【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、硝化細菌のグラニュール体である硝化グラニュールを形成する方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】現在、湖沼・内湾・内海などの停滞性・
閉鎖性水域において富栄養化が問題視されおり、その誘発因子である窒素化合物等の高度処理技術の開発が社会的急務であり、水環境保全のために不可欠なことである。 【０００３】廃水の処理技術には大別して生物学的処理と物理化学的処理に分けられるが、窒素化合物等の富栄養化原因物質を処理する際には経済面、環境負荷等を考慮すると生物学的処理が適していると考えられる。 【０００４】この生物学的処理を適用して窒素化合物等を含む廃水の処理を行う場合、好気性条件下において硝化細菌によりアンモニアを亜硝酸、硝酸へと酸化する硝化工程、および嫌気性条件下において脱窒細菌により亜硝酸、硝酸を窒素ガスへと還元する脱窒工程の２つの工程を経るが、化学独立性の硝化細菌は脱窒細菌に比べ増殖速度が遅く、処理装置外へウォッシュアウトされやすいために硝化工程が律速となっている。 【０００５】そこで、ウォッシュアウトを防止し、硝化工程の効率化を図るためには硝化細菌を処理装置内に高密度に保持する微生物固定化技術が重要となってくる。
現在、主に用いられている固定化技術には、硝化細菌を担体上に自然に付着・固定化させる生物膜法、硝化細菌を担体の微細な格子構造内に固定化させる包括固定化法がある。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前述したとおり増殖速度が遅く、特に無機性廃水中において生物膜の元となる細胞外ポリマーの産出量が少ない硝化細菌の固定化に、担体を用いる微生物固定化法を適用することは多大な時間と労力を必要とする。 【０００７】そこで、発明者らは担体を一切必要としない微生物固定化法として自己固定化法に注目した。 自己固定化法とは、微生物が持つ凝集作用を利用し微生物をグラニュール化（造粒化）する微生物固定化技術であるが、これまでは、前述の通り、細胞外ポリマーの産出量が少ない硝化細菌のグラニュール（以下、硝化グラニュール）を形成することは困難であると考えられていた。 【０００８】すなわち、本発明は、自己固定化法により、強度、沈降性およびアンモニア態窒素（ＮＨ ₄ ⁺ −
Ｎ）除去速度に優れた硝化グラニュールを形成することを目的とする。 【０００９】 【課題を解決するための手段】課題を解決するために、
本発明は、硝化細菌を含む汚泥と、無機性アンモニア含有水溶液とを、上向流好気性条件下、反応槽内にて連続的に接触させることをその特徴とする。 【００１０】また、硝化グラニュールの形成をより効率的に促進させるためには、無機性アンモニア含有水溶液の滞留時間を段階的に短縮すること、さらに反応槽上部からウォッシュアウトし、沈降槽に溜まった汚泥を反応槽内に返送することが好ましい。 【００１１】ここで「滞留時間（ＨＲＴ）」とは、無機性アンモニア含有水溶液が反応槽に入ってから出るまでの時間であり、反応槽の槽容量を流入速度で割った平均滞留時間を意味する。 【００１２】また、無機性アンモニア含有水溶液が無機炭素源を５００〜１５００ｍｇ／ｌ含み、さらには、その無機炭素源が炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムであることが好ましい。 【００１３】さらに、無機性アンモニア含有水溶液が微量金属としてリンおよび／または鉄を０．１〜１０ｍｇ
／ｌ含むこと、無機性アンモニア含有水溶液のｐＨ値を７．０〜８．５に調整すること、そのｐＨ値の調整に炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムを用いること、
曝気量が０．０１６〜０．３２l-Air／m ³ ／l-bedの範囲であること、も硝化グラニュールの形成促進に好ましい。 【００１４】以上のような本発明の方法によれば、反応槽下部に高微生物濃度および高ＮＨ ₄ ⁺ −Ｎ濃度環境を作り出すことができ、このような環境下において硝化細菌のグラニュール化が促進されるため、担体を用いた硝化細菌の固定化と比較して、強度、沈降性およびＮＨ ₄ ⁺ −
