一株好氧型兼性自养反硝化细菌及其应用
阅读：497发布：2020-06-19
专利汇可以提供一株好氧型兼性自养反硝化细菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一株好 氧 型兼性自养 反硝化细菌 及其应用，本 发明 涉及一株好氧型兼性自养反硝化细菌及其应用。本发明一株好氧型兼性自养反硝化细菌为假单胞菌属(Pseudomonas koreensis)Y5-11，保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为16651。本发明菌株既可以利用有机 碳 源进行生长，也可以CO2为唯一碳源还原 硝酸 盐，本发明应用于环境微生物技术领域。，下面是一株好氧型兼性自养反硝化细菌及其应用专利的具体信息内容。
1.一株好氧型兼性自养反硝化细菌，其特征在于它为Pseudomonas koreensis Y5-11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为16651。
2.根据权利要求1所述的一株好氧型兼性自养反硝化细菌，其特征在于好氧型兼性自养反硝化细菌Y5-11为革兰氏染色阴性、杆菌，长2～4μm，宽0.5～0.9μm，无芽孢，有鞭毛，并靠鞭毛进行运动，有荚膜，在LB培养基上形成乳白色菌落，菌落呈不规则圆形，表面凸起。
3.如权利要求1所述的一株好氧型兼性自养反硝化细菌的应用，其特征在于
Pseudomonas koreensis Y5-11用于去除地下水中污染物。
4.根据权利要求3所述的一株好氧型兼性自养反硝化细菌的应用，其特征在于污染物为硝酸盐。
一株好氧型兼性自养反硝化细菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一株好氧型兼性自养反硝化细菌及其应用。
背景技术
[0002] 微生物的反硝化作用是指微生物将硝酸盐还原生成氮气的过程。这一现象普遍存在于自然界(陆地、淡水和海洋系统)。一般认为反硝化作用分为缺氧-异养反硝化和厌氧-自养反硝化。缺氧-异养反硝化作用是在缺氧条件下(溶解氧为0.5mg/L左右)，以有机物(有机碳)为电子供体，还原硝酸盐生成氮气的过程。缺氧-异养反硝化作用的特点是需要大量的有机碳源维持生长(C/N>10)，而在污水或微污染地下水脱氮处理过程中，常出现碳源不足的情况，一般需要额外投加甲醇等有机物，由此导致了制水成本的提高。厌氧-自养反硝化细菌不需要有机碳源，以CO2、HCO3-或CO32-为碳源进行生长，根据电子供体的不同，可分为氢型自养反硝化细菌和硫自养反硝化细菌。由于厌氧-自养反硝化细菌是专性厌氧菌，且需要额外提供电子供体(即氢或者硫化物)，这些特点增加了厌氧-自养反硝化细菌的应用难度，也提高了其应用成本。近年来，也有大量的研究发现存在异养硝化-好氧反硝化细菌，使得在好氧的条件下进行脱氮反应成为可能，然而，此类细菌仍然需要很高的有机碳源(通常C/N为10～20)。
发明内容
[0003] 本发明提供了一株好氧型兼性自养反硝化细菌及其应用。
[0004] 本发明一株好氧型兼性自养反硝化细菌为Pseudomonas koreensisY5-11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为16651。
[0005] 本发明一株好氧型兼性自养反硝化细菌应用于去除地下水中污染物。
[0006] 本发明好氧型兼性自养反硝化细菌Y5-11的筛选方法为：将100mL低温(4℃左右)地下水样至于4℃培养箱中进行富集培养，定期加入0.1g/L的NaNO3；7～10d后，水样中明显呈浑浊状态，表明有微生物生长，将水样转入分离、纯化固体培养基中；分离、纯化的温度为6～10℃，分离、纯化的培养时间为3～4d，经过3次纯化后，进行菌体染色观察，当菌落中不再有杂菌存在时，即为纯菌株，用于进行筛选试验；将分离、纯化后的菌株进行液体扩培，收集菌体后，接种至100mg/L的硝酸盐溶液中，在6～10℃、摇床转速180rpm/min的条件下，
30min后测定剩余硝酸盐浓度并计算反硝化速率，选择可进行反硝化的菌株，即为好氧型兼性自养反硝化细菌。
30min后测定剩余硝酸盐浓度并计算反硝化速率，选择可进行反硝化的菌株，即为好氧型兼性自养反硝化细菌。
