一株星箭头菌SCSIO 43502及其应用
阅读：973发布：2020-05-13
专利汇可以提供一株星箭头菌SCSIO 43502及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株星箭头菌SCSIO 43502及其应用。星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502，保藏编号：CCTCC NO：M 2016504。本发明从珊瑚岛礁 生态系统 中的海草喜盐草 根际 中分离筛选到一株星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502，该菌其具有良好的固氮活性、促进海草生长的特性以及抵抗 海 水 酸化 的能 力 ，由此该星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502在海洋 微 生物 肥料 制备方面和在岛礁生态保护和修复方面具较高的价值以及广阔的应用前景。，下面是一株星箭头菌SCSIO 43502及其应用专利的具体信息内容。
1.星箭头菌（Sagittula stellata）SCSIO 43502，保藏编号：CCTCC NO：M 2016504。
2.权利要求1所述的星箭头菌（Sagittula stellata）SCSIO 43502在制备促生固氮菌肥中的应用。
3. 权利要求1所述的星箭头菌（Sagittula stellata）SCSIO 43502在保护和修复海草生态系统中的应用。
4. 一种促生固氮菌肥，其特征在于，以权利要求1所述的星箭头菌（Sagittula stellata）SCSIO 43502作为活性成分。
5. 一种权利要求4所述的促生固氮菌肥的制备方法，其特征在于，将星箭头菌（Sagittula stellata）SCSIO 43502接种到液体培养基中培养，即得促生固氮菌肥。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：将星箭头菌（Sagittula stellata）SCSIO 43502接种到选择性液体无氮液体改良培养基中，28℃振荡培养至对数期，即得促生固氮菌肥；所述的选择性液体无氮液体改良培养基的配方为：每升培养基含有NaCl 25g，KCl 0.56 g，MgSO4·7H2O 4.8 g，MgCl2·6H2O 4.0 g，K2HPO4 0.01 g，FeSO4·
7H2O 0.001 g，Tris 0.48 g，蛋白胨4.0 g，酵母提取物2.0 g，甘油2.0 mL，余量为水，pH为
8.2。
一株星箭头菌SCSIO 43502及其应用
技术领域：
[0002] 珊瑚岛礁是由造礁珊瑚的碳酸钙骨骼和其他生物碎屑堆积发育而成的一种特殊的生态系统，具有极高的生产力和生物多样性，因此被誉为“海洋中的热带雨林”和“蓝色沙漠中的绿洲”。然而由于全球气候变化和人类活动的影响，全球上处于衰退状态，据估算目前全球约有10％的珊瑚礁已经遭到不可逆转的严重破坏，约50％的珊瑚礁处于接近崩溃的边缘，其中东南亚地区珊瑚的退化问题更为严重，该区域约95％的珊瑚生存受到威胁，如果衰退情况持续，截止到2030年，全球将有约90％的珊瑚的生长受到严重的影响，而到2050年，全球所有的珊瑚都将处于危险状态(Bellwood et al.,2004；Kleypas et al.,2005；Burke et al.,2011)。
[0003] 岛礁生态系统的海草可以作为先锋植物在珊瑚礁衰退区域，从缓慢生长到形成良好的生态体系统，从而抑制了珊瑚礁底质的流失和珊瑚大面积衰退会进一步引起大规模的死亡，防止岛礁的三维立体结构的坍塌，阻止了海洋生态平衡造成生物多样性的丧失。岛礁生态系统的生产力通常受到氮素限制，而海草之所以能够在岛礁生态系统中生长主要得益于其共附生的固氮微生物，如固氮细菌和固氮蓝藻等，它们可以通过进行生物固氮作用为生态系统提供新氮源，从而一定程度上减缓了氮限制，促进海草生长；此外，固氮微生物还可以产生如植物生长调节剂、氨基酸和多糖等活性物质来促进海草生长(Lambers,Mougel,Jaillard,&Hinsinger,2009)。
[0004] Patriquin(1972)发现南美洲三种泰来藻生长所需要氮素全部是由根际沉积物中的固氮微生物所提供的；而在澳大利亚的卡奔塔利亚湾生物固氮作用能够满足大叶藻氮素需求的约50％(O’Donohue et al.,1991)。通过生物固氮作用提供的氮素供给海草植株生长，形成能够有效地促进岛礁生态系统的修复，固氮菌肥的制作和研究方面在其他生态系统中都有较多研究，而目前尚未报道。发明内容：
[0005] 本发明的第一个目的是提供一株从中国海南省三沙市岛礁生态系统海草喜盐草(Halophila ovalis)根际分离获得的，具有较高的固氮生物活性的星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502，该菌于2016年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2016504。
[0006] 根据乙炔还原法(Acetylene Reducing Activity,ARA)，应用气相色谱仪测定星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502固氮活性，研究结果显示星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO43502具有较高的固氮活性，为343±13.57nmol C2H4/h/mL。
