[발명의 명칭]

고추역병 방제용 길항 미생물 및 이 길항 미생물을 이용한 고추역병의 방제방법

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 고추역병 방제용 길항 미생물 및 이 길항 미생물을 이용한 고추역병의 방제방법에 관한 것이다.

농작물에 발생하는 각종 병충해는 직접적으로 수량을 감소시킬 뿐만 아니라, 품질에도 나쁜 영향을 미치게 된다. 이러한 병충해를 방지하기 위하여 새로운 농약의 개발과 사용방법이 계속 연구되어 왔으며, 현재에도 각국에서 새로운 농약개발에 주력하고 있는 실정이다.

병충해의 방제법으로는 크기 유기합성농약에 의한 방제법과 최근 새롭게 대두되는 생물학적 방제법이 있으나, 유기합성농약에 의한 방제법은 인축에 대한 농약중독, 자연환경에 미치는 작물잔류 및 토양잔류 독성 문제가 대두되고 있으므로, 이러한 유기합성농약의 단점을 없앨 수 있는 생물농약의 개발에 많은 관심이 집중되고 있다.

생물농약이란 생물 자체 또는 생물이 생산해내는 활성물질을 이용하여 농약으로 사용하는 것을 통털어 말하며, 이러한 생물농약은 첫째 인축에 무해하고, 둘째 유기합성농약의 장기간 사용해서 오는 병균의 내성 및 해충의 약체 저항성 발달을 피할 수 있으며, 셋째 병충해 방제에 유익한 천적을 보호할 수 있고, 넷째 자연환경을 오염시키지 않는 등의 장점을 갖는다.

지금까지 알려진 생물농약의 종류로는 농업용 항생물질, 세균 및 바이러스를 이용하는 미생물 살충제, 길항 미생물 등이 있다.

길항 미생물이란 두종류의 미생물을 배양할 때 한쪽의 미생물에 의해 다른 미생물의 생육을 저지하는 미생물을 말하여, 그의 작용 특성은 기생, 포식, 항생작용 등으로 알려져 있다.

지금까지 고추역병에 효과적인 농약으로는 최근 고시 사용하고 있는 유기합성약제인 메타실등이 있다. 그러나 이 약제를 적정농도 이상 사용할 경우 고추에 대한 약해를 우려할 수 있고, 약제살포회수를 많이(4~5회)하여도 고추역병이 완전 방제되지 않는 등 많은 문제점을 내포하고 있다. 뿐만 아니라 새로운 유기합성 농약의 개발은 합성에서 등록판매에 이르기까지 8~10년의 많은 기간이 소요되며, 그 개빌비만도 200억원 이상의 많은 경비를 요규하게 된다.

이러한 상황하에서 무공해 생물농약인 길항 미생물에 의한 방제는 매우 바람직하며, 그의 개발이 절실히 요구되고 있다. 지금까지 세계각국에서 생물농약에 대한 많은 연구 및 투자를 하고 있으나, 우수한 미생물의 탐색이 여의치 못한 실정이다. 지금까지 알려진 병해방제용 길항 미생물로는 근두암종병(Canker : Agrobacterium tumefaciens)의 방제를 위해 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 목화입고병(Rhizoctonia solani)방제를 위해 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 및 담배 흰비단병(Thanatephorus cucumeris)방제를 위해 트리코데르마 리그노룸(Trichoderma lignorum)이 미생물 농약제제로 등록 사용되고 있다.

그러나 고추역병의 방제를 위한 미생물 농약제제는 지금까지 알려진바 없다.

이러한 상황하에 본 발명자들은 고추역병 방제를 위한 생물농약의 개발을 위해 연구한 결과, 전국의 토양을 채취하여 분리하고 실내 및 생물검정을 실시하여 농약에 의한 난방제로 알려진 고추역병을 방제할 수 있는 우수한 길항 미생물이 바실러스(Bacillus)속 스트레인(Strain) AC-1을 발견하기에 이르렀다. 본 발명은 이러한 발견을 기초로 완성되었다.

