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一种筛选多霉素B组分高产菌株的方法

阅读:685发布:2020-05-08

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1.一种筛选多霉素B组分高产菌株的方法,其特征在于,包括配制出发菌株孢子悬液,将稀释后的孢子悬液经过先紫外诱变,再日光灯照射,然后ARTP复合诱变后,涂布于培养基平板并培养,将挑出的各单菌落的一半摇瓶考核,选出多氧霉素B组分含量高的菌株。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1,将多氧霉素出发菌株金色产色链霉菌接种于斜面培养基恒温培养;
步骤2,挑选步骤1培养好的孢子,加入生理盐,梯度稀释,涂布于斜面培养基平板上,恒温培养后长出单菌落;
步骤3,挑选步骤2饱满合格的单菌落,均匀切开,其中一半用于制作诱变的孢子悬液,另外一半用于摇瓶考核对照;
步骤4,将步骤3切下的半个单菌落加入含甘油的生理盐水,振荡分散制成待诱变孢子悬液;
步骤5,步骤4制成的待诱变孢子悬液滴入ARTP诱变育种仪的载片上,均匀涂开;
步骤6,将滴加到载片的悬液先紫外诱变,再日光灯照射,然后ARTP诱变,得到诱变液;
步骤7,用无菌生理盐水洗下步骤6所述的诱变液;
步骤8,保持黑暗或在红光下,将步骤7所述的诱变液用生理盐水梯度稀释,分别涂布于斜面培养基平板上,恒温培养;
步骤9,挑选步骤8培养突变的若干单菌落,切下所选这些单菌落的一半接种到摇瓶种子培养基,恒温振荡培养,其余半个仍要保留;将步骤3剩余的半个单菌落也接种到摇瓶种子培养基,恒温振荡培养;
步骤10,将步骤9培养的摇瓶种子以5-15%的接种量接种到摇瓶发酵培养基中继续恒温振荡培养;
步骤11,对步骤10的各发酵瓶发酵液中多氧霉素B组分含量进行检测,筛选与出发菌株单菌落比较代谢B组分含量提高的菌株。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤1、2中,培养参数为温度25-28℃培养5-8天。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,以质量百分含量计,所述步骤1、2、8中所述的斜面培养基包括以下成份:玉米粉0.2-0.7%、麦芽糖0.2-0.8%、酵母膏0.3-0.6%、琼脂
1.5-2.5%,其余是蒸馏水,所述的斜面培养基的消前pH为7.0-7.2。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤4中,所述的生理盐水为含20wt%甘油的生理盐水。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤6中,紫外诱变的参数为:15W紫光灯距离悬液30cm,照射5-60秒;日光照射的参数为:日光灯照射3分钟;ARTP诱变的参数为:
照射功率120W,氦气流量8-12SLM,照射10-180秒。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤8中,所述的培养为于温度25-27℃在暗处培养6-14天。
8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤9中,所述的培养为在28℃、转速
220rpm恒温摇床培养28-32小时;所述步骤10中,所述的培养为在28℃、转速220rpm恒温摇床培养130-140小时。
9.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤9中,以质量百分含量计,所述的摇瓶种子培养基包括以下成份:玉米粉1.0-2.0%、低温黄豆饼粉1-4%、啤酒酵母粉0.1-
1.0%、果葡糖浆0.5-1.5%、NaCl 0.1-0.3%、CaCO3 0.2-0.4%、KH2PO4 0.05-0.20%,自来水配制,所述的摇瓶种子培养基的消前pH为6.5-6.8。
10.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤10中,以质量百分含量计,所述的摇瓶发酵培养基包括以下成份:玉米粉8-10%、低温黄豆饼粉2.0-3.0%、啤酒酵母粉0.3-
0.5%、鱼粉0.4-0.8%、NaCl 0.1-0.5%、CaCO3 0.1-0.5%、KH2PO4 0.05-0.20%、α-淀粉酶为玉米粉质量的0.005-0.020%,自来水配制,所述摇瓶发酵培养基的pH值为消前6.5-6.8。

说明书全文

一种筛选多霉素B组分高产菌株的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物制药领域,具体涉及一种筛选多氧霉素B组分高产菌株的方法。

