一种强化烟草梗丝发酵过程的方法
阅读：6发布：2020-05-19
专利汇可以提供一种强化烟草梗丝发酵过程的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种强化 烟草 梗丝 发酵 过程的方法，使用解 淀粉 芽孢杆菌GUHP-86制剂对用于发酵过程的烟草梗丝进行处理，所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂包括解淀粉芽孢杆菌GUHP-86，所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86已于2016年1月4日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2016003。本发明解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂，可以强化烟草梗丝的发酵过程，具有增加烟香、柔和烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质和提高 口含烟 的实用安全性的作用。同时，本发明还公开了一种用于在烟草梗丝发酵过程中提高蛋白酶和淀粉酶活性的方法。，下面是一种强化烟草梗丝发酵过程的方法专利的具体信息内容。
1.一种强化烟草梗丝发酵过程的方法，其特征在于，使用解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂对用于发酵过程的烟草梗丝进行处理，所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)称取胰蛋白胨0.5-2g、酵母提取物0.5-1.5g、NaCl 6-8g、葡萄糖0.5-2g，补充蒸馏水至1000mL，并在110-130℃高压蒸汽灭菌10-30min，待冷却后接入所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86于30-40℃、170-190r/min进行培养18h±2h，得到种子液；
(2)将1000mL所述种子液于2-5℃、7000-9000r下离心10-20min，收集沉淀，并用6-9g/L的灭菌生理盐水洗涤所述沉淀，然后向所述沉淀中加入1000mL的灭菌生理盐水，摇匀，得到所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂；
所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86已于2016年1月4日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2016003。
2.一种用于在烟草梗丝发酵过程中提高蛋白酶和淀粉酶活性的方法，其特征在于，使用所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂对用于发酵过程的烟草梗丝进行处理。
一种强化烟草梗丝发酵过程的方法
技术领域
背景技术
[0002] 无烟气烟草制品(Smokeless tobacco products，STPs)使用时不发生燃烧过程，不会产生有害裂解产物，无烟气产生，可以在公共场所使用，是低害环保型新型烟草制品的一种重要组成形式。
[0004] 口含烟制品的生产原料中，烟梗是一种重要的辅料成分，一般是以烟草梗丝粉末的形式在口腔中使用，烟草梗丝作为辅料具有有害成分低，成本低，烟草废料有效利用等优势。烟草梗丝使用可以明显降低口含烟产品的价格。但是口含烟中使用梗丝作为辅料也会带来香气量降低的不利因素，因此使用生物发酵方法提升梗丝的品质是决定口含烟产品风格特征和降低价格的关键因素，从而影响消费市场对产品的接受程度。
[0005] 微生物发酵是改善口含烟烟草梗丝原料品质的一个有效途径。国内外的研究表明，通过微生物发酵能够有效提高梗丝香气量和醇化时间，明显提升梗丝的吃味，同时还可降低梗丝的木质气，使梗丝使用时的香气质和香气量变佳。发酵过程中，微生物进行代谢活动消耗掉梗丝中的蛋白质，纤维素、淀粉及一些不良成分等，同时微生物通过代谢产生的一些物质又会给梗丝增添芳香气味，使梗丝各种成分比例趋于协调，从而提高梗丝的香气量、愉悦性等品质，使杂气、刺激性下降，具有更好的食用舒适性。
[0006] 此外，口含烟是以烟草梗丝作为填充辅料的无烟气烟草梗丝制品，其中发酵醇化过程中会产生含有潜在有害成分化学成分，因此烟草梗丝中一些固有的有害成分将严重影响口含烟的食用安全性。TSNAs(烟草特有的亚硝胺)是烟草制品中重要的潜在有害成分。口含烟制品经过发酵醇化后TSNAs形成普遍认为是由烟草中的生物碱和亚硝盐反应形成的，因此亚硝酸盐是生成亚硝胺的前体物质之一，那么降低烟叶中亚硝酸盐含量将有助于降低亚硝胺含量，提高口含烟的食用安全性。研究发现，微生物的存在对亚硝酸盐的含量会产生很大的影响，微生物中很多种类可降亚硝酸盐，通过筛选降硝酸盐微生物然后接种到烟叶进行发酵就可降低梗丝中亚硝胺含量。
[0007] 同时，微生物代谢过程中往往会产生功效性成分，如产生多种酶，有些酶本身对提高烟叶的香气有帮助，如蛋白酶可以水解烟叶中的蛋白质；有些酶是对人体健康有益的酶，如纳豆激酶(nattokinase简称NK)，可以溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性，淀粉酶对消化系统起着很重要的作用，缺乏这种酶将给身体带来一系列问题，如皮肤红疹、心情抑郁和过敏等心理有关问题。这些具有生物活性的功能性酶的产生可以更好地提高口含烟的食用品质。
[0008] 然而烟草梗丝又不同于烟叶，烟叶的自身就比较柔软，而烟梗自身较硬，不利于发酵过程，所以对于促进烟叶发酵过程的微生物并不一定可以促进烟草梗丝的发酵过程。
[0009] 因此，人们希望找到其他新种类的微生物，以用于烟草梗丝的发酵过程，并实现减害、增香和提高生物活性功能酶活性的效果。
发明内容
[0010] 本发明第一方面涉及一种强化烟草梗丝发酵过程的方法，使用解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂对用于发酵过程的烟草梗丝进行处理，所述解淀粉芽孢杆菌 GUHP-86制剂的制备方法包括以下步骤：