[0007] 将星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502的发酵液加入到海草培养体系中海草的根部，发现其对海草植株的叶绿素含量、根长、株高和生物量等具有较好的促进作用，对其具有很好的促生作用。
[0008] 因此，本发明的第二个目的是提供星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502在制备促生固氮菌肥中的应用。
[0009] 本发明的第三个目的是提供星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502在保护和修复海草生态系统中的应用。
[0010] 本发明的第四个目的是提供一种促生固氮菌肥，其特征在于，以上述的星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502作为活性成分。
[0011] 本发明的第五个目的是提供上述的促生固氮菌肥的制备方法，其特征在于，将星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502接种到液体培养基中培养，即得促生固氮菌肥。
[0012] 具体步骤为：将星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502接种到选择性液体无氮液体改良培养基中，28℃振荡培养至对数期，即得促生固氮菌肥；所述的选择性液体无氮液体改良培养基的配方为：每升培养基含有NaCl 25g，KCl 0.56g，MgSO4·7H2O 4.8g，MgCl2·6H2O 4.0g，K2HPO4 0.01g，FeSO4·7H2O 0.001g，Tris 0.48g，蛋白胨4.0g，酵母提取物2.0g，甘油2.0mL，余量为水，pH为8.2。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0014] 本发明从珊瑚岛礁生态系统中海草喜盐草根际中分离筛选到一株星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502，其具有良好的固氮活性、促进海草生长的特性以及抵抗海水酸化的能力，由此该星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502在海洋微生物肥料制备方面和在岛礁生态保护和修复方面具较高的价值以及广阔的应用前景。
[0015] 星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502于2016年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2016504。附图说明：
[0016] 图1是星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502的16S rDNA的系统进化发育树，图中的SCSIO 43502表示星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502；
[0017] 图2是星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502的nifH的系统进化发育树，图中的SCSIO43502表示星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502。具体实施方式：
[0018] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0019] 实施例1：星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502的分离、纯化和鉴定[0020] 1、星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502的分离和纯化
[0021] 样品采集时间为2015年6月，从中国海南省三沙市珊瑚岛礁生态系统中海草喜盐草根际，分离纯化得到细菌SCSIO 43502。
[0022] 2、星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502的鉴定
[0023] 1)形态学鉴定：光学显微镜下，挑取培养处于对数生长期的细菌SCSIO 43502置于载玻片上，通过盖玻片加以固定，进行观察。本实施例中获得的细菌SCSIO 43502，为直杆状，革兰氏阴性菌，不形成孢子，在静止期易形成玫瑰状的花结和聚集、圆形、边缘凸起，颜色为淡奶油色。
[0024] 2)细菌固氮活性的测定
[0025] 本实施例细菌的固氮酶活性采用气相色谱仪测固氮菌的乙炔还原活性(Acetylene Reducing Activity,ARA)(参考Capone 1993，Capone DG(1993)Determination of nitrogenase activity in aquatic samples using the acetylene reduction procedure.Aquatic Microbial Ecology,621-631)。
[0026] 本实施例分实验组和空白对照组。
[0027] 实验组：分离纯化得到的细菌SCSIO 43502，将该其接种于100mL选择性液体无氮液体改良培养基内，温度为28℃，200rpm培养12h达到对数期后，取2mL于灭菌的10mL小瓶中，盖上橡皮塞，瓶盖边缘以石蜡封口，用注射器将1mL的乙炔注入10mL小瓶中，于30℃反应7h，然后取20μL反应后气体，待测；每个实验组设三个重复。