Ｎ除去速度に優れた硝化グラニュールを形成することができる。 したがって、廃水処理槽内に硝化細菌を高密度に保持し、効率のよい硝化処理を提供することも可能となる。 【００１５】以下、本発明について詳細に説明する。 【００１６】 【発明の実施の形態】本発明では、図１に示すような装置を用いて硝化グラニュールを形成する。 この装置は、
反応槽１と、反応槽下部に接続された溶液流入路２および空気流入路３と、無機性アンモニア含有水溶液を反応槽に供給するために溶液流入路に接続されたポンプ４
と、空気を反応槽に供給するために空気流入路に接続されたエアーポンプ（図示していない）と、反応槽上部に位置する気液分離部５と、反応槽上部に接続された溶液流出路６と、水溶液と共にウォッシュアウトしてくる汚泥を受け止めるために溶液流出路の出口に設置された沈降槽７と、を少なくとも備える。 【００１７】ここで使用可能な反応槽としては、気相と液相との接触時間が長く、汚泥を保持しうるものであればその形状、大きさは限定されないが、好ましくは、筒状のものであり、溶液の流入量およびアンモニア態窒素濃度により、その槽径、高さを決定する。 また、その他の装置の構成に関しては、特に限定されるものではなく、例えば、気泡を細かくするための散気板等、一般的に使用されているものを備えていても良い。 【００１８】上記のような装置を使用して硝化グラニュールを形成する方法としては、まず、反応槽内に硝化細菌を含む汚泥をいれる。 【００１９】ここで用いる汚泥としては、汚泥内に硝化グラニュールの種となる硝化細菌が含まれていればよいが、好ましくは硝化細菌が優占化している汚泥を用いる。 例えば、一般的な下水処理場の汚泥を本廃水で馴養することで硝化細菌が優占化した汚泥を得ることができる。 【００２０】また、反応槽へ入れる微生物の活性汚泥中濃度（ＭＬＳＳ）としては、特に限定されず、例えば、
ＭＬＳＳが３００ｍｇ／ｌ程度の低濃度から開始しても硝化グラニュールの形成を行うことができるが、最初に入れる微生物量が多ければ多いほど、グラニュール化がより促進され、短期間で所望の大きさの硝化グラニュールを形成することができる。 したがって、開始時のＭＬ
ＳＳが１０００〜２０００ｍｇ／ｌであると硝化グラニュール形成にとって好ましい。 【００２１】次に反応槽の下部の溶液流入路および空気流入路から無機性アンモニア含有水溶液および空気をポンプにより連続的に供給することで、反応槽内を上向流好気性状態に保持する。 【００２２】ここで供給される無機性アンモニア含有水溶液は、少なくとも硝化細菌の栄養分となるアンモニア態窒素および無機炭素源を含むことが必要である。 これらを十分な濃度与えることで硝化細菌の増殖が活発になり、硝化グラニュール形成にとって好ましい環境になる。 【００２３】アンモニア態窒素の濃度は、硝化細菌が増殖するのに十分な濃度、すなわち、硝化細菌に対するアンモニア容積負荷として十分に大きい値を適宜実験により決定することが好ましく、無機性アンモニア含有水溶液の滞留時間を終始一定の値としても構わない。 より好ましくは、硝化細菌が徐々に増殖する分、これに応じて滞留時間を短縮し、アンモニア容積負荷をほぼ一定に保つことであり、この場合、効率よく硝化グラニュール形成を行うことができる。 滞留時間を短縮する時の基準としては、安定してアンモニア態窒素の処理が得られ、反応槽内が定常になった時である。 【００２４】また、無機炭素源としては、限定されないが、炭酸ナトリウム（Ｎａ ₂ ＣＯ ₃ ）または炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ ₃ ）であることが好ましく、これらを添加した場合、無機性アンモニア含有水溶液のｐＨも同時に調整することが可能となる。 また、無機炭素源の濃度は、硝化細菌の栄養源として枯渇しない十分な量であれば特に限定されないが、好ましくは５００〜１５０
０ｍｇ／ｌ、より好ましくは８００〜１２００ｍｇ／ｌ
