L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌趋化物质及群游物质中的应用
阅读：559发布：2020-05-08
专利汇可以提供L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌趋化物质及群游物质中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了L-精 氨 酸在作为蜡样芽孢杆菌趋化物质及群游物质中的应用。本发明研究发现蜡样芽孢杆菌能够在L-精氨酸中很好的生长，L-精氨酸能够作为蜡样芽孢杆菌的趋化物质和群游物质；将L-精氨酸和蜡样芽孢杆菌应用于 植物 修复 镉污染 土壤 中时，蜡样芽孢杆菌TH-35能够活化镉污染土壤中的重金属镉，促进超累积植物对土壤中镉的吸收；同时，L-精氨酸能够发挥其对接种的蜡样芽孢杆菌的显著趋化作用和群游作用，使得植物 根际 蜡样芽孢杆菌的数量显著增加；促进超累积植物吸收土壤中的重金属镉，达到修复镉污染土壤的目的，具有较好的应用价值和广阔的发展空间。，下面是L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌趋化物质及群游物质中的应用专利的具体信息内容。
1.L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌趋化物质中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌正趋化物质中的应用。
3.L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌群游物质中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌正群游物质中的应用。
5.根据权利要求1～4所述的应用，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)TH-35，该菌株已于2016年6月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No.60044。
6.一种镉污染土壤的植物修复方法，其特征在于，在种植于镉污染土壤的植物根际添加L-精氨酸并接种蜡样芽孢杆菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述植物为镉超累积植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物为东南景天、遏蓝菜或印度芥菜中的任意一种或几种。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌TH-35，该菌株已于2016年6月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No.60044。
L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌趋化物质及群游物质中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 微生物在植物根际的定殖情况非常复杂，普遍认为在种植植物时引入定殖的微生物后，微生物首先从根际土壤向植物根部移动，与根表接触，沿根分布，最后繁殖建立自己的种群。但是，引入的微生物在植物根表的分布只占根表面的10％～20％，并非全面覆盖。因此，研究如何促进微生物向植物根际富集具有重要意义。
[0003] 趋化作用和群游作用在微生物定殖方面有重要的作用。细菌趋化反应是指有运动能力的细菌对环境中的刺激物做出的定向运动，膜上受体蛋白感受外界刺激并传递信号，使细菌的鞭毛马达做出相应旋转，趋向有益刺激，避开有害刺激，是细菌适应环境变化的一种基本属性，使其在生存上具有竞争优势。细菌对植物根系分泌物的正趋化反应有助于细菌向寄主根部分泌物运动，从而促进细菌在宿主植物根部定殖。细菌群游反应是指细菌在旋转的鞭毛驱动下，在半固体培养基表面的多细胞快速运动，是通过细胞之间的碰撞而不是翻滚和跑动来确定运动方向。与趋化反应一样，群游反应也是细菌在根际竞争能力的重要因素，在定殖过程中发挥重要作用。
[0004] 目前，已有大量研究报道植物根系分泌物中的组分物质对细菌有吸引作用。例如，组氨酸、脯氨酸、精氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸对枯草芽孢杆菌Tu-100有正趋化作用，有利于枯草芽孢杆菌Tu-100在油菜根际的定殖；苏氨酸、精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸对多黏类芽孢杆菌SQR-21有正趋化作用，有利于多黏类芽孢杆菌SQR-21在西瓜根际的定殖；大肠杆菌对天冬氨酸等7种氨基酸产生强烈的正趋化性，对谷氨酰胺等氨基酸则产生负趋化现象；此外，粘酸能诱导鹤羽田戴尔福特菌10492的群游反应，有利于戴尔福特菌10492在全红苋菜根际定殖；葡萄糖酸能诱导土壤杆菌T29的群游反应，有利于土壤杆菌T29在苋菜根际定殖。因此，只有部分物质对细菌有吸引作用，寻找对细菌有正趋化作用及群游作用的物质，对于提高细菌在植物根际的定殖能力具有重要意义。
