技术领域
[0001] 本
发明属于代谢组学研究技术领域，具体涉及一种基于UPLC-QTOF-MS对富硒烟叶的代谢组学研究的方法。
背景技术
[0002] 众所周知，细胞的生命活动是由许多基因、
蛋白质和小分子
代谢物共同作用的，核酸、蛋白质等主要功能的变化最终都反映在代谢
水平上，如神经递质、
激素调节的变化，受体的作用效应、细胞
信号的释放、
能量的传递以及细胞间的通讯，因此代谢组是基因调控网络和蛋白质作用网络的末端，它能够更准确的反映生命体系的状态，提供
生物的终端信息。正如妇产科教授比尔·拉斯利(Billy David)所说，基因组学和蛋白质组学告诉你可能会发生什么，代谢组学告诉你发生了什么。
[0003] 代谢组学(Metabonomics/Metabolomics)是20世纪90年代末期继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一
门新兴学科，是研究关于生物体被扰动后(如基因的改变或环境变化后)其代谢产物(内源性代谢物质)种类、数量及其变化规律的科学。代谢组学是系统生物学的重要一部分，研究对象大都是相对分子
质量1000以内的小分子物质，而且它还关注内源性代谢物在整个生物体、器官或组织中的代谢途径以及内部或外部因素的影响以及随时间变化的规律性。代代谢组学通过揭示内外因素影响代谢整体的变化，在一定的病理生理过程中反映出一系列生物事件。代谢组学可以在特定的生理周期或条件下对生物体或细胞的所有代谢产物进行定性和定量分析，以找出目标差异代谢物。它通常用于早期诊断、药物靶点发现、
疾病机制研究和疾病诊断。
[0004]
核磁共振NMR、气相色谱-质谱联用GC-MS、液相色谱-质谱联用LC-MS、毛细管
电泳-质谱联用CE-MS等技术已经广泛用于代谢组学研究。这些技术中的每一种都有各自的优点和缺点。LC-MS具有较高的检测动态范围，特别是对于复杂的混合物。但是，基于LC-MS的代谢组学存在分离效率低、分析时间长的缺点。GC-MS主要用于挥发性代谢物的分析，与非挥发性或热不稳定的代谢物不兼容。CE具有分析时间短、峰效率高、化合物不需挥发等优点，妨碍CE-MS广泛应用的不利因素是绝对迁移时间的重现性相对较差。NMR不仅简化了样品制备，而且减少了分析所需的时间，但核磁共振波谱仪的检出限和灵敏度是有限的。目前，超高效液相四级杆
串联飞行时间质谱联用仪(UPLC-QTOF-MS)技术似乎是最流行的技术。UPLC-QTOF-MS检测灵敏度高，分析时间短，重现性好，可同时准确分析代谢物，是代谢组学研究的最佳候选之一。
[0005] 硒是人体和动物所必需的微量元素。缺乏硒会导致人体免疫
力以及抗衰老能力下降，
机体表现出未老先衰，严重时会引发许多疾病，比如克山病、大骨节病、癌症等。体内过量的硒会产生不适症状，甚至造成机体中毒。鉴于硒对人体健康的影响至深，适当补充硒元素，对抗
氧化、防癌抗癌，提高机体免疫力等有重要作用。通过
植物吸收硒、再以饮食方式进行补硒是一种最理想的途径。
[0006] 适量的硒能够促进
农作物的生长，提高农作物的品质，增强农作物的抗氧化能力，增强农作物对重金属毒害的抵抗力等。硒除了促进
烟草生长之外，最重要的是能够提高烤烟品质，减轻吸烟对人体产生的危害，同时起到一点人体补硒作用，极大提高烟草的安全性。研究表明，硒含量的提高可以减少
卷烟中焦油的含量和自由基的浓度。
[0007] 吸烟有害健康，但是吸烟确是人类的一大嗜好。硒作为人体必需的微量元素之一，王美珠等人有研究发现：富硒香烟里硒的含量对烟焦油含量和自由基浓度有很大的影响。代谢组学主要研究内源性有机小分子在基因组、转录组、蛋白组等综合因素作用下的变化。
内源性有机小分子种类多、结构信息复杂，还涉及到许多的代谢通路，在鉴定与分析上非常的困难，故需要相对全面的进行检测。目前，代谢组学主要通过运用大型仪器进行数据的采集，例如核磁共振、气相色谱-质谱联用仪和液相色谱-质谱联用仪等。不论是基于核磁共振还是气相色谱-质谱联用仪，或是液相色谱-质谱联用仪的代谢组学，它所产生的多变量数据最常用的处理和评价方法为借助一些处理代谢组学数据的