본 발명은 병해 방제용 길항 미생물 바실러스속 스트레인 AC-1에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이 미생물을 이용한 고추역병의 방제방법에 관한 것이다.

이 미생물은 고추작물에 가장 피해가 크고 난방제로 알려진 고추역병 병원균의 생육저지 효과가 있어 시설재배지에서의 고추역병 방제에 매우 효과적인 미생물이라 할 수 있다.

본 발명에 의한 고추역병 방제용 길항 미생물은 이러한 관점에서 효과적으로 사용할수 있으며, 토양내에 존재하고 있는 미생물의 이용, 그리고 타작물에 병원성이 없으므로 안전하게 사용할 수 있다는 큰 잇점을 갖는다.

본 발명에 의한 길항 미생물 바실러스속 스트레인 AC-1은 토양내에 분포하는 수많은 세균중(백만 혹은 천만/g) 고추역병의 방제를 목표로 전국적으로 토양을 채취하고 균주로 분리하여 시험한 결과 방제균주중 우수한 균주로 선발된 길항 미생물이다.

상술한 길항 미생물은 하기의 분류학적 특성을 갖는다.

가. 형태적 성질

1. 형태 : 단간균

2. 포자형성유무 : 내생포자 형성

3. 크기 : 1.3~1.8×2.7×4.0㎛

4. 운동성 : 있음

5. 그람염색 : 영성

나. 배양적 성질

1. 감자 반합성 한천 평판 : 생육 양호, 원형(Circular), 전연(entire), 평활(Convex)

2. 감자 반합성 한천 사면 : 생육 양호, 사상(filiform)

3. 육즙 한천 천자배양 : 표면만 생육, 사상(filiform)

4. 감자 반합성 액체배양 : 불투명

다. 생리적 성질

1. 생육온도범위 : 5℃~45℃

2. 최적생육온도 : 25℃~35℃

3. 산소요구성 : 호기성

4. 생육 pH범위 : 4.0~9.0

5. 최적 생육 pH : 5.0~7.0

6. 사멸온도 : 95℃,10분

7. 제라틴액화력 : 있음

8. 리트머스밀크 : 산성

9. 인돌생산 : 없음

10. 전분 분해력 : 있음

11. 보구스-포로스카우엘(Voges-proskauer)반응 : 양성

12. 카타라제 : 양성

13. 카제인 분해력 : 양성

14. 티로시나제 활성 : 음성

15. 알기닌 가수분해 : 음성

16. 투윈 80(Tween 80)분해 : 음성

17. 케도락토스(3-ketolactose)생성 : 음성

18. 레반생산 : 양성

19. 삭카로스 환원 : 양성

20. 메칠레드 : 양성

21. 페닐알라닌 디아미나제 : 음성

22. 질산호흡 : 음성

23. 질산염의 환원 : 양성

24. 소금(NaCl) 내성 : 6.0~8.0

25. 색소생산 : 없음

26. 탄소원으로부터 산생산

가. 아라비노스(arabinose) : 있음

나. 자일로스(xylose) : 있음

다. 포도당(glucose) : 없음

라. 프럭토스(fructose) : 있음

마. 갤락토스(galactose) : 있음

바. 만노스(mannose) : 없음

사. 삭카로스(saccharose) : 있음

아. 락토스(lactose) : 있음.