[0005] 蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)TH-35具有高效的溶镉功能，能够在促进植物生长的同时活化土壤重金属镉，促进超累积植物对土壤中镉的吸收，但是目前还没有对蜡样芽孢杆菌有趋化作用的物质的相关报道。
发明内容
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有对蜡样芽孢杆菌有趋化作用和群游作用的物质的研究空白，提供L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌趋化物质和群游物质中的应用。
[0007] 本发明的目的是提供L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌趋化物质中的应用。
[0008] 本发明另一目的是提供L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌群游物质中的应用。
[0010] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0011] 本发明经过创造性的探索实验，发现蜡样芽孢杆菌能够在L-精氨酸中很好的生长，且L-精氨酸对蜡样芽孢杆菌有显著的趋化作用和群游作用；因此，以下内容均应在本发明的保护范围之内：
[0012] L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌趋化物质中的应用。
[0013] 优选地，所述应用为L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌正趋化物质中的应用。
[0014] L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌群游物质中的应用。
[0015] 优选地，所述应用为L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌正群游物质中的应用。
[0016] 优选地，所述蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)TH-35，该菌株已于2016年6月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No.60044，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0017] 所述蜡样芽孢杆菌TH-35具有高效的溶镉功能，能够有效溶解土壤碳酸盐结合态、磷酸盐结合态等主要结合形态镉，在促进植物生长的同时活化土壤重金属镉，促进超累积植物对土壤中镉的吸收，有效地提高超累积植物修复土壤重金属镉的效率。
[0018] 本发明还提供了一种镉污染土壤的植物修复方法，在种植于镉污染土壤的植物根际添加L-精氨酸并接种蜡样芽孢杆菌。
[0019] 当在镉污染土壤中种植植物，且L-精氨酸和蜡样芽孢杆菌TH-35同时存在时，一方面，蜡样芽孢杆菌TH-35能够活化镉污染土壤中的重金属镉，促进超累积植物对土壤中镉的吸收；另一方面，L-精氨酸能够对接种的蜡样芽孢杆菌TH-35产生显著趋化作用和群游作用，使植物根际蜡样芽孢杆菌TH-35的数量显著增加，进一步促进土壤中镉的活化，更多的重金属镉被富集在植物体内，达到修复镉污染土壤的目的。
[0020] 优选地，所述植物为镉超累积植物。
[0021] 更优选地，所述植物为东南景天、遏蓝菜或印度芥菜中的任意一种或几种。
[0022] 优选地，所述蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌TH-35，该菌株已于2016年6月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No.60044。
[0023] 本发明具有以下有益效果：
[0024] 本发明经过创造性的探索实验，发现蜡样芽孢杆菌能够在L-精氨酸中很好的生长，且L-精氨酸对蜡样芽孢杆菌有显著的趋化作用和群游作用；因此，L-精氨酸在作为蜡样芽孢杆菌趋化物质和群游物质中具有广泛的应用前景；
[0025] 基于以上应用，本发明还提供了一种镉污染土壤的植物修复方法，利用该方法在镉污染土壤中种植植物，且L-精氨酸和蜡样芽孢杆菌同时存在时，一方面，蜡样芽孢杆菌TH-35能够活化镉污染土壤中的重金属镉，促进超累积植物对土壤中镉的吸收；另一方面，L-精氨酸能够发挥其对接种的蜡样芽孢杆菌的显著趋化作用和群游作用，使得植物根际蜡样芽孢杆菌的数量显著增加；进而促进超累积植物吸收土壤中的重金属镉，土壤中更多的重金属镉被富集在植物体内，达到修复镉污染土壤的目的，具有较好的应用价值。附图说明
[0026] 图1是蜡样芽孢杆菌TH-35对各碳源的利用率结果图。
[0027] 图2是20种碳源对蜡样芽孢杆菌TH-35趋化作用的影响结果图。
[0028] 图3是11种碳源对蜡样芽孢杆菌TH-35群游作用的影响结果图。
具体实施方式