背景技术

[0002] 多氧霉素(polyoxin)是中国科学院微生物研究所1978年研制成功的农用抗生素,由金色产色链霉菌(Streptomyces aureoch romogenes)发酵产生,主要用于防治烟草赤星病、人参叶黑斑病、甜莱褐斑病、小麦白粉病稻纹枯病等真菌性病害,是一种两性水溶性多组份的肽嘧啶核甘类抗生素。它易溶于水,不溶于醇类、丙、氯仿、苯和乙醚等有机溶剂,在酸中稳定,在中失活,对紫外线稳定。它有较好的内吸传导性,主要干扰以几丁质为基质而构成的细胞壁的生物合成作用,以几丁质为基质而构成细胞壁的子囊菌纲、担子菌纲和半知菌纲的一些真茵茵丝接触多氧霉素后,局部膨大,破裂而溢出细胞内含物,致使其不能正常生长发育,也不能形成袍子,甚至导致菌丝体死亡。
[0003] 多氧霉素是含有A—N共14种不同同系物的混合物,各主要组份的作用又不相同,其中A组分与H组分为主要组分,B组分与L组分对烟草赤星病、苹果斑点落叶病有抑制作用,D组分对水稻纹枯病起抑制作用,K组分对稻瘟病有很好的疗效,I组分对烟草赤星病具有抑制作用,但是B、D、K、L组分四者却是少量组分,所以这是一对矛盾。因此要提高多氧霉素对烟草赤星病病原菌和苹果斑点落叶病的抗菌作用,必须提高B组分含量。
[0004] 在微生物菌种选育过程中,诱变育种是主要方法之一。它利用物理或化学诱变剂处理微生物细胞群,促进其在非自然条件下随机突变频率大幅度提高,然后用简便快速高效的筛选方法,从中挑选符合育种要求的突变株(如高产株或有效组分比例高的菌株)。其中物理诱变即利用物理因素(如紫外线、X射线、γ射线、快中子等)对悬液进行一定剂量一定时间的照射,使细胞内的遗传物质(如DNA)复制系统出错,从而诱发变异。化学诱变—利用化学诱变剂[如亚硝酸、甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲基脲、氮芥、乙烯亚胺、羟胺、氯化锂、秋水胆碱等]对悬液进行一定浓度一定时间的作用处理,使细胞内的遗传物质(如DNA)复制系统出错,从而诱发变异。
[0005] 由于金色产色链霉菌(Streptomyces aureoch romogenes)的遗传稳定性较差,每传代一次,生产效价就有可能出现不同程度的下降,单菌落直接考核可以减少传代。