[0011] (1)称取胰蛋白胨0.5-2g、酵母提取物0.5-1.5g、NaCl 6-8g、葡萄糖0.5-2 g，补充蒸馏水至1000mL，并在110-130℃高压蒸汽灭菌10-30min，待冷却后接入所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86于30-40℃、170-190r/min进行培养18h±2h，得到种子液；
[0012] (2)将1000mL所述种子液于2-5℃、7000-9000r下离心10-20min，收集沉淀，并用6-9g/L的灭菌生理盐水洗涤所述沉淀，然后向所述沉淀中加入1000 mL的灭菌生理盐水，摇匀，得到所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂；
[0013] 所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86已于2016年1月4日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2016003。
[0014] 优选地，所述灭菌生理盐水需在121℃高压蒸汽灭菌20min。
[0015] 优选地，烟草梗丝发酵步骤如下：称取20g烟草梗丝于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取2-6mL离心管内的菌液(即10％-30％接种量)于烟草梗丝，4mL 有糖盐溶液于烟草梗丝中，充分混匀，于37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
[0016] 优选地，所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl25g、KCl 0.5g、CaCl20.5g、 NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
[0017] 本发明第二方面提供一种用于在烟草梗丝发酵过程中提高蛋白酶和淀粉酶活性的方法，使用所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂对用于发酵过程的烟草梗丝进行处理。
[0018] 相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0019] (1)本发明的解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂可以强化烟草的发酵过程。经本发明解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂(20％接种量)处理后的烟草梗丝发酵 15天后，对烟草梗丝的感官评价较不经解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂处理的烟草梗丝增加了19.10％，即本发明的解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂具有增加烟香、柔和烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质的作用，提升了烟草梗丝品质。同时，经本发明解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂(20％接种量)处理后的烟草梗丝发酵21天后，亚硝酸盐含量较普通烟草梗丝下降了66.39％，因此，采用解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂处理烟草梗丝还可以提高口含烟的实用安全性。
[0020] (2)本发明的解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂可以提高烟草梗丝发酵过程中纳豆激酶、蛋白酶和淀粉酶的活性。经本发明解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂 (20％接种量)处理后的烟草梗丝发酵15天后，烟草梗丝中纳豆激酶酶活和蛋白酶酶活分别为10.48FU/g和1308.32IU/g。同时，经本发明解淀粉芽孢杆菌 GUHP-86制剂(20％接种量)处理后的烟草梗丝发酵15天后，烟草梗丝中明显检测出淀粉酶的存在，但不经本发明解淀粉芽孢杆菌GUHP-
86制剂处理的烟草梗丝经发酵后并不存在淀粉酶。而纳豆激酶、蛋白酶和淀粉酶不仅本身对提高烟草梗丝的香气有帮助，还是对人体健康有益的酶，这些具有生物活性的功能性酶的产生可以更好地提高口含烟的食用品质。
86制剂处理的烟草梗丝经发酵后并不存在淀粉酶。而纳豆激酶、蛋白酶和淀粉酶不仅本身对提高烟草梗丝的香气有帮助，还是对人体健康有益的酶，这些具有生物活性的功能性酶的产生可以更好地提高口含烟的食用品质。
[0021]
具体实施方式
[0022] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但不是对本发明的限制，基于本发明教导所做的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
[0023] 实施例1
[0024] 本实施例为解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂的制备，具体包括以下步骤：
[0025] (1)称取胰蛋白胨1.25g、酵母提取物0.625g、NaCl 6.25g、葡萄糖0.625g，补充蒸馏水至1000mL，并在121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却后接入所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86于37℃、180r/min进行培养18h±2h，得到种子液；