软件进行主成分分析以及
正交偏最小二乘分析。
发明内容
[0008] 本发明提供一种基于UPLC-QTOF-MS对富硒烟叶的代谢组学研究的方法，以解决基于UPLC-QTOF-MS对富硒烟叶的代谢组学研究存在的问题。
[0009] 为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0010] 一种基于UPLC-QTOF-MS对富硒烟叶的代谢组学研究的方法，包括以下步骤：
[0011] 步骤一：烤烟试验材料的设计
[0012] 烤烟试验采取随机区组试验设计，分别设置对照组、
根际施肥组和叶面喷施组，其中叶面喷施组又分为两个实验组，每个组使用的硒营养剂含量不同，试验总共分为4个处理，每个处理小区面积一样，种植前，对供试
土壤的理化性质进行检测；
[0013] 步骤二：烤烟样品采集及制备
[0014] 样品采集：烟叶成熟后分小区按照S型路线多点采取组成平均样品，先用
自来水再用去离子水清洗样品，迅速干燥后
马上进行
烘烤，烘烤措施按照标准化生产技术要求执行，烘烤结束后，装入密封袋保存于干燥的环境中；
[0015] 样品制备：将烤烟用植物
粉碎机粉碎，装入密封袋留存；
[0016] 步骤三：供试样品溶液的制备
[0017] 精密称取粉碎的烤烟0.09g置于10mL带盖离心管中，加入5mL80％的甲醇-水，加盖漩涡混匀30s，超声提取30min，在4000r/min下室温离心10min，取上层清液，过0.22μm有机滤膜，等待上机；
[0018] 步骤四：仪器条件设置
[0019] (1)色谱条件
[0020] 色谱柱：WatersACQUITY BEH C18柱；流动相：A相：0.1％
甲酸水；B相：甲醇，设置色谱分离梯度洗脱程序；柱温：35℃；进样体积：2μL；
[0021] (2)质谱条件
[0022] 四级杆飞行时间质谱，采用电喷雾离子源，各参数设置分别为：扫描模式：正离子扫描；质量扫描范围：低能量：50-1200Da，高能量：100-1200Da；雾化气：氮气；碰撞气：氩气；毛细管
电压：3.00KV；锥孔电压：40V；源偏移电压：80V；离子源
温度：100℃；脱
溶剂气体温度：50℃；锥孔气体流量：50L/h；脱溶剂气体流速：50L/h；碰撞能量:低能量：关，高能：20V；
校正液：亮
氨酸脑啡肽，正离子：m/z 556.2771；
[0023] 步骤五：样品测定
[0024] 将四个组的烤烟样品分别按照处理方法制备待测样品溶液，按照步骤四的色谱条件和质谱条件进行测定，每组6个样本，每个样本进样一次，进样量为2μL；
[0026] 使用Waters公司Progenesis QI软件进行色谱峰自动识别提取与峰匹配，将数据结果导入EZinfo.，进行非监督主成分分析(PCA)以及正交偏最小二乘法辨别分析。
[0027] 进一步地，步骤一中所述烤烟的品种为
云烟87。
[0028] 进一步地，步骤一中所述对照组处理为未施用硒肥。
[0029] 进一步地，步骤一中所根际施肥组处理为施用
生物质碳掺杂壳聚糖纳米硒。
[0030] 更进一步地，施用生物质碳掺杂壳聚糖纳米硒量为10kg/亩。
[0031] 进一步地，步骤一中所述叶面喷施组处理为施用氨基酸纳米硒。
[0032] 更进一步地，施用氨基酸纳米硒的量为150mL/亩·次及施用氨基酸纳米硒的量为300mL/亩·次。
[0033] 进一步地，步骤一中所述每个处理小区面积为55.56m2。
[0034] 进一步地，步骤二中所述标准为GB/T 23219-2008标准。
[0035] 进一步地，步骤三中超声提取的功率为100w。
[0036] 本发明具有以下有益效果：
