水稻控制通气组织形成的关键基因OsLSD1.1在减少甲烷排放上的应用
阅读：628发布：2020-05-12
专利汇可以提供水稻控制通气组织形成的关键基因OsLSD1.1在减少甲烷排放上的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了 水 稻控制通气组织形成的关键基因OsLSD1.1在减少甲烷排放上的应用。与对照野生型相比，突变体株系株高变矮，分蘖增多，且有 叶片 发黄的性状。突变体株系与野生型相比具有减少甲烷排放的作用，且检测 根际 土壤 微 生物 发现产甲烷减少，甲烷 氧 化菌增多。其根系的 树脂 切片结果也显示出，突变体株系的通气组织形成与野生型相比也受到抑制，这在一定程度上抑制了稻田甲烷的排放。，下面是水稻控制通气组织形成的关键基因OsLSD1.1在减少甲烷排放上的应用专利的具体信息内容。
水稻控制通气组织形成的关键基因OsLSD1.1在减少甲烷排放
上的应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，涉及水稻控制通气组织形成的关键基因OsLSD1.1在减少甲烷排放上的应用。
背景技术
[0002] 自工业革命以来，人类活动导致大气中的甲烷、氧化亚氮和二氧化碳等温室气体排放量剧增。这些温室气体的大量排放导致全球气温上升，给人类生活和生态环境带来严重影响。甲烷是主要的温室气体之一(王晓萌等，2018)。截止到2012年，大气中甲烷气体浓度是工业化之前的1.2倍(Forster P et al,2007)。在100年内，甲烷的增温潜势是二氧化碳的25倍(WMO.Greenhouse gas bulletin,2013)。
[0003] 稻田被认为是主要的温室气体排放源之一。IPCC第4次评估结果显示，农业源释放的温室气体总量占全球温室气体总量的14％，而我国农业源释放的温室气体总量占中国温室气体的比例却超过了17％(蔡松锋等，2011)。中国是主要的农业生产大国之一，其中中国水稻种植面积占世界水稻种植面积的27％(邵美红等，2011)。随着中国人口的增加和土地耕作面积的不断减少，在有限的耕作面积下，需要提高水稻的产量，但同时也会导致更多的温室气体排放。另外，氮肥的大量施用，在提高水稻产量的同时也会使甲烷的排放量激增，引起一系列环境效应。
[0004] 通气组织(aerenchyma)是植物薄壁组织内一些气室或空腔的集合。许多水生和湿生植物在根茎内均形成通气组织，其它一些植物在缺氧环境中也分化产生或加速通气组织的发育(Watkin et al，1998)。植物体中，通气组织的基本功能是为植物提供体内的氧气运输通道，并且增强氧在体内的扩散，维持细胞组织中适宜的氧浓度。通气组织同样有利于氧从地上部到根尖的长距离运输，以确保植物正常的进行生理代谢功能(孔妤等，2008)。由通气组织分泌到根系的氧气，可以调节根际氧化还原势，缓解还原性物质对植物的毒害，改变根系微环境。利用通气组织可以将一些有害的代谢废气如甲烷、氧化亚氮等排出体外(孔妤等，2008)。另外有研究表明，通气组织参与了稻田温室气体排放到大气中的过程，是稻田温室气体排放的一条重要途径(Lai,2009)。
[0005] 目前关于通气组织相关基因的报道已有许多。拟南芥中参与调控通气组织形成的基因分别是上游基因AtLSD1.1和两个下有基因AtEDS1、AtPAD4，拟南芥响应环境的变化后自身代谢随之发生改变，这会影响基因AtLSD1.1的表达，它通过负调控下游AtEDS1和AtPAD4基因表达来参与乙烯及活性氧代谢途径，间接的影响植物叶片非程序性死亡(RCD)和根系的细胞程序性死亡(PCD)，由此来调控叶片和根系通气组织的形成(Muehlenbock et al.,2007)。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供水稻通气组织形成关键基因OsLSD1.1突变体株系在减少通气组织形成、降低甲烷排放、减少产甲烷菌(mcrA)增加甲烷氧化菌(pmoA)上的应用。
[0007] 水稻控制通气组织形成的关键基因OsLSD1.1在调控根系通气组织发育和减少甲烷排放上的应用。所述的OsLSD1.1基因在RAP-DB数据库中的编号为Os08g0159500。
[0008] 所述的植物优选为单子叶植物。
[0009] 所述的植物进一步优选水稻。
[0010] OsLSD1.1的突变体株系在减少水稻根际土壤产甲烷菌含量，增加甲烷氧化菌含量方面的应用。
[0011] 本发明的有益效果：
[0012] 1、本发明通过系统研究，首次发现了敲除OsLSD1.1基因的水稻通气组织形成关键基因OsLSD1.1突变体株系与野生型相比，甲烷排放减少了30％左右(图1)。
[0013] 2、OsLSD1.1突变体株系与野生型相比，通气组织形成明显受到抑制(图2)。
