技术领域
[0001] 本
发明涉及
微生物，也涉及
烟草，进一步来说，涉及由一种枯草芽孢杆菌制成的制剂在烟草加工的应用方法。
背景技术
[0002] 无烟气
烟草制品(Smokeless tobacco products，STPs)不发生烟草燃烧过程，不会产生有害裂解产物，无烟气产生，可以在公共场所使用，是低害环保型新型烟草制品的一种重要形式。
[0003]
口含烟是STPs的重要组成，是目前市场份额增长最快的产品类别，受到世界各主要烟草企业的关注，并在该领域投入大量的资金和精
力进行相关的研发工作。
[0004] 口含烟制品一般是以烟草粉末的形式在
口腔中使用，烟草中的成分溶出后通过口腔黏膜吸收。因此，烟草原料是口含烟的核心材料，其品质直接决定着口含烟产品的
风味特色和使用安全性，从而影响消费市场对产品的接收程度。
[0005] 微生物
发酵是改善口含烟烟草原料品质的一个有效途径。最先开展
微生物接种烟叶以增加香气试验的是Tamayo，并指出芽抱杆菌和小球菌可改善烟叶香气。然后通过外加菌种，诱发烟叶内与香气物质转化有关的生化代谢途径，以改善烟叶品质提高烟叶香气。
[0006] 同时，微生物代谢过程中往往会产生功效性成分，如产生多种酶，有些酶本身对提高烟叶的香气有帮助，如蛋白酶可以
水解烟叶中的
蛋白质，水解产物和进一步转化的产物可产生烟草致香物质；有些酶是对人体健康有益的酶，如蛋白酶对消化系统起着很重要的作用，再如纳豆激酶(nattokinase简称NK)，可以溶解血栓，降低血
粘度，改善血液循环，
软化和增加血管弹性。因此接种合适的功能菌于烟叶中发酵不仅从感官上增香提质，同时还可产生一些功能活性物质，这些酶的产生将大大提高口含烟食用价值。因此寻找更加优良的菌株用以改善烟叶发酵周期，丰富烟叶发酵后的香气物质，提升烟叶吸食品质成为研究的热点问题。
[0007] 目前将微生物用于口含烟的
专利技术仅有ZL2016103176476号《适用于口含烟的烟丝的制备方法及应用》，该技术将合理配方的烟叶组经科学合理的微生物发酵降解烟草中的部分大分子物质，有效降低烟丝苦涩味和辛辣味，并具有柔和与协调的感官特性，所用的菌种为红曲霉(Monascus purpureus Went.)、鲁氏毛霉(Mucor roxianus)或根霉(Rhizopus)或乳酸菌(Lactobacillus)的一种或几种。迄今为止，尚无将枯草芽孢杆菌用于烟草提质增香的专利
申请件。
发明内容
[0008] 本发明旨在提供一种产蛋白酶和纳豆激酶的枯草芽孢杆菌B-01制剂，得到一种新型的可以用于烟草提质增香的制剂。
[0009] 本发明的又一目的是提供上述制剂的应用方法，使其在口含烟品质改善方面得到实际应用。
[0010]
发明人提供的产蛋白酶和纳豆激酶的枯草芽孢杆菌B-01制剂，是由以下方法制备而成的：
[0012] 按下面配方配制培养基：胰蛋白胨1.25g、
酵母提取物0.625g、NaCl 6.25g、
葡萄糖0.625g、水1000mL；配好后分按三
角瓶容量的20％分装入三角瓶，121℃高压
蒸汽灭菌
20min，待冷却后接入枯草芽孢杆菌B-01于37℃、180r/min进行培养18h±2h，得到种子液；
[0013] (2)配制制剂
[0014] 将所得1000mL的种子液于2～5℃、7000～9000r/min下离心10～20min收集沉淀并用无菌生理盐水洗涤，收集沉淀并加入1000mL的无菌生理盐水，摇匀，得到所述枯草芽孢杆菌B-01制剂。
[0015] 所述枯草芽孢杆菌，其微生物学分类命名为枯草芽孢杆菌B-01，已于2019年1月7日在中国典型培养物保藏中心保藏，该中心地址是中国武汉·武汉大学，邮政编码430072，电话号码为027-68754952，保藏编号为CCTCC M 2019027；其拉丁文名称为：Bacillus subtilis B-01；
[0016] 对上述枯草芽孢杆菌B-01的形态和生理生化特征进行鉴定，枯草芽孢杆菌B-01细胞呈杆状，芽孢中生或近中生，初步判断为芽孢杆菌；所述枯草芽孢杆菌B-01的全部16S rRNA序列如
序列表所示，将该序列表提交到NCBI，通过Blast在线程序在GenBank
数据库中检索与已刊登的16S rRNA序列同源性进行比较进一步确定其为枯草芽孢杆菌。
[0017] 发明人提供的上述制剂的应用方法，是称取20g经121℃、5min巴氏杀菌的烟丝于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取2～6mL离心管内的菌液(即10％～30％接种量)于烟叶，
4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，于37℃
培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
[0018] 上述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl2 5g、KCl 0.5g、CaCl2 0.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
[0019] 上述培养箱内进行培养的时间为1～25天。