[0037] 我国是世界第一烟草大国，人民生活水平在提高的同时，高品质烟草的生产受到了全社会的重视。许多研究都表明硒在提高烤烟品质及安全性中有积极影响。本发明利用代谢组学研究硒的不同施肥方式及不同的硒浓度(根际施硒与叶面施硒)对烟草的影响，为硒在烟草生产中的科学施肥方式提供参考依据。
附图说明
[0038] 图1为对照组、根际施肥组以及叶面喷施组低能量总离子流图(A/B/C/D)；
[0039] 图2为对照组、根际施肥组以及叶面喷施组高能量总离子流图(E/F/G/H)；
[0040] 图3为得分图，其中，1代表对照组，2代表根际施肥组，3代表叶面喷施组(150mL亩·次)，4代表叶面喷施组(300mL/亩·次)，5代表质控样组，6代表空白组；
[0041] 图4为三维score图，其中，1代表对照组，2代表根际施肥组，3代表叶面喷施组(150mL亩·次)，4代表叶面喷施组(300mL/亩·次)，5代表质控样组，6代表空白组；
[0042] 图5为对照组与根际施肥组的OPLS-DA图，其中，1代表对照组，2代表根际施肥组；
[0043] 图6为对照组与根际施肥组的S-Plot图；
[0044] 图7为对照组与叶面喷施组(150mL/亩·次)的OPLS-DA图，其中，1代表对照组，3代表叶面喷施组；
[0045] 图8为对照组与叶面喷施组(150mL/亩·次)的S-Plot图；
[0046] 图9为对照组与叶面喷施组(300mL/亩·次)的OPLS-DA图，其中，1代表对照组，4代表叶面喷施组；
[0047] 图10为根际施肥组与叶面喷施组(300mL/亩·次)的S-Plot图；
[0048] 图11为根际施肥组与叶面喷施组(150mL/亩·次)的OPLS-DA图，其中，2代表根际施肥组，3代表叶面喷施组；
[0049] 图12为根际施肥组与叶面喷施组(150mL/亩·次)的S-Plot图；
[0050] 图13为根际施肥组与叶面喷施组(300mL/亩·次)的OPLS-DA图，其中，2代表根际施肥组，4代表叶面喷施组；
[0051] 图14为根际施肥组与叶面喷施组(300mL/亩·次)的S-Plot图；
[0052] 图15为叶面喷施组(150mL/亩·次)与叶面喷施组(300mL/亩·次)的OPLS-DA图，其中，3代表根际施肥组，4代表叶面喷施组；
[0053] 图16为叶面喷施组(150mL/亩·次)与叶面喷施组(300mL/亩·次)的S-Plot图。
具体实施方式
[0054] 1.1实验材料
[0056] 仪器：超高效液相色谱仪，Waters ACQUITY UPLC I-Class；四级杆飞行时间质谱仪， G2-XS QTof；
超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司，SB25-120；
电子分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司，BP121S。
[0057] 试剂：甲醇、乙腈(色谱纯，Fisher公司)；甲酸(色谱纯，Sigma公司)；亮氨酸-脑啡肽(Waters公司)；超纯水，Milli-Q公司超纯水仪制备。
[0058] 1.1.2烤烟试验材料
[0059] 1.1.2.1烤烟试验材料的设计
[0060] 烤烟不同施硒方式试验是在富川县朝东镇东水村的大田进行，试验时间2017年2月至2017年9月。烤烟品种为云烟87。
[0061] 试验采取随机区组试验设计，分别设置对照组、根际施用纳米硒营养剂以及叶面喷施纳米硒营养剂试验(见表1)。试验分为4个处理，每个处理小区面积：55.56m2，种植前，对供试土壤的理化性质进行检测，检测值见表2。
[0062] 表1烤烟材料实验方法设计
[0063]处理 纳米硒营养剂 备注
Nx1 未施用硒肥 对照组
Nx2 生物质碳掺杂壳聚糖纳米硒(10kg/亩) 根际施肥组
Nxy2 氨基酸纳米硒(150mL/亩·次) 叶面喷施组