자. 래피노스(raffinose) : 없음

차. 전분(starch) : 없음

카. 글리세린(glycerin) : 있음

타. 만니톨(mannitol) : 있음

파. 살리신(salicin) : 있음

27. 탄소원으로부터 가스 생산

가. 아라비노스(arabinose) : 없음

나. 자일로스(xylose) : 없음

다. 포도당(glucose) : 없음

라. 프럭토스(fructose) : 없음

마. 갤락토스(galactose) : 없음

바. 만노스(mannose) : 없음

사. 삭카로스(saccharose) : 없음

아. 락토스(lactose) : 없음

자. 래피노스(raffinose) : 없음

차. 전분(starch) : 없음

카. 글리세린(glycerin) : 있음

타. 만니톨(mannitol) : 없음

파. 살리신(salicin) : 있음

상기의 토양유래의 길항 미생물의 분류학적 특성을 버지의 매뉴얼(Bergy's manual of determinative bacteriology, 7판, 1957, 8판 1974)에 따라 그 형태적, 배양적, 및 생리적 성질을 조사한 바 본 균주는 바실러스(Bacillus)속으로 동정되었다. 그러나 바실러스속의 공지 종 균주종에서 상기의 분류학적 특성을 갖는 균주를 발견할 수 없었으므로, 본 발명의 길항 미생물을 신규종의 균주로 간주하고 바실러스속 스트레인 AC-1이라고 명명하였다.

상술한 바실러스속 스트레인 AC-1은 한국과학기술원(KAIST)에 1988년 2월 6일자로 KCTC 833OP의 수탁번호로 기탁되어 있다.

본 발명의 고추역병 방제용 길항 미생물의 고추역병 방제효과 및 여러 가지 시험성적에 대해서는 하기의 실시예에 상세히 설명한다.

[실시예 1]

[각종 작물에 대한 병원성 조사]

감자 300g을 증류수 1ℓ에 넣어 끓인 물에 세균학적 펩톤(Bacteriological peptone) 5g, 질산칼슘(Ca(NO ₃ ) ₂ ·4H ₂ O)0.5g, 인산나트륨(Na ₂ HPO ₄ ·12H ₂ O) 2g 및 서당(sucrose) 15g을 섞은 후 pH를 7.0으로 조절하여 감자반합성 액체 배지를 제조한다.

이 감자 반합성 액체 배양액에 바실러스 스트레인 AC-1(KCTC 833OP)균주를 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양한다. 이 배양액 1%가량을 본 배지(500㎖ 삼각 플라스크 배지 100㎖)에 접종하여 30℃에서 48시간, 회전속도 150rpm으로 진탕배양한다.

작물(고추, 가지, 토마토, 수박, 참깨, 콩, 오이, 무, 배추)을 각각 사각폿트(16.5×7.8×7.5㎝)에 파종한 후, 본엽 3.4엽기시 상기에서 배양된 균을 접종 농도(4.2×10 ⁸ 세포/㎖)로 조정한 후 폿트당 50㎖ 관추처리 및 엽면처리한다. 접종상(28℃, 습도 100%)에서 18시간 방치후 25~30℃의 온실에서 20일간 주기적으로 병원성 여부를 조사하였다. 결과는 표 1에 나타낸다.

[표 1]

상기의 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이 본 발명의 길항 미생물은 각종 작물에 대해 병원성을 나타내지 않았다.

[실시예 2]

[각종 식물 병원균에 대한 생육저지 효과]

식물 병원균으로는 식물에 가장 피해를 많이 주는 병원균인 입고병균(Fusarium sp., Pythium sp., Rhizoctonia sp.), 고추역병균(Phytopgtora capsici), 사과나무 부란병균(Valsamali) 및 벼 백엽고병균(Xanthmonas campestris pv. oryzae)의 6종을 사용한다. 배지는 실시예 1과 동일한 배지를 사용한다.

식물 병원균 및 길항 미생물이 동시에 생육될 수 있는 상술한 배지를 녹인 후 50℃의 배지에 각 병원균의 균사, 세포, 포자를 혼합 평판(Plating method)하고, 배지가 완전히 굳은 다음 길항 미생물을 배양한 액체 배양액에 페이퍼 디스크(직경 8㎜)를 묻은 후 병원균이 혼합된 샤레에 올려놓고 각종 병원균의 생육이 잘되는 적정 온도에서 3~4일 배양한다. 길항 미생물이 각종 병원균 생육에 미치는 영향을 저지원의 직경으로 조사한다. 결과는 표 2에 나타낸다.

