一种强化烟叶发酵过程的方法
阅读：509发布：2020-05-18
专利汇可以提供一种强化烟叶发酵过程的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种强化烟叶 发酵 过程的方法，使用解 淀粉 芽孢杆菌GZU03制剂对用于发酵过程的烟叶进行处理，所述解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂包括解淀粉芽孢杆菌GZU03，所述解淀粉芽孢杆菌GZU03已于2018年11月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2018762。本发明解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂，可以强化 烟草 梗丝的发酵过程，具有增加烟香、柔和烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质和提高 口含烟 的实用安全性的作用。同时，本发明还公开了一种用于在烟叶发酵过程中提高蛋白酶和淀粉酶活性的方法。，下面是一种强化烟叶发酵过程的方法专利的具体信息内容。
1.一种强化烟叶发酵过程的方法，其特征在于，使用解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂对用于发酵过程的烟叶进行处理，所述解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)称取胰蛋白胨0.5-2g、酵母提取物0.5-1.5g、NaCl 6-8g、葡萄糖0.5-2g，补充蒸馏水至1000mL，并在110-130℃高压蒸汽灭菌10-30min，待冷却后接入所述解淀粉芽孢杆菌GZU03于30-40℃、170-190r/min进行培养18h±2h，得到种子液；
(2)将1000mL所述种子液于2-5℃、7000-9000r下离心10-20min，收集沉淀，并用6-9g/L的灭菌生理盐水洗涤所述沉淀，然后向所述沉淀中加入1000mL的灭菌生理盐水，摇匀，得到所述解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂；
所述解淀粉芽孢杆菌GZU03已于2018年11月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2018762。
2.一种用于在烟叶发酵过程中提高蛋白酶和淀粉酶活性的方法，其特征在于，使用所述解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂对用于发酵过程的烟叶进行处理。
一种强化烟叶发酵过程的方法
技术领域
背景技术
[0002] 无烟气烟草制品(Smokeless tobacco products，STPs)不发生烟草燃烧过程，不会产生有害裂解产物，无烟气产生，可以在公共场所使用，是低害环保型新型烟草制品的一种重要形式。
[0004] 口含烟制品一般是以烟草粉末的形式在口腔中使用，烟草中的成分溶出后通过口腔黏膜吸收。烟叶是口含烟的核心材料，其品质直接决定着口含烟产品的风味特色和使用安全性，从而影响消费市场对产品的接收程度。
[0005] 微生物发酵是改善口含烟用烟叶原料品质的一个有效途径。国内外的研究表明，通过微生物发酵能够大大缩短烟叶醇化的时间，明显消除烟叶的木质味，使烟叶的刺激性和异味减少，香气质和香气量变佳。发酵过程中，微生物进行代谢活动消耗掉烟叶中蛋白质，纤维素、淀粉及一些不良成分等，同时微生物通过代谢产生的一些物质又会给烟叶增添一些芳香气味，使烟叶各种成分比例趋于协调，从而提高烟叶的香气量、愉悦性等品质，使杂气、刺激性下降，具有更好的食用舒适性。
[0006] 同时，微生物代谢过程中往往会产生功效性成分，如产生多种酶，有些酶本身对提高烟叶的香气有帮助，如蛋白酶可以水解烟叶中的蛋白质，水解产物和进一步转化的产物可以产生烟草致香物质；有些酶是对人体健康有益的酶，如淀粉酶对消化系统起着很重要的作用。因此接种合适的功能菌作用于烟叶中发酵不仅可从感官上增香提质，同时还可产生一些功能活性物质，这些酶的产生将大大提高口含烟食用价值。
[0007] 人们希望找到其他新种类的微生物，以用于烟叶的发酵过程，并实现减害、增香和提高生物活性功能酶活性的效果。
发明内容
[0008] 本发明第一方面涉及一种强化烟叶发酵过程的方法，使用解淀粉芽孢杆菌 GZU03制剂对用于发酵过程的烟叶进行处理，所述解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂的制备方法包括以下步骤：
[0009] (1)称取胰蛋白胨0.5-2g、酵母提取物0.5-1.5g、NaCl 6-8g、葡萄糖0.5-2 g，补充蒸馏水至1000mL，并在110-130℃高压蒸汽灭菌10-30min，待冷却后接入所述解淀粉芽孢杆菌GZU03于30-40℃、170-190r/min进行培养18h±2h，得到种子液；
[0010] (2)将1000mL所述种子液于2-5℃、7000-9000r下离心10-20min，收集沉淀，并用6-9g/L的灭菌生理盐水洗涤所述沉淀，然后向所述沉淀中加入1000 mL的灭菌生理盐水，摇匀，得到所述解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂；