[0028] 所述的选择性液体无氮液体改良培养基的配方为：每升培养基含有NaCl 25g，KCl 0.56g，MgSO4·7H2O 4.8g，MgCl2·6H2O 4.0g，K2HPO4 0.01g，FeSO4·7H2O 0.001g，Tris
0.48g，蛋白胨(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)4.0g，酵母提取物2.0g，甘油2.0mL，余量为蒸馏水，pH为8.2(Garriet W Smith,1992)。固体培养基中加入2％的Agar，其中液体培养基采用0.22μm滤膜抽滤灭菌，固体培养基采用高温高压灭菌。
0.48g，蛋白胨(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)4.0g，酵母提取物2.0g，甘油2.0mL，余量为蒸馏水，pH为8.2(Garriet W Smith,1992)。固体培养基中加入2％的Agar，其中液体培养基采用0.22μm滤膜抽滤灭菌，固体培养基采用高温高压灭菌。
[0029] 空白对照组：对照容器中加入乙炔气体但是不加入细菌，其他同实验组。
[0030] 所有样品用气相色谱检测乙烯的生成量。本实施例分离纯化得到的纯菌株细菌SCSIO43502可以利用N2作为氮源，且具有较高的生物固氮活性，纯培养条件下平均固氮活性为343±13.57nmol C2H4/h/mL。
[0031] 实施例2：菌株的16SRNA和固氮基因扩增
[0032] 选择实施例1分离纯化得到的细菌SCSIO 43502纯培养物进行DNA提取和纯化，本实施例DNA的提取与纯化，其操作方法参考东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》P409。采用细菌的16S 27F/1492R(Weisenburg et al.,1991，16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.，Journal of bacteriology，1991 173(2):697-703和nifH基因通用引物PolF/PolR(参考Poly et al.,2001，Comparison of nifH Gene Pools in Soils and Soil Microenvironments with Contrasting Properties，Applied and Environmental Microbiology,2001，67(5)：2255-2262)分别进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示。
[0033] 表1 PCR反应体系
[0034]
[0035] PCR反应条件为：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃40s，共30个循环；后延伸72℃10min。取2μL PCR反应产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，若有目的条带的出现，则将剩余的PCR产物直接交与华大基因用ABI Prism 3730XL DNA分析系统测序，并将测序分析得到的16S rDNA(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和固氮基因序列nifH(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)通过应用BLAST与GenBank数据库中的序列进行比对，对其种属鉴定进行初步的分子生物学确定并建立系统发育树，系统发育树如图1和图2所示，从系统发育树可以看出与细菌SCSIO 43502的16S rDNA序列具有较近亲缘关系的序列均来自Sagittula属，并且与已知菌种的星箭头菌Sagittula stellata SBW140(Genebank登陆号为：KC534335.1)的16S rDNA序列具有99％的相似性，固氮基因与成团范菌Pantoea agglomerans G33-1相似度最高，仅为92％，该菌也来源珊瑚礁生境的海草根际，基于此将细菌SCSIO 43502命名为星箭头菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502，其于2016年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2016504。
[0036] 实施例3：细菌发酵液对海草喜盐草促生作用的有效性试验
[0037] 将用选择性液体无氮液体改良培养基(配方同实施例1)，28℃振荡过夜发酵培养后的星箭头菌(S.stellata)SCSIO 43502菌液，待菌株充分生长后，利用紫外分光光度计测定各菌株悬浮液OD(optical density)值，当OD660值0.6，分别取出20mL加入海草喜盐草养殖缸内海草根际(实验组)，其中对照组中仅仅只加入20mL的超纯水(CK组)，各三个重复，然后将其置于相同培养条件下，光暗周期12h:12h(光：暗周期)，光照强度200μE/m2/s，30℃培养，45天后，点数根的条数并且测量根的长度，结果如表2所示。
[0038] 表2不同处理组的海草喜盐草生理特性
[0039]
[0040] 注：“+”表示的升高
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