[0030] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0031] 以下用蜡样芽孢杆菌TH-35为具体的菌株，研究L-精氨酸对蜡样芽孢杆菌的趋化作用和群游作用。该蜡样芽孢杆菌TH-35已在申请号为201610563729.9的现有专利中公开。该蜡样芽孢杆菌TH-35已于2016年6月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No.60044，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0032] 实施例1蜡样芽孢杆菌在不同碳源环境中的生长情况
[0033] 1、实验方法
[0035] 将蜡样芽孢杆菌TH-35划线接种至LB固体培养基上，在生化培养箱中培养14h至对数生长期后，用棉签挑取单独的菌落接至IF接种液中，配制成透光率为85％左右的菌悬液，按每孔100μL的量添加到包含不同碳源的GenIII的微孔中孵育，所有的孔在刚开始的时候都是无色的，在培养过程中那些能被细胞利用碳源的孔中的呼吸作用会增强。增强的呼吸作用导致四唑氧化还原染料被还原，变成紫色。放入培养箱中培养24h后将微孔板放入酶标读数仪并测定OD590吸光值，利用OD590吸光值表示蜡样芽孢杆菌TH-35对各碳源的利用率。
[0036] 2、实验结果
[0037] 蜡样芽孢杆菌TH-35对各碳源的利用率结果如图1所示，可以看出，在71种碳源中，蜡样芽孢杆菌TH-35在28种碳源(L-苹果酸、α-酮-戊二酸、D-葡糖酸、D-丝氨酸、L-乳酸、D-麦芽糖、α-D-葡糖、L-丝氨酸、乙酸、D-果糖-6-磷酸、D-纤维二糖、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、溴-丁二酸、γ-氨基-丁酸、柠檬酸、β-羟基-D,L丁酸、甲酸、D-果糖、D-苹果酸、粘酸、糖质酸、D-松二糖、L-焦谷氨酸、D-葡糖-6-磷酸、L-果糖、L-精氨酸、α-羟基-丁酸)中能够很好地生长；而其余43种碳源孔颜色无明显变化，且吸光度与阴性对照相比无差异，说明蜡样芽孢杆菌TH-35对其余43种碳源的利用率较差。
[0038] 实施例2不同碳源对蜡样芽孢杆菌的趋化作用
[0039] 1、实验方法
[0040] 根据以上实施例1的实验结果，选取实施例1中的20种碳源，研究不同碳源对蜡样芽孢杆菌TH-35的趋化作用。
[0041] 将菌株于LB液体培养基中富集14h至对数生长期后，取上述菌液离心倒掉上清液，加入无菌水洗涤菌体2次，重悬得到待用菌液。用最大量程为200μL的移液枪吸取100μL的菌液，用注射器吸取碳源溶液(30μmol·L-1)200μL，并设定无菌水为对照，每组处理设置3个平行。将注射器针头插入移液枪吸头，放置于超净台中静置2h，拔出注射器将其内部液体用无菌水稀释后，涂布至LB固体培养基并放置于生化培养箱中，28℃培养24h，计算菌落形成数量(CFUs)，利用CFUs表示各种碳源分别对蜡样芽孢杆菌TH-35的趋化作用。
[0042] 2、实验结果
[0043] 20种碳源溶液对蜡样芽孢杆菌TH-35的趋化作用结果如图2所示，可以看出，在20种碳源中，与对照组无菌水相比，16种碳源(D-果糖、D-果糖-6-磷酸、D-苹果酸、D-葡糖酸、D-丝氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-苹果酸、L-乳酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、α-羟基-丁酸、γ-氨基-丁酸、柠檬酸、溴-丁二酸、乙酸)对蜡样芽孢杆菌TH-35有正趋化作用；其余4种碳源(L-焦谷氨酸、α-酮-戊二酸、甲酸、粘酸)无明显趋化效果，表现出负趋化作用。其中，L-精氨酸对蜡样芽孢杆菌TH-35的趋化效果最好。
[0044] 实施例3不同碳源对蜡样芽孢杆菌的群游作用
[0045] 1、实验方法
[0046] 根据以上实施例2的实验结果，选取实施例2中的11种正趋化作用较好的碳源，研究不同碳源对蜡样芽孢杆菌TH-35的群游作用。
[0047] 将菌株于LB液体培养基中富集14h至对数生长期后，取上述菌液离心重悬，上清液倒掉后加入无菌水进行洗涤菌体。配制含30μmol·L-1碳源(对照为无菌水)的半固体LB培养基，并放置直径为8mm的无菌滤纸片于培养基表面的中心，于超净台内风干30min后，吸取5μL富集后的蜡样芽孢杆菌菌液于滤纸片中央，待其向四周均匀的扩散开后，放置于生化培养箱中于28℃培养4d，在每个板的三个不同的方向测量菌落直径，每组处理设置3个平行，利用菌落直径表示11种碳源对蜡样芽孢杆菌TH-35群游作用的影响。
[0048] 2、实验结果
[0049] 11种碳源对蜡样芽孢杆菌TH-35群游作用的影响结果如图3所示，可以看出，在11种碳源中，与对照组无菌水相比，7种碳源(D-葡糖酸、D-丝氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、乙酸)对蜡样芽孢杆菌TH-35有正群游作用；其余4种碳源(L-乳酸、α-羟基-丁酸、γ-氨基-丁酸、柠檬酸)无明显群游效果。其中，L-精氨酸对蜡样芽孢杆菌TH-35的群游效果最好，其群游直径为对照组无菌水的1.35倍。
[0050] 以上结果说明：L-精氨酸对蜡样芽孢杆菌TH-35的趋化作用和群游作用最好。
[0051] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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