[0007] 提取好氧型兼性自养反硝化细菌基因组DNA后进行16S rDNA序列扩增，将获得片段用于测序，根据好氧型兼性自养反硝化细菌的基因特征，并根据《伯杰细菌鉴定手册》，鉴定为假单胞菌属的Pseudomonas koreensis，最终命名为Pseudomonas koreensis Y5-11。
[0008] 本发明Pseudomonas koreensis Y5-11既可以利用有机碳源进行生长，也可以CO2为唯一碳源还原硝酸盐，且不需要额外提供电子供体。测定Y5-11在无碳源条件下的硝化速率，当硝酸盐浓度达到150.0mg/L时，反硝化速率最高，为135.12mg/L/h。
[0009] 本发明Pseudomonas koreensisY5-11保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为16651。附图说明
[0010] 图1为本发明好氧型兼性自养反硝化细菌Y5-11的革兰氏染色结果示意图；
[0011] 图2为本发明好氧型兼性自养反硝化细菌Y5-11的菌落示意图。
具体实施方式
[0012] 具体实施方式一：本实施方式一株好氧型兼性自养反硝化细菌为Pseudomonas koreensis Y5-11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为16651。
[0013] 本实施方式好氧型兼性自养反硝化细菌Pseudomonas koreensis Y5-11的筛选方法为：将100mL低温(4℃左右)地下水样至于4℃培养箱中进行富集培养，定期加入0.1g/L的NaNO3；7～10d后，水样中明显呈浑浊状态，表明有微生物生长，将水样转入分离、纯化固体培养基中；培养基主要成分为：NaNO3 0.1～0.5g/L，MnSO4 0.01～0.05g/L，(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 0.01～0.10g/L，CaCl2 0.01～0.05g/L，Na2HPO4 0.3～0.9g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，NaCl 0.3～0.9g/L，pH值7.0～7.4，(固体培养基中加入1.8g/L的琼脂)；分离、纯化的温度为6～10℃，分离、纯化的培养时间为3～4d，经过3次纯化后，进行菌体染色观察，当菌落中不再有杂菌存在时，即为纯菌株，用于进行筛选试验；将分离、纯化后的菌株进行液体扩培，收集菌体后，接种至100mg/L的硝酸盐溶液中，在6～10℃、摇床转速180rpm/min的条件下，30min后测定剩余硝酸盐浓度并计算反硝化速率，选择可进行反硝化的菌株，即为好氧型兼性自养反硝化细菌。
[0014] 提取好氧型兼性自养反硝化细菌基因组DNA后进行16S rDNA序列扩增，将获得片段用于测序，根据好氧型兼性自养反硝化细菌的基因特征，并根据《伯杰细菌鉴定手册》，鉴定为假单胞菌属的Pseudomonas koreensis，最终命名为Pseudomonas koreensis Y5-11。
[0015] 本发明Pseudomonas koreensis Y5-11既可以利用有机碳源进行生长，也可以CO2为唯一碳源还原硝酸盐，且不需要额外提供电子供体。测定Y5-11的反硝化速率，当硝酸盐浓度达到150.0mg/L时，反硝化速率最高，为135.12mg/L/h。
[0016] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：好氧型兼性自养反硝化细菌Pseudomonas koreensis Y5-11为革兰氏染色阴性、杆菌，长2～4μm，宽0.5～0.9μm，无芽孢，有鞭毛，并靠鞭毛进行运动，有荚膜，在LB培养基上形成乳白色菌落，菌落呈不规则圆形，表面凸起。其他与具体实施方式一相同。
[0017] 具体实施方式三：本实施方式一株好氧型兼性自养反硝化细菌应用于去除地下水中污染物。
[0018] 具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：污染物为硝酸盐。其他与具体实施方式三相同。