[0011] 所述解淀粉芽孢杆菌GZU03已于2018年11月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2018762，保藏地址为中国武汉武汉大学湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号。
[0012] 优选地，所述灭菌生理盐水需在121℃高压蒸汽灭菌20min。
[0013] 其中，所述解淀粉芽孢杆菌GZU03菌落及显微镜形态观察：图1为解淀粉芽孢杆菌GZU03的显微镜(1000X)观察照，菌株革兰氏染色菌体为紫色，为革兰氏阳性菌。图2为解淀粉芽孢杆菌GZU03的平板菌落形态，在酪蛋白平板上均能产生水解圈且形成圆形、低凹起、有粘性的小菌落，其颜色呈乳白色或淡黄色，边缘较为规则，无光泽，稍隆起，不透明，菌落直径2.0mm～3.0mm。
[0014] 其中，对所述解淀粉芽孢杆菌GZU03的形态和生理生化特征进行鉴定，所述解淀粉芽孢杆菌GZU03细胞呈杆状，单个、成对或链状排列，芽孢中生或近中生，初步判断为芽孢杆菌属。所述解淀粉芽孢杆菌GZU03的全部16S rRNA 序列如序列表所示，将该序列表提交到NCBI，通过Blast在线程序在GenBank 数据库中检索与已刊登的16S rRNA序列同源性进行比较进一步确定其为解淀粉芽孢杆菌。
[0015] 优选地，烟叶发酵步骤如下：称取20g烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取2-6mL离心管内的菌液(即10％-30％接种量)于烟叶，4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，于
37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
[0016] 优选地，所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl25g、KCl 0.5g、CaCl20.5g、 NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
[0017] 本发明第二方面提供一种用于在烟叶发酵过程中提高蛋白酶和淀粉酶活性的方法，使用所述解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂对用于发酵过程的烟叶进行处理。
[0018] 相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0019] (1)本发明从豆豉中分离和培养得到的试验菌种，经形态学、生理生化性质、16S rRNA序列分析表明该菌株属于解淀粉芽孢杆菌，微生物学分类命名为解淀粉芽孢杆菌GZU03(拉丁文学名：Bacillus amyloliquefaciens.GZU03)。
[0020] (2)本发明的解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂可以强化烟草的发酵过程。经本发明解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂(20％接种量)处理后的烟叶发酵15天后，对烟叶的感官评价较不经解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂处理的烟叶增加了 15.22％，即本发明的解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂具有增加烟香、柔和烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质的作用，提升了烟叶品质。
[0021] (3)本发明的解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂可以提高烟叶发酵过程中蛋白酶和淀粉酶的活性。经本发明解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂(20％接种量)处理后的烟叶发酵15天后，烟叶中蛋白酶酶活为1312.63IU/g。同时，经本发明解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂(20％接种量)处理后的烟叶发酵15天后，烟叶中明显检测出淀粉酶的存在，但不经本发明解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂处理的烟叶经发酵后并不存在淀粉酶。而蛋白酶和淀粉酶不仅本身对提高烟叶的香气有帮助，还是对人体健康有益的酶，这些具有生物活性的功能性酶的产生可以更好地提高口含烟的食用品质。
[0023] 图1为解淀粉芽孢杆菌GZU03显微镜(1000X)观察照
[0024] 图2为解淀粉芽孢杆菌GZU03的平板菌落形态
[0025] 图3为胰蛋白酶活力测定标准曲线
具体实施方式
