一种利用绿木霉和碱蓬联合修复重金属污染土壤的方法
阅读：898发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种利用绿木霉和碱蓬联合修复重金属污染土壤的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种利用绿木霉和 碱 蓬联合修复重金属污染 土壤 的方法，属于 土壤修复 的技术领域。所述方法如下：将绿木霉菌株F7定殖在碱蓬 根际 ，构建得到绿木霉菌株F7‑碱蓬互生载体；将所述绿木霉菌株F7‑碱蓬互生载体定植在重金属污染土壤中进行修复；待定植120～136d后， 收获 碱蓬植株地上部分，完成土壤修复。本发明采用绿木霉F7‑碱蓬互生载体处理重金属污染土壤，提高了 铜 镉锌铅复合污染土壤的修复效率， 微 生物 与 植物 之间存在协同促进修复效果的现象；同时绿木霉F7‑碱蓬互生载体提高土壤微生物量，改善植物的根际微生态环境；绿木霉F7‑碱蓬互生载体处理重金属污染土壤，具有良好的生态效应，适用于重金属复合污染土壤的修复。，下面是一种利用绿木霉和碱蓬联合修复重金属污染土壤的方法专利的具体信息内容。
1.一种利用绿木霉和碱蓬联合修复重金属污染土壤的方法，包括以下步骤：
1)将绿木霉菌株F7定殖在碱蓬根际，构建得到绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体；
2)将所述绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体移栽在重金属污染土壤中进行修复；
3)待定植120～136d后，收获碱蓬植株地上部分，完成土壤修复；
所述重金属污染的重金属为Cu、Cd、Zn或Pb；
所述重金属污染土壤为农田土壤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的定殖的方法包括碱蓬苗与绿木霉的定殖方法和碱蓬种子与绿木霉的定殖方法。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述碱蓬苗与绿木霉的定殖方法包括以下步骤：制备的绿木霉菌株F7孢子悬液加入到碱蓬苗的根际土壤中，然后用无菌水进行浇灌碱蓬苗，得到绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述碱蓬苗高度为10～15cm。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述碱蓬种子与绿木霉的定殖方法包括以下步骤：取消毒后的碱蓬种子浸泡于绿木霉菌株F7孢子悬液后，在土层深度为1.0～2.0cm处种植并用无菌水进行浇灌保持土壤湿润，长至苗高12cm，得到绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碱蓬种子浸泡的时间为1h～2h。
7.根据权利要求3或5所述的方法，其特征在于，所述绿木霉菌株F7孢子悬液的活菌浓度为1×10 6 ～1×10 7 个孢子/mL。
8.根据权利要求3或5所述的方法，其特征在于，所述绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体中碱蓬根际F7菌达到2×10 3 cfu/g以上。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，修复过程保持土壤含水量为最大田间持水量的60％～70％。
一种利用绿木霉和碱蓬联合修复重金属污染土壤的方法
技术领域
背景技术
[0002] 土壤重金属污染是全球面临的重大环境问题之一，Cd因其较强的生物毒性和强烈的“三致”作用，而受到人们广泛关注。传统重金属污染的治理方法多为物理、化学法。如化学沉淀法、离子交换法、反渗透法、萃取法、活性炭吸附法等，它们各有优点，但也存在着投资大、能耗高、易造成二次污染、操作困难等缺点。