[0019] 具体实施方式五：本实施方式好氧型兼性自养反硝化细菌Pseudomonas koreensis Y5-11的筛选方法为：将100mL低温(4℃左右)地下水样至于4℃培养箱中进行富集培养，定期加入0.1g/L的NaNO3；7～10d后，水样中明显呈浑浊状态，表明有微生物生长，将水样转入分离、纯化固体培养基中；培养基主要成分为：NaNO3 0.1～0.5g/L，MnSO40.01～0.05g/L，(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 0.01～0.10g/L，CaCl2 0.01～0.05g/L，Na2HPO4 0.3～
0.9g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，NaCl 0.3～0.9g/L，pH值7.0～7.4，(固体培养基中加入1.8g/L的琼脂)；分离、纯化的温度为6～10℃，分离、纯化的培养时间为3～4d，经过3次纯化后，进行菌体染色观察，当菌落中不再有杂菌存在时，即为纯菌株，用于进行筛选试验；将分离、纯化后的菌株进行液体扩培，收集菌体后，接种至100mg/L的硝酸盐溶液中，在6～10℃、摇床转速180rpm/min的条件下，30min后测定剩余硝酸盐浓度并计算反硝化速率，选择可进行反硝化的菌株，即为好氧型兼性自养反硝化细菌。
0.9g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，NaCl 0.3～0.9g/L，pH值7.0～7.4，(固体培养基中加入1.8g/L的琼脂)；分离、纯化的温度为6～10℃，分离、纯化的培养时间为3～4d，经过3次纯化后，进行菌体染色观察，当菌落中不再有杂菌存在时，即为纯菌株，用于进行筛选试验；将分离、纯化后的菌株进行液体扩培，收集菌体后，接种至100mg/L的硝酸盐溶液中，在6～10℃、摇床转速180rpm/min的条件下，30min后测定剩余硝酸盐浓度并计算反硝化速率，选择可进行反硝化的菌株，即为好氧型兼性自养反硝化细菌。
[0020] 好氧型兼性自养反硝化细菌Pseudomonas koreensis Y5-11为革兰氏染色阴性、杆菌，长2～4μm，宽0.5～0.9μm，无芽孢，有鞭毛，并靠鞭毛进行运动，有荚膜，在LB培养基上形成乳白色菌落，菌落呈不规则圆形，表面凸起。Y5-11的革兰氏染色结果如图1所示；Y5-11的菌落如图2所示。
[0021] 好氧型兼性自养反硝化细菌Pseudomonas koreensis Y5-11生理生化特征测定参照文献方法(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社，2001.)。本实施方式中好氧型兼性自养反硝化细菌的生理生化特征为：接触酶阳性，氧化酶阳性，可以水解吐温80、精氨酸，可进行明胶液化，可以还原硝酸盐生成氮气；不能水解葡萄糖产酸，不能水解淀粉；可以利用D-阿拉伯醇、D-果糖、D-半乳糖、α-D-葡萄糖、D-甘露醇、甲基丙酸、甲基琥珀酸、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、乙醇、苯甲酸盐、苹果酸盐和乳酸盐。：接触酶阳性，氧化酶阳性，可以水解吐温80、精氨酸，可进行明胶液化，可以还原硝酸盐生成氮气；不能水解葡萄糖产酸，不能水解淀粉；可以利用D-阿拉伯醇、D-果糖、D-半乳糖、α-D-葡萄糖、D-甘露醇、甲基丙酸、甲基琥珀酸、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、乙醇、苯甲酸盐、苹果酸盐和乳酸盐。
[0022] 具体实施方式六：本实施方式Pseudomonas koreensis Y5-11的鉴定：
[0023] 提取好氧型兼性自养反硝化细菌Pseudomonas koreensis Y5-11的基因组DNA后进行16S rDNA序列扩增：用于扩增的PCR反应引物为通用引物：正向引物5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；反向引物5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR反应体系如下：20～50ng模板DNA，0.2μL Taq酶，2.5μL 10×Buffer(含Mg2+)，1μL dNTP(各2.5mmol/L)，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，加入无菌去离子水至25μL。PCR扩增条件：94℃预变性4min，之后