[0026] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但不是对本发明的限制，基于本发明教导所做的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。其中，以下实施例中的烟叶均以烤烟烟叶为例。
[0027] 实施例1
[0028] 本实施例为分离的所述解淀粉芽孢杆菌GZU03的鉴定。
[0029] 所述解淀粉芽孢杆菌GZU03菌落及显微镜形态观察：图1为解淀粉芽孢杆菌GZU03的显微镜(1000X)观察照，菌株革兰氏染色菌体为紫色，为革兰氏阳性菌。图2为解淀粉芽孢杆菌GZU03的平板菌落形态，在酪蛋白平板上均能产生水解圈且形成圆形、低凹起、有粘性的小菌落，其颜色呈乳白色或淡黄色，边缘较为规则，无光泽，稍隆起，不透明，菌落直径2.0mm～3.0mm。
[0030] 所述解淀粉芽孢杆菌GZU03的全部16S rRNA序列如序列表所示。
[0032] 表1解淀粉芽孢杆菌GZU03生理生化特征—碳源利用
[0033]
[0034]
[0035] +：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应
[0036] 表2解淀粉芽孢杆菌GZU03生理生化特性—酶活、碳源同化
[0037]
[0038] +：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应
[0039] 结合16S rRNA和生理生化分析，GZU03被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
[0040] 实施例2
[0041] 本实施例为解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
[0042] (1)称取胰蛋白胨1.25g、酵母提取物0.625g、NaCl 6.25g、葡萄糖0.625g，补充蒸馏水至1000mL，并在121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却后接入所述解淀粉芽孢杆菌GZU03于37℃、180r/min进行培养18h±2h，得到种子液；
[0043] (2)将1000mL所述种子液于4℃、8000r下离心10min，收集沉淀，并用8.5g/L的灭菌生理盐水洗涤所述沉淀，然后向所述沉淀中加入1000mL的灭菌生理盐水，摇匀，得到所述解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂。
[0044] 所述灭菌生理盐水需在121℃高压蒸汽灭菌20min。
[0045] 实施例3
[0046] 本实施例中称取20g烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取2mL所述解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂(即10％接种量)于烟叶，4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到样品1。
[0047] 所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl25g、KCl 0.5g、CaCl20.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
[0048] 称取20g烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取2mL无菌生理盐水、 4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到对比样1。
[0049] 将样品1和对比样1同时在37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
[0050] 感官评定步骤如下：请10余位本领域感官测评人员对烟叶发酵烟叶样品进行感官评定。评吸方法为将口含烟直接置于上唇与上排牙齿之间，每次放入唇内的烟丝颗粒质量为0.2g，标准使用时间定为10min。对烟叶发酵样品的入口口感、香味、劲头、释放均匀性各15分，刺激性、顺应性(口含烟食用时间未达标准使用时间被吐出视为顺应性差)、滋味、余味各10分，总分100分，进行评价。
[0051] 待发酵结束后进行121℃、5min巴氏杀菌，进行感官评定。
[0052] 实施例4
[0053] 本实施例中称取20g烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取4mL所述解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂(即20％接种量)于烟叶，4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到样品2。
[0054] 所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl25g、KCl 0.5g、CaCl20.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