[표 2]

표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 길항 미생물 AC-1(KCTC 833OP)균주와 식물 병원균과의 실내길항효과 검정결과, 본 발명의 길항 미생물은 모든 작물에 대한 묘시들음병(입고병)의 원인이 되는 푸사리움(Fusarium), 피티움(Pythium) 및 리조크토니아(Rhizoctonia)균에 대하여 생육저지 효과를 나타내어 균사 생육 억제 현상이 높았으며, 사과나무에 치명적인 부란균병에 대해서도 억제 효과를 나타내었다. 특히 농약에 의한 약제 방제가 곤란하였던 고추 재배지에서 가장 치명적인 역병의 병원균에 대해서도 우수한 생육 억제효과를 나타내었다. 그러나 식물병원세균에 의한 벼 백엽고병균에 대해서는 생육 억제 효과를 나타내지 않았다.

[실시예 3]

[배지의 산도(pH)와 균생육 특징]

배지는 실시예 1과 동일한 배지를 사용한다.

500㎖ 플라스크에 최저 3.5에서 최고 8.5까지 0.5 단위씩 11단계의 산도를 조절한 배지 각각 100㎖씩을 분주한다. 3일간 배양된 사면 시험관으로부터 살균수로 희석한 원균을 1㎖(1.4×10 ⁶ 세포/㎖)씩 접종한 후, 30℃로 조정된 진탕 배양기내에서 회전수 150rpm으로 48시간 동안 배양한다. pH 별로 각각 1㎖씩 취하여 희석법(dilution method)으로 샤레에 평판하고, 24시간 후 집락수를 관찰하여 pH 별균 배양관계를 조사한다. 결과는 표 3에 나타낸다.

[표 3]

표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 세균은 산도(pH)와 균 증식간에 매우 높은 관계를 갖고 있다. 보통 세균의 증식시에는 대체로 최적 산도(pH)가 한곳뿐인데 반하여 본 발명의 세균은 산성인 pH5.0과 중성인 pH7.0에서 균증식이 높아 일반세균증식과는 다른 양상을 나타내고 있다.

이와같은 특성중에서 산성 조건에서도 균증식 및 생육이 양호하다고 하는 것은 우리나라 밭토양의 64.2%가 pH 5.1~6.0의 산성토양이기 때문에 토양내에서의 균생존 가능과 정착 조건이 좋다는 것을 의미한다. 따라서 그만큼 본 발명의 길항 미생물의 이용 가능성이 높다는 것으르 시사한다.

[실시예 4]

[온실내 고추역병 방제 효과]

폿트(16.5×7.8×7.5㎝)에 고추묘를 육모한후, 고추묘가 5~6엽기때, 감자 반합성 배지로 30℃에서 3일간 배양된 길항 미생물인 AC-1균주를 살균수로 10배 희석한 균농도(5.2×10 ⁷ 세로/㎖)로 폿트당 60㎖ 관주 처리하고 3일 후에 고추역병균의 농도(유주자낭, 5×10 ⁴ /㎖)를 60㎖ 관주하여 길항 미생물 처리 폿트와 길항 미생물 무처리 폿트내의 고추역병 발병 상태를 발병주율로 관찰한다. 발병조사는 3폿트의 발병율조사로 한 폿트당 3주씩이었으며 결과는 표 4에 나타낸다.