である。 【００２５】さらに、無機性アンモニア含有水溶液には上記成分の他にカルシウム、マグネシウム、ケイ素、カリウム、硫酸、炭酸、ナトリウム等の無機性イオンが含まれていても構わない。 特に微量金属としてリンおよび／または鉄を０．１〜１０ｍｇ／ｌ含むことが好ましく、１〜５ｍｇ／ｌ含むことがより好ましい。 このリンおよび／または鉄は溶液のｐＨ値を調整することでそれぞれ微粒子またはコロイドを形成し、硝化細菌の凝集を助け、硝化グラニュールの形成を促進する。 通常の廃水にはリンおよび／または鉄が微量金属として含まれているが、これらを含まない、もしくはその濃度が十分ではない廃水を無機性アンモニア含有水溶液として使用する場合には上記濃度範囲となるように、水溶性のリンおよび／または鉄の化合物を添加することが好ましい。 【００２６】また、無機性アンモニア含有水溶液のｐＨ
値は、ｐＨ調整剤により好ましくは７．０〜８．５、より好ましくは７．５〜８．３の範囲に調整される。 この範囲外である場合には、鉄などの微量金属の微粒子またはコロイドが形成されず、さらには、硝化細菌が失活してしまうなどの不具合を生じる。 また、上記ｐＨ値の範囲は、無機炭素源として炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムを用いた場合も同様であるから、この範囲にｐＨが収まるように炭素源としての濃度を検討する必要がある。 【００２７】また、無機性アンモニア含有水溶液に供給する曝気量は、反応槽の形状、大きさ等を考慮することはもちろん、グラニュール形成を妨害しない最適量で、
かつ硝化細菌の増殖のために溶液中の溶存酸素を少なくとも１ｍｇ／ｌ以上に保てるような量を適宜実験により決定する。 好ましくは、０．０１６〜０．３２l-Air／m
³ ／l-bed、より好ましくは０．０７９〜０．２９l-Air
／m ³ ／l-bedである。 なお、「l-Air／m ³ ／l-bed」は、
単位装置容積当たりの曝気量（速度）を意味する。 曝気量が０．０１６l-Air／m ³ ／l-bedより小さいと水溶液中の溶存酸素濃度が低下し、好気性である硝化細菌の増殖が停止してしまうためグラニュール形成に悪影響を及ぼす。 また、曝気量が０．３２l-Air／m ³ ／l-bedより大きいと、硝化細菌のウォッシュアウト量が増加し、さらには、気泡の剪断応力により所望の大きさのグラニュールが得られない場合があり、さらには、細かい気泡が合一し大きな気泡（スラグ流）となり気液界面が減少することで結果的に溶存酸素濃度が減少してしまうという不具合を生じる。 【００２８】さらに、硝化グラニュール形成を促進するために、ウォッシュアウトされ沈降槽に溜まった汚泥を定期的に反応槽内へ返送することが好ましい。 【００２９】さらに、無機性アンモニア含有水溶液の温度は、特に限定されず、室温でよい。 【００３０】以上のようにして、所望の大きさの硝化グラニュールが形成されるまで上向流好気性流動床の状態を保持する。 【００３１】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、この開示の一部を為す記載および図面は本発明の範囲をなんら限定するものではなく、当業者には様々な代替実施の形態、実施例、および運用技術が明らかとなろう。 したがって、本発明の技術的範囲は、明細書および図面から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。 【００３２】 【実施例】（実施例１） グラニュールの形成直径５ｃｍ、高さ３．２ｍの構造を有する有効容積６．
３ｌの反応槽を用意し、ここへ下水処理場の汚泥を本廃水で約２年間馴養した種汚泥を入れた。 さらに１．０ｌ
／ｍｉｎの量の空気とともに表１に示す組成である無機性アンモニア含有水溶液を反応槽下部のそれぞれの流入路から連続的に供給することで、上向流好気性条件下を保持した。 なお、無機性アンモニア含有水溶液の滞留時間は表２に示すとおりに短縮した。 また、沈降槽にウォッシュアウトされた汚泥は反応槽内に定期的に返送した。 【００３３】 【表１】