[0055] 称取20g烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取4mL无菌生理盐水、 4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到对比样2。
[0056] 将样品2和对比样2同时在37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
[0057] 请10余位本领域感官测评人员对发酵烟叶样品进行感官评定。评吸方法为将口含烟直接置于上唇与上排牙齿之间，每次放入唇内的烟丝颗粒质量为0.2g，标准使用时间定为10min。对烟叶发酵样品的入口口感、香味、劲头、释放均匀性各15分，刺激性、顺应性(口含烟食用时间未达标准使用时间被吐出视为顺应性差)、滋味、余味各10分，总分100分，进行评价。
[0058] 待发酵结束后进行121℃、5min巴氏杀菌，进行感官评定。
[0059] 实施例5
[0060] 本实施例中称取20g烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取6mL所述解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂(即30％接种量)于烟叶，4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到样品3。
[0061] 所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl25g、KCl 0.5g、CaCl20.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
[0062] 称取20g烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取6mL无菌生理盐水、 4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到对比样3。
[0063] 将样品3和对比样3同时在37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
[0064] 感官评定步骤如下：请10余位本领域感官测评人员对发酵烟叶样品进行感官评定。评吸方法为将口含烟直接置于上唇与上排牙齿之间，每次放入唇内的烟丝颗粒质量为0.2g，标准使用时间定为10min。对烟叶发酵样品的入口口感、香味、劲头、释放均匀性各15分，刺激性、顺应性(口含烟食用时间未达标准使用时间被吐出视为顺应性差)、滋味、余味各10分，总分100分，进行评价。
[0065] 待发酵结束后进行121℃、5min巴氏杀菌，进行感官评定。
[0066] 实施例3、实施例4、实施例5中不同样品在发酵过程中的感官评价分值见表3。
[0067] 由表3中结果可知，本发明的解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂可以强化烟草的发酵过程。经本发明解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂(20％接种量)处理后的烟叶发酵15天后，对烟叶的感官评价较不经解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂处理的烟叶增加了15.22％，即本发明的解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂具有增加烟香、柔和烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质的作用，提升了烟叶品质。同时，接种量为20％时，感官评价评分最高，发酵效果最好，对烟叶的改善更大，得到的发酵烟品质更好。
[0068] 表3不同样品在发酵过程中的感官评价分值见表1
[0069]
[0070] 实施例6
[0071] 将实施例4中的样品2、对比样2经发酵15天后的发酵烟叶命名为发酵样品2、发酵对比样2，分别测定发酵样品2和发酵对比样2中蛋白酶活性。
[0073] 采用酪蛋白平板法测定酶活性。首先制备胰蛋白酶活力标准曲线(图3)。将胰蛋白酶商业酶分别配制成10IU/mL、25IU/mL、50IU/mL、75IU/mL、100 IU/mL、125IU/mL浓度，各取10uL点样于新配制的酪蛋白平板孔中，自然放置10min后倒置放入37℃培养箱内16h后取出，测量溶解圈直径，计算各溶解圈面积。以溶解圈面积(x，mm2)为横坐标，以胰蛋白酶活力(y，IU/mL) 为纵坐标，绘制胰蛋白酶标准曲线。
[0074] 测量样品酶活力。取发酵烟叶粗酶液10uL点样于酪蛋白平板上，然放置10 min后倒置放入37℃培养箱内16h后取出，测量溶解圈直径，计算各溶解圈面积。根据胰蛋白酶标准曲线回归方程计算样品蛋白酶酶活。测得发酵对比样2 酶活为148.13IU/g，发酵样品2蛋白酶酶活为1312.63IU/g，表明GZU03能产生较高酶活的蛋白酶。