[표 4]

표 4에서와 볼 수 있는 바와 같이, 고추역병균에 대한 길항 미생물인 AC-1(KCTC 833OP) 무처리 폿트에서는 역병균 처리 5일후부터 역병이 발생하기 시작하여 7일후에는 모든 고추묘가 100% 발병율을 보이는데 반해, 길항 미생물 처리 폿트에서는 처리 7일후에 1주가 발병하여 발병율이 11.1%이고, 처리 32일 후에는 발병율이 44.4%로서 발병 억제효과가 뚜렷하게 나타난다. 그러므로 본 발명의 길항 미생물이 온실 내에서 높은 역병균의 농도하에서도 역병 발병을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 5]

[고추역병 발생지 토양에서의 길항 미생물 효과]

고추역병균은 토양전염성 병원균으로서 토양내에 서식하고 있으므로 고추를 계속하여 재배하는 경우 고추역병균의 농도증가에 의해 발병율이 높아지고 있으며, 매년 재배하였던 고추재배지는 자연히 고추역병 상습발생지로 방제에 어려움을 겪고 있는 실정이다. 이 실시예에서는 고추 재배경력이 15년이고, 매년 고추역병의 피해를 받고 있는 토양에서 실험하였다.

플라스틱 사각밧트(48×38×15㎝)에 고추역병 상습지 토양을 10㎏씩 평량하여 채우고, 5엽기의 고추묘를 16주 이식하여 묘가 정착된 7일후(7엽기)에, 길항 미생물 AC-1 균주를 희석한 균 농도로 조정(1.7×10 ⁷ 세포/㎖)하여 폿트당 300㎖를 고추묘 주위에 골고루 관주한다. 또한 고추역병 방제농약으로 고시되어 있는 메타실동을 1000배 농도로 300㎖ 1회 관주처리한다. 무처리구에서는 길항 미생물 또는 방제농약의 살포없이 고추묘만 이식하고 재배방법은 동일하게 수행하여 상기의 길항 미생물 또는 메타실동 처리구와 비교한다. 이 시험은 온실내에서 실시한다. 결과는 표 5에 나타냈다.

[표 5]

표 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 무처리구에서는 10일후부터 고추역병의 발병을 보이기 시작하여 24일 후에는 이식된 주의 전체의 반이 넘은 56.3%의 발병주율을 나타내었으나 길항 미생물 AC-1(KCTC 833OP) 처리구에서는 10일, 17일, 24일 후까지 전혀 고추역병이 발병하지 않았으며, 메타실동 처리구에서는 처리 24일 후에 초기 발병을 나타내었다. 또한 길항 미생물 AC-1(KCTC 833OP) 처리구에서는 처리 37일 후에 단지 6.3%의 발병율을 나타내므로써 방제전문약제인 메타실동 처리효과보다도 방제효과가 높거나 동일하였다. 따라서, 본 발명의 길항 미생물인 고추역병균이 많이 분포하고 있는 상습 토양지에서도 고추역병을 효과적으로 방제할 수 있다는 것을 알 수 있다.

[실시예 6]

[고추재배단지(시설재배지)에서의 길항 미생물 AC-1(KCTC 833OP) 균주 처리에 의한 고추역병 방제 실증시험]

비닐하우스 재배에 의한 고추재배단지는 많이 형성되어 있으나 이중에서도 경상남도 창녕군 남지읍은 우리나라에서도 재배경력이 많고 재배면적도 넓어 고추시설 단지중에서 선진지역으로 알려진 곳이다.

이곳에서의 고추 재배시 병충해로서 가장 문제시 되고 있는 것은 역시 고추역병에 의한 피해가 제일이며, 재배년수가 오랜 곳일수록 발병률이 높아 적은 곳에서는 2~3%, 많은 곳에서는 40~50%의 발병주율을 나타내고 있다. 따라서 이는 비닐하우스에서도 발병이 문제되고 있으며 실제 뚜렷한 방제법이 없는 실정이다.

이 실시예에서는 경상남도 창녕군 남지읍 김정건씨의 경작지에서 실험한 길항 미생물의 고추역병 방제시험을 설명하고자 한다.