[0003] 与传统重金属污染修复方法相比，植物修复法具有环境友好、不产生二次污染、修复成本低廉等优点，使得植物修复法成为重金属污染修复研究的热点。作为一种盐生植物，碱蓬不仅在盐分引起渗透压和离子胁迫的氧化应激方面显示出特有的适应性，在金属离子毒性上也拥有相对的各种生理解毒机制，因此可广泛用于中碱性土壤的重金属污染修复中。同其它重金属富集植物一样，碱蓬也存在着生物量小、生长缓慢、单位面积上植物对重金属的吸收和积累总量少等瓶颈问题。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提出了利用绿木霉和碱蓬联合修复重金属污染土壤的方法，为寻找一种微生物与碱蓬联合修复的方式，提高碱蓬对中碱性重金属污染土壤的修复效率，以期尽快恢复中碱性重金属污染土壤的生产能力。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种利用绿木霉和碱蓬联合修复重金属污染土壤的方法，包括以下步骤：
[0007] 1)将绿木霉菌株F7定殖在碱蓬根际，构建得到绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体；
[0008] 2)将所述绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体移栽在重金属污染土壤中进行修复；
[0009] 3)待定植120～136d后，收获碱蓬植株地上部分，完成土壤修复。
[0011] 优选的，所述碱蓬苗与绿木霉的定殖方法包括以下步骤：所述制备的绿木霉菌株F7孢子悬液加入到碱蓬苗的根际土壤中，然后用无菌水进行浇灌碱蓬苗，得到绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体。
[0012] 优选的，所述碱蓬苗高度为10～15cm。
[0013] 优选的，所述碱蓬种子与绿木霉的定殖方法包括以下步骤：取消毒后的碱蓬种子浸泡于绿木霉菌株F7孢子悬液后，在土层深度为1.0～2.0cm处种植并用无菌水进行浇灌保持土壤湿润，长至苗高10～15cm，得到绿木霉F7-碱蓬互生载体。
[0014] 优选的，所述碱蓬种子浸泡的时间优选为1h～2h。
[0015] 优选的，碱蓬种子的消毒方法为1％次氯酸钠溶液浸泡10～15min。
[0016] 优选的，所述绿木霉菌株F7孢子悬液的活菌浓度为1×106～1×107个孢子/mL。
[0017] 优选的，所述绿木霉F7-碱蓬互生载体中碱蓬根际F7菌达到2×103cfu/g以上。
[0018] 优选的，所述修复过程保持土壤含水量为最大田间持水量的60％～70％。
[0019] 优选的，所述金属污染的重金属为Cu、Cd、Zn或Pb。
[0020] 本发明提供了一种利用绿木霉和碱蓬联合修复重金属污染土壤的方法，包括以下步骤：1)将绿木霉菌株F7定殖在碱蓬根际，构建得到绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体；2)将所述绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体定植在重金属污染土壤中进行修复；3)待定植120～136d后，收获碱蓬植株地上部分，完成土壤修复。本发明采用绿木霉F7-碱蓬互生载体处理重金属污染土壤，提高了铜镉锌铅复合污染土壤的修复效率，微生物与植物之间存在协同促进修复效果的现象；同时绿木霉F7-碱蓬互生载体提高土壤微生物量，改善植物的根际微生态环境；绿木霉F7-碱蓬互生载体处理重金属污染土壤，具有良好的生态效应，适用于重金属复合污染土壤的修复。附图说明
[0021] 图1为实施例1中不同处理下修复136d后碱蓬地上部生物量；
[0022] 图2为实施例1中修复136d后碱蓬地上部和地下部的Cu、Cd、Zn、Pb含量；
[0023] 图3为实施例1中修复136d后碱蓬地上部和地下部的Cu、Cd、Zn、Pb累积量；
[0024] 图4实施例2中不同处理下修复120d后碱蓬地上部生物量；
[0025] 图5为实施例2中修复120d后碱蓬地上部和地下部的Cu、Cd、Zn、Pb含量；
[0026] 图6为实施例2中修复120d后碱蓬地上部和地下部的Cu、Cd、Zn、Pb累积量。
[0027] 保藏信息
[0028] 绿木霉，Trichoderma virens，菌株编号：F7JX993849，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年6月29日，保藏编号为CGMCC No.3.17613。
具体实施方式
[0029] 本发明提供了一种利用绿木霉和碱蓬联合修复重金属污染土壤的方法，包括以下步骤：