[0020] 发明人从贵州酱香酒大曲中分离和培养得到的试验菌种，经形态学、生理生化性质、16S rRNA序列分析表明该菌株属于枯草芽孢杆菌，微生物学分类命名为枯草芽孢杆菌B-01；本发明的B-01制剂相对于
现有技术具有以下有益效果：①可以强化烟草的发酵过程，经B-01制剂处理后的烟叶发酵13天后，对烟叶的感官评价较普通烟叶增加了48.3％，经B-01制剂发酵口含烟使其香气突显协调，刺激性明显减弱、辣感少，余味舒适纯净；②可以提高烟叶发酵过程中蛋白酶和纳豆激酶的活性，经B-01制剂以20％接种量处理后的烟叶发酵
15天后，烟叶中蛋白酶酶活为5.76U/g；同时，经B-01制剂以20％接种量处理后的烟叶发酵
13天后，烟叶中明显检测出纳豆激酶的存在，而蛋白酶和纳豆激酶不仅本身对提高烟叶的香气有帮助，还是对人体健康有益的酶，这些具有生物活性的功能性酶的产生更好地提高口含烟的食用品质；③枯草芽孢杆菌B-01分离和培养方法简单，操作容易，成本低，适宜推广应用于对口含烟品质改善。
附图说明
[0021] 图1为枯草芽孢杆菌B-01
显微镜镜检图；
[0022] 图2为枯草芽孢杆菌B-01的
酪蛋白平板上菌落形态；
[0023] 图3为枯草芽孢杆菌B-01的系统发育树图；
[0024] 图4为胰蛋白酶活力测定标准曲线。
具体实施方式
[0025] 下面结合
实施例对本发明作进一步的详细说明，但不是对本发明的限制，基于本发明教导所做的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品
说明书进行。所用
试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
[0026] 实施例1
[0027] 本实施例为分离的所述枯草芽孢杆菌B-01的鉴定。
[0028] 所述枯草芽孢杆菌B-01菌落及显微镜形态观察：附图1为枯草芽孢杆菌B-01的显微镜镜检图，菌株革兰氏
染色菌体为紫色，为
革兰氏阳性菌，有芽孢。附图2为枯草芽孢杆菌B-01的平板菌落形态，在酪蛋白平板上均能产生水解圈。
[0029] 对所述枯草芽孢杆菌B-01进行生理生化特征鉴定，所述枯草芽孢杆菌B-01生理生化特性—酶活、
碳源同化如表1所示。
[0030] 表1菌株GZU05生理生化特性–酶活、碳源同化
[0031]
[0032]
[0033] 注：+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应
[0034] 基于枯草芽孢杆菌B-01的全部16S rRNA序列的系统发育树如附图3。综合形态生理生化和16S rRNA分析可确定B-01即为枯草芽孢杆菌。
[0035] 实施例2枯草芽孢杆菌B-01制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
[0036] (1)种子液培养基配制和灭菌，按下面配方配制培养基:胰蛋白胨1.25g、酵母提取物0.625g、NaCl 6.25g、葡萄糖0.625g、水1000ml，配好后按三角瓶容量的20％分装入三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却后接入所述枯草芽孢杆菌B-01于37℃、180r/min进行培养18h±2h，得到种子液；
[0037] (2)将所得1000mL的种子液于2～5℃、7000～9000r/min下离心10～20min收集沉淀并用无菌生理盐水洗涤，收集沉淀并加入1000mL的无菌生理盐水，摇匀，得到所述枯草芽孢杆菌B-01制剂。
[0038] 实施例3
[0039] 本实施例中称取20g经121℃、5min巴氏杀菌的烟丝于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取4mL所述枯草芽孢杆菌B-01制剂(即20％接种量)于烟叶，4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到样品1。
[0040] 所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl2 5g、KCl 0.5g、CaCl2 0.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
[0041] 称取20g经121℃、5min巴氏杀菌的烟丝于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取4mL无菌生理盐水、4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到空白对照样。
[0042] 将样品和对照样同时在37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
[0043] 请10余位本领域感官测评人员对发酵烟叶样品进行感官评定。评吸方法为将口含烟直接置于上唇与上排
牙齿之间，每次放入唇内的烟丝颗粒
质量为0.2g，标准使用时间定为10min。对烟叶发酵样品的入口口感、
香味、劲头、释放均匀性各15分，刺激性、
顺应性(口含烟食用时间未达标准使用时间被吐出视为顺应性差)、滋味、余味各10分，总分100分，进行评价，得分见表2。