Nxy3 氨基酸纳米硒(300mL/亩·次) 叶面喷施组
[0064] (硒浓度的设计说明：要求根际施硒与叶面喷施硒的最终效果是使烤烟中的硒含量处于同一水平；叶面喷施组施硒的最终效果是使烤烟中的硒含量处于不同的水平。)[0065] 表2供试土壤的理化性质指标
[0066]
[0067] 1.1.2.2烤烟样品采集及制备
[0068] 样品采集：烟叶成熟后分小区按照S型路线多点采取组成平均样品，先用自来水再用去离子水清洗样品，迅速干燥后马上进行烘烤，烘烤措施按照GB/T23219-2008标准化生产技术要求执行，烘烤结束后，装入密封袋保存于干燥的环境中。
[0069] 样品制备：将烤烟用植物粉碎机粉碎，装入密封袋留存。
[0070] 1.2实验方法
[0071] 1.2.1供试样品溶液的制备
[0072] 精密称取粉碎的烤烟0.09g(精确到0.0001g)置于10mL带盖离心管中，加入5mL80％的甲醇-水，加盖漩涡混匀30s，超声提取30min,4000r/min室温离心10min，取上层清液，过0.22μm有机滤膜，等待上机。
[0073] 1.2.2色谱条件
[0074] 色谱柱：WatersACQUITY BEH C18柱(50mm×2.1mm，0.17μm)；流动相：A相：0.1％甲酸水；B相：甲醇，色谱分离梯度洗脱程序见表3；柱温：35℃；进样体积：2μL。
[0075] 表3色谱分离梯度洗脱程序
[0076]
[0077] 1.2.3质谱条件
[0078] 四级杆飞行时间质谱，采用电喷雾离子(ESI)源，各参数设置分别为：扫描模式：MSE Centroid，正离子扫描；质量扫描范围：低能量：50-1200Da，高能量：100-1200Da；雾化气：氮气(N2，PEAKNM32LA氮气发生器)；碰撞气：氩气(Ar，纯度99.999％)；毛细管电压(Capillary Voltage)：3.00KV；锥孔电压(SamplingCone Voltage)：40V；源偏移电压(Source Offset Voltage)：80V；离子源温度(Source Temperature)：100℃；脱溶剂气体温度(Desolvation Temperature)：50℃；锥孔气体流量(Cone Gas Flow)：50L/h；脱溶剂气体流速(Desolvation Gas Flow)：50L/h；碰撞能量(CE):低能量：关，高能：20V；校正液(LockMass)：亮氨酸脑啡肽，正离子：m/z 556.2771。
[0079] 1.2.4样品测定
[0080] 将三个组的烤烟样品分别按照处理方法制备待测样品溶液，按照“1.2.2色谱条件”和“1.2.3质谱条件”进行测定，每组6个样本，每个样本进样一次，进样量为2μL。
[0081] 1.2.5代谢组学数据处理方法
[0082] 使用Waters公司Progenesis QI软件进行色谱峰自动识别提取与峰匹配，将数据结果导入EZinfo.，进行非监督主成分分析(PCA)以及正交偏最小二乘法辨别分析(OPLS-DA)。
[0083] 1.3结果与讨论
[0084] 1.3.1UPLC-QTOF-MS分析方法的建立
[0085] 3.3.1.1色谱条件的选择与优化
[0086] 色谱柱的选择：Waters公司超高效液相色谱柱ACQUITY BEH C18(50mm×2.1mm，0.17μm)能够耐受超高的压力(0-15000psi)，而且它采用亚乙基桥杂化颗粒，使得其具有非常宽的pH使用范围：1-12，在方法开发上更加快速简便，所以选择该色谱柱作为最佳的分析柱子。
[0087] 流动相的优化体系的优化：分别采用甲醇-0.1％甲酸-水、乙腈-0.1％甲酸-水进行系统进样，经过多次实验，选择甲醇-0.1％甲酸-水作为流动相体系，紧接着进行流动相梯度洗脱程序的优化，使得总离子流图最可能的反映出烤烟样品的化学成分，最终优化得到的梯度洗脱程序见表3。