[0026] (2)将1000mL所述种子液于4℃、8000r下离心10min，收集沉淀，并用8.5g/L的灭菌生理盐水洗涤所述沉淀，然后向所述沉淀中加入1000mL的灭菌生理盐水，摇匀，得到所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂。
[0027] 所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86已于2016年1月4日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2016003。
[0028] 所述灭菌生理盐水需在121℃高压蒸汽灭菌20min。
[0029] 实施例2
[0030] 本实施例中称取20g烟草梗丝于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取2mL 所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂(即10％接种量)于烟草梗丝，4mL有糖盐溶液于烟草梗丝中，充分混匀，得到样品1。
[0031] 所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl25g、KCl 0.5g、CaCl20.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
[0032] 称取20g烟草梗丝于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取2mL无菌生理盐水、4mL有糖盐溶液于烟草梗丝中，充分混匀，得到对比样1。
[0033] 将样品1和对比样1同时在37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
[0034] 感官评定步骤如下：请10余位本领域感官测评人员对发酵烟草梗丝样品进行感官评定。评吸方法为将口含烟直接置于上唇与上排牙齿之间，每次放入唇内的烟丝颗粒质量为0.2g，标准使用时间定为10min。对烟草梗丝发酵样品的入口口感、香味、劲头、释放均匀性各15分，刺激性、顺应性(口含烟食用时间未达标准使用时间被吐出视为顺应性差)、滋味、余味各10分，总分100分，进行评价。
[0035] 待发酵结束后进行121℃、5min巴氏杀菌，进行感官评定。
[0036] 实施例3
[0037] 本实施例中称取20g烟草梗丝于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取4mL 所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂(即20％接种量)于烟草梗丝，4mL有糖盐溶液于烟草梗丝中，充分混匀，得到样品2。
[0038] 所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl25g、KCl 0.5g、CaCl20.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
[0039] 称取20g烟草梗丝于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取4mL无菌生理盐水、4mL有糖盐溶液于烟草梗丝中，充分混匀，得到对比样2。
[0040] 将样品2和对比样2同时在37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
[0041] 请10余位本领域感官测评人员对发酵烟草梗丝样品进行感官评定。评吸方法为将口含烟直接置于上唇与上排牙齿之间，每次放入唇内的烟丝颗粒质量为 0.2g，标准使用时间定为10min。对烟草梗丝发酵样品的入口口感、香味、劲头、释放均匀性各15分，刺激性、顺应性(口含烟食用时间未达标准使用时间被吐出视为顺应性差)、滋味、余味各10分，总分100分，进行评价。
[0042] 待发酵结束后进行121℃、5min巴氏杀菌，进行感官评定。
[0043] 实施例4
[0044] 本实施例中称取20g烟草梗丝于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取6mL 所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂(即30％接种量)于烟草梗丝，4mL有糖盐溶液于烟草梗丝中，充分混匀，得到样品3。
[0045] 所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl25g、KCl 0.5g、CaCl20.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
[0046] 称取20g烟草梗丝于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取6mL无菌生理盐水、4mL有糖盐溶液于烟草梗丝中，充分混匀，得到对比样3。
[0047] 将样品3和对比样3同时在37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
[0048] 感官评定步骤如下：请10余位本领域感官测评人员对发酵烟草梗丝样品进行感官评定。评吸方法为将口含烟直接置于上唇与上排牙齿之间，每次放入唇内的烟丝颗粒质量为0.2g，标准使用时间定为10min。对烟草梗丝发酵样品的入口口感、香味、劲头、释放均匀性各15分，刺激性、顺应性(口含烟食用时间未达标准使用时间被吐出视为顺应性差)、滋味、余味各10分，总分100分，进行评价。
[0049] 待发酵结束后进行121℃、5min巴氏杀菌，进行感官评定。
[0050] 实施例3、实施例4、实施例5中不同样品在发酵过程中的感官评价分值见表1。