[0044] 表2烟丝在发酵过程中的感官评价分值
[0045]
[0046] 由表2中结果可知，本发明的枯草芽孢杆菌B-01制剂可以强化烟草的发酵过程。经实施例3中的枯草芽孢杆菌B-01制剂处理后的烟叶发酵13天后，对烟叶的感官评价较普通烟叶(原烟，发酵0天的烟叶)增加了48.3％，即枯草芽孢杆菌B-01制剂具有增加烟香、柔和烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质的作用，提升了烟叶品质。
[0047] 实施例4
[0048] 将实施例3中的样品、对照样经发酵13天后的发酵烟叶分别测定其蛋白酶活性。
[0049] 粗酶液提取：称取发酵样品1g，精确至0.0002g。然后用25mL
磷酸缓冲溶液浸提24h，然后用慢速定性
滤纸过滤，滤液待用。
[0050] 采用酪蛋白平板法测定酶活性。首先制备胰蛋白酶活力标准曲线(图3)。将胰蛋白酶商业酶分别配制成10IU/mL、25IU/mL、50IU/mL、75IU/mL、100IU/mL、125IU/mL浓度，各取10uL点样于新配制的酪蛋白平板孔中，自然放置10min后倒置放入37℃培养箱内16h后取出，测量溶解圈直径，计算各溶解圈面积。以溶解圈面积(x，mm2)为横坐标，以胰蛋白酶活力(y，IU/mL)为纵坐标，绘制胰蛋白酶标准曲线。
[0051] 测量样品酶活力。取发酵烟叶粗酶液10uL点样于酪蛋白平板上，然放置10min后倒置放入37℃培养箱内16h后取出，测量溶解圈直径，计算各溶解圈面积。根据胰蛋白酶标准曲线回归方程计算样品蛋白酶酶活。测得发酵对比样2酶活为96.5IU/g，发酵样品2蛋白酶酶活为1239.6IU/g，表明B-01能产生较高酶活的蛋白酶。
[0052] 实施例5
[0053] 将实施例3中的样品、对照样品经发酵13天后的发酵烟叶分别测定其纳豆激酶活性。
[0054] 粗酶液提取：称取发酵样品1g，精确至0.0002g。用25mL磷酸缓冲溶液浸提24h，然后用慢速定性滤纸过滤，滤液待用。
[0055] 向试管中加入1.4mLTris-HCl(50mmol/L，pH7.8)缓冲液和0.4mL
纤维蛋白原溶液(7.2mg/mL)，37℃温育5min后加入0.1mL凝血酶(20U/mL)，再37℃温育10min形成人工血栓，加入0.1mL样品粗酶液，37℃温育60min，加入2mL三氯乙酸(0.2moL/L)溶液静置20min终止反应，13000r/min离心10min，取上清液于275nm
波长处测定吸光度。酶活定义：每分钟275nm处吸光度增加0.01所需要的酶量定义为1个单位的纤维蛋白降解酶活力(FU)。
[0056] 对照样品纳豆激酶酶活为0.2FU/g，B-01发酵样品纳豆激酶酶活为8.6FU/g，表明B-01制剂可以提高烟叶发酵过程中纳豆激酶活性。
[0057] 实施例6
[0058] 发酵烟叶风味物质的变化。
[0059] 将2g烟叶放入10mL顶空固相微萃取瓶中，将顶空瓶放入CTC自动进样器品盘，设置萃取条件为：70℃保持5分钟，70℃
吸附30分钟，萃取盘转速为250r/min，萃取得到的物质在气相色谱进样口进行
解吸附，解吸
温度250℃，时间5min。
[0060] 色谱柱:DB-wax(60m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；进样口温度：240℃；载气：He，1.5mL/min；分流比2∶1；升温程序：初始温度40℃，保持1min，以10℃/min升至120℃，保持
1min；以3℃/min升至230℃，保持5min。传输线温度：240℃；电离方式：EI；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；扫描范围：33～350amu；
数据采集模式：全扫描。采用谱库检索定性。
[0061] 挥发性风味成分检测结果见表3。
[0062] 表3烟叶挥发性风味物质成分表
[0063]
[0064]
[0065]
[0066] 与空白对比，添加了菌株B-01的发酵烟叶新生成的挥发性物质有正十七烷、乙酸、2,6,10,14四甲基十六烷、2,3-二甲基-十一烷、十六碳四烯-1-醇、1-甲基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉
酮、二十七烷、2-甲基-5-[(E)-1-丙烯基]吡嗪、2-吡咯甲
醛、2,3-丁二醇、1-环己烯-3-酮；而双环[4.1.0]庚烷、正十一烷、法尼基丙酮、5-甲基呋喃醛、N-[9-
硼双环[3.3.1]壬-9-基]-丙胺、2-环戊烯-1-酮、2,5-二甲基[1,3]噻唑并[3,2-a]吡啶-4-鎓-8-醇钠消失没有被检出。这里需要时说明的是，B-01新产生了吡嗪类等酱酒香的特征成分。
[0067] 综合分析风味成分和感官评定结果可以发现挥发性风味物质成分种类和含量在原烟、自然发酵烟叶和接种发酵烟叶中差异较大，原烟中不少物质在发酵后不见了，一些成分的相对含量也减少了，而且发酵后也新增加了一些成分并增加了一些风味成分的相对含量，把这些变化同感官评定结果进行对比会发现接种B-01发酵和自然发酵都能改善原烟的刺激性和邪杂味，能显著改善感官品质和增香，而且接种发酵比自然发酵品质能进一步提升一个台阶。
