAs释放曲线（见图5）。从图5中可看出，①该口含型烟草制品4种烟草特有亚硝胺以及总TSNAs均呈指数型曲线释放，前30 min释放相对较快，30 min内NNN释放了60.3%，NNK释放了62.2%，NAT释放了48.1%，NAB释放了62.2%，总TSNAs释放了
57.2%，30 min到60 min释放速率较前30 min明显减慢；②4种烟草特有亚硝胺的释放速率各不相同，其中NNK释放最快，其次为NNN， NAT和NAB释放速率较为接近且相对较慢。
57.2%，30 min到60 min释放速率较前30 min明显减慢；②4种烟草特有亚硝胺的释放速率各不相同，其中NNK释放最快，其次为NNN， NAT和NAB释放速率较为接近且相对较慢。
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