[0014] 3、OsLSD1.1突变体株系与野生型相比，根际土壤中产甲烷菌(mcrA)减少，甲烷氧化菌(pmoA)增多(图3-4)。
[0016] 图1 OsLSD1.1突变体株系与野生型的甲烷排放特征。
[0017] 图2 OsLSD1.1突变体株系与野生型的的通气组织发育状况。
[0018] A OsLSD1.1突变体株系与野生型根部通气组织发育情况(中氮控水)[0019] B OsLSD1.1突变体株系与野生型根部通气组织发育情况(中氮淹水)[0020] 图3 OsLSD1.1突变体株系与野生型的产甲烷菌(mcrA)定量结果。
[0021] 图4 OsLSD1.1突变体株系与野生型的甲烷氧化菌(pmoA)的定量结果。
[0022] 图5 OsLSD1.1突变体株系的鉴定
[0023] A：两轮PCR筛选鉴定突变体纯合体；B：TOS17插入位点；C：Real-time PCR检测基因OsLSD1.1敲除效果。(野生型N-WT与突变体m12比较，不同字母表示差异显著P＜5﹪)具体实施方式
[0024] 实施例1基因OsLSD1.1日本晴背景突变体材料的鉴定
[0025] 将突变体库中购买的TOS17插入的日本晴oslsd1.1突变体1个株系的所有种子MS发苗后提取DNA，经两轮PCR扩增鉴定筛选得到纯合突变体株系，编号为m12(如图5A)，将两轮PCR产物进行测序，根据测序结果对比基因OsLSD1.1序列分析，可知TOS17片段反向插入在OsLSD1.1基因片段第二个外显子位置(图5B)，与网站给出的突变体信息一致。鉴定为纯和体的株系进行基因OsLSD1.1定量表达检测，结果显示纯合突变体株系中基因OsLSD1.1表达显著下调(图5C)，基因敲除效果显著。
[0026] 实施例2田间原位测定甲烷气体排放通量
[0027] 在采样当天，将采气装置套于植株上方，密封好采气底座。每隔5分钟采集一次气体，共采集三次，同时在第二次采气期间，记录温度。田间采气结束后，立即将样品送于实验室，用气相色谱仪进行测定。结果见图1,有图1可见水稻通气组织形成关键基因OsLSD1.1突变体株系与野生型相比，甲烷排放减少了30％左右(图1)。
[0028] 实施例3根系树脂切片的完成
[0029] 1)取材、固定抽气
[0030] 田间现场选择完整，无杂质的根系，用锋利的切割器准确，轻柔的采集根系样品，避免牵拉、挫伤与挤压组织。然后将样品迅速置于固定液中。固定液选取FAA(体积比75℅酒精90ml+冰醋酸5ml+甲醛5ml)。样品带回实验室，用抽气装置进行真空抽气，将细胞里的气体抽出。
[0031] 2)脱水
[0033] 50％，70％浓度的乙醇各脱水1次(30min/次)
[0034] 50％，70％，80％，90％浓度的丙酮各脱水1次(20min/次)
[0035] 95％丙酮脱水1次(30min/次)
[0036] 100％丙酮脱水3次(40min/次)
[0037] 3(V/V丙酮)：1(包埋剂)2h
[0038] 1(V/V丙酮)：1(包埋剂)4h
[0039] 1(V/V丙酮)：3(包埋剂)12h
[0040] 目前常用的包埋剂是环氧树脂(Epon 812环氧树脂)，配方见附注1。
[0041] 附注1：Epon 812环氧树脂包埋剂配方 单位：克
[0042] 注：DMP—30每10滴0.2克
[0043]
[0044]
[0045] 3)浸透
[0046] 纯包埋剂浸透(24h)。浸透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂，这种包埋剂在单体状态时(聚合)为液体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，并经加温后，能聚合成固体，以便进行超薄切片。
[0047] 4)包埋聚合
[0048] 包埋 将样品放入盛有200ul纯包埋剂的包埋板中
[0049] 聚合 将包埋板置于40℃、60℃条件下聚合各(48h)
[0050] 5)修块切片展片
[0051] 修块 将包埋头修成梯形，且样品表面积小于0.2mm×0.2mm。
[0052] 切片 将修好的树脂块用切片机切成小片，用捞样器捞到载玻片上，将每片样分开，避免重叠。
[0053] 展片 将载玻片置于60℃烘片机上烘干、展片，显微镜下观察。
[0054] OsLSD1.1突变体株系与野生型的的通气组织发育状况见图2，,由图2可见：OsLSD1.1突变体株系与野生型相比，通气组织形成明显受到抑制(图2)。
[0055] 实施例4土壤产甲烷菌(mcrA)、甲烷氧化菌(pmoA)Q-PCR鉴定
[0056] 1)土壤DNA的提取
[0057] 称取0.5g根际土于lysing matrix E tube中,加入978ul sodium phosphate buffer,122ul MT buffer,在fastprep仪器中以6.0的速度匀化40秒，14000g,离心15min。将离心后的上清液转移到干净的2ml管中，加入250ul PPS翻转试管10次混合，14000g,离心