94℃变性45s，55℃扩增45s，72℃延伸1min，经过30次循环后，72℃延伸10min，之后4℃终止反应，将获得片段用于测序，基因序列如SEQ ID NO：1所示，GenBank注册号为MH817853。根据好氧型兼性自养反硝化细菌的基因特征，并根据《伯杰细菌鉴定手册》，鉴定为假单胞菌属的Pseudomonas koreensis，最终命名为Pseudomonas koreensis Y5-11。
94℃变性45s，55℃扩增45s，72℃延伸1min，经过30次循环后，72℃延伸10min，之后4℃终止反应，将获得片段用于测序，基因序列如SEQ ID NO：1所示，GenBank注册号为MH817853。根据好氧型兼性自养反硝化细菌的基因特征，并根据《伯杰细菌鉴定手册》，鉴定为假单胞菌属的Pseudomonas koreensis，最终命名为Pseudomonas koreensis Y5-11。
[0024] 对本实施方式的类Pseudomonas koreensis Y5-11在低温、无有机碳源加入的条件下反硝化功能进行验证：
[0025] 试验1：好氧型兼性自养反硝化细菌Pseudomonas koreensis Y5-11在6～10℃、无有机碳源条件下的反硝化速率测定：模拟地下水水质：分别配制浓度为10.0、20.0、40.0、60.0、100.0、150.0、200.0mg/L的硝酸盐溶液，然后加入MnSO4和FeSO4，混合溶液中MnSO4浓度为7～10mg/L，FeSO4浓度为5～8mg/L；然后将菌株Pseudomonas koreensis Y5-11培养至
107～109个/mL，取50mL菌液在6000g离心10min获得菌体沉淀，用无菌去离子水对菌体沉淀清洗2～3次，将菌体转入50mL模拟得地下水中，30min后测定剩余硝酸盐浓度，并计算反硝化速率，当硝酸盐浓度达到150.0mg/L时，反硝化速率最高，为135.12mg/L/h。当硝酸盐浓度超过150mg/L时，反硝化速率呈下降趋势。
107～109个/mL，取50mL菌液在6000g离心10min获得菌体沉淀，用无菌去离子水对菌体沉淀清洗2～3次，将菌体转入50mL模拟得地下水中，30min后测定剩余硝酸盐浓度，并计算反硝化速率，当硝酸盐浓度达到150.0mg/L时，反硝化速率最高，为135.12mg/L/h。当硝酸盐浓度超过150mg/L时，反硝化速率呈下降趋势。
[0026] 由试验可知，Pseudomonas koreensis Y5-11可以以CO2为唯一碳源还原硝酸盐，且不需要额外提供电子供体，在6～10℃、无碳源条件下，当硝酸盐浓度达到150.0mg/L时，反硝化速率为135.12mg/L/h。
[0027] 试验2：从不同地下水采样地采取4份实际地下水样品50mL，水质如表1所示。
[0028] 表1地下水水质
[0029]
[0030] 是将菌株Pseudomonas koreensis Y5-11培养至107～109个/mL，取50mL菌液在6000g离心10min获得菌体沉淀，用无菌去离子水对菌体沉淀清洗2～3次，将菌体收集，分别转入4份水样中，处理30min和8h后测定水中剩余硝酸盐浓度，并计算硝酸盐的去除率，结果如表2所示。结果表明，经8h处理后，Y5-11可以去除地下水中80％左右的硝酸盐，处理后，硝酸盐可以满足我国《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)的要求(以地下水为水源时，硝酸盐≤20mg/L)
[0031] 表2Pseudomonas koreensis Y5-11在30min和8h后对地下水中硝酸盐的去除效果[0032]
[0033] 由试验1和2可知，Pseudomonas koreensis Y5-11可以以CO2为唯一碳源还原硝酸盐，且不需要额外提供电子供体，在6～10℃、无碳源条件下，当硝酸盐浓度达到150.0mg/L时，反硝化速率为135.12mg/L/h。在不额外添加碳源和电子供体的条件下，经8h处理后，Y5-11可以去除地下水中80％左右的硝酸盐。
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