技术领域
[0001] 本
发明涉及一种提高
酿酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法，属于
生物工程技术领域。
背景技术
[0002] 葡糖二酸(Glucaric acid)，是葡萄糖的
醛基和C6位羟基皆被
氧化为羧基而形成的二元酸。自然界中即存在葡糖二酸，如十字花科的素菜(花椰菜等)、
水果(如柑橘等)以及
哺乳动物的
代谢物中均发现葡糖二酸。葡糖二酸及其衍生物在医药方面有重要的应用，由于葡糖二酸及其内酯可以有效抑制β-葡萄糖醛酸酶的活性，因此成为良好的抗癌物质。而且，葡糖二酸还具有降低胆固醇的作用；葡糖二酸-1,4-内酯具有抗氧化作用，能够抑制糖尿病。研究发现，葡糖二酸可以通过缩聚反应形成聚酰胺，该
聚合物具有
生物可降解性，开拓了可降解尼龙材料的发展前景。
[0003] 酿酒酵母相较于大肠杆菌，具有更高的工业应用价值，一方面酿酒酵母的耐酸能
力强于大肠杆菌，另一方面酿酒酵母本身可以作为单细胞蛋白用于
饲料、食品等。酿酒酵母还具有其它优点，如耐低温、可低pH
发酵、没有
噬菌体感染、适合大规模发酵、易分离和高抗逆性等特点。因而酿酒酵母已经广泛用于产
有机酸的研究，如ρ-羟基苯
甲酸、ρ-
氨基
苯甲酸、ρ-羟基苯
丙烯酸和青蒿酸等。通过酿酒酵母代谢工程制备葡萄糖二酸具有2个优势，一是细胞本身含有葡糖糖二酸合成途径中的肌醇-1-
磷酸合成酶Ino1，二是酵母能够利用葡萄糖-6-磷酸合成肌醇。目前对于通过酿酒酵母代谢工程制备葡萄糖二酸研究的相关报道比较少，Prather课题组将外源MIOX和UDH基因引入酿酒酵母细胞进行异源表达实现了通过葡萄糖和外加肌醇在酿酒酵母细胞中产葡萄糖二酸，但是其产量在上罐培养条件下只有1.6g/L。我们前期酿酒酵母工程菌Bga-001在分批补料发酵条件下能够产6g/L的葡萄糖二酸。
[0004] 通过代谢工程策略构建的途径含有异源酶时，由于异源蛋白缺少宿主细胞天然代谢调控机制，因此，宿主细胞流量存在
不平衡的问题。
脚手架蛋白被用来募集代谢途径酶进行融合表达，该方法可以减少底物流失和中间代谢物的积累，提高途径合成效率，因此近年来成为研究的热点。在大肠杆菌中，通过构建脚手架蛋白葡糖二酸的产量可以提高3倍。在酿酒酵母中，通过亲合体和脚手架构建融合蛋白将法尼基二磷酸合成酶和法尼烯合成酶进行共
定位，法尼烯的产量提高了135％；将这种方法应用于大肠杆菌聚羟基丁酸酯(PHB)的合成后，PHB的产量提高了7倍。本发明拟通过构建亲合体脚手架将拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的肌醇加氧酶MIOX4和丁香假单胞菌来源的糖醛酸脱氢酶udh通过不同的linker连接，提高MIOX1和udh的途径效率，在此
基础上进一步提高葡糖二酸合成途径的效率，从而为进一步的代谢改造奠定基础。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题在于提供一种提高提高酿酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法。本发明通过以下方案来实现：
[0006] 本发明的第一个目的是提高一种合成D-葡萄糖二酸的酿酒酵母基因工程菌，是以酿酒酵母BY4741的opi1缺失株为出发菌株，将拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的肌醇加氧酶MIOX4和丁香假单胞菌来源的糖醛酸脱氢酶udh通过linker连接，然后整合至酿酒酵母opi1缺失株的基因组上。
[0007] 在一种实施方式中，所述肌醇加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述糖醛酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008] 在一种实施方式中，所述linker包括GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK或SSSNNNNNNNNNN。
[0009] 在一种实施方式中，所述肌醇加氧酶和糖醛酸脱氢酶通过linker融合后整合至opi1缺失株的OPI1基因启动子上。
[0010] 在一种实施方式中，所述OPI1基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述
片段MIOX4来自拟南芥，udh片段来自丁香假单胞菌(Pseudomonas putida)，分别由引物从Bga-001基因组扩增获得。Bga-001菌株来源于
专利：一种提高酿酒酵母工程菌株发酵生产葡萄糖二酸的方法(
申请号：201810091278.2)[0012] 本发明的第二个目的是筛选出一种利用上述工程菌提高提高酿酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法，利用葡萄糖为底物高产高附加值葡糖二酸。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，将单菌落接种于YPD培养基中，28～30℃，200～250rpm，培养20～24h，获得
种子液。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的
碳源为葡萄糖，初始浓度为15～25g/L。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵是将种子液按照1～2％的接种量接种至发酵培养基中，于28～30℃、200～250rpm，培养160～240小时。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，在发酵24小时和36小时补加葡萄糖，使发酵体系中的葡萄糖浓度为5g/L。
[0017] 本发明还要求保护所述酿酒酵母基因工程菌或所述方法在制备葡萄糖二酸或其衍生产品方面的应用。