【表２】 このような上向流好気性流動床を１００日間保った結果、直径約２００μｍのグラニュールが形成され（図２）、５５０日目には直径約１１００μｍのグラニュールが形成された。 【００３４】（実施例２） グラニュールのキャラクタリゼーション実施例１により形成されたグラニュールの形態を確認するためＳＥＭ（走査電子顕微鏡）により表面構造の観察を試みた。 【００３５】パラホルムアルデヒドおよびオスミウム酸二重固定化法でグラニュールの前処理を行った後、これに金蒸着（４００Å）を施し、ＳＥＭ（ＪＳＭ−５２０

０、日本電子）で観察した。 そのＳＥＭ画像を図３aおよび図３bに示す。 これにより、グラニュール表面は微生物が高密度に層を形成した構造をとっていることが確認された。 【００３６】さらに、実施例１により形成されたグラニュール内の微生物群集構造の解析をＦＩＳＨ（fluoresc

ence in situ hybridization）法により行った。 【００３７】ＦＩＳＨ法は、蛍光標識をつけたオリゴヌクレオチドプローブを１６ＳｒＲＮＡ内の種特異的な塩基配列を標的としてハイブリダイゼーションさせ、蛍光顕微鏡下で特定の微生物のみを特異的に検出する方法である。 ハイブリダイゼーションは、Amannらの方法（Mol

ecular Microbial Ecology Manual, 3.3.6:1-15 (199

5)）に準拠して行った。 【００３８】本実験のin situハイブリダイゼーションにはオリゴヌクレオチドプローブとしてβ-proteobacte

riaに属するアンモニア酸化細菌に特異的なＮＳＯ１９

０、および亜硝酸酸化細菌のNitrobacter属を特異的に検出するＮＩＴ３、また真正細菌に特異的なＥＵＢ３３

８を用いた。 表３にそれぞれのプローブのハイブリダイゼーション条件および蛍光標識を示す。 【００３９】 【表３】 アンモニア酸化細菌の検出結果を図４a、図４bに、亜硝酸酸化細菌の検出結果を図５に示す。 【００４０】グラニュール内にアンモニア酸化細菌が棲息していることが図４aにより確認された。 また、アンモニア酸化細菌はグラニュールの表層約１００μｍで優占化しており、図４bからクラスターをつくって存在していることが確認された。 【００４１】さらに、図５より亜硝酸酸化細菌もまた表層部分に存在していることが確認された。 しかし、アンモニア酸化細菌に比べ菌体数が極端に少ないため、亜硝酸酸化細菌の検出についてはハイブリダイゼーション条件の再検討が必要だと考えられる。 【００４２】（実施例３） ＮＨ

₄

⁺ −Ｎ除去速度およびＮＨ

₄

⁺ −Ｎ除去率の経日変化実施例１と同様にしてグラニュール形成を行うと同時に、溶液流入路および反応槽高さ３２０ｃｍで水溶液を定期的にサンプリングしてアンモニア態窒素濃度（ＮＨ

₄

⁺ −Ｎ）の測定を行い、本実施例におけるグラニュールのＮＨ

₄

⁺ −Ｎ除去速度およびＮＨ

₄

⁺ −Ｎ除去率の経日変化を算出した。 それぞれの結果を図６および図７に示す。 【００４３】図６よりＮＨ

₄

⁺ −Ｎ除去速度は滞留時間を徐々に短縮することにより１．５kg-N／(m

³・日)にまで到達することが確認され、図７よりＮＨ

₄

⁺ −Ｎ除去率は約４００日の運転中、常に９０％以上の安定した除去率であったことがわかる。 【００４４】（実施例４） グラニュールの沈降性実施例１で得られたグラニュールおよび浮遊性硝化細菌をそれぞれメスシリンダーに投入し、攪拌後５秒、１５

秒、３０秒の沈降性を評価した。 【００４５】図８に示すように、実施例１で得られたグラニュールは攪拌後５秒で水面上部が透明になり始め、

３０秒で完全に沈降した。 一方、フロックを形成した硝化細菌は３０秒経過しても依然懸濁している様子が観察された。 【００４６】このことから、実施例１で得られるグラニュールは非常に沈降性が良く、固液分離能に優れていると言える。 【００４７】（実施例５） グラニュールの強度および装置内固定化の評価まず、実施例１で得られたグラニュールがエアレーションの剪断応力に耐え、その原形（直径）を保つかどうかを観察することにより、その強度評価を行った。 【００４８】本実施例には表１の組成からＮａＨＣＯ