시설하우스의 면적은 150평(495㎠)이고, 겨울동안의 보온은 연탄난로에 의존하며, 일몰전 기온의 급강하를 막기 위해 짚으로 엮은 발을 덮어주고 있었다. 재배기간은 비닐하우스 등에 따라 차이가 있으나, 겨울재배는 1월부터 7월까지이며 그후에는 다른 작물을 재배하고 있다.

이 시험에 이용된 비닐하우스내의 고추품종은 “청원”으로 1987년 1월 10일 정식하였고, 주당 재식거리는 40×45×80㎝이며, 구당 면적은 10.5㎠(3.18평)로 구당 재식주수는 43~46주(구내로 난로 설치 관계)이었다.

각 시험구간에는 썬라이트로 토양내 30㎝ 깊이로 차단 설치하고, 길항 미생물 처리구, 방제농약으로 알려진 메타실동 처리구 및 무처리구로서 임의 난괴법 3반복으로 설치하였다.

길항 미생물 AC-1(KCTC 833OP) 균주 처리는 정식후 34일부터 주당 일주일 간격으로 3회 관주 처리하며, 길항 미생물 접종 농도는 6.4×10 ⁷ 세포/450㎖(1회시:3.6×10 ⁶ 세포/150㎖, 2회시:1.7×10 ⁷ 세포/150㎖, 3회시:1.7×10 ⁸ 세포/150㎖)이었다. 메타실동 처리는 주당 1500배액 100㎖를 1회 관주처리 하였다.

시험구에서는 균주 처리시 초발을 보였으나, AC-1(KCTC 833OP) 균주 처리 3회 처리후부터의 발병주를 처리후 15일,25일,40일,55일간 조사하였으며, 각 시험구간의 발병주율로 방제효과를 검토하였다. 결과는 표 6에 나타낸다.

[표 6]

표 6의 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 처리 15일 후의 발병율은 길항 미생물 AC-1(KCTC 833OP) 균주 처리구에서는 3.8%, 방제약인 메타실동 처리구에서는 3.1%이었으나, 무처리구에서는 7.8%로 균주처리구 및 메타실동 처리구보다 높은 경향이다.

처리 25일 후에는 무처리 11.4%에 비해 균주처리와 약제 처리에서 각각 3.8% 및 3.9%로 발병억제효과를 나타내었으며, 방제약제와 균주의 효과는 비슷하였다.

그러나, 처리 40일 및 55일 후부터는 메타실동 처리구가 8.6% 및 19.6%인데 반해 길항 미생물 처리구에서는 6.8% 및 10.6%로서 고추역병 방제 농약인 메타실동의 방제효과 보다도 우수한 효과를 나타내었다.

[실시예 7]

[길항 미생물 AC-1(KCTC 833OP)의 대량 배양배지 개발]

감자 300g을 끓인 증류수 1ℓ에 넣고 서당(sucrose) 15g, 옥수수 침지액 8㎖, 질산칼슘(Ca(NO ₃ ) ₂ ·4H ₂ O) 0.5g, 인산나트륨(Na ₂ HPO ₄ ·12H ₂ O) 2g을 섞은 후 pH를 7.3으로 조절하여 배지를 제조한다.

삼각 플라스크 배양은 300㎖ 플라스크에 상기의 배지 100㎖를 넣고, 회전시 진탕배양기내 28℃, 150rpm에서 배양한다.

발효기(Biostat ^R E,20ℓ용) 배양은 상기의 배지 10ℓ를 배양온도 28℃, pH 7.3, PO ₂ 50%, 250rpm에서 배양한다.

배양경화후 12,24,36,48,72,96 시간별로 배양액 1㎖를 취하여 연속 희석법으로 상기 배지 샤레에 평판하고, 24시간 집락수를 조사하여 균증식량을 조사한다. 결과는 표 7에 나타낸다.

[표 7]

표 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 사용된 배지는 배양 24시간 후에도 2.5×10 ⁹ 세포/㎖까지 증식시킬 수 있으므로, 가격이 저렴하고 우수한 산업용 배지이다.