[0051] 由表1中结果可知，本发明的解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂可以强化烟草的发酵过程。经本发明解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂(20％接种量)处理后的烟草梗丝发酵15天后，对烟草梗丝的感官评价较不经解淀粉芽孢杆菌GUHP-86 制剂处理的烟草梗丝增加了19.10％，即本发明的解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂具有增加烟香、柔和烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质的作用，提升了烟草梗丝品质。同时，接种量为20％时，感官评价评分最高，发酵效果最好，对烟草梗丝的改善更大，得到的发酵烟品质更好。
[0052] 表1不同样品在发酵过程中的感官评价分值见表1
[0053]
[0054] 实施例5
[0055] 将实施例3中的样品2、对比样2经发酵15天后的发酵烟草梗丝命名为发酵样品2、发酵对比样2，分别测定发酵样品2、发酵对比样2中纳豆激酶活性。
[0057] 向试管中加入1.4mLTris-HCl(50mmol/L，pH7.8)缓冲液和0.4mL纤维蛋白原溶液(7.2mg/mL)，37℃温育5min后加入0.1mL凝血酶(20U/mL)，再 37℃温育10min形成人工血栓，加入0.1mL样品粗酶液，37℃温育60min，加入2mL三氯乙酸(0.2moL/L)溶液静置20min终止反应，13000r/min离心10min，取上清液于275nm波长处测定吸光度。酶活定义：每分钟275nm处吸光度增加0.01所需要的酶量定义为1个单位的纤维蛋白降解酶活力(FU)。
[0058] 不同发酵样品纳豆激酶活力测定结果见表2。
[0059] 从表2中可以看出，发酵对比样2纳豆激酶酶活为0.29FU/g，发酵样品2 纳豆激酶酶活为10.48FU/g，表明解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂可以提高烟草梗丝发酵过程中纳豆激酶活性。
[0060] 表2不同发酵样品纳豆激酶活力测定结果
[0061]
[0062] 实施例6
[0063] 将实施例4中的样品2、对比样2经发酵15天后的发酵烟草梗丝命名为发酵样品2、发酵对比样2，分别测定发酵样品2和发酵对比样2中蛋白酶活性。
[0064] 粗酶液提取：称取发酵样品1g，精确至0.0002g。然后用25mL磷酸缓冲溶液浸提24h，然后用慢速定性滤纸过滤，滤液待用。
[0065] 采用酪蛋白平板法测定酶活性。将胰蛋白酶商业酶分别配制成10IU/mL、 25IU/mL、50IU/mL、75IU/mL、100IU/mL、125IU/mL浓度，各取10uL点样于新配制的酪蛋白平板孔中，自然放置10min后倒置放入37℃培养箱内16h 后取出，测量溶解圈直径，计算各溶解圈面积，从而测定溶解圈面积(x，mm2) 和胰蛋白酶活力(y，IU/mL)的关系。
[0066] 测量样品酶活力。取发酵烟草梗丝粗酶液10uL点样于酪蛋白平板上，然放置10min后倒置放入37℃培养箱内16h后取出，测量溶解圈直径，计算各溶解圈面积，根据溶解圈面积(x，mm2)和蛋白酶活力(y，IU/mL)的关系计算样品蛋白酶酶活。测得发酵对比样2酶活为137.86IU/g，发酵样品2蛋白酶酶活为 1308.32IU/g，表明解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂在烟草梗丝发酵过程中能产生较高酶活的蛋白酶。
[0067] 实施例7
[0068] 将实施例4中的样品2、对比样2经发酵15天后的发酵烟草梗丝命名为发酵样品2、发酵对比样2，分别测定发酵样品2和发酵对比样2中是否产淀粉酶。
[0069] 对加有可溶性淀粉的LB平板进行打孔，然后接入水提取发酵样品2所得的提取液，碘染后发现有透明圈，表明其产淀粉酶。
[0070] 对加有可溶性淀粉的LB平板进行打孔，然后接入水提取发酵对比样2得的提取液，碘染后未发现明显的变化，表明其基本不产淀粉酶。
[0071] 实施例8
[0072] 对实施例4中的样品2和对比样2发酵过程中亚硝酸盐含量进行测定。
[0073] 亚硝酸盐含量采用萘乙二胺盐酸法测定。称量3.0g磨成粉末状的烟草梗丝，放于250mL锥形瓶里，然后加入10mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，加入蒸馏水 150mL，在70度水浴中加热30min并取出。进行过滤。然后将滤液倒入250mL 容量瓶中，在旋转的同时加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀并加入5mL醋酸锌溶液，以沉淀蛋白质。将水加至刻度，摇匀，用滤纸过滤。
[0074] 取经上述处理过的滤液50mL于100mL的容量瓶中，加入2mL饱和碱式乙酸铅溶液，加水到刻度，摇匀，然后过滤。取滤出液50mL于100mL容积瓶中，加入0.1mL硫酸溶液，加水到刻度，摇匀，然后再过滤，滤液备用。
[0075] 量取20mL处理后的滤液，在50mL比色管中加入2mL对氨基苯磺酸(4g/L), 搅拌，放置3分钟～5分钟，然后加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，搅拌后静置15分钟，用2厘米比色管，于波长545nm处测吸光度，根据吸光度计算亚硝酸盐含量。
[0076] 不同样品发酵过程中亚硝酸盐含量测定结果见表3。
[0077] 表3不同样品发酵过程中亚硝酸盐含量测定结果
[0078]
[0079]
[0080] 由表3可以看出，经本发明解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂(20％接种量)处理后的烟草梗丝发酵21天后，亚硝酸盐含量较不经解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂处理的烟草梗丝下降了66.39％，因此，采用解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂处理烟草梗丝不仅使烟草梗丝增香、产生多种有益的功能酶，而且大大降低了烟草梗丝中亚硝酸盐含量，这将提高口含烟的食用安全性。
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