₃

を除いた無機性アンモニア含有水溶液を用いた。 図９に示すような有効容積１ｌの完全混合流型三相流動槽内に実施例１で得られたグラニュールを２５vol％（ＭＬＳ

Ｓは９１００ｍｇ／ｌ）投入し、回分処理した後、上記水溶液と空気を連続供給した。 ここで上記水溶液のアンモニア容積負荷は１．５８kg-N/(m

³・日)であり、滞留時間は７．６時間である。 また、曝気量は０．５ｌ／mi

nとした。 さらに、上記水溶液のｐＨは、ＮａＨＣＯ

₃の供給を制御するｐＨコントローラーにより７．０±０．

２に保った。 【００４９】０、３０、９０日目のグラニュール平均径の結果を表４に示す。 また、それぞれのグラニュール径分布を図１０に示す。 【００５０】 【表４】 表４より、日数が経つと共にグラニュール平均径はわずかながら増加傾向にあることがわかる。 また、図１０のグラフからも日数の経過と共にグラニュール径が増加側にシフトしていく様子が分かる。 これより、本発明により得られるグラニュールの緻密さ、強固さが示される。 【００５１】次に、グラニュールの系および浮遊性硝化細菌の系のそれぞれのＭＬＳＳ値の経日変化を比較した。 浮遊性硝化細菌のＭＬＳＳ値は、上記の装置に実施例１のグラニュールではなく、浮遊性硝化細菌を投入し、同様の条件において回分処理した後、無機性アンモニア含有水溶液と空気を連続供給して測定した。 【００５２】この結果、図１１に示すように、グラニュールの系では、初日９１００ｍｇ／ｌであるＭＬＳＳの値が常に１００００ｍｇ／ｌ以上を保っているのに対し、浮遊性硝化細菌の系においては、３０００ｍｇ／ｌ

まで減少し、定常に達していることがわかる。 また、図１２にはそれぞれの系に設けた沈降槽の写真を示すが、

槽外にウォッシュアウトした微生物量は浮遊性硝化細菌の方が約３倍多い。 また、グラニュールの系の沈降槽に堆積していた堆積物は、装置を運転していくと共に発生し始めた浮遊性硝化細菌であり、グラニュールは皆無であった。 【００５３】したがって、本発明の硝化グラニュールは、高度に装置内に固定化することが可能であり、既存処理装置への応用も期待できる。 【００５４】 【発明の効果】本発明によれば、強度、沈降性およびＮ

Ｈ

₄

⁺ −Ｎ除去速度に優れた硝化グラニュールを形成することができる。 したがって、廃水処理槽内に硝化細菌を高密度に保持し、効率のよい硝化処理を提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】 【図１】 本発明に使用するグラニュール形成装置の一例を示す模式図。 【図２】 本発明の方法により１００日で形成されたグラニュールの写真。 【図３】 本発明によるグラニュールの表面のＳＥＭ画像。 【図４】 本発明によるグラニュールの表面のアンモニア酸化細菌を示す蛍光顕微鏡写真。 【図５】 本発明によるグラニュールの表面の亜硝酸酸化細菌を示す蛍光顕微鏡写真。 【図６】 本発明によるグラニュールのＮＨ ₄ ⁺ −Ｎ除去速度の経日変化を示すグラフ。 【図７】 本発明によるグラニュールのＮＨ ₄ ⁺ −Ｎ除去率の経日変化を示すグラフ。 【図８】 本発明によるグラニュールと浮遊性硝化細菌の沈降性を比較した写真。 【図９】 本発明によるグラニュールの強度評価に用いた完全混合流型三相流動槽の模式図。 図１と同じの構成は同じ符号を附してある。 【図１０】 本発明によるグラニュールの強度評価における、０，３０および９０日経過後のグラニュール径分布を示すグラフ。 【図１１】 本発明によるグラニュールの装置内固定化の評価における、グラニュールと浮遊性硝化細菌のＭＬ
ＳＳの濃度の経日変化を示すグラフ。 【図１２】 本発明によるグラニュールの装置内固定化の評価における、グラニュールの系と浮遊性硝化細菌の系の沈降槽の写真。 【符号の説明】 １ 反応槽２ 溶液流入路３ 空気流入路４ ポンプ５ 気液分離部６ 溶液流出路７ 沈降槽８ サンプリング孔９ 流量計１０ グラニュール１１ ｐＨコントローラー１２ NaHCO ₃水溶液流入路