[0018] 有益效果：葡萄糖二酸合成途径效率低且MIOX4
稳定性差的问题，本方法将MIOX4和udh通过不同的linker进行融合表达，通过发酵培养后筛选出能够提高葡萄糖二酸合成途径效率的葡萄糖二酸高产菌株，实现了外源基因在酿酒酵母细胞中的稳定表达。本实验室构建的分别表达MIOX4和udh的酿酒酵母工程菌，其途径效率低，相同发酵条件下其葡萄糖二酸产量只有0.25g/L，而经过融合表达后，在相同的发酵条件下产量最高达1.45g/L，提高了近5倍。
附图说明
[0019] 图1为工程菌构建策略图；
[0020] 图2为MIOX4-linker-udh整合片段琼脂糖凝胶
电泳检测图；其中，泳道0为不融合linker的对照，泳道1～12分别表示通过GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK或SSSNNNNNNNNNN融合的整合菌株；
[0021] 图3为MIOX4-linker-udh整合菌株基因型琼脂糖凝胶电泳检测图；其中，泳道0为不融合linker的对照，泳道1～12分别表示通过GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK或SSSNNNNNNNNNN融合的整合菌株；
[0022] 图4为不同酿酒酵母工程菌的葡萄糖二酸产量；其中Bga-L1～Bga-L13分别表示：不融合linker的对照，分别通过GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK或SSSNNNNNNNNNN融合的整合菌株；Bga-2表示单独表达2个基因的菌株。
具体实施方式
[0023] 下面结合附图和具体
实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0024] YPD培养基组成：每升YPD培养基含有20g蛋白胨，20g葡萄糖和10g酵母提取物，定容后1×105Pa灭菌20min。固体培养基每升加入20g的琼脂粉。
[0025] 发酵培养基组成：YPD培养基组成外加10.8g/L的肌醇。
[0026] 表1为实施例1、2用到的引物
[0027]
[0028] 实施例1：MIOX4-linker-udh整合片段的获得
[0029] 以Bga-001(公开于公开号为CN108220176A的专利申请专利：一种提高酿酒酵母工程菌株发酵生产葡萄糖二酸的方法)的基因组为模板，先以MIOX4-LF/MIOX4-LR为引物，扩增PTEF1-MIOX4片段；再分别以UDH-F(0-12)和UDH-R扩增不含linker，及分别含有如下12个不同linker：GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK和SSSNNNNNNNNNN的UDH-TCYC1片段，然后以MIOX4-LF和UDH-R将上述两个片段进行融合PCR，获得通过12个不同linker连接的PTEF1-MIOX4-UDH-TCYC1的DNA片段(图1和图2)。
[0030] 然后以Bga-001的基因组为模板，通过引物HIS3-(opi1)F/HIS3-(opi1)R扩增SEQ ID NO.5所示的HIS3片段(含有OPI1启动子上游同源序列，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，以上述获得的通过12个不同linker连接的DNA片段PTEF1-MIOX4-UDH-TCYC1为模板，通过引物MIOX4-LF/TCYC1-(opi1)R扩增获得PTEF1-MIOX4-UDH-TCYC1片段(含有OPI1启动子下游同源序列)，最后通过
醋酸锂转化法将上述2个片段整合到opi1缺失株的启动子上。
[0031] 实施例2：MIOX4-linker-udh整合菌株的检测
[0032] 提取通过上述方法获得的酵母转化子的基因组，以MD-Check-(opi1)F/MD-Check-(opi1)R为引物扩增提取的基因组，验证MIOX-UDH1融合蛋白是否整合到BY4741opi1Δ菌株的基因组上，图3可以说明所验证的菌株基因组上有MIOX与UDH融合蛋白，最终获得正确的整合菌株，分别命名为Bga-L1～Bga-L13。
[0033] 实施例3：融合表达工程菌发酵合成葡萄糖二酸
[0034] 1、种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于10mL的YPD培养基中，30℃，250rpm，摇床培养24h即为种子液。
[0035] 2、发酵条件：将种子液按照5％的接种量接种到含有50mL液体培养基的250mL的锥形瓶中，发酵培养基中的葡萄糖浓度为20g/L，并加入10.8g/L的肌醇。30℃、摇床转速250rpm，培养240小时。
[0036] 3、产物检测：取发酵液1mL，高速离心10min，保留上清液并用0.22μm规格的滤
膜过滤，滤液即为样品。即可通过液相色谱-质谱连用(LC-MS)检测，或通过高效液相色谱(HPLC)检测，以5mM
硫酸为流动相，色谱柱为有机酸柱(Aninex Hpx-87H ion exchange column)，柱温55℃，示差折光检测器，进样量30μL，流速0.6mL/min。
[0037] 每linker筛选出两个融合片段整合成功的菌株进行摇瓶发酵，同时以BY4741opi1Δ上单独表达MIOX4和udh的菌株(Bga-2)作为对照，对比葡萄糖二酸产量是否有所提高。发酵结果(图4)表明，相同发酵条件下，没有进行MIOX4和udh融合表达的酿酒酵母工程菌，其途径效率低，葡萄糖二酸产量只有0.25g/L，而经过融合表达后，在相同的发酵条件下，Bga-L12工程菌产量最高达1.45g/L，提高了近5倍；Bga-L5、Bga-L9的葡萄糖二酸产量分别为1.20g/L和1.41g/L。
[0038] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以
权利要求书所界定的为准。