[0030] 1)将绿木霉菌株F7定殖在碱蓬根际，构建得到绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体；
[0031] 2)将所述绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体移栽在重金属污染土壤中进行修复；
[0032] 3)待定植120～136d后，收获碱蓬植株地上部分，完成土壤修复。
[0033] 将绿木霉菌株F7定殖在碱蓬根际，构建得到绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体。
[0034] 本发明中，所述定殖的方法优选包括碱蓬苗与绿木霉的定殖方法和碱蓬种子与绿木霉的定殖方法。所述碱蓬苗与绿木霉的定殖方法优选包括以下步骤：所述制备的绿木霉菌株F7孢子悬液加入到碱蓬苗的根际土壤中，然后用无菌水进行浇灌碱蓬苗。所述碱蓬苗高度优选为10～15cm。所述绿木霉菌株F7孢子悬液的活菌浓度优选为1×106～1×107个孢子/mL。
[0035] 本发明中，所述碱蓬种子与绿木霉的定殖方法优选包括以下步骤：取消毒后的碱蓬种子浸泡于绿木霉菌株F7孢子悬液后，在土层深度为1.0～2.0cm处种植并用无菌水进行浇灌保持土壤湿润，长至苗高12cm，构建得到绿木霉F7-碱蓬互生载体。所述碱蓬种子浸泡的时间优选优选为1h～2h。碱蓬种子的消毒方法优选为1％次氯酸钠溶液浸泡10～15min。所述绿木霉菌株F7孢子悬液的活菌浓度优选为1×106～1×107个孢子/mL。所述绿木霉F7-碱蓬互生载体中碱蓬根际F7菌的菌体浓度优选达到2×103cfu/g以上。
[0036] 得到绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体后，本发明将所述绿木霉菌株F7-碱蓬互生载体移栽在重金属污染土壤中进行修复。
[0037] 本发明中，所述移栽至重金属污染的土壤的深度优选为20～30cm，更优选为25cm。所述移栽的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的移栽方法即可。
[0038] 本发明中，所述修复过程优选保持土壤含水量为最大田间持水量的60％～70％。
[0040] 本发明中，所述移栽的时间优选为125～130d，最优选为128d。
[0041] 本发明中，所述收获碱蓬植株地上部分的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的收获方法即可。
[0042] 本发明中，所述金属污染的重金属为Cu、Cd、Zn或Pb。
[0043] 下面结合实施例对本发明提供的一种利用绿木霉和碱蓬联合修复重金属污染土壤的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0044] 实施例1
[0045] 供试土壤：为平度市某镇农田土壤，其基本理化性质为：pH 6.62(土水比1：2.5)，有机质16.6g/kg，阳离子交换量19.8cmol/kg，总铜含量53.5mg/kg，总镉含量1.08mg/kg，总锌含量184mg/kg，总铅含量45.2mg/kg。
[0046] 供试碱蓬种子，采自于野外。
[0047] 供试菌株：绿木霉(Trichoderma virens)菌株F7JX993849，保藏编号：CGMCC No.3.17613。
[0048] 培养基：马铃薯葡萄糖(PDA)培养基，称取马铃薯200克，洗净切块，加去离子水煮沸30min后，过滤出上清液，加入葡萄糖20克，用去离子水定容至1000ml，121℃灭菌20min。固体培养基，加琼脂15～20克。
[0049] 绿木霉F7孢子悬液制备：将绿木霉F7菌种在PDA斜面上进行活化，约6d后产孢子，加入6ml无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将孢子悬浮液置于已灭菌100ml三角瓶内，瓶中预先放置数粒无菌玻璃珠，充分震荡后用灭菌的脱脂棉进行过滤，并用无菌水重洗滤渣26
～3次。用血球计数板测定孢子浓度，并稀释至1×10个孢子/mL的孢子悬液。
～3次。用血球计数板测定孢子浓度，并稀释至1×10个孢子/mL的孢子悬液。