[0088] 1.3.1.2质谱条件的选择与优化
[0089] QTOF-MS的采集模式可选择MS、MSE两种模式，MS模式只能得到单纯的一级质谱图，MSE模式既能采集到一级质谱图，也能得到二级质谱图，综合考虑，选择MSE模式作为采集的模式。代谢组学的数据要求能广泛的获得化合物的信息，故质谱条件的优化主要是通过仪器的校准，使得仪器处于最优条件。经过优化，最终确定的质谱条件见“1.2.3质谱条件”。
[0090] 1.3.2UPLC/Q-TOF MS图谱分析
[0091] 1.3.2.1UPLC/Q-TOF MS总离子流图对比
[0092] 通过UPLC/Q-TOF MS分别获得对照组、根际施用纳米硒营养剂以及叶面喷施纳米硒营养剂的烤烟的正负离子总离子流图，如图1、2所示。从图中可以叫较直观的观察到对照组、根际施用纳米硒营养剂以及叶面喷施纳米硒营养剂的烤烟样本之间有一些差别。四组样本的峰形和峰强度也存在差异。总之，从直观上能看到四组烤烟样本之间的差异，但是这种差异同样会在同一组间的不同样本之间也会存在，为了获得更准确的代谢差异，需要进行进一步的数据处理。
[0093] 1.3.2.2统计结果
[0094] 四组烤烟的色谱-质谱联用数据运用Waters公司Progenesis QI软件以及EZinfo.统计软件进行处理和分析。首先利用非监督的主成分分析方法(PCA)对对照组、根际施用纳米硒营养剂以及叶面喷施纳米硒营养剂的四组烤烟进行分析，得到正负离子得分图如图3以及三维score图如图4。由图中可以看出，对照组与根际施用纳米硒营养剂的烤烟，对照组与叶面喷施纳米硒营养剂的烤烟还是叶面喷施不同量的纳米硒营养剂均存在一定的分离趋势，说明四组烤烟样本在物质组上有一定的区别。
[0095] 主成分分析(PCA)作为无监督的分析方法，能同时反映了组内和组间的差异，即把数据的原始状态反映出来，但是主成分分析(PCA)的分析方法不能更好的反映出组间代谢物的差异，所以为了突出组间代谢差异的物质，方便寻找代谢差异物，本研究接着运用了有监督的正交偏最小二乘法(OPLS-DA)对组与组间的数据进行分析。
[0096] 运用正交偏最小二乘法(OPLS-DA)处理对照组与根际施肥组得到OPLS-DA图和S-plot图分别为图5和图6；处理对照组与叶面喷施组(150mL/亩·次)得到OPLS-DA图和S-plot图分别为图7和图8；处理对照组与叶面喷施组(300mL/亩·次)得到OPLS-DA图和S-plot图分别为图9和图10；处理根际施肥组与叶面喷施组(150mL/亩·次)得到OPLS-DA图和S-plot图分别为图11和图12；处理根际施肥组与叶面喷施组(300mL/亩·次)得到OPLS-DA图和S-plot图分别为图13和图14；处理叶面喷施组(150mL/亩·次)与叶面喷施组(300mL/亩·次)得到OPLS-DA图和S-plot图分别为图15和图16。由图中可知对照组与根际施肥组、对照组与叶面喷施组、根际施肥组与叶面喷施组以及不同硒含量的叶面喷施组的OPLS-DA模型都有较好的区分。基于组与组间的S-plot图，寻找它们之间的差异代谢物，通过搜索Chemspider
数据库与一级、二级质谱比对，鉴定得到差异代谢物的相关信息如表4。鉴定出来的这些差异代谢物主要与烟草的生长及品质有着密切的关系，综合来看叶面喷施组(300mL/亩·次)烟叶生长较好而且获得的富硒烤烟品质较好。
[0097] 表4代谢物的相关信息
[0098]
[0099]
[0100] 尽管已经描述和叙述了被看作本发明的示范
实施例，本领域技术人员将会明白，可以对其作出各种改变和替换，而不会脱离本发明的精神。另外，可以做出许多
修改以将特定情况适配到本发明的教义，而不会脱离在此描述的本发明中心概念。所以，本发明不受限于在此披露的特定实施例，但本发明可能还包括属于本发明范围的所有实施例及其等同物。