发明内容

[0006] 为了解决现有技术中多氧霉素B组分含量较低的问题,本发明提供一种筛选多氧霉素B组分高产菌株的方法,包括配制出发菌株孢子悬液,将稀释后的孢子悬液经过先紫外诱变,再日光灯照射,然后ARTP复合诱变后,涂布于培养基平板并培养,将挑出的各单菌落的一半摇瓶考核,选出多氧霉素B组分含量高的菌株。本发明的筛选方法可以快速地筛选出含量高的菌株,本发明筛选的多氧霉素B组分含量高的菌株,其发酵液对烟草赤星病、苹果斑点落叶病具有抑制作用。
[0007] 为了实现发明目的,本发明采用如下技术方案:一种筛选多氧霉素B组分高产菌株的方法,包括如下步骤:步骤1,将多氧霉素出发菌株金色产色链霉菌接种于斜面培养基恒温培养;
步骤2,挑选步骤1培养好的孢子,加入生理盐水,梯度稀释,涂布于斜面培养基平板上,恒温培养后长出单菌落;
步骤3,挑选步骤2饱满合格的单菌落,均匀切开,其中一半用于制作诱变的孢子悬液,另外一半用于摇瓶考核对照;
步骤4,将步骤3切下的半个单菌落加入含甘油的生理盐水,振荡分散制成待诱变孢子悬液;
步骤5,步骤4制成的待诱变孢子悬液滴入ARTP诱变育种仪的载片上,均匀涂开;
步骤6,将滴加到载片的悬液先紫外诱变,再日光灯照射,然后ARTP诱变,得到诱变液;
步骤7,用无菌生理盐水洗下步骤6所述的诱变液;
步骤8,保持黑暗或在红光下,将步骤7所述的诱变液用生理盐水梯度稀释,分别涂布于斜面培养基平板上,恒温培养;
步骤9,挑选步骤8培养突变的若干单菌落,切下所选这些单菌落的一半接种到摇瓶种子培养基,恒温振荡培养,其余半个仍要保留;将步骤3剩余的半个单菌落也接种到摇瓶种子培养基,恒温振荡培养;
步骤10,将步骤9培养的摇瓶种子以5-15%的接种量接种到摇瓶发酵培养基中继续恒温振荡培养;
步骤11,对步骤10的各发酵瓶发酵液中多氧霉素B组分含量进行检测,筛选与出发菌株单菌落比较代谢B组分含量提高的菌株。
[0008] 优选的,所述步骤1、2中,培养参数为温度25-28℃培养5-8天。
[0009] 优选的,以质量百分含量计,所述步骤1、2、8中所述的斜面培养基包括以下成份:玉米粉0.2-0.7%、麦芽糖0.2-0.8%、酵母膏0.3-0.6%、琼脂1.5-2.5%,其余是蒸馏水,所述的斜面培养基的消前pH为7.0-7.2。
[0010] 优选的,步骤4中,所述的生理盐水为含20wt%甘油的生理盐水。
[0011] 优选的,所述步骤6中,紫外诱变的参数为:15W紫光灯距离悬液30cm,照射5-60秒;日光照射的参数为:日光灯照射3分钟;ARTP诱变的参数为:照射功率120W,氦气流量8-
12SLM,照射10-180秒。
[0012] 优选的,所述步骤8中,所述的培养为于温度25-27℃在暗处培养6-14天。
[0013] 优选的,所述步骤9中,所述的培养为在28℃、转速220rpm恒温摇床培养28-32小时。
[0014] 优选的,所述步骤10中,所述的培养为在28℃、转速220rpm恒温摇床培养130-140小时。
[0015] 优选的,所述步骤9中,以质量百分含量计,所述的摇瓶种子培养基包括以下成份:玉米粉1.0-2.0%、低温黄豆饼粉1-4%、啤酒酵母粉0.1-1.0%、果葡糖浆0.5-1.5%、NaCl 0.1-
0.3%、CaCO3 0.2-0.4%、KH2PO4 0.05-0.20%,其余是蒸馏水;所述的摇瓶种子培养基的消前pH为6.5-6.8。
[0016] 优选的,所述步骤10中,以质量百分含量计,所述的摇瓶发酵培养基包括以下成份:玉米粉8-10%、低温黄豆饼粉2.0-3.0%、啤酒酵母粉0.3-0.5%、鱼粉0.4-0.8%、NaCl 0.1-0.5%、CaCO3 0.1-0.5%、KH2PO4 0.05-0.20%、α-淀粉酶为玉米粉质量的0.005-0.020%,其余是蒸馏水;所述摇瓶发酵培养基的pH值为消前6.5-6.8。
[0017] 与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:(1)本发明提供了一种多氧霉素B组分高产菌株的筛选方法及其应用,筛选得到多氧霉素B组分高产菌株的发酵液主要成分为多氧霉素B组分,其发酵液对烟草赤星病和苹果斑点落叶病具有抑制作用。
[0018] (2)本发明的筛选方法可以理性快速地筛选高产菌株,简单易行,所制备得到的培养基原料成本低、来源广,具有十分重要的工农业应用潜附图说明
[0019] 下面结合附图作进一步说明。
[0020] 图1为出发菌株98#发酵液HPLC分析图谱;图2为多氧霉素B组分高产菌株发酵液HPLC分析图谱;
图3为多氧霉素B组分高产菌株发酵液对烟草赤星病的抗菌活性实验;
图4为多氧霉素B组分高产菌株发酵液对苹果斑点落叶病的抗菌活性实验。