[0050] 绿木霉F7-碱蓬互生载体构建：选取饱满的碱蓬种子，用1％次氯酸钠溶液浸泡种子15min。取消毒好的种子用去离子水清洗种子5～7次，每次5min；之后浸泡于浓度为1×106个孢子/mL的孢子悬液中2h，取出浸泡的种子后在土层下约1.5cm种植，用无菌水进行浇
3
灌保持土壤湿润，至苗高12cm，经检测碱蓬根际F7菌达到2×10 cfu/g以上，构建了绿木霉F7-碱蓬互生载体；
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灌保持土壤湿润，至苗高12cm，经检测碱蓬根际F7菌达到2×10 cfu/g以上，构建了绿木霉F7-碱蓬互生载体；
[0051] 盆栽验：盆栽试验设置两个处理，处理一：CK，为不接种绿木霉F7的碱蓬对照；处理二：接种绿木霉F7的碱蓬。每处理做四次重复。盆内径宽30cm，长90cm，每盆中装入风干后过2mm筛的土样15kg，加入蒸馏水至土壤田间持水量，保持土壤含水量平衡1周后将上述步骤所得的碱蓬移种至盆中。每盆6棵。栽种行距是15cm，株距是30cm，相当于22.2株/m2土地，以利于分枝的生长。在修复过程中，保持土壤含水量为最大田间持水量的65％左右。植物生长
136d后，用不锈钢剪刀减去地上部，测定植株鲜重。用去离子水冲洗后，105℃杀青20min，70℃烘至恒重，粉碎过100目筛。保留部分根际鲜土供土壤微生物数量指标分析用。
136d后，用不锈钢剪刀减去地上部，测定植株鲜重。用去离子水冲洗后，105℃杀青20min，70℃烘至恒重，粉碎过100目筛。保留部分根际鲜土供土壤微生物数量指标分析用。
[0052] 不同处理下修复136d后碱蓬地上部生物量见图1。从图1中可以看出，绿木霉F7处理组碱蓬地上部和地下部的生物量显著大于对照组。绿木霉F7处理组碱蓬地上部和地下部的干重分别比对照高37.6％和38.6％。说明绿木霉F7能够显著提高碱蓬生物量。
[0053] 碱蓬铜镉锌铅含量的测定：碱蓬草样品采用微波消解法(浓HNO3与30％H2O2体积比为7:1)进行消化，随后采用ICP-MS测定Cu、Cd、Zn和Pb含量，消化以及测定过程中以国家标准物质(GBW07603 GSV-2)为内标控制样品分析质量。接种绿木霉F7对碱蓬铜镉Cu、Cd、Zn和Pb含量和累积量的影响分别见图2、图3。
[0054] 图2为修复136d后碱蓬地上部和地下部的Cu、Cd、Zn、Pb含量，与未施加绿木霉F7的对照相比，绿木霉F7处理均可以显著增加碱蓬地上部和地下部的Cu、Cd、Zn、Pb含量。绿木霉F7处理组碱蓬地上部的Cu、Cd、Zn、Pb含量分别高于对照组25.1％，16.4％，14.3％和16.1％；地下部分别高于对照组17.8％，11.7％，13.4％和23.1％。
[0055] 图3为修复136d后碱蓬地上部和地下部的Cu、Cd、Zn、Pb累积量，与未施加绿木霉F7的对照相比，绿木霉F7处理均可以显著增加碱蓬地上部和地下部的Cu、Cd、Zn、Pb累积量。绿木霉F7处理组碱蓬地上部的Cu、Cd、Zn、Pb累积量分别高于对照组72.2％，60.1％，57.3％和59.7％；地下部分别高于对照组80.9％，71.5％，74.1％和89％。说明绿木霉F7可以显著提高碱蓬对重金属污染土壤的修复效率。
[0056] 采用稀释涂布平板法测定碱蓬根系土壤中细菌、放线菌和真菌的数量。绿木霉F7处理组碱蓬根系土壤与对照土壤微生物数量的变化如表1所示。可以看出，接种绿木霉F7对增加土壤微生物的数量，改善微生态环境起着明显的作用。与对照组相比，绿木霉F7处理组碱蓬根系土壤中细菌、放线菌和真菌的数量分别增加了2.53倍、4.25倍和42.3倍。
[0057] 表1绿木霉F7处理组与对照组碱蓬根际土壤微生物数量(个/g干土)[0058]
[0059] 实施例2
[0060] 供试土壤：为平度市某镇农田土壤，其基本理化性质为：pH 7.08(土水比1：2.5)，有机质14.9g/kg，阳离子交换量18.6cmol/kg，总铜含量67.5mg/kg，总镉含量4.15mg/kg，总锌含量418mg/kg，总铅含量276mg/kg。
[0061] 供试碱蓬种子，采自于野外。
[0062] 供试菌株：绿木霉(Trichoderma virens)菌株F7JX993849，保藏编号：CGMCC No.3.17613。