5min,将上清液转移至干净的2ml管中。加入1ml binding matrix suspension(使用之前混合均匀)，摇动2min,精置3min,弃上清500ul,将剩余的溶液吹吸均匀，吸600ul于SpinTM Filter中，14000g,离心1min,弃去滤液，将剩余的液体吸到管中，进行相同的操作。待所有液体过滤完毕后，加入500ul SEWS-M(使用前加入无水乙醇100ml)，吹吸重悬，14000g,离心
1min,倒掉滤液，不再加任何液体，14000g,离心4min，弃掉下面的套管，换上1.5ml新管子。
敞口放置5min,散掉乙醇，吸80ul DES(55℃水浴条件下，CDES提前预热5min)均匀润湿DNA,手指轻弹重悬，放置2min，14000g,离心2min,获得土壤DNA,储存于-20℃冰箱。
5min,将上清液转移至干净的2ml管中。加入1ml binding matrix suspension(使用之前混合均匀)，摇动2min,精置3min,弃上清500ul,将剩余的溶液吹吸均匀，吸600ul于SpinTM Filter中，14000g,离心1min,弃去滤液，将剩余的液体吸到管中，进行相同的操作。待所有液体过滤完毕后，加入500ul SEWS-M(使用前加入无水乙醇100ml)，吹吸重悬，14000g,离心
1min,倒掉滤液，不再加任何液体，14000g,离心4min，弃掉下面的套管，换上1.5ml新管子。
敞口放置5min,散掉乙醇，吸80ul DES(55℃水浴条件下，CDES提前预热5min)均匀润湿DNA,手指轻弹重悬，放置2min，14000g,离心2min,获得土壤DNA,储存于-20℃冰箱。
[0058] 2)产甲烷菌(mcrA)、甲烷氧化菌(pmoA)质粒的获得
[0059] 查找相关文献(Xianfang Fan et al,2015 Effects of fertilization on microbial abundance and emissions of greenhouse gases(CH4 and N2O)in rice paddy fields.Ecology and Evolution 2016；6(4):1054–1063),获得相关引物如下：
[0060] mcrA-F:5′-GCMATGCARATHGGWATGTC-3′(SEQ ID NO.1),
[0061] mcrA-R:5′-TGTGTGAASCCKACDCCACC-3′(SEQ ID NO.2),
[0062] pmoA-F:5′-GGNGACTGGGACTTCTGG-3′(SEQ ID NO.3),
[0063] pmoA-R:5′-CCGGMGCAACGTCYTTACC-3′(SEQ ID NO.4).
[0064] 其中，M代表A或C；R代表G或A；H代表A或C或T；W代表A或T；S代表G或C；K代表G或T；D代表代表A或G或T；N代表A或G或C或T，未知，或其他；Y代表T或C。
[0065] 以提取到的土壤DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应程序如下：94℃预变性2min,94℃变性30s,55℃复性30s，72℃延伸7min,30个循环。PCR扩增后，选取条带正确的胶带用OMEGA试剂盒进行胶回收。回收产物进行中间载体构建，构建体系如下：DNA 4.5ul,PMD19-T载体0.5ul,10x T-Vector Buffer 5ul，16℃条件下于酶连仪中过夜。次日将酶连产物转入到DH5a感受态细胞当中，涂布到含有氨苄抗性的LB固体培养基上培养12h,挑取单克隆进行测序，验证正确后，提取相应的质粒。
[0066] 2)产甲烷菌(mcrA)、甲烷氧化菌(pmoA)Q-PCR鉴定
[0067] 梯度稀释产甲烷菌(mcrA)、甲烷氧化菌(pmoA),制作标准曲线。以提取的土壤DNA作为模板，进行产甲烷菌和甲烷氧化菌的拷贝数鉴定。最后鉴定的结果显示OsLSD1.1突变体株系与野生型相比，产甲烷菌减少，甲烷氧化菌增多，最终导致了突变体株系与野生型的甲烷排放差异。OsLSD1.1突变体株系与野生型的产甲烷菌(mcrA)定量结果如图3所示，OsLSD1.1突变体株系与野生型的甲烷氧化菌(pmoA)的定量结果如图4所示，结果可见OsLSD1.1突变体株系与野生型相比，根际土壤中产甲烷菌(mcrA)减少，甲烷氧化菌(pmoA)增多(图3-4)，说明水稻控制通气组织形成的关键基因OsLSD1.1可在调控根系通气组织发育和减少甲烷排放上应用。
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