具体实施方式

[0021] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,而不构成对本发明的限制。
[0022] 实施例1:原始菌株孢子制备取多氧霉素出发菌株金色产色链霉菌98#,稀释涂布斜面培养基,28℃恒温培养7天,挑选平板上生长快且较饱满的单菌落孢子,切下一半单菌落孢子加入生理盐水,制成孢子悬液。100mL斜面培养基成分为玉米粉0.5g、麦芽糖0.5 g、酵母膏0.4 g、琼脂2.0 g,其余是蒸馏水,消前pH7.0-7.2。
[0023] 实施例2:多氧菌素出发菌株的诱变将实施例1中切下的半个单菌落加入含20%甘油的生理盐水,振荡分散制成孢子悬液。
吸取15μL孢子悬液滴入ARTP诱变育种仪载片上,均匀涂开。使用ARTP诱变育种仪先紫外诱变(15W紫光灯距离悬液30cm,照射30秒),再日光灯照射3分钟,然后ARTP诱变(照射功率
120W,氦气流量8-12SLM,照射70秒),得到诱变液。红光下用无菌生理盐水洗下诱变液,用生理盐水梯度稀释诱变液至10-4、10-5、10-6,涂布于培养基平板上,26℃黑暗培养8天。挑选培养突变的单菌落,切下其中一半单菌落接种到摇瓶种子培养基,恒温振荡培养。将实施例1剩余的半个单菌落作为对照也接种到摇瓶种子培养基,28℃220rpm振荡培养30h后10%移种量移入摇瓶发酵培养基中继续28℃220rpm振荡培养136h。
[0024] 摇瓶种子培养基成份为:玉米粉15g/L、低温黄豆饼粉20 g/L、啤酒酵母粉4 g/L、果葡糖浆10mL/L、NaCl 1 g/L、CaCO3 3 g/L、KH2PO4 1 g/L,自来水配制,所述摇瓶种子培养基的消前pH6.5-6.8。
[0025] 摇瓶发酵培养基成份为:玉米粉100 g/L、低温黄豆饼粉25 g/L、啤酒酵母粉4 g/L、鱼粉5 g/L、NaCl 3 g/L、CaCO3 3 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、α-淀粉酶为玉米粉质量的0.015%,自来水配制,所述摇瓶发酵培养基的pH值为消前6.5-6.8。
[0026] 实施例3:发酵液分析用HPLC(高效液相色谱)检测发酵产物中多氧霉素组分变化,通过峰形的增减与相对峰面积变化筛选与出发菌株98#次级代谢组分有差异的菌株。
[0027] 样品处理:取1mL发酵液10000rpm离心5分钟,取上清液200μL加入200μL超纯水稀释。加入80μL含0  .5%三氟乙酸的甲醇水溶液,充分混匀后,14000rpm离心10分钟。取上清液400μL进行HPLC 分析。
[0028] HPLC条件:色谱柱采用Thermo 250mm,4.6μm C18色谱柱。HPLC 流动相为10%甲醇水溶液(含0 .1%三氟乙酸),检测波长为260nm,进样体积5μL,样品保留时间9分钟。
[0029] 图1为出发菌株98#发酵液HPLC分析图谱。图2为筛选出的多氧霉素B组分高产菌株发酵液HPLC分析图谱。图2跟图1比较,其它组分所占比例减小,可见筛选出的菌株次级代谢产物发生了变化。
[0030] 通过定量分析,多氧霉素B组分高产菌株发酵液中多氧霉素B组分占主要成分,部分其它组分降低到比较低的水平。检测结果为,对照品与诱变后高产菌株的多氧霉素B组分含量分别为2.6g/L和3.6g/L。
[0031] 实施例4:测定多氧霉素B组分高产菌株发酵液对烟草赤星病和苹果斑点落叶病病原菌的抑菌活性1 烟草赤星病病原菌菌悬液的制备:接种烟草赤星病和苹果斑点落叶病病原菌于PDA(去皮的新鲜土豆200g,琼脂20g,葡萄糖20g,蒸馏水1L,pH自然)中,28℃培养5天。用10mL无菌水刮下指示菌斜面得到菌液12000-15000rpm保持30s打散,即为病原菌菌悬液。
[0032] 2 双层平板的制备:在无菌平板中倒入10mL80℃的琼脂水培养基(琼脂15g,蒸馏水1L,pH自然),平放于水平工作台面上,待其完全冷却,即为底层培养基。取5mL50℃水浴中保温的PDA培养基(去皮的新鲜土豆200g,琼脂20g,葡萄糖20g,蒸馏水1L,pH自然)。按3%的接种量加入烟草赤星病或苹果斑点落叶病病原菌菌悬液,混合混匀后,倒入底层培养基上,晃动平板使培养基均匀铺开。
[0033] 3 抑菌活性的检测:在双层平板中均匀放置4个津杯,其中1个牛津杯加入200μL PDA培养基作为对照(稀释40倍),其它3个牛津杯加入200μL多氧霉素B组分高产菌株发酵液离心上清液(稀释50倍)。将平板置于28℃培养箱中培养18小时。如图3和4所示,加入多氧霉素B组分高产菌株发酵液离心上清液的牛津杯周围有明显的抑菌圈生成,说明多氧霉素B组分高产菌株发酵液与对照品98#相比,对烟草赤星病和苹果斑点落叶病病原菌抑制作用有了一定的提高。
[0034] 以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何不经过创造性劳动想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
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