[0063] 培养基：马铃薯葡萄糖(PDA)培养基，称取马铃薯200克，洗净切块，加去离子水煮沸30min后，过滤出上清液，加入葡萄糖20克，用去离子水定容至1000ml，121℃灭菌20min。固体培养基，加琼脂15～20克。
[0064] 绿木霉F7孢子悬液制备：将绿木霉F7菌种在PDA斜面上进行活化，约6d后产孢子，加入6ml无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将孢子悬浮液置于已灭菌100ml三角瓶内，瓶中预先放置数粒无菌玻璃珠，充分震荡后用灭菌的脱脂棉进行过滤，并用无菌水重洗滤渣2～3次。用血球计数板测定孢子浓度，并稀释至1×107个孢子/mL的孢子悬液。
[0065] 绿木霉F7-碱蓬互生载体构建：取上述制备的F7孢子悬液加入到苗高12cm人工种植的碱蓬根际土壤周围并用无菌水进行浇灌，3d一次，持续21d，经检测碱蓬根际F7菌达到2×103cfu/g以上，构建了绿木霉F7-碱蓬互生载体；
[0066] 盆栽验：盆栽试验设置两个处理，处理一：CK，为不接种绿木霉F7的碱蓬对照；处理二：接种绿木霉F7的碱蓬。每处理做四次重复。盆内径宽40cm，长75cm，每盆中装入风干后过2mm筛的土样15kg，加入蒸馏水至土壤田间持水量，保持土壤含水量平衡1周后将上述步骤所得的碱蓬移种至盆中。每盆6棵。栽种行距是20cm，株距是25cm，相当于19.9株/m2土地，以利于分枝的生长。在修复过程中，保持土壤含水量为最大田间持水量的65％左右。植物生长
120d后，用不锈钢剪刀减去地上部，测定植株鲜重。用去离子水冲洗后，105℃杀青20min，70℃烘至恒重，粉碎过100目筛。保留部分根际鲜土供土壤微生物数量指标分析用。
120d后，用不锈钢剪刀减去地上部，测定植株鲜重。用去离子水冲洗后，105℃杀青20min，70℃烘至恒重，粉碎过100目筛。保留部分根际鲜土供土壤微生物数量指标分析用。
[0067] 绿木霉F7对碱蓬生物量的影响见图4。
[0068] 从图4中可以看出，绿木霉F7处理组碱蓬地上部和地下部的生物量显著大于对照组。绿木霉F7处理组碱蓬地上部和地下部的干重分别比对照高23.5％和32.4％。说明绿木霉F7能够显著提高碱蓬生物量。
[0069] 碱蓬铜镉锌铅含量的测定：碱蓬草样品采用微波消解法(浓HNO3与30％H2O2体积比为7:1)进行消化，随后采用ICP-MS测定Cu、Cd、Zn和Pb含量，消化以及测定过程中以国家标准物质(GBW07603 GSV-2)为内标控制样品分析质量。接种绿木霉F7对碱蓬铜镉Cu、Cd、Zn和Pb含量和累积量的影响分别见图5、图6。
[0070] 图5为修复120d后碱蓬地上部和地下部的Cu、Cd、Zn、Pb含量，与未施加绿木霉F7的对照相比，绿木霉F7处理均可以显著增加碱蓬地上部和地下部的Cu、Cd、Zn、Pb含量。绿木霉F7处理组碱蓬地上部的Cu、Cd、Zn、Pb含量分别高于对照组36.3％，33.2％，26.5％和24.1％；地下部分别高于对照组25.5％，35.7％，24.2％和21.7％。
[0071] 图6为修复120d后碱蓬地上部和地下部的Cu、Cd、Zn、Pb累积量，与未施加绿木霉F7的对照相比，绿木霉F7处理均可以显著增加碱蓬地上部和地下部的Cu、Cd、Zn、Pb累积量。绿木霉F7处理组碱蓬地上部的Cu、Cd、Zn、Pb累积量分别高于对照组68.3％，64.5％，56.3％和53.2％；地下部分别高于对照组66.1％，79.7％，64.4％和61.1％。说明绿木霉F7可以显著提高碱蓬对重金属污染土壤的修复效率。
[0072] 采用稀释涂布平板法测定碱蓬根系土壤中细菌、放线菌和真菌的数量。绿木霉F7处理组碱蓬根系土壤与对照土壤微生物数量的变化如表2所示。可以看出，接种绿木霉F7对增加土壤微生物的数量，改善微生态环境起着明显的作用。与对照组相比，绿木霉F7处理组碱蓬根系土壤中细菌、放线菌和真菌的数量分别增加了2.36倍、4.76倍和38.5倍。
[0073] 表2绿木霉F7处理组与对照组碱蓬根际土壤微生物数量(个/g干土)[0074]
[0075] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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