[0075] 实施例7
[0076] 将实施例4中的样品2、对比样2经发酵15天后的发酵烟叶命名为发酵样品2、发酵对比样2，分别测定发酵样品2和发酵对比样2中是否产蛋白酶。
[0077] 对加有可溶性淀粉的LB平板进行打孔，然后接入水提取发酵样品2所得的提取液，碘染后发现有透明圈，表明其产淀粉酶。
[0078] 对加有可溶性淀粉的LB平板进行打孔，然后接入水提取发酵对比样2得的提取液，碘染后未发现明显的变化，表明其基本不产淀粉酶。
[0079] 实施例8
[0080] 发酵烟叶风味物质的变化。
[0081] 将2g烟叶放入10mL顶空固相微萃取瓶中，将顶空瓶放入CTC自动进样器品盘，设置萃取条件为：70℃保持5分钟，70℃吸附30分钟，萃取盘转速为 250r/min，萃取得到的物质在气相色谱进样口进行解吸附，解吸温度250℃，时间5min。
[0082] 色谱柱:DB-wax(60m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；进样口温度： 240℃；载气：He，1.5mL/min；分流比2﹕1；升温程序：初始温度40℃，保持1min，以10℃/min升至120℃，保持
1min；以3℃/min升至230℃，保持5min。传输线温度：240℃；电离方式：EI；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；扫描范围：33～350amu；数据采集模式：全扫描。采用谱库检索定性。
1min；以3℃/min升至230℃，保持5min。传输线温度：240℃；电离方式：EI；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；扫描范围：33～350amu；数据采集模式：全扫描。采用谱库检索定性。
[0083] 挥发性风味成分检测结果：
[0084] 表4发酵烟叶挥发性风味物质成分表
[0085]
[0086]
[0087]
[0088]
[0089]
[0090] 注：“0”表示未检测出。
[0091] 表5发酵烟叶挥发性风味物质成分相对含量(％)对照表
[0092]
[0093] 表6挥发性风味物质成分种类对照表
[0094]
[0095] 由表4-6可知，原烟叶、发酵对比样2和样品2挥发性风味物质成分的种类及相对含量相差都较大。共检测出原烟叶挥发性风味物质43种、发酵对比样2 风味物质37种、样品2风味物质45种。其中，原烟叶包括醇类5种、醛类4 种、酮类15种、烷烃类8种、酸类2种、酯类3种、嘧啶类1种、烯烃类1种、其他类4种；发酵对比样2包括醇类6种、醛类4种、酮类7种、烷烃类8种、酸类4种、酯类3种、烯烃类1种、其他类3种；样品2包括胺类1种、醇类4 种、醛类4种、酮类13种、烷烃类12种、酯类3种、酸类3种、其他类5种。
[0096] 经发酵的烟叶酮类和醇类较未发酵原烟叶都有增加，表明发酵有利于烟叶风味物质的产生。发酵样品2的醇类物质较原烟叶来说增加，原烟叶醇类相对含量为1.84％，而发酵对比样2及样品2的醇类相对含量为16.84％和7.84％，较原烟叶增加较多，主要增加的为植醇；原烟叶、发酵对比样2及样品2的醛类都是4 种，而发酵对比样2的相对含量较原烟叶多了10倍，这主要是因为原烟叶未检测到苯乙醛，发酵对比样2和样品2的苯甲醛相对含量较原烟叶增加了近5倍，原烟叶苯甲醛相对含量为0.23％，发酵对比样2和样品2苯甲醛相对含量分别为 1.10％和1.12％，苯甲醛具有特殊的杏仁气味，对烟叶的风味会产生一定的影响。原烟叶及样品2的酮类物质比发酵对比样2多了近一倍，分别为15种、13种和 7种。就相对含量来说，原烟叶和发酵对比样2的酮类相对含量为5.86％和5.92％，而样品的相对含量6.49％，主要是2-吡咯烷酮相对含量的增加及一些经发酵后就挥发了的酮类物质的影响，如2(5H)-呋喃酮、法尼基丙酮等。烷烃类挥发性风味物质经发酵后相对含量增加，种类也增加；原烟叶酸类物质相对含量为40.2％，而发酵样品中仅为5.09％和0.39％，表明在发酵过程中消耗了大部分的酸从而使风味更协调；酯类物质变化不是很明显，种类及相对含量都相差不大，说明发酵对酯类物质的影响不大；对其他类来说，主要是因为烟碱相对含量的不同，导致了其他类物质相对含量的差别。
[0097] 综合分析风味成分和感官评定结果可以发现挥发性风味物质成分种类和含量在原烟叶、自然发酵烤烟和接种发酵烤烟中差异较大，原烟叶中不少物质在发酵后不见了，一些成分的相对含量也减少了，而且发酵后也新增加了一些成分并增加了一些风味成分的相对含量，把这些变化同感官评定结果进行对比会发现接种解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂发酵和自然发酵都能改善原烟叶的刺激性和邪杂味，能显著改善感官品质和增香，而且接种发酵比自然发酵品质能进一步提升一个台阶。同时，我们还以白肋烟烟叶和晾晒烟烟叶进行了实验，也得到了上述的效果。
[0098] 附序列表：
[0099] 解淀粉芽孢杆菌GZU03的16S rRNA序列为：
[0100]。
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